核酸疫苗的构建、表达和免疫效应研究

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1、f’j：◆^：1镛答辩委员会主席：．芒查塾拯答辩委员会成员：鱼墓壑塾握奎囱田塾援、论文答辩日期：2Q]Q生§旦至曼旦●■{弋◆'’婶目录英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第一部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、22第二部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43第三部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60-7口⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯UV参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一60附致录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65◆综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯66j●√义DMEMDMSOEBEBNAEBVEDTAELISAFBSFCMFITCGFPHⅣHLAHPVHRPIFN—YIIFIL．4中文名称氨节青霉素别藻青蛋白丙烯酰胺过硫酸铵N-N亚甲双丙烯酰胺碱基对互补脱氧核糖核酸细胞毒性T淋巴细胞焦碳酸二乙酯Dulbecco7smodifiedDMEM培养基Eagle’sMediumdimethylsulfoxide

4、二甲亚枫Ethidiumbromide溴化乙啶EBvirusnuclearantigenEB病毒核抗原Epstein—BarrVirusEB病毒EthyleneDiamininetetraceticacid乙二胺四乙酸Enzyme．1inkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验Fetalbovineserum胎牛血清Flowcytometry流式细胞术Fluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素Greenfluorescentprotein绿色荧光蛋白Humani

5、mmunodeficiencyvirus人免疫缺陷病毒Humanleukocyteantigen人类白细胞抗原Humanpapillomavims人乳头瘤病毒Horseradishperoxidase辣根过氧化物酶Interferon．YY一干扰素Indirectimmunofluorescence间接免疫荧光Interleukin．4白细胞介素一4参吐RNARr．PCRSARS—CoVSDS．PAGESLETEMEDVLP＆bonucleicacidReversetranscriptionPolym

6、erasechainreactionSARscoronavirusSDSpolyacrylamidegelElectrophoresisSystemiclupuserythematosusTetramethylethylenediamineVirus—likeparticles2核糖核酸逆转录PCRSARS冠状病毒SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳系统性红斑狼疮四甲基乙二胺病毒样颗粒DNA疫苗。并通过转染COS一7细胞，经RT-PCR,间接免疫荧光，Westernblot分析和电镜观察验证嵌合重组质粒在真核中的

7、表达，及形成嵌合病毒样颗粒的情况。3．通过免疫BALB／c小鼠，研究多表位重组质粒pcDNA3．I(+)／EBVLMP2和嵌合重组质粒pcDNA3．1(+瑚PV6bLl△／EBVLMP2多表位的免疫效应，即采用ELISA检测血清IgG和阴道分泌物slgA特异性抗体方法分析体液免疫情况；通过CTL细胞杀伤活性检测和细胞内细胞因子检测等方法分析细胞免疫情况。方法：1．将本实验室已筛选获得的EBVLMP2多表位的核酸序列经真核密码子优化后交由生物公司合成，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1(+)上，构

8、建pcDNA3．I(+yEBVLMP2多表位真核重组质粒。利用转染试剂lipofectaminem2000转染COS．7细胞，通过RT-PCR和间接免疫荧光鉴定EBVLMP2多表位的表达和定位。2．设计了扩增真核密码子优化的HPV6bLl的PCR引物，并在两端设计酶切位点。先将密码子优化的HPV6bLl序列克隆至真核表达载体pcDNA3．1(+)上，构成中间质粒pcDNA3．I(+)／HPV6bLl△。通过设计扩增EBVLMP2多表位的PCR引物，并将其