复制型HBV转基因小鼠的建立、生物学特性、应用及无免疫耐受研究

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1、博士学位论文复制型HBV转基因小鼠的建立、生物学特性、应用及无免疫耐受研究博士研究生：刘光泽指导教师：顾为望摘要人类乙型肝炎病毒具有严格的种属特异性，～直缺乏理想的动物模型；．通过转基因技术建立HBV转基因小鼠模型，在国内外已被广泛用于乙型肝炎发病机理、抗乙肝治疗和药物筛选评价研究。作者建立的复制型HBV全基因组转基因小鼠，经不断选育现已稳定遗传20代以上，且可用常规ELISA和荧光定量PCR检测到乙肝病毒在血清中的复制和表达，与国际上普遍认同的由Guidou建立的复制型HBV转基因小鼠相当。该复制型HBV转基因小鼠模

2、型为研究HBV的发病机制研究以及抗乙肝药物开发研究提供了良好的实验动物模型。目前已被国内近百家科研单位应用。本论文的研究内容包括：(1)HBV转基因小鼠模型的建立；(2)HBV转基因小鼠生物学特性；(3)I-IBV转基因小鼠在抗乙肝药物药效评价中的应用；(4)利用siRNA短暂基因沉默技术制备无免疫耐受I-IBV转基因小鼠；(5)总结与展望。第一章复制型1．3copyD基因型HBV转基因小鼠的建立。本实验将1．3copy的D基因型HBV全基因组作为目的基因，采用显微注射技术将其注入小鼠受精卵细胞雄原核，然后将受精卵移植

3、于受体假孕母鼠输卵管内，发育产生子代小鼠。仔鼠尾组织提取DNA进行HBV基因PCR整合检测，再用酶联免疫吸附法(ELIsA)检测血清乙型肝炎表面抗原及e抗原，荧光定量PCR检测血清HBVDNA。结果：共获卵数1210枚，注射882枚，存活397枚，成活率45％；移植卵数337枚，受体数14只，怀孕鼠9只，产仔54只，移植成功率为16．02*／,(54／337)，用PCR法检中文摘要测54只仔鼠尾组织，15只为整合阳性。GO代经血清检测HBvDNA和HBsAg阳性4R；GI代检测61只仔鼠，血清HBsAgIjEI性13只

4、。可遗传子代Founder2只。定量检测血清中HBsAg表达量为80～9301ag／L。取转基因小鼠肝、脾、肾、小肠及股动脉等组织，进行HasAg、HBcAg免疫组化检测，仅发现肝及肾组织有HBsAg、HBcAg散在不均匀表达。第二章对已制备获得的稳定传代复制型1．3copyD基因型HBV转基因小鼠的F14．F20代小鼠进行了生物学特性研究。所观察的主要内容包括以下几个方面：(1)乙肝病毒指标复制表达水平及稳定性；(2)免疫学特性及病理观察；(3)乙肝病毒基因在各组织的转录水平；(4)传代培育。首先，本研究应用ELIS

5、A和荧光定量PCR的方法对血清乙肝相关指标进行了分析，发现转基因小鼠血清中存在HBsAg、HBeAg、HBcAg、preSI及HBVDNA，其dPHBsAg的表达水平较高，达5107．54-4144．8IU／ml，个体问有明显的差异但性别之间无显著差异；而HBeAg表达水平较低，仅为(1．944-1．66s／co)，血清中存在HBVDNA含量达到104～lOqcopy／ml。通过超高速离心的方法，在透射电镜下观察到HBV转基因小鼠血清中存在HBsAg颗粒和D粕e氏类颗粒，此结果证实了该转基因小鼠中整合的HBV基因组DN

6、A可复制包装成病毒颗粒并分泌入血，本转基因鼠为复制型。免疫组织化学结果显示：转基因小鼠肝细胞中表达l-IBsAgaX《IHBeAg蛋自两种病毒蛋白，但并不是所有的肝细胞同时表达HBsAg、HBeAg蛋白。HBsAg分布于肝细胞质中，HBcAg蛋白分布于肝细胞核中。肝组织H-E染色分析发现，转基因小鼠肝组织中未见肝细胞病变。采用流式细胞术和Elispot法对该晶系转基因小鼠脾细胞悬液DC的特异性标志CDlle及其上TLR2或其胞内TLR9的表达检测发现，HBV转基因小鼠自身除对HBV病毒存在免疫耐受外，其天然和获得性免疫

7、功能未见异常。利用real-timeRT-PCR荧光定量技术对转基因小鼠肝、肾、脾等十余多种组织中的总RNA进行定量检测，分析了I-IBV基因在转基因小鼠中各组织的转录特征，结果表明转基因小鼠基因组中整合的HBV基因主要在肝、肾Ⅱ博士学位论文组织能够转录出乙肝的rnRNA，并以肝组织转录水平最高。在早期培育阶段，将两个首建鼠(Founder)分别与正常鼠杂交进行传代，在每一世代仔鼠中进行检测发现其阳性率始终保持在40％一50％之间。这说明1．3eopyD型HBV稳定整合表达，并能可靠地遗传给下一代。为增加外源基因的拷贝

8、数，提高阳性率和表达水平，本研究把两个首建鼠分别传代至F14代进行互交并检测互交后生产仔鼠，其阳性率达N80％左右，这说明不同的首建鼠基因的整合位点不同且呈多位点整合，互交后可显著提高阳性表达率。上述实验结果表明我们建立的复制型1．3copyD基因型HBV转基因小鼠是国内比较理想的乙肝转基因动物模型。第三章利用HBV转基因小鼠对多