隐孢子虫canbd基因的克隆与真核表达

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1、安徽农业大学硕士学位论文隐孢子虫CaNBD基因的克隆与真核表达姓名：刘维申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李培英；王菊花201205摘要隐孢子虫病是由隐孢子虫感染引起的一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。近年来，隐孢子虫因在婴幼儿、幼畜、免疫缺陷者，尤其是艾滋病(AIDS)患者中感染率高且危害严重而倍受重视。虽然国内外学者对隐孢子虫病已进行了广泛而深入的研究，但迄今仍未发现公认有效的治疗隐孢子虫病的药物。由于隐孢子虫有新的简化代谢途径，能依靠膜上ATP结合盒式转运蛋白(C幽BC)对营养物质进行转运调节作用，并且具有逃避免疫和多

2、向抗药性的特性，致使许多疫苗和药物均难以成功防治隐孢子虫病。因此，深入进行隐孢子虫印4BC蛋白研究，对揭示隐孢子虫致病机理，筛选出治疗隐孢子虫病的特效药物具有重要意义。本课题先用PCR方法扩增奶牛源安氏隐孢子虫ABC蛋白基因的核苷酸结合区——Q脚，克隆、测序，获得安氏隐孢子虫＆脚基因；接着采用4种方法分离并培养小鼠肠上皮细胞(IEC)，建立小鼠IEc细胞的原代培养方法，并获得隐孢子虫所寄生的肠上皮细胞体外模型；然后将目的基因片段Cc脚与真核表达载体pEGFP．cl连接，构建＆E?v=8_D真核表达载体，并采用脂质体转染法将重组真核质粒导

3、入小鼠IEC细胞进行表达，观察蛋白表达情况；最后检测转染后细胞内外液体中4种离子的浓度，用SPSSl6．0软件进行差异显著性分析，明确＆“阳蛋白的转运功能。首先，用粪便DNA提取试剂盒抽提安氏隐孢子虫基因组DNA作为模板，合成疟原虫ABC蛋白基因序列的简并引物(加酶切位点眈根I和列II、起始子ATG和终止子TAA)，进行安氏隐孢子虫ABC蛋白核苷酸结合区基因(Cc脚)的扩增、克隆、测序，得到大小为41lbp的目的基因片段，翻译为氨基酸序列，大小为137aa，经氨基酸序列比对发现，所获安氏隐孢子虫＆Ⅳ叻氨基酸序列存在ABC蛋白家族的特征序

4、列“LsGGQ”和隐孢子虫ABc蛋白模体walkerA一“GETGSGKST”、WalkerB一“DEATSSLD”，因此，初步确定本次PCR所扩增出的411bp的核苷酸产物是安氏隐孢子虫ABC蛋白的一段ATP结合区基因序列，命名为＆脚。将Cc脚基因的克隆重组质粒与真核表达质粒pEGFP．C1均用限制性内切酶&DRI和聊I进行双酶切，酶切产物用T4连接酶进行连接，构建重组真核表达质粒pEGFP-C1．@批8_D，通过PCR、双酶切和测序鉴定，成功构建了pEGFP-C1．Q订惦D。其次，采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性

5、蛋白酶I联合消化法以及胶原酶I和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法4种方法分离到小鼠原代肠上皮细胞并进行培养，通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法进行细胞特异性鉴定，结果4种分离方法均能得到小鼠肠上皮细胞，通过比较发现组织块培养法所获IEC细胞中成纤维细胞污染较严重；胶原酶I和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IEC细胞成活率不高；嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶I联合消化法2种方法所获得小鼠IEC细胞成活率高、纯度较好，适合用于真核载体的转染。最后，采用脂质体转染法将重组真核表达质粒pEGFP．C1．伽D导入小鼠IEC原代细胞内，分别用空质粒pE

6、GFP。C1转染小鼠IEC细胞和未经任何处理的IEC细胞做对照组和空白组，结果在荧光显微镜下观察到转染组和对照组有荧光出现，空白组未见荧光，表明目的基因Cc脚在IEC细胞中成功表达。收集细胞经超声波破碎仪破碎制为悬液作为细胞内液，收集细胞培养液作为细胞外液，用溶液离子检测试剂盒检测细胞内液和细胞外液中4种离子的浓度，用sPssl6．0软件进行差异显著性分析，结果表明在＆W肋蛋白的作用下，这4种离子从细胞外转运至细胞内。因此，确定此次获得的㈣D是安氏隐孢子虫ABC蛋白的核苷酸结合区基因，且＆脚蛋白有转运营养物质的作用。综上所述，本课题在国

7、内外首次克隆安氏隐孢子虫ABC蛋白的核苷酸结合区基因——＆批BD，构建真核表达质粒pEGFP—C1．＆以BD，通过建立原代小鼠IEC培养方法，获得原代小鼠IEC，将㈣D基因导入小鼠IEC中成功表达，并通过检测4种离子浓度，发现Q脚蛋白有转运这4种离子的功能。安氏隐孢子虫＆彻基因的成功克隆和表达可为研究隐孢子虫抗药机制奠定基础，进而为解决隐孢子虫抗药问题并最终为使用药物治疗隐孢子虫病提供理论依据。关键词：隐孢子虫，＆【lv肋，肠上皮细胞，真核表达，转运IlAbs仃actC巧ptosporidiosisisazoonoticparasiti

8、cdiseaSecausedby咖f唧D，．埘渤朋in先ction．Itwasaworldwidedis仃ibution．Inrecentyears，(功fo蔑pD，．砌甜朋washighlyValuedb