核酸疫苗和蛋白疫苗不同免疫策略调节免疫反应及机制研究

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1、中文摘要关键词：DNA疫苗蛋白疫苗共免疫调节性T细胞首先，为了探讨核酸疫苗在单独免疫的情况下诱导机体产生的免疫反应情况，本研究选择了口蹄疫病毒和SARS-CoV病毒两种病毒模型进行实验．在口蹄疫模型中，本研究比较了不同的化学佐剂对表达口蹄疫VPl蛋白的DNA疫苗免疫小鼠后诱导的免疫反应。结果发现各佐剂与DNA疫苗共免疫均可诱发机体产生抗原特异性体液免疫和细胞免疫反应．其中，左旋咪唑佐剂诱导出最高水平的IgG2cx、体外T细胞扩增活性、体内DTH反应和IF}41表达，并显著的增强动物体的Thl型免疫反应。在SARS．coV模型中，将SARS-CoV病毒N，M和E蛋白的cDNA分别克隆至真

2、核表达载体pcDNA3d构建DNA疫苗，配合左旋眯唑佐剂进行小鼠免疫和免疫学检测。结果表明，三种SARSDNA疫苗都能在体外真核细胞中成功表达，免疫小鼠后都能诱导动物体产生抗原特异性的体液和细胞免疫反应。其中，表达N蛋白的DNA疫苗诱导出最高水平的IgG、IFN-?表达和体内CTL。两种病毒模型的研究结果表明，DNA疫苗在一定佐剂的配合下能够诱导机体产生抗原特异性的体液和细胞免疫反应。为了能进一步的提高DNA疫苗的免疫效果，选择了将DNA疫苗与蛋白疫苗联合免疫的DNAprime-蛋白boost策略。在口蹄疫病毒模型中，将FMDVvpl核酸疫苗与口蹄疫病毒灭活疫苗或VPl重组蛋白疫苗联合

3、免疫(核酸疫苗初免．蛋白疫苗加强)小鼠或本动物牛，分别利用ELISA检测免疫动物血清IgG，MTT法检测T细胞增殖反应。竞争定量PCR法检测细胞因子表达，液相阻断ELlSA检测牛血清中和抗体。结果显示，与单独免疫DNA疫苗或蛋白疫苗相比，DNA初免一蛋白加强的联合免疫策略能够显著的提高动物血清IgG、体外淋巴细胞增殖活性、体内DTH反应，、Thl型细胞因子的表达和保护性中和抗体的产生等免疫反应．表明prime_boost联合免疫的策略能够显著的提高DNA疫苗的免疫效果和保护力。虽然研me．boost的联合策略能够提高疫苗的免疫效果，但这种初免和加强的免疫策略并不利于实际操作。因此，本研

4、究想将这种prime-boost策略改进为。DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫”，并预期这种共免疫策略的免疫效果能够达到或超过prime—boost策略。将FMDVvplDNA疫苗与口蹄疫灭活疫苗或VPI重组蛋白疫苗共免疫小鼠和牛．结果发现，体液免疫反应检测得到了预期的结果，共免疫显著提高了小鼠和牛血清【gG水平；但细胞免疫反应检测确得到了意外的结果，共免疫显著的抑制了体外淋巴细胞增殖活性及体内D1m反应；T细胞转移和混合淋巴细胞反应实验结果表明共免疫诱导主动的T细胞免疫抑制；竞争PCR结果发现共免疫下调lL-2和IFN吖的表达，上调了IL．-IO的表达。此部分研究结果表明DNA疫苗与蛋白疫苗

5、共免疫可能诱导动物体产生了调节性T细胞。在发现DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫诱导机体产生调节性T细胞的现象后，本研究想进一步的利用这种共免疫的策略对过敏性疾病进行免疫预防和治疗。选择了哮喘和跳蚤过敏性皮炎两种疾病模型。在哮喘模型中，根据文献利用OVA抗原诱导Balb／C,'b鼠哮喘模型，实验证明表达OVA抗原的DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫能够显著的抑制小鼠哮喘的发生；这种抑制作用是由于共免疫诱导机体产生了调节性T细胞所造成的；这种调节性T细胞并不属于CD4+CD25+天然调节性T细胞，而属于cD_4+cD25‘亚群，并表达IL-10和TGF-p两种有调节功能的细胞因子。在跳蚤过敏性皮炎(FA

6、D)模型中，本实验室之前的研究建立了FAD的小鼠模型。表达跳蚤抗原的DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫后有效地抑制了小鼠FAD的发生，及相应的皮炎症状、皮试反应、炎症细胞在皮肤的侵润、炎症相关细胞因子的表达等；同时也证明这种抑制是由于共免疫诱导了调节性T细胞所造成的；这种调节性T细胞的功能具有抗原特异性，表型为CD4+CD25ToxP3+，同时表达IL-lO和IFN吖和T-bet等因子。两种疾病模型的结果都表明，DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫能诱导抗原专一性调节性T细胞并抑制过敏性哮喘和皮炎的发生。总之，本研究的结果证明。DNA疫苗在单独使用时需要配合适合的佐剂诱导机体产生有效的体液和细胞免疫反应

7、；在DNA疫苗与蛋白疫苗进行DNA初免一蛋白加强的联合免疫策略时，能显著的增强疫苗的免疫效果和保护性反应；在DNA疫苗与蛋白疫苗共免疫的联合免疫策略时，却诱导机体产生了抗原特异性的T调节细胞，并抑制小鼠哮喘和皮炎的发生。．IIAbstractKeywords：DNAvaccine,proteinvaccine,co-immunization,TregulatorycellDNAvaccinationisusefulforgeneratingim