丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究

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1、丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究胡琳燕1余加林1收稿日起：2007-09-29，接收日期：2008-02-03国家中医药管理局（国中医药函[2007]223号）NO.2006LHR09，重庆市教育委员会（渝教科[2006]8号）NO.KJ060303,重庆市卫生局（渝中医[2004]12号）NO.2004-B-66*通讯作者：Tel：023-63635567,email:yujialin486@sohu.com,huli3188@yahoo.com.cn重庆医科大学附属儿童医院：1新生儿科，2儿科医学研究所中心实验室，重庆，4000143浙江大学医学院附属

2、妇产科医院新生儿科，杭州，310006刘官信1，2陈波曼3李芳1李禄全1钟海英1，2摘要：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)，采用丹参对4~5代MSCs进行反复多次诱导分化及再分化，将其诱导分化为神经样细胞，倒置显微镜下连续观察形态学变化，通过免疫荧光细胞化学检测神经样细胞巢蛋白(nestin）、神经丝蛋白(neurofiliament,NF）、突触小泡蛋白(synaptophysin)的表达，采用细胞膜电位特异的荧光探针DiBAC4(3)标记细胞，激光扫描共聚焦显微镜动态监测细胞受高钾刺激前后的荧光强度变化，观察细胞电生理反应。结果显示

3、：MSCs第1次经过丹参诱导2h后，MSCs伸出突起，向神经性细胞形态转变，此时nestin表达率为(95.1±2.1)%（±s,n=3），基本不表达NF；随着诱导分化及去分化过程的次数增加，细胞分化为神经样细胞的时间缩短，突起拉长并交互缠绕呈复杂网状，MSCs第4次经过丹参诱导1h后，NF表达率(95.3±1.6)%(±s,n=3)，并表达Synaptophysin，5h后Synaptophysin表达更为广泛；激光共聚焦扫描显微镜显示第4次诱导5h后的细胞在高钾刺激下发生去极化，胞内荧光强度瞬时增强，而MSCs空白对照对高钾刺激无反应。本优化诱导方案可以高效率地诱导MSCs分化为

4、具有电生理特性的神经样细胞。关键词：骨髓间充质干细胞；丹参；神经性分化；优化方案；电生理特性骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)定向诱导分化是近来研究热点。MSCs属多能干细胞，具自我更新和多向分化潜能，一定条件下可分化为神经细胞。本课题研究小组前期已证实丹参注射液可诱导MSCs分化为神经样细胞，但诱导条件也即细胞的生存条件比较单一，以致细胞不能长期存活，诱导8h就可见明显的细胞漂浮死亡，尽管此时的细胞表达神经特异性烯醇化酶(NeuN)[1]，但体外培养的神经元成熟时间是9~14天[2]，因此仅仅诱导8h的神经样细胞无法表现出兴奋性生理特性。近来本研究

5、小组发现同样以这种单一的诱导条件，即含有60mg/L丹参及10ng/mL碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowth，factor,bFGF)的无血清培养基，经过反复多次诱导后神经样细胞表现出兴奋性神经细胞的特性，本文就报道上述结果：1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物清洁级4周龄Wistar大鼠，雌雄不限，购自第三军医大学大坪实验动物中心[合格证号：SCXK（渝）20020003]。1.1.2主要试剂DMEM/F12培养基（美国Gibco）；胎牛血清（澳大利亚PAA）；重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）（美国PeproTech）；丹参注射液（1.5g/ml正大

6、青春宝）；DiBAC4(3)(美国Biotium)；羊抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体（美国Promega）；小鼠抗NF68KD/200KD单克隆抗体，兔抗突触小泡蛋白(Synaptophysin)多克隆抗体（美国Neomarkers）；兔抗羊Cy3荧光二抗，羊抗鼠Cy3荧光二抗，羊抗兔Cy3荧光二抗（美国Sigma，武汉博士德公司分装）；DAPI（美国Roche）。1.1.3主要试剂的配制：丹参储备液的配制：取一支丹参注射液（10ml/支）用15ml无血清DMEM／F12培养液稀释为600mg/L的储备液，4℃保存；bFGF储备液的配制：用pH7.6、5mmol/LTris盐酸溶解

7、稀释为10mg/L储备液，分装－20℃保存，临用时用无血清DMEM／F12培养液稀释为10µg/L临时储备液；诱导液的配制：丹参储备液和无血清DMEM／F12培养液以1:9混合，并追加bFGF临时储备液，使得丹参工作浓度为60mg/L，bFGF工作浓度为10ng/L；荧光染料及高钾刺激液的配制：将DiBAC(3)溶于无水乙醇配成5mmol/L储备液，分装后4℃保存。染色前用无血清的DMEM/F12培养液稀释为5µmol/L。将KCl溶于5µmo