peialeinate纳米粒介导vegfr3+sirna干扰淋巴管内皮祖细胞抗肿瘤淋巴管新生的作用

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1、复旦大学博士学位论文中文摘要目的研究以聚乙烯亚胺一海藻酸(PEI．alginate)纳米粒为载体的siRNA干扰淋巴管内皮祖细胞(1ymphaticendothelialprogenitorcells，LEPCs)的VEGFR-3基因表达，探讨以LEPCs为靶点的抗肿瘤淋巴管新生的作用。方法用ficoll密度梯度离心法从人脐带血中分离出单形核细胞，用抗VEGFR-3抗体标记后用流式细胞仪分选出VEGFR-3+细胞，用含有15％FBS、100IU／mL青霉素和100mg／L链霉素的DMEM培养液对分选后的VEGFR-3+内皮祖细胞

2、进行培养，培养12h后分别进行CD34／VEGFR-3和CDl33／VEGFR-3免疫细胞双标记染色，在共聚焦激光扫描显微镜下观察分选的VEGFR-3+细胞的CDl33和CD34的表达。通过VEGF．C诱导LEPCs向淋巴管内皮细胞(1ymphaticendothelialcells，LECs)分化。在荧光显微镜下观察LEPCs分化过程中CDl33和LYVE．1的表达。采用PEI和alginate合成纳米粒载体，扫描电镜和zeta电位仪检测纳米载体的形态、大小和电位。按照基因序列化学合成VEGFR-3siRNA。凝胶电泳阻滞分析

3、检测PEI．alginate纳米粒对siRNA的包封效率：MTT法检测纳米粒载体对细胞的毒性；用合成的纳米粒载体介导VEGFR-3siRNA转染LEPCs，荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率；扫描电镜检测转染2h时纳米粒子与细胞的关系；透射电镜检测纳米粒于转染后2h和6h在细胞内的降解情况；RT-PCR和westem-blot检测VEGFR-3siRNA的抑制效率。选取4～6周龄雌性Balb／c裸小鼠皮下接种S180细胞。将S180细胞按5x106个／200¨1接种BABL／c裸小鼠建立肿瘤淋巴管新生模型。当肿瘤生长至20d时，

4、将裸鼠随机分为3组：转染的LEPCs组(以5×105个／100I．tl转染的LEPCs直接瘤内多点注射，隔日1次，共2次)、未转染的LEPCs组(以5x105个／1001．d的LEPCs直接瘤内多点注射，隔日1次，共2次)和对照组(瘤内未移植LEPCs)。于LEPCs移植后第2d和第4d处死动物取肿瘤组织，制作切片，荧光显微镜观察移植细胞的存活。于LEPCs移植后第21d处死动物取肿瘤组织，制作切片，采用LYVE．1免疫组化染色标记肿瘤淋巴管，在荧光显微镜下观察，参照Weidner法测定肿瘤组织内和周边的淋巴管密度。结果人脐带血

5、中VEGFR-3十细胞同时表达CD34和CDl33。经VEGF—C诱导后1周，细胞CDl33表达减弱；诱导后4周，细胞表达淋巴管内皮特异性标志物LYVE．1，CDl33表达消失。扫描电镜和zeta电位仪检测结果显6复旦大学博士学位论文示，纳米粒载体表面电位为15～17．5mv，粒子直径为125～128nm，且多为球型结构。凝胶电泳阻滞分析结果表明，当N／P大于4时，PEI．alginate纳米粒对siRNA完全包封。MTT检测结果显示，经alginate修饰的PEI组在不同N／P时，对细胞的毒性均小于PEI转染组，且具有统计学意

6、义。PEI．alginate纳米粒介导siRNA转染LEPCs后，N／P为8时，转染效率可达30％以上，明显高于对照组，P<0．01。扫描电镜结果显示，在转染后2h，有纳米粒子吸附于细胞表面，在无血清的DMEM中，与PEI-alginate纳米粒相比，PEI-alginate／siRNA纳米粒表面光滑，粒径大于PEI．alginate纳米粒粒径，且两者粒径均大于在双蒸水中的粒径。透射电镜观察到，转染后2h，PEI．alginate／siRNA纳米粒已经进入细胞，且发生轻微降解，转染后6h，降解程度明显增强。RT-PCR和west

7、ern-blot检测结果显示，转染后48h和72h，siRNA干扰组mRNA和蛋白表达水平明显减弱。各组裸鼠接种S180细胞9d后，在其接种部位长出肿块，成瘤率达90％，后呈进行性生长，至36d移植瘤直径约为1cm。肿瘤表面可见扩张的血管且与皮肤有粘连。荧光显微镜结果显示，移植组肿瘤组织可见到绿色荧光，提示移植细胞成功。LYVE．1免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，未转染的LEPCs组和转染的LEPCs组肿瘤内和肿瘤周边淋巴管显著增多。转染的LEPCs组与未转染的LEPCs组相比，肿瘤内和肿瘤周边淋巴管密度明显减少，具有统

8、计学意义。结论本研究制备了PEI．alginate纳米粒载体，此纳米粒载体成功介导VEGFR．3siRNA转染LEPCs，达到理想的转染效率和抑制效率。本研究建立了裸鼠S180肿瘤动物模型；PEI．alginate纳米粒介导VEGFR-3siRNA转染LEPCs