复制型hbv小鼠模型建立与可诱导肝细胞特异性表达upa转基因小鼠制备

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1、硕士学位论文摘要目的l、构建及鉴定水动力法转染HBV小鼠模型，探讨该模型在HBV疫苗评价中的应用。2、制备可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠，为人肝嵌合体小鼠模型的建立奠定基础。方法1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用(1)∥讼V．HBVl．3质粒的鉴定：含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1．3个拷贝HBV基因组(a’w亚型)的HBV表达质粒pA舭HBVl．3(由中国疾控中心病毒病所谭文杰教授惠赠)，酶切鉴定并将该质粒转染Hllh7肝癌细胞系，ELISA方法检测HBsAg、HBeAg的分

2、泌表达水平。，(2)水动力法HBV小鼠模型的构建：将p儿舭HBVl．3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL／6小鼠，分别于注射后10天、30天、60天采集血液和肝组织标本，ELISA检测血清HBsAg、HBcAg表达；R砌．TimePCR检测血清及肝组织病毒载量；HE染色、免疫组化染色检测肝组织病理学改变及病毒抗原在肝组织中的定位及表达。．(3)水动力法HBV小鼠模型的优化：采用免疫抑制剂地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠，O．2ml／只／次(50m班g)隔日一次连续3次，建立免疫功能抑制小鼠模型，在此基础

3、上制备乙肝病毒转染小鼠模型，于注射后每周采集尾静脉血，进行血清HBSAg、HBeAg检测及病毒载量检测。(4)水动力法转染HBV小鼠模型的鉴定：利用HBV商品化疫苗(商品名：安在时，成分：HBsAg)免疫小鼠，2pg／只，14天1次，共2次，生理盐水为对照，200肛l／只：第2次加强免疫14天后用水动力法转染pAAv．HBVl．3，进行免疫保护性实验，在不同时间点采集尾静脉血，ELISA检测血清HBsAg、HBeAg，Real—TimePCR检测血清病毒载量。(5)水动力法转染HBV小鼠模型在疫苗评价中的应用：

4、用重组腺病毒(AdS)免疫C57BL／6小鼠，同时设置安在时疫苗(商品化疫苗)及生理盐水为对照。分别于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾静脉血，ELISA检测血清HBsAb，最后1次免疫14天后尾静脉水动力法注射pAAV-HBvl-3质粒溶液1．6m1(20“∥只)，于不同时间点采集尾静脉血，ELISA检测血清HBsAg、HBeAg，Real．TimePCR检测血清病毒载量。1摘要硕士学位论文2、可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备(1)pTet．0n．舢b啪in转基因小鼠的制备：构建及鉴定含血清白蛋白

5、增强子和启动子序列的pTet．0n—Albumin载体，在细胞水平验证越b啪iIl启动子转录活性，通过将pTet．on．舢b啪in载体显微注射B6／CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠，然后与野生型C57BL／6杂交，PCR筛选转基因阳性小鼠，ImPCR、Wbst锄blot鉴定rtTAmImA及蛋白表达。(2)pTRE2．uPA转基因小鼠的制备：构建及鉴定含小鼠uPA基因的pTRE2．uPA载体，与pT睢on质粒共转Huh7细胞系，细胞水平鉴定uPA的表达及其生物活性；通过将pTRE2-uPA载体

6、显微注射B6／CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠，与野生型C57B啪杂交，PCR筛选转基因阳性小鼠。‘(3)可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备：将已获得稳定的且在小鼠肝细胞特异性表达Albumin．rtTA的转基因小鼠与T砌j12一l姚转基因小鼠杂交，子代鼠Dox诱导，诱导12周后处死小鼠，取血清和肝组织进行ALT和肝组织uPA表达及病理学检测，获得可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠。结果．1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用(1)pA舭HBVl．3质粒的鉴定结果：

7、将包含1．3倍全长HBV基因组的质粒pAAV-HBvl．3酶切分析与预期结果相符，pAAV-HBVl．3脂质体转染H11h7细胞72h后收集细胞培养上清，ELISA方法检测HBsAg、HBeAg均为阳性，OD值分别为0．309及1．279，对照(未转染的Huh7细胞培养上清)均为阴性。(2)水动力法HBV小鼠模型的鉴定结果：C57B“6小鼠尾静脉水动力法注射pA觚乙HBVl．3，10天时通过ELISA方法检测小鼠血清HBsAg、HBeAg，结果均为阳性，感染率为100％；30天、60天时血清HBsAg、HBeA

8、gELISA检测结果均为阴性。Rcal．胁ePCR检测小鼠血清及肝组织病毒载量，结果显示，注射质粒10天、30天及60天时实验组小鼠血清及肝组织病毒载量明显高于对照组，且在10天时达高峰，以后随时间延长，血清及肝组织中病毒载量降低。免疫组化染色可见，10天时注射pAAV．HBVl．3小鼠肝组织均存在HBsAg、HBcAg阳性细胞，注射HBV质粒30天和60天时小鼠肝组织未检测到HBsA