2型糖尿病及其微血管并发症患者血清microrna表达谱筛选及临床价值的研究

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AbstractserumsofT2DMandT2DMCpatientsandmayhavethepotentialtobenovelauxiliarydiagnosisanddifferentialdiagnosisbiomarkersforT2DMandT2DMC．Keywords：type2diabetes；microvascularcomplications；serummiRNA；oxidizedlipoprotein；biomarkerV 目录第l章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．12型糖尿病及其微血管并发症⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2微小核糖核酸背景介绍⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21-2．1微小核糖核酸的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2．2miRNA的形成及其生物学功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3miRNA与T2DM及T2DMC之间的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．3．1miRNA与T2DM的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．3．2miRNA与T2DMC的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．4血清miRNA与T2DM及其微血管并发症⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4．1血清miRNA与T2DM的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．4．2血清miRNA作为糖尿病微血管并发症的生物标志物⋯⋯⋯⋯⋯81．5血清氧化脂蛋白与2型糖尿病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l2．1．1研究对象和样本收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．1．2主要仪器及试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1．3血清低密度芯片技术检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．4血清miRNA的定量分析检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．5血清氧化脂蛋白的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．1．6数据分析与统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l62．2实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．2．1血清miRNA的低密度芯片初筛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．2血清miRNA的复筛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．2．3血清特异miRNA的大批量样本验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．2．4ROC曲线分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2．6T2DM及T2DMC患者血清氧化脂蛋白的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．2．5T2DM及T2DMC患者血清miRNA与脂蛋白和血糖的相关性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31；2．2．6T2DM和T2DMC危险因素分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．362．3讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一37结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41VI 目录引用文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42在读期间发表的学术论文及研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一5l致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52VII 第l章前言第1章前言糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一种由遗传因素和后天环境共同作用，以糖代谢功能紊乱为主要特征的慢性炎症性疾病。DM主要分为1型和2型，其中2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)较为常见，占糖尿病总数的95％左右。最新流行病学调查显示，DM是继癌症，心血管疾病之后的第三大严重威胁人类生命健康的疾病。在发达工业国家，仅T2DM影响的人就超过其社会总人口的5％。目前，全球共有2．2亿人确诊罹患T2DM，预计到2030年，这一数字将达到3．66亿。T2DM也因此被世界卫生组织称为2l世纪的灾难。在我国，成年人群中T2DM的患者超过1亿，T2DM前期人群达4．9亿，我国T2DM患病人群占世界总患病人群的三分之一【·】。1．12型糖尿病及其微血管并发症T2DM是以胰岛B细胞受损和组织的胰岛素抵抗为主要特征的慢性炎症性代谢类疾病【11。高血糖、高血脂、高血压、晚期糖化终产物(advancedglycationendproducts，AGEs)、生长因子、炎性细胞因子和高浓度的自由脂肪酸(freefattyacid，FFAs)等都可以诱导T2DM的发生【挪。T2DM的发展可以导致大血管并发症和微血管并发症的发生，其中微血管并发症包括：糖尿病肾病、糖尿病神经病、视网膜病变。高血糖在T2DM和T2DMC的发生发展过程中均起到关键作用。在T2DM发生发展过程中，高血糖可以激活多元醇和己糖胺途径、增加氧化应激水平和AGEs的合成、激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen．activatedproteinkinases，MAPKs)的活性、刺激一些生长转化因子和细胞因子等的表达【31。而这些信号通路或蛋白的激活又可以使得多个下游信号通路被激活，包括增加线粒体超氧阴离子的形成、NADPH氧化酶的活化和相关的氧化应激等，并可以加剧糖尿病诱导的细胞功能紊乱。高血糖和随之而来的氧化应激增加、AGEs的积累、PKC和MAPKs的激活又可以增加促炎症转录因子NF．KB的激活，增加炎症反应的发生。而炎症在T2DM的胰岛素抵抗和T2DMC的发生过程中起到主要作用。高血糖诱导的转化生长因子131(transforminggrowthfactor-lBl，TGF．p1)的激活可以促进与糖尿病肾病相关的促纤维化基因的表达。另外，DM相关的一些氧化应激包括线粒体氧化应激和内质网氧化应激等是糖尿病并发症的重要致病因素，而这其中涉及的一些因子包括Nox4和Nrf2又是高血糖和TGF．B1的下游信号物[41]。因此高血糖通过促进各种炎症和病理基因和蛋白表达的方式在整个DM和T2DMC的发生发展过程中都起到了非常重要的作 用。1．2微小核糖核酸背景介绍第l章前言1．2．1微小核糖核酸的发现微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类约为23个核苷酸单链非编码小分子RNA，最早于1993年由Lee等在对秀丽线虫进行遗传研究时被发现。他们发现，lin．4RNA可以与lin一14mRNA的3’非编码区(3’untranslatedregion，3'-UTR)部分碱基配对，并抑制其翻译，提示Iin-4可以通过RNA与RNA的相互作用来影响lin．14mRNA的活性。随后，另一个miRNA．1et一7在2000年同样在秀丽线虫中被发现，并被证实具有相似的转录后表达调控的作用，能够通过与靶mRNA的3’．UTR进行识别与结合来降低蛋白质的表达，从而对基因的表达起到调控的作用。1in．4和1et．7的发现使得miRNA这类小分子的生物学功能开始受到人们的重视开【81。随后的研究证实miRNA广泛存在于多种动植物当中，并且可以调节许多基本的细胞进程，包括增殖、分化、衰老、凋亡、代谢、细胞间的信息交流等过程。1．2．2miRNA的形成及其生物学功能(1)miRNA的生物合成动植物中miRNA的生物合成过程具有一定区别。动物miRNA基因在细胞核内主要由RNA聚合酶II[91(少部分在RNA聚合酶III【10】)的作用下形成具有发夹环状结构的原始miRNA即pri—miRNA。随后pri—miRNA在RNaselII内切酶Drosha的作用下释放含有颈环结构的约70个核苷酸长度的miRNA前体即aapre．miRNAlll]，之后pre．miRNA在核转运蛋白exportin一5(Exp．5)的作用下进入细胞质。在细胞质中pre．miRNA先后经由Dicer和Argonaute(AGO)作用切割颈环形成双链小RNA即duplexmiRNA。最后duplexmiRNA与RNA诱导沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)结合，释放成熟miRNA。(2)miRNA的作用机制成熟miRNA通过与靶mRNA的3'-UTR进行部分的互补配对，继而实现基因的转录后水平调控。miRNA对基因的表达有三种调控形式【12】：(一)表达抑制。miRNA通过与靶mRNA进行部分的碱基配对，对mRNA的稳定没有影响但可以抑制mRNA的翻译，继而对蛋白质水平产生影响；(二)直接降解靶mRNA。如果miRNA与靶mRNA的碱基完全互补配对，那么靶mRNA则会被降解；(三)miRNA介导的靶mRNA降解。而降低靶mRNA的稳定性是抑制基因表达的主要方式[131。而miRNA自身的活性和含量也从转录到与目标位点的结合以及 第1章前言miRNA的稳定性等多个水平被调控【14】。有研究表明，一个miRNA可以对多个mRNA进行调节，同时一个mRNA也有可能被多个miRNA进行调节，这使得miRNA对生物体的调节呈现巨大的复杂性[15】。miRNA的合成过程如图1．1所示呻m褂neluv耳le口Utmr■怕pe蛳J／miRl蛆do薛m∞is誓记tamermI：≈NAregulation图1．1动物体内miRNA的生物合成过程(引自HennessyE，O’I)riscollL．MolecularmedicineofmicroRNAs：structure，functionandimplicationsfordiabetes．2008Aug15；10：e24．)(3)miRNA的生物学功能和研究方法miRNA广泛分布在多种单细胞和多细胞生物中，在许多生物学过程中扮演三 第l章前言着重要的调节作用。有报道称，miRNA可对人类基因组中约30％的基因起到调控作用。目前，研究确认miRNA对多个细胞进程起调控作用，并继而影响到整个机体的生命活动过程。在人体中，miRNA对癌症的发生【161、炎症的发生【17】、神经紊乱[18】、肥胖病和糖尿病的发生【19。201、心血管疾病的发生、脂质代谢、胆固醇的生物合成[211、DNA的甲基化和染色质的修饰阎、能量动态平衡等多个生理和病理过程起着重要的调节作用【12]。目前，对于在某种特定生理或病理状态下miRNA的表达情况分析比较常用的技术有深度测序和miRNA芯片。利用Solexa深度测序并结合生物信息学方法，可以获得miRNA表达谱，并发现新miRNA，为后续研究奠定基础。miRNA芯片可以高通量、大规模的分析miRNA在不同时期或不同样本中表达的差异性，进而了解miRNA在特定疾病中的生物学功能。但和深度分析不同的是，miRNA芯片只能对已知的miRNA进行分析。实时荧光定量PCR技术(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)是目前分析样本中特定miRNA含量比较常用的技术。而对于分析和预测miRNA作用靶点比较常用的生物预测软件有targetScan，PicTar和Tarbase等[23】。1．3miRNA与T2DM及T2DMC之间的关系1．3．1miRNA与T2DM的关系miRNA在T2DM的发生发展过程中起到了重要的作用。自2004年Poy等【24]证实miRNA参与了T2DM过程后，其在T2DM中的作用就开始引起了人们的重视。实验表明，miRNA在2型糖尿病的发生过程中对包括肝脏、脂肪组织、骨骼肌组织、胰腺和血管内皮等糖尿病相关的组织和细胞都起到重要的生理调节功能【25]。miRNA对胰腺的形成、葡萄糖刺激的胰岛素分泌和13细胞功能的维持都具有重要作用。Dicer酶是miRNA成熟所必须的酶。在胚胎发育时敲除小鼠Dicer酶基因将导致小鼠胰腺发生功能障碍【261，提示miRNA对于正常胰腺的形成与发育是必需的。通过在高葡萄糖环境下培养胰腺p细胞MIN6细胞系证实，高血糖可以使得miR．124a、miR-107、miR-30d的表达上调，并使miR-296、miR一484、miR-690的表达下降。而miR．30d表达上调可以促进胰岛素基因的转录，但其含量的变化对胰岛素的分泌物并没有影响[271。另外在胰腺8细胞MIN6细胞系中miR．184可以通过抑制其靶蛋白Slc25a22(一种线粒体谷氨酸载体)来抑制胰岛素的分泌【28】。miR一375是胰岛素特异性miRNA，对正常胰腺的形成和葡萄糖刺激的胰岛素分泌具有重要作用129-30]。通过对胰岛瘤1E细胞进行研究发现，miR-375对3’．磷酸肌醇依赖的蛋白激酶一1(Y-PhosphoinositideDependentProtein4 第l章前言Kinase—l，PDKl)具有调节作用，高糖可以促进胰岛素基因的表达，但miR一375可以抑制这种作用【31]，胰岛细胞过量表达miR-375又会减少糖原合成激酶3B的磷酸化和蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)，这表明miR-375参与了P13．kinase／PDKl／PKB信号途径。另外，将小鼠的miR-375基因敲除，使得miR一375表达缺陷将会导致胰岛13细胞受损和高血糖的发生，并增加胰岛a细胞的数量，最终导致肝脏分泌的葡萄糖增加和糖异生的发生【321。miR-375的正常表达对于胰岛的分化和形成以及胰岛素的分泌是必须的。1．3．2miRNA与T2DMC的关系T2DMC是T2DM患者在高血糖和炎症等因子刺激血管内皮细胞，引起血管内皮炎症而产生的一种疾病，其主要特征是微血管内皮基底膜增厚并有透明样物质沉积，T2DMC患者的微循环有不同程度的异常，基底膜病变常与微循环异常相互影响，促使微血管病变的加重和发展。T2DMC主要包括糖尿病肾病，糖尿病视网膜病变，糖尿病神经病，有研究显示在糖尿病微血管并发症的进程中有多个miRNA在其中起到重要作用。1．3．2．1miRNA与糖尿病肾病糖尿病肾病是一种严重的进展性肾脏疾病，可以导致终末期肾病，由胞外基质蛋白包括胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白和尿蛋白等的大量积累引起1肾小球系膜扩张、。肾小管间质纤维化、肾小球基底膜增厚等现象是糖尿病肾病的主要特点【33-341。在糖尿病肾病的发生发展过程中，肾细胞中转化生长因子(transforminggrowthfactorbeta，TGF．13)水平和信号会显著增强，而这会强力诱导纤维化和肾功能不全【3舡361。Kato等发现在TGF一13处理的小鼠肾系膜细胞和糖尿病小鼠肾小球细胞中miR．192、miR．200b／c、miR-216a、miR．217的表达水平显著升高[35,37】，其中miR-192在糖尿病肾病的发展中起到关键作用。在鼠。肾系膜细胞中，miR-192可以上调对纤维化起关键作用的基因包括Colla2和Col4al。另外miR-192可使得miR-216a、miR一217、miR-200b／c表达上调，而这些miRNA的上调又可增加胶原蛋白的表达。在小鼠肾系膜细胞中，miR-200b／c也可通过抑制Zebl的表达来调节纤维化进程，并促进TGF．p的表达【371。进一步的实验证实，在糖尿病小鼠皮质中TGF．B、p53和miR．192的表达均显著增加，并导致肾小球的扩张和纤维化。如果将小鼠的miR．192基因敲除可以使得小鼠糖尿病肾病的一些主要症状消失。同时，体外实验证实，TGF一13也可以激活miR一192和p53，miR一192又可在一个反馈回路中靶向调节Zeb2基因，导致小鼠肾系膜细胞胞外基质蛋白基因表达增加，加剧糖尿病肾病的发展[38-39】。在人糖尿病肾病早期患者中，也发现 第1章前言miR一192与Zeb2的水平具有负相关性138]，但也有研究显示miR-192的表达下降与糖尿病肾病的加重和肾小管间质纤维化有关【401。miR．192是TGF一13处理的细胞或糖尿病肾病中起调节作用的关键miRNA[41-43]。另外最近有研究表明，在ApoE-／一小鼠和TGF．p处理的肾小管细胞等肾细胞中miR-192的表达水平显著下降，这也体现了miRNA在糖尿病肾病中作用机制的复杂性。另外一些miRNA在糖尿病肾病的进展中也起到了重要作用。在糖尿病小鼠中，miR．93显著下降，而血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA，VEGF．A)水平则上升，提示VEGFA可能是miR一93的一个直接作用靶标，另外miR-93会有抗血管生成作用[删。在小鼠肾系膜细胞中，miR．377可以通过下调超氧化物歧化酶和p21活化蛋白激酶的表达来增加纤维蛋白的表达【45】。miR-29c、miR一192和miR一200b在糖尿病小鼠肾小球细胞或高糖诱导的血管内皮细胞中表达会被上调，其中miR．29c通过靶向Spryl蛋白来激活Rho激酶(Rhokinase)，并导致胞外基质蛋白的积累[461。1．3．2．2miRNA与糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变是糖尿病中非常常见的一种并发症，在美国它是导致失明最重要的原因之一【471。Kovacs等通过对链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导产生的糖尿病小鼠的视网膜和视网膜血管内皮细胞进行深度测序分析发现一些NF-rd3应答miRNA包括miR-146、miR-155、miR．132和miR-21的表达显著上调，另外对血管内皮生长因子起应答作用的miRNA和对p53起应答作用的miR．34家族也都显著上调【481。有研究发现，在糖尿病小鼠模型中，高浓度葡萄糖处理的血管内皮细胞和视网膜细胞中miR．146含量显著下降，而miR一146表达下降时纤维连接蛋白(fibronectin，miR-146a的靶标，可以促进纤维化和细胞的肥大)的表达会上升[49】，而且由于在内皮细胞中miR-146对NF．KB的激活存在反馈调节机制，使得miR．146有可能通过抑制NF—r．B的表达来治疗糖尿病视网膜病变【49】。McArthur等发现在糖尿病小鼠模型中，高浓度葡萄糖处理的血管内皮细胞和视网膜细胞中miR．200b的水平显著下斛50】，并且在糖尿病视网膜病变中，用miR-200的拮抗剂(antagomirs)去处理内皮细胞可以增加VEGF的合成，而用miR．200的类似物(miRNA．mimic)可以抑制糖尿病诱导的VEGF的mRNA和蛋白质的合成增!jfl[501。另外Silva检测了糖尿病视网膜病变凋亡的视网膜神经元中miR029b和它潜在的靶标RAX(一种对PKR促凋亡信号途径起激活作用的蛋白)发现，miR．29b在糖尿病发生早期会表达上调。因此在糖尿病早期miR．29b的上调可能通过抑制PKR途径来抑制视网膜细胞的凋亡【511。因此，通过外源注射miR-29b、miR一200b有可能作为治疗糖尿病视网膜病变的方法之一。1．3．2．3miRNA与糖尿病神经病变6 第l章前言糖尿病神经病是糖尿病常见而复杂的并发症，可涉及到神经系统的不同部位，并以外周神经病变最为常见。目前为止，关于miRNA对糖尿病神经病变起调节作用的文章还没有报道。然而，最近的研究显示miRNA在外周围神经平衡(intheregulationofperipheralnervehomeostasis)的调控中的起重要作用【521。在对大鼠进行坐骨神经去神经和神经支配恢复后发现肌肉特异性miR．1和miR．133a的表达调节被解除。另外miR．1和miR-133a在骨骼肌中的作用靶点也发生改变1531。这提示miRNA可能参与了糖尿病神经病的发展，因此对糖尿病神经病变中异常表达的miRNA进行研究对于深入研究糖尿病神经病变的发生发展具有重要意义。1．4血清miRNA与T2DM及其微血管并发症1．4．1血清miRNA与T2DM的关系最近研究表明，miRNA可以广泛分布于血清、血浆和其他体液中而不会被内源性RNA酶所降解【541。并且，在不同生理和病理状况下，循环miRNA的表达会有所不同，这也使得循环miRNA具有作为包括癌症【12】，心力衰竭【5卯，肝损伤【56】等多种病症的潜在标志物。血液中miRNA的来源多种多样，可以来源也血细胞，也可以来源于组织细胞的分泌和释放【12】。在血液中，胞外miRNA主要存在于胞外体(exosomes)、微粒体(microparticles，MP)和凋亡小体(apoptoticbodies)等一些膜性小囊泡(membranousvesicles，MV)中，另外也可以与高密度脂蛋白或RNA结合蛋白相结合存在【12】。细胞分泌的miRNA可以通过血液运输到靶细胞，并调节相关基因，继而影响靶细胞的功能。而I-IDL所携带的miRNA在不同病理下回有所不同，另外HDL也可以携带和转运miRNA，参与细胞间的信息交流。在不同生理和病理状况下，细胞会选择性的将不同的miRNA包裹进不同类型的囊泡，这使得在不同生理和病理状况下，血浆miRNA的种类和含量也会有所不同，血浆中miRNA可能作为疾病的生物标志物。胰岛素敏感组织发生胰岛素抵抗是糖尿病发生的重要原因，而胰岛素敏感组织能够以囊泡的形式分泌miRNA进入血循环，这使得血浆miRNA有可能反映2型糖尿病的发生发展情况U2]。在Chen等【571证实2型糖尿病患者血清miRNA表达谱会发生变化后，多个课题组[58-60]报道糖尿病患者血清中一些miRNA存在显著改变，而且一些miRNA在糖尿病发生数年前就已经发生显著的改变，因此这些miRNA有可能成为糖尿病发生的很好的生物标志物。Kong等【60I对miR一29a，miR-30d，miR一9，miR一124a，miR．34a，miR一146a和miR-375这7个涉及2型糖尿病病理和胰岛素释放的miRNA在2型糖尿病患者血清中的表达进行分析发现，它们均显著上调，其中 第l章前言miR．34a的变化最大。Zampataki发现在2型糖尿病患者血清中miR-24，miR．20b，miR一21，miR—191，miR-486，miR．15a，miR．126，miR．223，miR．197，miR．320，miR．150和miR．29b的含量都是下降的，而miR．28．3p却是升高的，更有意义的是在糖尿病症状尚未表现出来时miR-15a，miR．29b，miR．126，miR-223的下降和miR一28．3p的上升就已经发生了[59】。通过对健康人与肥胖患者、非肥胖型糖尿病患者和肥胖型糖尿病患者的血清miRNA进行比较，NuriaPescador等发现miR一138和miR一376a在肥胖病人与健康对照、非肥胖型糖尿病、肥胖型糖尿病人中有显著差异，而同时运用miR．503和miR-138的表达水平可以区分肥胖型糖尿病和非肥胖型糖尿病【61】。此外，在冠心病患者中，伴有糖尿病的患者比没有糖尿病的患者血清miR．145要更低f62]。另外，SuhedaErenerl63】等通过小鼠的实验证实循环miR一375可用来预测胰岛13细胞的死亡，而由于胰岛B细胞受损是糖尿病发生过程中的重要事件，这使得miR-375具有预测糖尿病发生的潜力。综上所述，血浆miRNA在2型糖尿病的发生发展过程中可能起到重要的作用。1．4．2血清miRNA作为糖尿病微血管并发症的生物标志物2型糖尿病微血管并发症早期常常无显著症状，这给疾病的诊断和治疗带来了很大困难。血清miRNA由于其在血液中可以稳定存在，在不同疾病中有其独特的表达谱和给患者带来的创伤性小等优点使得它成为很多疾病良好的生物标志物。ZampetakiA等【删对大量糖尿病患者血清进行检测发现有13个miRNA表达发生显著变化，其中血清miR一126的下降对糖尿病的发生具有预测价值并会导致一些次临床的外周动脉疾病的发病风险增加。在糖尿病患者血清中内皮细胞凋亡小体内miR-126含量的减少暗示miR一126输送在减少。在冠心病(coronaryarterydisease，CAD)患者中伴有糖尿病的患者其miR．17和miR．145显著下降[651。有人对原发性局灶节段性肾小球硬化和肾间质纤维化患者其血清miR一192和miR-205要显著高于健康对照嘲。另外miR．1、miR．133、miR．125b、miR一200b、miR-206和miR-503在糖尿病心血管病和心脏病模型中发生显著变化；在糖尿病视网膜病变模型中miR-146和miR-29b显著上升167-68]；在糖尿病肾病模型中miR-192、miR．200b／c、miR．216a、miR．217、miR．29b／c和miR一377发生显著改变【691。这些对于2型糖尿病及其并发症的早期诊断具有重要价值，有作为2型糖尿病及其并发症的生物标志物的潜在价值。1．5血清氧化脂蛋白与2型糖尿病氧化低密度脂蛋白(OX．LDL)是一种促促动脉粥样硬化性脂蛋白。在体内可以与p2糖蛋白I(p2．GPI)结合形成132-GPI-ox-LDL复合物。在自身免疫性疾 第1章前言病患者，包括系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等中132-GPI．OX—LDL复合物含量显著上升[70-71】。另外对132-GPI—OX—LDL复合物的测定对于预测炎症介导的动脉粥样硬化具有重要价值。而2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病，另外血管内皮细胞受损是糖尿病微血管并发症的基础，因此132．GPI．OX—LDL复合物在2型糖尿病及其并发症患者中可能也会有明显的上升趋势[72—31。脂蛋I兰I(a)[1ipoprotein(a)，Lp(a)】最早于1963年由挪威遗传学家Berg在研究低密度脂蛋白(10w．densitylipoprotein，LDL)的遗传变异时发现。Lp(a)由载脂蛋A[apoprotein(a)，apo(a)]和载脂蛋白B(apoproteinB，apoB)通过二硫键连接而成。其脂肪酸结构、组成、抗氧化能力以及体外氧化行为与LDL相似174-761。具有促进动脉粥样硬化的作用，是纤溶和动脉粥样化系统的重要组成部分，血清／血浆中的Lp(a)含量上升会引起纤维蛋白溶解系统受损、血管内皮细胞损伤、炎性反应、平滑肌细胞增生以及血栓形成等多种As相关的病理过程177|。最近有研究表明无论在体内还是体外B2．GPI与Lp(a)h㈣高的亲和力[78-79】。另外有研究表明，在冠心病患者中132-GPI．Lp(a)含量显著上升，是冠心病的独立危险因子【791，提示132-GPI．Lp(a)可能具有类似p2一GPI．OX—LDL功能，在炎症类疾病中包括动脉粥样硬化中起到预测作用[79-s0]。研究发现，As病变血管处的巨噬细胞可以通过直接吼间接的方式摄取p2-GPI．OX．LDL复合物，继而加速泡沫细胞的形成。本实验室先前已经发现在常伴有早发As病变的类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)及系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)和冠心病(coronaryarterydisease，CAD)患者血清中p2-GPI—Lp(a)和132-GPI—OX．LDL水平均显著上升[78,81]，另外在2型糖尿病患者血清中也有不同程度的上升[79】，当它们在糖尿病并发症中的变化情况以及它们与糖尿病中变化的血清miRNA的关系却没有报道，血清／血浆132-GPI—Lp(a)水平与糖尿病及其微血管并发症以及其变化的miRNA的关系仍有待研究。 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选第2章T21ⅪI及其并发症患者特异血清miRl峨表达谱的筛选T2DM是目前全球范围内严重危害人类健康与生命安全的重要疾病，具有高发病率、高致残率、和高复发率的特点。我国是T2DM高发大国，T2DM患者超过一亿，糖尿病对我国居民健康构成了重大威胁。目前临床上对T2DM的诊断指标主要有：空腹血糖，口服葡萄糖耐量试验(oralglucosetolerancetes，OGTT)，糖化血红蛋白(HbAlC)等，其中空腹血糖和OGTT是目前我国最常用的检测方式，但仅检测空腹血糖，T2DM的漏诊率较高，比较普遍的做法是同时检测和OGTT后2h血糖值，但这使得操作较为繁琐。国外有以HbAlC作为筛查T2DM高危人群和诊断T2DM的一种方法的。HbAlC实验简单易行，结果稳定，变异性小，且不受进食时间及短时间生化方式改变的影响，患者依从性好，美国糖尿病学会将HbAlC≥6．5％作为糖尿病诊断指标之一，但在我国HbAlC检测标准化程度不高，测定HbAlC的仪器和质量控制尚不能符合T2DM诊断标准的要求。另外目前对于T2DMC的检测较为困难。早期T2DMC难以被及时发现。因此探索和发现T2DM和T2DMC特异性生物标志物，为临床提供简便、快捷、准确、特异的病程观察与预后判断指标尤为重要【82】。微小核糖核酸是一类长约19～23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，在进化上高度保守，可在翻译水平调控基因的表达。血清肛缸浆miRNA具有检出谱系广、稳定性高、特异性高的特点。血清／血浆某些特定的miRNA表达水平的变化可反映特定组织器官的某种病变，是相关疾病的生物诊断标志物。近期研究表明，胰岛p细胞受损和外周组织的胰岛素抵抗均可导致多种miRNA的表达发生异常改变，可用于该疾病的临床鉴别诊断。但已有的报道主要集中在动物、体外细胞的研究，临床方面少有相关报道且病例数较少。因此，临床大样本筛选T2DM和T2DMC患者血清特异性miRNA，评价其对T2DM和T2DMC发生发展的诊断价值，对于T2DM和T2DMC诊断和治疗具有重要意义。低密度芯片技术是一种与定量PCR技术原理相似的技术，具有高灵敏性、高通量的优点。我们首先采用低密度芯片技术对T2DM和T2DMC患者及健康对照组的混合血清miRNA的表达进行初筛测定，再运用RT-PCR和qRT-PCR技术对初筛所挑选出的血清miRNA进行小样本的复筛和大样本的验证，以筛选出T2DM和T2DMC患者的血清特异miRNA表达谱，并进一步对所筛选miRNA在临床T2DM和T2DMC鉴别中价值。10 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选2．1实验材料与方法2．1．1研究对象和样本收集87例T2DM及87例T2DMC患者为2013年9月至2015年1月在南京军区总医院内分泌科收治的初次入院患者，患者未经过任何治疗或在入院前一个月内未使用任何药物治疗。糖尿病按照美国糖尿病协会制定的入选标准：空腹血糖兰7．0mmoUL且餐后2h血糖三11．1mmol／L；排除标准：在最近一个月内使用过任何治疗糖尿病药物或降糖药物的；患有严重脏器疾病的，包括肝脏疾病，慢性肾功能不全等，在最近一个月内做过外科手术的和患有内分泌疾病的；糖尿病微血管并发症入选标准：忠有2型糖尿病并被确诊伴有糖尿病视网膜病变或糖尿病神经病或糖尿病肾病中一种或几种的患者。排除标准：在最近一个月内使用过任何药物降糖或治疗糖尿病的；患有肝脏疾病；慢性肾功能不全患者；在最近一个月内做过外科手术的患者；健康对照入选标准：所有生化指标均正常，且在最近三年内未患任何严重脏器疾病的人。样本收集方式：收集患者入院时(未经治疗)及健康对照组禁食12h以上的静脉血5ml，3000r／min，离心5min，收集血清样本，放置于一80℃保存待用。2．1．2主要仪器及试剂2720型PCR仪(美国ABI公司)、7500型实时荧光PCR仪(美国ABI公司)，SAS67120型超纯水机(Millipore公司)，WH．851型涡旋仪(南京大学生命科学学院)，7600型全自动生化分析仪(日立公司)；TaqMan探针、miRNA引物(美国ABI公司)；无水乙醇、氯仿、异丙醇、酸性水饱和酚(上海化学试剂公司)；DEPC水(南京凯基公司)；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；人工合成的成熟体miRNA(Invitrogen公司)；总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)空腹血糖检测试剂(英国Randox公司)，高密度脂蛋白．胆固醇(HDL—C)、低密度脂蛋白．胆固醇(LDL．C)检测试剂盒(日本第一化学株式公会)。逆转录及qPCR反应体系试剂的配制：(1)逆转录反应体系(10gL反应体系)DEPC水3．5“L5xAMVbuffer2laL10mMdNTPl“LRT-primerlgLAMv酶0．5肛LRNA2gL(2)qRT-PCR反应体系(20gL反应体系) 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选DEPC水14．77“L10xPCRbuffer2gL25mMMgCh1．2uL10mMdNTP0．4uLTaq酶0．3uLProbeO．33gLcDNA1gL(3)醋酸钠溶液(3mol／L，PH=5．3)的配置称取36．3g无水溶解于90ml超纯水中，以醋酸调pH值至5．3并定容体积至100ml。向溶液中加入100止的DEPC并充分溶解以便除去RNA酶，置于37℃过夜，之后高压灭火，冷却后即可备用。(4)标准曲线试剂体系的制备将人工合成的浓度为1I．tmol／L的miR．16成熟体以DEPC水分别稀释成10—3(106fmol／L)、10‘4(105fmol／L)、10’5(104fmol／L)、10。6(103fmol／L)的浓度梯度作标准曲线，用以计算样本的绝对浓度。miR一16的eDNA单独逆转。反应体系为：miR-16(10一、104、10一、10’6浓度梯度)RNA各2皿、1皿浓度为10mM的dNTP、2gL5xAMVbuffer、0．5皿AMV、3．5gLDEPC水、1gLmiR-16zkq20151222的逆转录引物配成总100L的体系。qRT-PCR反应体系：lrtLcDNA、0．33gLTaqMan探针、1．2此的25mMMgCl2、0．3止Taq酶、0．40L2．5mMdNTP、2此10xPCRbufier和14．77此DEPC水。2．1．3血清低密度芯片技术检测2．1．3．1血清RNA提取1)从健康对照组、糖尿病组和糖尿病并发症组各25例血清样本中每个样本里取500此的血清分别置于除酶管中，每组总体积12．5ml。2)向三组各加入加Trizol至37．5ml，混匀，静置10min。3)加入5ml氯仿混匀，静置10rain，之后离心100009，20min。4)取上清约20ml，加入等体积的异丙醇，混匀在．20℃静置lh以上，离心10000g，30min。5)弃上清，沉淀加75％乙醇1ml，用移液器吹打混匀，吸入1．5mlEP管内160009，15rain。6)弃上清，室温干燥，加DEPC水22．5此。测量并记录RNA浓度。之后保存在一80℃。2．1．3．2低密度芯片分析血清miRNA 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选将三份混合血清抽提的总RNA委托上海英潍捷基贸易有限公司进行低密度芯片(TU)A)检测。TLDA技术流程如下：首先进行反转录，将总RNA加入到反应管中，放入PCR仪设置程序进行反应。将反应所得cDNA放在冰上备用；在反转录之后先进行预扩增，以提高TaqMan技术检测的灵敏性，低水平表达miRNA的检测可在RT-PCR完成后进行预扩增；待反应结束后加入Tris—EDTA缓冲液稀释反应液，再进行TaqManMicroRNAArray上样，最后上机进行反应。如图2．1所示。MegaPlexRTPrimers／P“merPools厂—=}T啦I刚^一从少量，甚至是单细胞中进行ImicroRNA表达谱分析MegaPkDxRTl———=Iupto300*phxIlMeslaPkexPre·AmplificationI——／J＼zkq20151222TaqMan圆—■==~、Real-tim,西1≯PCR、⋯·$z、图2．1低密度芯片技术检测原理2．1．4血清miP小TA的定量分析检测(1)苯酚．氯仿法提取血清．uRNA1)给除酶的1．5“EP管逐一编号并各加入300止，DEPC水，随后每管加入对应血清样本100皿，吹打混匀。2)向1)中每管加入200止水饱和酚，震荡混匀，静置约3rain，再加入200此氯仿，颠倒震荡充分混匀，并继续静置5min，25℃16000g离心20min。3)取上清加入对应编号的新的1．5lIllEP管中，每管加40止的醋酸钠溶液(pH=5．3，浓度为3mol／L)和800ml的异丙醇，充分混匀后一20℃静置1—2h，之后4℃、16000g离心20min。 第2章'I'2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选4)除去上清，加入75％的乙醇1ml后于涡旋仪上轻柔混匀，后5℃、16000g离心20min。5)除去上清，室温干燥，加入22止的DEPC水溶解RNA，保存于一80℃。(2)RT-PCR反应ABI公司针对每一种miRNA均设计了一个相同颈环结构的基因特异性反向引物，利用miRNA特异性反向引物进行逆转录，就可得到结构相同但属于特定miRNA的cDNA。步骤如下：1)根据实际情况，配置母液并加入特定miRNA的反向引物。2)分装8皿母液于200v．L的除酶EP管中，并加入2皿RNA组成10此逆转录体系，轻柔混匀。阴性对照cDNA与样本cDNA同时制备，以DEPC水替代血清RNA。3)将2)中混合物放入PCR仪进行逆转录，反应参数设置为：16℃30min；42℃30mira85℃，5min。(3)qR■PCR反应运用含有特异正向、反向引物以及MGB探针的试剂盒对待测miRNA进行定量检测，具体步骤如下：1)根据实际情况，配制除cDNA和探针以外的母液于除酶EP管中。2)分装18．67止母液于96孔PCR板(ABI公司)中，加入0．33皿对应探针zkq20151222和1此的eDNA组成20皿的反应体系，混匀。每个样本做3个复孔。阴性对照与样本eDNA同时进行扩增。3)将PCR板置于ABl7500检测系统进行PCR扩增反应。扩增条件为：95℃5min；95℃15s，60℃1min(收集荧光)，共40循环。满足以下几个条件即认为有显著差异：03CT值<35；②在75％以上的血清样本中能够被检测到；③2型糖尿病或糖尿病并发症组与健康对照组相比P值<0．05。miRNA检测的流程和原理如图2．2所示。14 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选‘·l”●''Sat-●⋯tt⋯·⋯·-●¨●mⅢ“⋯¨“¨^‘罱两彤r————————————：—：=：=：=>‰ox_t*--V●●，t一一-．-t¨^t·●’t●A一●⋯⋯o、====================)，．‘、t·、●'，一●●‘'，．●-．-’’．’|’‘’H儿．u-e川·J⋯⋯-●．¨．．”⋯⋯r●r4—-、．=刍圭兰兰兰-二兰兰：．，Hvt·●t一一⋯t⋯⋯¨o-●IrJ^¨⋯·●。’●-_●_--。___________________________________。__。__-‘-●_-_●__‘．---．-_-_____．．-__-．________．_____--__________．___-一●I’-‘1J一一————、一p。—’—。胃===。●1●⋯·^ot一’，(蔑>·F’一zkq20151222—’—————’《．-。JL，∞-)-‘1■●__________________________一r‘————一。’F’I4⋯●一●，●t‘o●--一．·’’j翊谚，．、／—一-’一’一_两’·’，’-}y图2．2nfiRNA检测的原理和流程 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选2．1．5血清氧化脂蛋白的测定2．1．5．1p2一GPI—Lp(a)和D2一GPI—OX．LDL的测定用本实验室建立的ELISA法[83】及自制的抗体检测p2-GPI—Lp(a)和p2一GPI—OX．LDL含量。具体步骤如下：以浓度为2．5mg／1的抗p2一GPI抗体(本实验室自制)作为包被抗体包被96孔微孔板，在37℃下温育2h，之后4℃保存过夜；以pH值为7．4的PBS缓冲液洗涤3次，每次1min；加入10g／l明胶一0．01mol／LPBS于37℃封闭lh，PBS洗涤3次，每次1min；分别加入稀释液f空白)、标准溶液(标准曲线)、待测血清，每孔100止，37℃温育2h；PBS洗涤4次，加入二抗(检测p2一GPI—Lp(a)的二抗为HRP—apo(a)多抗，检测p2一GPI—OX—LDL的二抗为HRP—apoB，二抗均为实验室自制)，每孔100止，37℃温育2h；PBS洗涤3次，之后每孔分别加入TMB(四甲基联苯胺)50止、过氧化氢尿素50皿显色lo~15min；加入2mol／l的硫酸终止反应，每孔100止：’用酶标仪测定450nnl波长处吸光度(A)值【84】，并使用回归曲线计算出待测血清p2-GPI．Lp(a)的含量。测定50份正常人血清B2．GPI．Lp(a)和B2．GPI．OX．LDL的水平，以正常人的均值加2倍标准差的和作临界值，定为1ku／l，大于lku／1为水平升高[88-89】。2．1．5．2OX—LDL和OX．Lp(a)的测定分别用兔抗人OX—LDL多克隆抗体和OX．Lp(a)自身抗体(本室制备)包被96孔zkq20151222微孔板，每孔100uL，37℃温育2h，之后4℃保存过夜：用PH为7．4的PBS缓冲液洗涤3次后，每次1min，再用含10％小牛血清pH为7．4的PBS缓冲液于37℃封闭1h；PBS洗涤3次，分别加入稀释液(空白)、标准溶液(标准曲线)、待测血清，每孔100gL，37℃温育2h；PBS洗涤3次，加入二抗(测定OX．LDL的二抗为HRP．apoB，测定OX．Lp(a)的二抗为HRP．印o(a)多抗，二抗均为本实验室自制)，每孔100皿，37℃温育2h；PBS洗涤3次，每孔分别加入TMB(四甲基联苯胺)50止、过氧化氢尿素50止显色10～15min后加入2tool／1的硫酸终止反应，每孔100止；测定450nnl波长处吸光度(A)值[841。拟合回归曲线计算每份标本OX—Lp(a)含量。该法平均批内变异系数(CⅥ为5．7％～6．9％，平均批间CV为9．2％～10．5％。2．1．6数据分析与统计数据分析采用SPSSl7．0软件进行。miRNA、脂蛋白的含量以数据均值4-标准误表示，其他数据及计量资料以数据均值4-标准差表示。所有数据首先检验是否为正态数据，非正态数据转换为正态数据后再进行分析。正态数据三组间的比较用one．wayalrlova分析，两组间的比较用独立样本的t检验与配对样本t检验。偏态数据在两组间的比较用Mann-WhitneyU检验，三组或多组问比较采用 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选Kruskal-WallisH秩和检验。采用Spearman分析变量间的相关性。独立危险因素分析采用多元Logistic回归分析，P<0．05为差异有统计学意义。2．2实验结果2．2．1血清miRNA的低密度芯片初筛(一)各组研究对象的I临床信息本研究用于低密度芯片初筛所用T2DM及其微血管并发症与健康对照组的基本临床信息如表2．1所示。与健康对照组相比，患者性别、年龄与患者组无显著差异，但T2DM及其微血管并发症组中TG显著升高，HDL．C显著降低。另外LDL．C在并发症组中显著升高。表2．1各研究对象的临床信息zkq20151222注：与健康对照组比较：+P<005，¨R0．01(二)低密度芯片检测结果低密度芯片结果采用Ct值表示，以U6为内参。T2DM及T2DMC组相对健康对照组的血清miRNA变化倍数采用2‘AAC‘表示(ACt=CtmiRNA—Ctu6。RNA：AACt=-ACtm很NA．ACt健康对照)。用低密度芯片技术分别测定T2DM及T2DMC组以及健康对照组混合血清中768种miRNA的表达，其中，T2DM患者混合血清中共检测到287种血清IIliRNA的表达(Ct值<40)，在T2DMC患者混合血清中共检测到218种血清111iRNA的表达(Ct值<40)，在健康对照混合血清中共检测到244种血清miRNA的表达(Ct值<40】。进一步对低密度芯片结果进行分析显示：与健康对照组相比，T2DM患者血清miRNA表达谱发生改变，皮尔森相关系数R值为0．683，包括miR一661、miR．571在内的多个miRNA表达水平发生改变，如图2．2所示；与健康对照组相比，T2DMC患者血清miRNA表达谱也发生变化，R值为0．673，包括miR-661、miR-571等多个miRNA表达水平发生改变，结果见图2．3所示；同时，两组糖尿病患者血清miRNA表达谱同样发生了变化，R值为0．7481，结果见图2．4 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选所示。进一步以至少一个患者组Ct值小于30，变化倍数>2为初筛标准，发现T2DM及T2DMC组血清中有53种miRNA较对照组升高，117种miRNA较对照组发生降低，各组中miRNA的变化情况见表2．2．2．3。随后，根据上述结果，我们选取了相比健康对照组，在T2DM和T2DMC患者中升高比较大的部分miRNA进行后续研究，如图2．5所示。●hsa-miR．1243·名．miR．19b-1N0nnaICOntroI／10酽：0．6823。5。：j属sa-miR．12748iP<0．0001。。：。／I／尺．51搿№●艮鼍●●■●●r执．．·：。；，／‘啷●●●●，●hsa—miR一564●●●●¨●●●●●●●●●●9hsa-miR-106b●●●●’曹●●●●●●●，●T2DM●●e电■●-4-●●●●●¨●hsa-mlR一5Z●●●■n●寺e●●Jr●●●●¨ee●0．／0●声母·····hsa．I■‘￥9b-3p0／鹰。口‘／●胁—mIR．152擘e●●_●e毒0hsa-miR．1490h鬟3-1I●208Ir=a．miR-646图2．2与健康对照组相比T2DM患者血清中表达发生变化的miRNA●’hsa-miR．1243hsa．rTIIR．19b-1NormalcontroI10酽=o．6726。55P‘0．0001h铀巾1。R一1274Brlsa．miR．212．2·hsa—miR．564hsa—nR．518f-4-T2DMcomplicationhsa．miR-152hsa．miR一10曲hsa．miR．125b．1hsa—miR一52：hsa-mIR-约c“8⋯鹫9b-3phsa．mlR-596f'sa-miR．149hsa．oJR一208hsamiR一509-5phsa·miR·25dm⋯R-7口．hsa-mIR-646图2_3与健康对照组比较T2DMC患者血清中表达发生变化的miRNA 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选Z‘T2DMhsa-nlIR8．6-4-2h}-miR．1274B酽=0．7481hsa-，【R．146aP《O．0001”fn’I嘲2“*⋯-R1撇．'．hsa帅IR．1257hs}mIR5541"213MCOrn№miR．51H咕,a4niRt开口5p．4·rBa．miR．152h伯．mlR．1。5br啪．mIR3了er鼬卅rlR一523hsa．"niR．∞jhSa巾jR．29ch⋯．：譬：6。381．6。hSa柙JR-1C1hs}m1R520c3DI'瞄-miR．∞erM．帅R1臣1h辅州噼595hs}mIR．646．n。图2．4T2DM患者与T2DMC患者间存在表达差异的血清miRNA表2．2T2DM及T2DMC患者上调血清miRNA的循环数和变化倍数miR-661miR．571miR-1267miR．564miR-1208miR-664-3pmiR-584—5pmilol303miR-770-5pmil0892bmiR-886-5pmiR-212-3pmiR-516a-3pmiR-1255b-5pmiR-30a-3pmiR-151a-5pmiR-30e-3pmiR-378a．3pmiR-638miR．1227miR-605UD30．99031．95931．02829．99630．00929．95031．02830．02627．99627．99523．98725．98l27．04725．98428．03726．99928．04228．986UD30．98627．98331．98829．95830．97426．96526．99226．95028．93l28．94427．98726．94523．85224．04824．92825．11027．02l27．96l27．99028．07428．95029．00429．98721．13428．96528．97727．95427．99927．94329．98229．00826．98326．994267949．76067264．51532127．11967123．95016179．33833204．54216112．3698378．9344．05l2095．04316698．5592．01716．2194．20733．10l32．78932．43017．3308．5794．0768．389l33649．508116611．618633“．66855871．89014855．4127741．7937589．7627159．1373900．6133759．4581822．193l634．43914．6597．6247．5757．4107．4013．7983．7283．7143．684 miR-132-3pmiR-1260amiR-652—3pmiR-15b-5pmiR-330-3pmil01254miR-34b-3pmilol233miR-663bmiR-lOb一3pmiR-223—5pmiR-199a一3pmiR-376cmiR-671-3pmiR-128miR-491—5pmiR-26b一5pmiR-454—3pmiR-29c-3pmiR-16-5pmiR-145-5pmiR-532-5pmiR-146b一5plet-7a-SpmiR-26a-5pmiR-24—3pmiR-195—5pmiR-495mil0381miR-20b-5pmiR-361—5pmiR-425—5p第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选27．99221．93830．98828．97031．06l29．04929．06621．99424．97828．98827．99728．99232．00l31．01930．99728．98733．00528．95434．00223．98826．97731．01526．97329．00226．97l21．98028．96230．98034．95729．96730．96724．07425．99222．95027．01125．98328．98227．97727．94722．98024．94829．94425．96925．9892997829．97329．99027．96428．96926．95422．99822．99624．9822899323．97827．98524．97020．02226．98929．97628．97027．96728．97622．95426．98821．00029．99027．97830．90228．95529．0lO21．95824．94428．96827．98428．93431．96230．98l30．96l28．96032．97928．93l33．98323．97326．97031．00926．97329．00426．97321．98328．96930．98934．96829．98031．01424．89116．1202．00863．46631．94517．0188．5228．7982．0464．1372．08916．51832_31616．3708．3198．1028．18466，08616．1208275．3298．01516．06416．36832．1088．15516．12215．65615．8198．082255．53016．11816．02l8．7573．5393．5243．5213．5081．9691．9651．9131．8871．8831．8661．8571．8371．8ll1．8091．7971．7951．7921．7871．7831．7721．7631．76l1．7601．7551．7531．7501．7481．707I．001 第2章T2DM及其并发症患者特异血清mi砌临表达谱筛选 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选let-7e．5p24．95524．97326．03miR-432．5p25．9825．94127·937miR一1274a20．98122．98122E951miR-409．3p23．98123．97225·965miR-425．3p26．98825．97728．981miR-93．3p26．97426．98428,989miR．18424．96223．90726-921miR．29a-3p29．98128．97531．95miR一342．3p21．01420．96822t986miR．320a18．98619。97120．959miR-200b．3p26．97528．98428．96miR-221．3p26．01324，97328．003miR_106b．5p30．97829．99532．969miR-374a．5p28．96429．96630·955miR．122．5p23．98624．98125．978miR-200c．3p24．98726-98626．979miR．126-3p23．98122．98725．975miR-886-3p26．97428．95928'969miR-193a．5p25．99426．97827·99lmiR．885．5p23．96525．97625·963miR．194．5p27．98229．97729-98lmiR．31．5p27．98930，00629．99miR-28．3p24．98723．95426．989miR．29．5029．95829．9731．96lmiR．15227．9463829．956miR．222．3p19．94119．92921．952miR．21．5p27．96827．96629．98miR．331．3p24．95924．00126·972miR．200a-3p28．97928．99930·99lm识．150．5p18．96217．95120·975mil030b．5p24．96724．98326．98miR．27a．3p29．96228．95931．976let-79-5p26．97625．96728．99lmig一139．3p24．95524．97726·97lmiR．324．5p28．97627．95530．999miR．21525．99527．9828．028miR．139．5p23．96623·97226miR一324．3p25．9625．9728．002miR．193b．3p25．9725．975281014miR．30a．5p23．95124．95826．942miR．1274b14．9817．9717．975miR-320b27．99430．00130．996miR_483．5p23．97226．96326·9“miR一133a22．99524．98425·9743．984．1621．0134．0788．1654．0248．37l8．0874．1622．0361．OOl8．2887．962．0122．0221．0088．0291．01S2．03711．0110．9968．2433．9970．0044．0624．0367．833．9728．1183．9848．0758．1093．978．1771．0184．01544．0142．016O．5l1．0080．5071．0150，8370．4740．470．4650．4620．4550．4540．450．4490．4460．4440．“4O．4440．4430．4420．4410．440．4380．4370．4360．4340．43l0．4310．4280．231O．230．2250．224 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选 。西C日￡U刁O止3∞∞02翮∞02∞∞O1翮∞0第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选_Control_T2DMT2DMcomplication一-IlIlIIlIIII“IlIIIIJIJlIlI图2．5与健康对照组比较在T2DM和T2DMC组中升高2倍以上的部分血清miRNA2．2．2血清miRNA的复筛根据TLDA初筛中T2DM及T2DMC患者血清miRNA相对健康对照组的变化情况，并结合已有的文献报道结果，我们挑选miR-571、rniR．661、miR一770—5p、miR-892b，miR-1303、miR-886—3p，miR-1323、miR-152—5p，miR一342—5p，miR-423．5p、miR-103和miR-19b进行小批量样本复筛。我们运用qRT-PCR技术在TLDA所用样本包括25例T2DM、25例T2DMC及25例健康对照中逐一验证，测定各miRNA在各样本血清中的含量和变化情况，结果显示，与健康对照相比，12种miRNA在T2DM及T2DMC患者中均显著升高，同时10种miRNA在两组患者之间也存在显著差异，具体结果见表2．4。24咖仰oo，oo4o：，o砌 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选表2．4复筛组各miRNA在各组样本中的含量注：miRNA的含量以平均值土标准误表示，浓度为fmol／L。三组间比较采取单因素方差分析，Pl为糖尿病组与健康对照的P值，JP2为并发症组与健康对照的P值，．P3为糖尿病与并发症的雅，P<0，05为统计学有差异。2．2．3血清特异miRNA的大批量样本验证随后，根据qRT．PCR复筛结果，我们挑选了在复筛组结果中变化明显、背景(DEPC水)较低且目前研究报道较少(主要为新发现的miRNA)共8种miRNA，包括：miR．57l、miR-661、miR．770．5p、miR-892b、miR-1303、miR-886—3p、miR．1323和miR-152．5p，进一步运用qRT-PCR技术在另外一组大批量样本包括62例T2DM、62例T2DMC及62例健康对照组成的验证组标本中逐一进行验证。2．2．3．1验证组研究对象的临床基本信息验证组研究对象的基本资料如表2．4所示，结果显示，患者与对照组性别、年龄无显著差异，但患者血糖、TG显著高于健康对照，而HDL则显著低于对照。T2DM、T2DMC患者LDL水平亦高于对照，其中T2DMC患者与对照有显著差异。表2．4验证组研究对象的临床信息注：多组间比较采用单因素方差分析，与健康对照组比较叩<0．05。25 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选2．2．3．2QPcR对血清miRNA的验证结果用QPCR技术检验健康对照(62例)、T2DM(62例)和T2DMC(62例)各组中血清miRNA的含量。结果显示：与健康对照组比较，8个血清miRNA在T2DM及T2DMC组中都显著上升；T2DMC患者血清miR-661、miR．892b、miR-886—3p和miR-1323水平高于T2DM患者；miR-571、miR-661、miR-892b、miR-770．5p在T2DM及T2DMC患者血清中表达水平较高，8种血清miRNA在各组中的表达如图2．7所示。—JoE巴强；《C莨翊miR．571miR-152-503≥oE七：一檀托靛鼎3≥oE之：，疆《忙莨黑miR-770-SpmiR-886-3p一1／IoEo《拄莨翊 _Jo￡匕谢托‘茛黑—JoE8拯托莨翊第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选miR$613≥oE匕《缸莨黑miR．892b●●●}————————————————————————————叫图2．78种血清miRNA在T2DM及T2DMC患者中的表达水平(注：miRNA的含量以平均值±标准误表示，浓度为fmol／L。叶℃表P(0．05，+叶E表P(0．01，¨+代表P<0．001)2．2．4ROC曲线分析为探讨T2DM及T2DMC患者血清中8个显著变化的miRNA对疾病的诊断效果，进一步运用ROC线分析各miRNA对T2DM及T2DMC的诊疗效果，结果显示，8种血清miRNA对T2DM诊断的ROC篚t线下面积(AUC)在0．774--0．877之间，对T2DMC诊断的ROC曲线下面积在0．823,-,0．946之间。根据选定的cuto仃值，8种一]／loE巴搿缸茁翊 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选血清miRNA对T2DM诊断的灵敏性和特异性分别在68．2％～88．1％和63．0％～84．5％之间，对T2DMC诊断的灵敏性和特异性分别在64．8％～84．7％秆180．6％。98．6％之间，8种血清miRNA对T2DM及T2DMC的ROC曲线分析结果见表2．5．2．6及图2．8。表2．58种血清miRNA对T2DM诊断的Roc曲线下面积及灵敏性、特异性表2．68种血清miRNA对T2DMC的诊断ROC曲线下面积及灵敏性、特异性为进一步分析上述血清miRNA对T2DM和T2DMc的鉴别诊断价值显示，继续分析8种血清miRNA在T2DM和T2DMC之间ROC曲线，结果显示，8种血清miRNA对T2DM和T2DMC鉴别诊断的ROC曲线下面积在0．611～0．675之间，提示8种血清miRNA对两者鉴别具备一定临床价值。进一步针对选定的cutof嘴分析上述miRNA鉴别诊断的灵敏性和特异性，发现3种miRNA包括miR-886—3p、miR-892b和IIliR-571的灵敏性和特异性均超过60％，分别为：miR．886—3p(灵敏性=0．651，特异性=0．628)、miR-892b(灵敏性=0．662，特异性=0．622)和miR-571(灵敏性 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选=0．603，特异性=0．608)，具体ROC曲线分析结果见表2．7及图2．8。表2．78种血清miIⅢ—埘T2DM及T2DMC的鉴别诊断ROC曲线下面积及灵敏性、特异性图示miR．152的ROC曲线图示miR．571的ROC曲线 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选图示miR-661的ROC曲线图示miR·770-5p的ROC线图示miR-886-3p的ROC曲线图示miR一892b的ROCI抽线 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选图示miR．1303的ROC曲线图示miR．1323的ROC曲线图2．88种miRNA对糖尿病及其微血管并发症诊断的ROC曲线图图示miR·886·3p的ROCI拍线I荪miR-770-5p的RoC曲线3l 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选图示miR-892b的ROC曲线图示miR．571的ROC曲线'·秘弊幢图示miR．661的ROC曲线图示miR一1303的ROC曲线32 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选1．特异性图示miR-152的ROC曲线图示miR一1323的ROC曲线图2．88种miRNA对T2DM与T2DMC鉴别诊断的ROCI抽线图2．2．6T2DM及T2DMC患者血清氧化脂蛋白的测定已有研究显示，氧化脂蛋白及其相关复合物在T2DM及T2DMC的发生发展中发挥重要作用，但其与血清miRNA的关系目前尚不清楚，为探讨OX．LDL、OX—Lp(a)、p2一GPI．OX—LDL、p2一GPI．Lp(a)在各组中的变化情况及其与各miRNA的相关性，本实验通过ELISA测定了各组中四种氧化脂蛋白的含量，并进行了Spearman相关性分析确定其与各miRNA的相关性。结果显示：OX．LDL、OX—Lp(a)、p2一GPI—OX．LDL、p2．GPI—Lp(a)l四种氧化脂蛋白在健康对照，糖尿病及并发症组间都有显著差异：miR．571、miR．661、miR．1303、miR一152、miR一1323和miR-886—3p与OX—LDL呈正相关，miR一571、miR．1323和miR一886—3p与OX—Lp(a)呈_IqZ相关。各组中血清氧化脂蛋白的含量见图2．9，miRNA与血清氧化脂蛋白的相关性见表2．8。 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选梦图2．9各血清氧化脂蛋白的含量34^．1_，口0I'^tvdl。xO】I口co一苗J．Pi口coO一一_，a￡11D-1矗O卜oc卫苗三c毒§o【1￡，nlI彤ldl．1d。_H矗葛考鼍．Jlu8uoQ】【-1￡、ojoJ。蕃二LO矗吐芑；口叠筘-芑。口cOo 第2章T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱筛选表2．88种血清miRNA与4种血清氧化脂蛋白及其复合物之间的相关性注：+为P<0．05，料为P<0．01，}}+为P<0．0012．2．5T2DM及T2DMC患者血清miRNA与脂蛋白和血糖的相关性分析为了探讨在T2DM及T2DMC患者中上述8个miRNA与血清脂蛋白和血糖的相关性，本研究进行TSpearman相关性分析。结果显示，miR-886—3p、miR-770-5p、miR一892b、miR．571、miR一661、miR．1303、miR．152、miR．1323与FPG和TRIG呈正相关，与}玎)LC呈负相关，miR-886-3p、miR-892b、miR-571、miR一661、miR．152、miR．1323与LDLC呈正相关，结果见表2．9。表2．98种变化血清miRNA与生化指标的相关性分析FPGCHOLTRIGHDLCLDLCmiR．886．3PR值0．446”0．0050．212”-0．413”0．178”JP值<0．00010．9440．001