慢性再障患儿血清il-17及il-23的检测及意义

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Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterDetectionandsignificanceofIL·-17andIL．-23inserumofchildrenwithchronicaplasticanemiaByDanfengWangSupervisor：Prof．XigeWangPediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2013 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：王尽叹日期：声B年6月7日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：主目民日期：≯晖占月1日 慢性再障患儿血清lL-17及IL-23的检测及意义硕士研究生：王丹凤导师：王西阁专业：儿科学郑州大学第三临床学院河南郑州450052摘要慢性再生障碍性贫血(chronicaplasticanemiaCAA)，是一种主要表现为全血细胞减少的难治性血液病，由多种致病因素协同作用引起骨髓造血功能衰竭。其发病机制目前主要存在3种学说，即免疫异常、造血干／祖细胞缺陷、骨髓造血微环境异常。其中慢性再障发病的免疫机制在近年研究较多。临床工作中也发现对再障患者应用抗淋已／侗腺细胞球蛋白(ALG／ATG)、环磷酰胺、环孢素A(CsA)等免疫抑制剂治疗有效，进一步证明了免疫调节功能异常在再障发病中的重要作用。目前，多数研究显示：CD4+T细胞的功能异常与AA发病密切相关。应用PCR、流式细胞术检测再障患者外周血单个核细胞中不同T细胞亚群的数量，结果显示CD4+T细胞比例减少、CD8+T细胞比例增高、CD4+／CD8+T的比值降低，Thl细胞显著增多，Thl与Th2细胞比例明显失衡。此外，再障患者的Treg及其调控基因Foxp3表达显著减少。经免疫抑制治疗有效后，体内免疫紊乱可缓慢纠正。近来，在研究某些免疫性疾病过程中发现了一种新的CD4+T细胞亚型一辅助性T细胞17(Thelper17cell，ThlT)，以特异性分泌白介素17(interleukin一17，IL．17)为主要特征。而IL．23为调控Thl7细胞分化发育的主要因子。Thl7细胞能够分泌IL．17、IL一22、IL．6、TNF．a等多种细胞因子，其发挥炎症效应的核心因子是IL．17，能够介导免疫性疾病，并参与自身反应性疾病、感染、肿瘤等疾病的发生、发展及转归过程。 摘要Thl7细胞的发现使得我们对再障的免疫发病机制有了新的认识。由此，我们设计本实验。目的讨论Thl7相关细胞因子IL一17、IL．23在儿童慢性再障发病过程中的作用，为慢性再障的治疗寻找新的治疗途径及方法。材料与方法病例组：选取2011年10月至2012年10月就诊于郑州大学三附院及一附医院的慢性再障患儿(诊断及疗效标准参照中华医学会2001年制定的小儿再生障碍性贫血的诊疗建议)。初诊组55例，病程(6士O．7)月，既往均未接受输血及免疫抑制治疗，其中男31例，女24例，年龄3岁．14岁，中位年龄8岁。恢复组50例，为应用ALCC'ATG和(或)口服环孢素A及配合其他治疗(11土1．5)月，达到缓解或者治愈水平者，男28例，女22例，年龄3岁．13岁，中位年龄7岁。正常对照组：同期在郑大三附院儿童保健中心体检的正常儿童25例，男14例，女11例，年龄2岁．12岁，中位年龄6岁。所有受试对象均留取清晨空腹血3ml，其中lml用于检测血常规，2ml用于ELISA法检测血清IL．17、IL．23。所有数据采用SPSSl7．0软件处理，计量资料以均数士标准差g±习表示，多样本间比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD．t检验，变量问相关性分析采用直线相关分析，以a=O．05为检验水准。结果1．CAA组初诊组血清IL-17、IL．23水平分别为(27．71士2．21)pg／ml、(189．00土11．72)pg／ml，显著高于恢复组(21．43+2．0S)pg／ml、(143．02+11．9S)pg／ml 摘要及正常对照组(18．59-a：1．35)pg／ml、(143．02-4：11．95)pg／ml(P<0．01)，差异有统计学意义，恢复组血清IL．17、IL一23水平与正常对照组比较无统计学差异(P>O．05)。2．CAA初诊组血清IL．17与IL．23水平呈直线正相关(严0．491，0．05)。3．CAA初诊组血清IL—17、IL一23水平与同期检测血常规的HGB、WBC、PLT计数均呈负相关(P0．05)。结论Thl7相关细胞因子IL—17、IL．23可能参与慢性再障的发病，并作为评定再障免疫抑制治疗评价疗效的指标之一，慢性再障患儿体内可能存在IL一23／IL一17轴。关键词：慢性再生障碍性贫血辅助性T细胞17白介素．17白介素．23III 摘要 AbstractDetectionandsignificanceoflL-·17andIL--23inserumofchildrenwithchronicaplasticanemiaPostgraduate：DanfengWangSupervisor：XigeWangPediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhouHenan450052Chronicaplasticanemia,referredtoasCAA，causedbyavarietyoffactors，ischaracterizedbyfailureofbonemarrow，whichmainlyresultingpancytopeniasyndromeinclinicalmanifestations．CAA’Spathogenesisiscomplex，currentlyexistthreedoctrines：hematopoieticstem／progenitorcellsdeficiency，immunedysfunction，abnormalbonemarrowmicroenvironment．‘anddefectsinheatopoieticstemcells，Failureofthebonemarrowmicroenvironment，damagetotheproductionorreleaseofhematopoieticgrowthfactors，cellorimmunosuppressionhumoralbonemarrow．Inrecentyears，scientistsgotmoreresearchesonimmunesystemofCAA．Clinicalworkimmunosuppressants，antilymphatic／thymocyteglobulin(ALG／ATG)，cyclophosphamide，cyclosporineA(CsA)furtherprovedeffectiveinpatientswithaplasticanemia，immuneregulationfunctionabnormalitiesinaplasticanemiaincidenceinanimportantrole．ManystudieshavedemonstratedthatCD4+helperTcellimmunedisorderiscloselyrelatedwithAA．ApplicationofPCRandflowcytometrytodetectdifferentTcellsubsetsinperipheralbloodmononuclearcellsofpatientswithaplasticanemiainperipheralbloodmononuclearcells，showedthattheratioofCD4+Tcellsreduced，a11dratioofCD8+Teellincreased，theratiooftheCD4十／CD8十Tcellsreduced，IV Abstract乃Jincreasedsignificantly，theproportionof砀JandTh2cellsobviouslyunbalanced．Atthesametime，thestudyalsofoundthatexpressionofTreganditsregulatorygenesFoxp3hassignificantreductionintheperipheralbloodofCAAchildren，andthenrecoveredaftereffectiveimmunosuppmssiontherapy．Thelper17cell(Thl7)，isfoundinrecentyearsasanewkindofCD4+Tcellsubtypes，withspecificsecreteinterleukin17asthemainfeature．AndIL-23ismainfactorthatCallregulatethedifferentiationanddevelopmentofThl7cell．CombinedwithIL-23RinthesurfaceofmatureThl7，IL一23canmaintainandexpandthedifferentiationandfunctionof11117．Moreover,itCanalsopromoteTcellandantigen-presentingcelltogenerateIFN-randIL-12SOastoinvolveintheregulationofthetreedendriticcellsCO-stimulation，andthusplaytheanti—tumorandanti-metastaticactivity．Allthesearecloselyrelatedtohuman’Sautoimmunediseases，tumors，inflammatoryresponsediseasesetc．IL一17maypromoteinflammation，inducemacrophagestosecreteIL-12，IL-6，IL·8，TNF-c【etc．，enhanceThlcelldifferentiationandTcellactivation．AfterthediscoveryofThl7，wegotanewunderstandingofaplasticanemia’Simmunepathogenesis．Thus，wedesigntheexperiment．ObieetiveInvestigatethecorrelationbetweenThl7relatedcytokinesIL-17，IL一23intheprocessofchildrenwithCAA，inordertoresearchsomenewtreatmentsandsolutionstoCAA．ExperimentalMethodThecasegroup：CollectingthechildrenwithChronicaplasticanemiafromOct．201toOct．2012inthepediatricinpatientandoutpatientoftheaffiliatedhospitalofZhengzhouUniversity．Thenewlydiagnosedgroup：55patients，thecourseof6monthsto1year，neverreceivebloodtransfusionandimmunesuppressiontherapybefore，31males，24females，agedfrom3to14yearsold，withanaverageage8yearsold；Therecoverygroup：50patients，havingreceivedtakingATG，cyclosporineV Abstractcapsules，androgen，reengineeringgreenbloodpiece，traditionalChinesemedicinetreatmentformorethan6months，andallindicatorsofrecoveryachievedremissionorcurethelevelofthose，28males，22females，agedfrom3to13yearsold，withanaverageageof7yearsold．DiagnosisandtreatmentrefertothepediatricCAAtreatmentrecommendationsbyChineseMedicalAssociation，whichpublishedin2001．Normalcontrolgroup：Electing25under-examinationnormalchildreninthechildcarecenterofthethirdaffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，14males，11，females，2-12yearsold，withailaverageageof6yearsolAllchildrenweredrawn3mlfastingbloodintheearlymorning,hereinlmlusedtotestroutineblood，2mlforELISAserumIL-17，IL一23．AlldatawouldbeprocessedbysoftwareSPSS17，measurementdatawereexpressedasmean+standard6±s)deviation，multiplesamples’diversitywereanalyzedwithsingle-factoranalysisofvariance，twosamples’comparesweretakenLSD—ttesting，andthecorrelationbetweentwovariableswereanalyzedbylinearcorrelationanalysis，a=O．05hasstatisticallysignificant．Result1．TheserumIL一17，IL一231evelofnewlydiagnosedinchildrenwithCAAwere(27．71±2．21)pg／ml、(189．00±11．72)pg／ml，obviouslyhigher(21．43±2．05)pg／ml、(143．02±11．95)pg／mlthantherecoverygroupandnormalcontrolgroup(18．59±1．35)pg／ml、(143．02±11．95)pg／ml，thedifferencehasstatisticallysignificant；2．TheserumIL一23andIL．171evelsinnewlydiagnosedchildrenwerepositivelylinearcorrelation(严O．491尸<0．05)，recoverygroupandnormalcontrolgrouphadnon—linearrelation(r=0．127、r=0．121，>0．05)．3．TheserumIL一17，IL．23levelofnewlydiagnosedinchildrenwithCAAshowedanegativecorrelationwithperipheralbloodWBC，PLTandHGBcount．Thedifferencehasstatisticallysignificant． AbstractConclusinThl7relatedcytokinesIL-17，IL一23mayparticipateinthepathogenesisofcllromcaplasticanemia,andasoneoftheindicatorsofimmunosuppressivetherapycurativeeffectevaluationofaplasticanemia．CllromcaplasticanemiawithIL一23／IL-17axismayexistinthebodywithC11romcaplasticanemia．Keywords：Thelper17cellcllromcaplasticanemiainterleukin-17intedeukin-23VlI 目录正文部分中英文缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I慢性再障患儿血清IL．17及IL．23的检测及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．74讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．95结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯136附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯147参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16综述部分Thl7细胞在再生障碍性贫血发病中的概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27附录部分个人简历在校期间发表的学术论文及成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31 中英文缩略词对照表英文缩写111EDTAELISAODILTGFⅢN．rTregCAACsAMSCsMHCTNFATGALGRORTGF—pFoxp3姆CsPCR英文全称HelpertlymphocyteEthylenedinitrilotetraaceticacidEnzyme-linkedImmunosorbentAssayOptimaldensityInterleukintransforminggrowthfactorInterferon-rRegulatoryTcellChronicaplasticanemiaCyclosporineAMesenchymalstemcellsMaiorhistocompatibieycomplexTumornecrosisfactoranti—thymocyteglobulinAnti—lymphocyteglobulinOrphannuclearreceptorTransforminggrowthfactorpFoxhead／winged-helixtransprcriptionfactorp3Antigen—presentingcellsPolymerasechainreaction中文全称辅助性T淋巴细胞乙二胺四乙酸酶联免疫吸附法光密度白介素转化生长因子干扰素．r调节性T细胞慢性再生障碍性贫血环孢素A间充质干细胞主要组织相容复合物肿瘤坏死因子抗胸腺细胞球蛋白抗淋巴细胞球蛋白孤独核受体转化生长因子D叉头／翼状螺旋转录因子抗原提呈细胞多聚酶链反应 引言慢性再障患儿血清IL．17及IL．23的检测及意义1硕士研究生：王丹风导师：王西阁专业：儿科学郑州大学第三临床学院河南郑州450052再生障碍性贫血(aplastieanemiaAA)，主要表现为骨髓造血功能衰竭、贫血、出血及反复感染，是难治性血液病之一，其中急性重型再生障碍性贫血(SAA)，临床起病急，病程发展快，预后极差。儿童时期的再生障碍性贫血多为后天获得性，任何年龄均可发病，男、女发病率无统计学差掣11。病程超过3个月为慢性型再障(CAA)，临床呈现轻或中度贫血，感染、出血较SAA轻，外周血象中除血小板减少外，红细胞、白细胞中至少有l项减低，骨髓小粒中红髓减少，骨髓象中包括巨核细胞系在内有2至3系细胞增生减低，可见超过30％的淋巴细胞【21。．大量研究认为AA的主要发病机制为免疫异常：异常的T细胞功能亢进、淋巴因子加速原始造血细胞凋亡、细胞毒性T细胞的杀伤作用，三者协同导致造血微环境及造血细胞改变，最终引起骨髓造血衰竭【341。T细胞作为体内的主要效应细胞参与细胞免疫反应，可依功能和表面标志物的不同划分为不同的亚群。为维持机体的健康状态，T细胞的数目、各亚群的数量和比值需要在一定的范围内保持相对平衡。既往研究中，应用PCR、流式细胞术检测再障患者外周血单个核细胞中不同T细胞亚群的数量，结果显示CD4+T细胞比例减少、CD8+T细胞比例增高、CD4+／CD8+T的比值降低，Thl细胞显著增多，n1与Th2细胞比例明显失衡【5．7】。同时发现，Treg及其调控基因Foxp3在再障患儿外周血中表达降低，经治疗免疫紊乱得到纠正后可回升【8】。Thl7细胞是新近在研究免疫性疾病动物模型中发现的一种经由天然前体T细胞分化而来的新的CD4+T细胞亚群，具有独立的分化、发育调节机制【91。研 引言究证实，原始T细胞由TGF—p单独诱导可分化为Treg，而TGF一13与IL．6联合则诱导原始T细胞向Thl7细胞转化，并可抑制Foxp3+Treg的分化。Thl7细胞可通过ROR),t特异性转录，并由IL．23扩增和维持其功能。Thl7细胞能够分泌IL一17、IL-17F、IL一22、IL一6、TNF．0【等多种细胞因子，其发挥炎症效应的核心因子是IL．17，能够介导免疫性疾病，并参与自身反应性疾病、感染、肿瘤等疾病的发生、发展及转归过程。已有研究证实，类风湿性关节炎(RA)、人类免疫缺陷病毒(H1V)感染等患者体内存在Thl7／Treg细胞亚群失衡，并与病情活动度等因素有关【lo-111。Rouvier等人于1993年首次发现IL．17，为同型二聚体结构，由155个氨基酸组成。其发挥效应的途径为：活化丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF．r．B．DNA)[12】。IL．17通过诱导巨噬细胞分泌细胞因子，促进Tc细胞活化和Thl细胞的分化等。此外，IL一17被激活后，募集嗜中性粒细胞，释放和表达集落刺激因子、趋化因子及粘附分子，从而造成组织破坏和细胞浸润【131。研究表明，在多发性硬化、实验性自身免疫性脑炎、哮喘、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)和同种异体移植排斥反应等疾病患者的外周血或组织中可检出较健康者高的IL．17表达[14】。GuYan等人研究发现AA患者外周血单个核细胞和骨髓中IL．17mRNA较正常者表达增高，血浆中IL．17、IL．8水平升高11引。IL．23是由二硫键联结P40和P19两个亚基而组成，能特异性刺激记忆性CD4+T细胞。通过受体IL．12R1和IL．23R传递信号，使Thl7细胞的分化和功能得到维持和扩大，还促进T细胞、抗原提呈细胞(APCs)产生IFNo),、IL．12等细胞因子，通过调节树突状细胞的共刺激功能而发挥抗肿瘤、抗转移活性【l61。Ghilardi研究表明，敲除IL．23靶基因的小鼠体液免疫功能严重损伤，其APCs刺激CD4+T细胞分泌IL．17的能力降低，提示IL．23在小鼠T细胞中通过CD4+T细胞诱导IL．17产生。由此可见，在天然免疫和获得性免疫间可能存在IL．23／IL一17轴。在炎症性肠病、变应性鼻炎、慢性感染等疾病的研究中均证实存在IL．23／IL．17轴，而在AA的研究中罕见报道【l。卜191。目前临床上对再障患者应用免疫抑制剂治疗，如抗淋巴俩腺细胞球蛋白(ALG／ATG)、环孢素A、CD3单克隆抗体、麦考酚吗乙酯、环磷酰胺、甲泼尼龙等，尤其是将CsA联合ATG／ALG作为治疗再障的一线方案取得了明显疗效，其主要作用于T淋巴细胞，纠正免疫紊乱和刺激造血因子产型20-211，更深一步证明了免疫紊乱介导的造血功能衰竭在再障发病中的重要作用【5】。2 引言因此，本实验设计应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测初诊及经治疗有效的再障患儿和正常儿童外周血血清中IL．17、IL．23水平，并分析其与外周血中WBC、PLT、HGB计数的相关性，以期探讨Thl7细胞及其相关细胞因子在再障发病中的作用，为儿童再障发病机制的研究提供新的思路，为治疗提供依据。 材料和方法2材料和方法2．1研究对象2．1．1慢性再生障碍性贫血患儿病例组选取2011年10月至2012年10月就诊于郑州大学第三附属医院及第一附属医院的慢性再障患儿共105例(诊断及疗效标准参照中华医学会2001年制定的d,JL再生障碍性贫血的诊疗建议【2】)。初诊组55例，病程(6士O．7)月，既往均未接受输血及免疫抑制治疗，其中男31例，女24例，年龄3岁．14岁，中位年龄8岁。恢复组50例，为应用ALG／ATG和(或)口服环孢素A及配合其他治疗(114-1．5)月，达到缓解或者治愈水平者，男28例，女22例，年龄3岁．13岁，中位年龄7岁。2．1．2正常对照组同时期郑州大学第三附属医院儿童保健中心体检的正常儿童25例，男14例，女11例，年龄2岁．12岁，中位年龄6岁。所有纳入实验的儿童年龄、性别进行比较，无统计学差异(尸>O．05)，实验前均取得其监护人知情同意。2．2主要仪器与设备台式高速离心机TGL．B(上海安亭科学仪器厂)；电子天平Sartorius(德国)；移液枪晶美生物科技公司．80℃超低温冰箱Enviro．scan(ForomaScientific公司)；一200冰箱BCD．258A(青岛海尔集团)；酶标仪ST-360型(上海科华有限公司)；数显电热恒温水温箱HH·W21·600S(上海跃进医疗器械厂)；多功能血细胞分类计数仪MB．A(陕西省宝鸡市无线电二厂制造)；4 材料和方法紫外分光光度仪各种耗材ThermoNanoDrop1000(美国)；包括普通干燥管、EDTA抗凝管、一次性枪头、一次性手套、无菌Ep管、刻度离心管等；2．3主要试剂人IL．17ELISA试剂盒、人IL一23ELISA试剂盒均有上海丽臣生物有限公司提供。2．4实验方法和步骤2．4．1标本的采集初诊组患儿于确诊且未做治疗前采血，恢复组为治疗达到缓解或者治愈水平随访过程中采血，两组均取清晨空腹静脉血3ml。正常对照组为体检正常者，留取空腹静脉样本3ml。其中lml置于EDTA抗凝管中，当日在郑州大学第三附属医院常规室检测血常规，另外2ml置于普通干燥试管中，室温下自然凝固2h，后以3000r·min‘1离，t315分钟，分离血清置于无菌EP管内，置．80。C冰箱冻存用于ELISA法检测血清IL．17、IL．23。2．4．2免疫吸附法(ELISA)．人IL．17及IL．23ELISA试剂盒灵敏度为1．0pg／ml，采用酶标仪为450nm波长。2．4．2．1具体操作过程(1)在室温平衡20min后，将所需微孔酶标板从铝箔袋中取出；(2)设置5个标准品孔、105个样本孔和1个空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50I．tl(IL．17的浓度稀释为48、24、12、6、3、1．5pg／ml，IL-23的浓度稀释为320、160、80、40、20、10pg／m1)；(3)样本孔加入样本稀释液40I．tl及待测样本10I．tl；(4)在标准品孔和样本品孔中(除空白孔外)加入经辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100}，tl，密封反应孔，37。C恒温水温箱避光孵育60min；5 材料和方法(5)取出重复洗板5次；(6)所有孔加入各50I．tl底物A、B，37。C避光温育15mira(7)所有孔加入终止液50}tl，5min后在450nm波长处测定各孔的OD值；(8)在Excel工作表中绘制出标准品线性回归曲线计算各样本浓度值(以标准品浓度作横坐标，对应的OD值作纵坐标)2．5统计学处理本实验所有数据均采用SPSSl7．0软件处理，计量资料采用均数4-标准差蜃±0表示，多样本间比较采用单因素方差分析，两两样本均数比较采用LSD—t检验，两变量间相关性分析采用直线相关分析，以a=O．05为检验水准。6 结果3结果3．1血清IL．17的水平CAA组患儿初诊组血清IL．17水平(27．71+2．21)pg／ml显著高于恢复组(21．434-2．05)pg／ml及正常对照组(18．594-1．35)pg／ml(P<0．01)，差异有统计学意义，恢复组血清IL．17水平与正常对照组比较无统计学差异(尸>0．05)。(见表1)3．2血清IL．23的水平CAA组患儿初诊组血清IL-23水平(189．004-11．72)pg／ml显著高于恢复组(143．024-11．95)pg／ml及正常对照组(130．344-9．62)pg／ml(P<0．01)，差异有统计学意义，恢复组血IL-23水平与正常对照组比较无统计学差异(尸>0．05)。(见表1)3．3血清IL．17、IL．23水平的相关性CAA组患儿初诊组血清IL-17与IL一23水平呈直线正相关(产O．491,p<0．05见图1)，恢复组及正常对照组血清IL．17与IL．23水平无相关性(严O．127、r=0．121，>O．05。(见图2、3)3．4血清IL．17、IL．23水平与同期血常规的相关性初诊组血清IL一17、IL．23水平与同期检测血常规的HGB、WBC、PLT计数均呈负相关(尸<0．05)，恢复组及正常对照组两者与HGB、WBC、PLT计数无相关性(尸>0．05)。(见表2)。7 结果表1CAA组与对照组外周血血清IL．17及儿．23的水平Q咖l，予4-0F谯169．97294．18P值o．05，n=50)14 附图对照组赢清广J-■水平，、卫心暑、_，对照组血清IL-23水平(pglml)图3正常对照组儿童血清11,-23与1L--17水平的相关性；(P>o．05，n=25)15 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综述1．3再生障碍性贫血的发病机制1．3．1免疫机制大量研究认为AA的主要发病机制为免疫异常：异常的T细胞功能亢进、淋巴因子加速原始造血细胞凋亡、细胞毒性T细胞的杀伤作用，三者协同导致造血微环境及造血细胞改变，最终引起骨髓造血衰竭。T细胞作为体内的主要效应细胞参与细胞免疫反应，能够对抗原起到识别、递呈、处理等作用，沟通细胞因子与靶细胞之间的联系、维持机体免疫功能的稳态【4】。临床研究证实，再障患儿外周血单核细胞上CD4+T细胞比例减少，CD8+T细胞表达增高。CD4+T细胞分为效应T细胞(111)和调节性T细胞(regulatoryTcell．Treg)。依功能不同111细胞可分为：Thl细胞，参与细胞免疫应答，活化细胞毒性T细胞，优势分泌IFN-7；而Th2细胞主要产生IL-4，通过增强B细胞介导的体液免疫应答发挥作用。研究发现，再障患儿外周血中Thl细胞及Thl／Th2细胞比值明显升高，从而推测再障的发病机制为某一抗原特异性刺激T细胞，使Thl细胞异常扩增，分泌大量细胞因子如IL．2、IFN吖、TNF．a等。IL．2可诱导NK细胞、细胞毒性T细胞、CD8+T活化增殖，再障患者血清IL．2水平升高，且部分患者外周血单个核细胞培养可自发分泌IL．2E5。61。Sloand等应用重组人IL．2受体抗体治疗15例纯红再障，6例患者短期出现治疗效果，治疗18个月后全部患者HGB水平恢复正常。说明IL一2再障的发病中起造血抑制作用【7J。IFN吖为II型干扰素，可增加造血细胞膜表面的FasR的表达，触发多能干细胞系、巨核系、粒细胞系的凋亡系统，导致造血衰竭。在体外实验中，将抗TNF．a抗体加入培养的骨髓细胞，能够增加红系集落形成单位和红系爆式集落形成单位的大小及数量，TNF．Q可协同IFN吖的作用，抑制造血干／祖细胞在组织培养中的增殖，促使原始和定向造血细胞的凋亡瞵出J。Thl细胞上存在一种特定的分子一黏液素3(TIM．3)，可参与Thl细胞的免疫应答反应及相关疾病的发生。Shan等应用RT-PCR法检测AA患者外周血及骨髓中TIM．3mRNA及IFN-ymRNA的表达均高于正常对照组，因此推断，TIM-3可能参与AA的发病过程u¨。Treg细胞不同于Th／Th2细胞，自身难于在体外活化和扩增，但在外周Treg细胞能够识别自身抗原并抑制效应性T细胞，在维持机体内环境的稳态、免疫耐受、肿瘤监测等方面起着重要的作用【ll-12】。Costantino等研究发现Treg细胞能 综述通过细胞间直接接触，或通过分泌IL．10、TGF．B间接抑制局部免疫反应，抑制Thl细胞的活化和增殖，从而发挥免疫抑制作用，且此免疫抑制不具有MHC限制性【13】。叉头／翼状螺旋转录因子Foxp3(Foxhead／winged-helixtransprcdptionfactorp3，Foxp3)，是Treg细胞分化和维持功能的关键，在CD4+CD25+Treg细胞基因和蛋白质水平均呈高表达，Foxp3基因突变或缺失的小鼠，其体内CD4+CD25+Treg细胞表达降低、调节功能障碍，可引起自身免疫性疾病【14d引。Solomou等采用流式细胞术分别检测再生障碍性贫血患者及健康志愿者外周血单个核细胞Treg细胞表达，结果显示，病例组与健康对照组相比CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细J]I亘／CD4+T细胞明显下降。给予病例组免疫抑制治疗3到6个月后复测其CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达，结果提示较治疗前回升，其中治疗达到完全缓解者CD4+CD25+T细胞表达明显升高【16】。骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓微环境中的非造血细胞，可分化为成骨细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞等，MSC在体内外均具有免疫抑制、造血支持作用【17】。Li等通过对AA患者和健康志愿者骨髓MSC的生物功能和基因表达发现，与健康者相比，AA患者的骨髓MSC显示异常的形态、增殖减少和潜在凋亡。AA患者骨髓MSC难以分化成为骨细胞而易被诱导分化成脂肪细胞。进一步证实了AA患者的骨髓MSC的异常生物属性可破坏骨髓微环境【l引。此外，抗原递呈细胞(APc)的异常可打破免疫耐受和淋巴细胞的极化，树突状细胞(DC)是体内提呈抗原功能最强的专职提呈细胞，分为髓系(DCl)和淋巴系DC(DC2)两类【l91。既往研究中，SAA患者外周血DCI及其表面CD68表达较对照组显著增高，DCl／DC2比例失衡，经治疗缓解后可恢复到正常水平12岘¨。1．3．2遗传因素近来对端粒酶活性及其相关基因的研究显示，再障的发病存在宿主遗传易感性。端粒是存在于真核细胞染色体末端的DNA重复序列，能够保证染色体末端在复制过程中避免受到重组、降解和融合。端粒酶属核酸蛋白酶，在延长端粒末端的基础上还能维持端粒的长度和结构完整。人类端粒酶主要由端粒酶逆转录酶(hTERT)、RNA成分(hTERC)和相关蛋白I(hTEPl)组成。其中hTERT是端粒酶的主要调控亚单位和关键结构，只在具有端粒酶活性的细胞中表达，如各种具有分裂增殖能力的细胞、生殖细胞及肿瘤细胞，且表达与端粒酶活性22 综述呈正相关【22‘231。Ball等运用流式细胞术及PCR等技术分析了再障患者及健康人外周血粒细胞和淋巴细胞的端粒长度，结果显示再障患者外周血粒细胞的端粒长度较对照组明显缩短【24】。1．3．3造血干／组细胞的功能异常研究证实，再障患者的造血干／祖细胞(HSC／HPC)明显减少，在体外培养集落中，包括骨髓粒单系集落生成细胞(CFU．GM)、粒系集落生成细胞(CFU．G)、红系集落生成细胞(CFU．E)和多向造血祖细胞(CFU．Mix)等均明显减少【251。造血干细胞因子受体(c．kit)是酪氨酸蛋白激酶受体，其产物广泛表达于增殖阶段的造血细胞表面，尤其是早期HSC／HPC表面。c．kit的配体干细胞因子(SCF)I主I成纤维细胞和内皮细胞产生，能刺激原始造血细胞增殖、分化。既往研究证实，再障患者c—kit表达减低，而SCF表达正常，即SCF／c．1【it信号转导途经异常，引起造血干，祖细胞增殖反应下降，导致骨髓造血衰竭【26-27]。转录因子GATA．2可调控造血干／祖细胞的增殖和分化，属于锌指结构家族，因识别和结合靶基因的特异性[T／A(GATA)G／A]序列得名。GATA一2基因在胚胎发育的早期已开始调节造血系统的发育和生成，敲除GATA．2基因可导致造血功能的严重缺陷和胚胎死亡【28-291。Wu等应用免疫荧光方法测定再障患者及正常人骨髓基质中的GATA的表达水平，结果显示再障患者骨髓基质中GATA．2的表达低于正常，说明GATA基因在再障的造血衰竭机制中起一定作用【30】。2Thl7细胞的研究进展及在再障发病机制中的作用2．1Thl7细胞的生物学特性Thl7细胞是新近发现的一种新的Th细胞亚群，与IL．23密切相关的且能够分泌IL．17能介导前炎症反应，并且参与自身免疫性疾病、感染、肿瘤等的病理过程【3¨。人类Thl7细胞主要为记忆CD4+T细胞，表达CD45R0。11117细胞由初始CD4+T细胞分化而来，IL．6和转化生长因子(TGF)．D联合成为启动因子，其他的细胞因子如IL．21、IL．1D、TNF．Q等也参与Tlll7的分化起始【32】。近年研究发现，敲除IL．21或1L．21R基因的小鼠模型中，即使IL．6联合TGF．D也不能诱导n17完全分化，且小鼠体内CD4+IL．17+T细胞表达减少，说明在经典的TGF．p联合IL．6模式中，IL．2l是促使Thl7完全分化的重要细胞因子。ROR)'t23 综述是Thl7细胞分化中的主要转录调控因子。RORa也是依赖于转录激活子3(STAT3)的激活，通过转化生长因子(TGF)．p和IL．6的共同诱导，促进Thl7细胞分化。RORa与ROIⅫ能以协同方式诱导初始CD4+T细胞向Thl7细胞分化。Thl7细胞以分泌IL一17为主，其他还有IL．21、IL06、IL022、TNF．Ⅱ等【33琊】。2．2Thl7细胞相关细胞因子及其功能2．2．1lL-17人类IL．17由155个氨基酸组成，呈同型二聚体形态，分子质量为3ku，N端信号多肽。IL．17与受体IL．17R结合后，通过活化丝裂原激活蛋白激酶(MAP)和核因子(NF．r,B—DNA)两条途径发挥促炎症作用，诱导趋化因子(如MCP—l和MIP一2)、促炎细胞因子(如IL．6、TNF)和基质金属蛋白酶的表达，释放和表达集落刺激因子、趋化因子及粘附分子的，募集嗜中性粒细胞，从而造成组织破坏和细胞浸润【3∞81。此外，IL-17能够增加黏附分子(ICAM)．1在成纤维母细胞细胞问的表达，增加上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞分泌IL．6、IL．8、G—CSF和PGE2的分泌例。2．2．2IL-6IL．6于1980年被Weissenbach发现，是一种来源于巨噬细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞及若干肿瘤细胞等细胞的糖基化蛋白。IL．6首先需与其受体形成具有生物学活性的IL．6／IL．6R(a链)／gpl30(13链)六聚体，通过JAK．STAT(信号转导和转录活化蛋白)途径和Ras．MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)途径诱导靶基因表达从而实现其生物学功能。其主要作用是作为活化T淋巴细胞产生抗体，释放肾上腺皮质激素，刺激凝血和造血，诱导急性期反应，但也能下调TNF．c‘和IL．1B的产生，具有旁分泌、自分泌和内分泌因子的功能，既能促进炎症发生，也能限制炎症反应，并能促成全身性的免疫抑制，对机体的天然免疫和获得性免疫都具有重要的调节作用m41】。2．2．3IL．23IL．23是Oppmann等人于2000年发现的P40家族的新成员，主要由外周单核细胞来源吞噬细胞、树突细胞、小胶质细胞等APCs分泌，受前列腺素E2的调节。IL．23通过P40和P19两个亚单位与其受体(IL-12131和IL一23R)结合发24． 综述挥生物学效应。IL．23R主要表达于记忆性T细刺421。Wiekowski等在研究中发现，过度表达p19的转基因鼠出现发育不全、成熟前死亡、不育、多器官炎症等症状，全身多器官有巨噬细胞和淋巴细胞浸润，P19分子在抗细菌感染高峰期表达增高，恢复期逐渐下降。缺失P40的小鼠肺结核分枝杆菌感染模型中，其IFN-，／分泌和特异性的迟发型超敏反应(DTH)完全消失。以上结果表明，IL一23可能在感染的急性期或免疫反应的晚期发挥主导的作用【43掣】。此外，IL．23还能通过直接作用于DC促进肿瘤肽的呈递，或通过活化M9分泌促炎性因子，IFN-7诱导骨髓来源的巨噬细胞表达IL．23R等途径发挥抗肿瘤作用【451。2．3Thl7细胞与Treg的关系Thl7细胞可诱导感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的发生，与Treg同属于CD4+T细胞但两者的功能截然相反，Treg具有免疫抑制和免疫无能的作用，而且在细胞分化发育过程中两者也相互制约。Zhou等研究证实：Treg和Thl7细胞在转录水平RORl,t和Foxp3可相互制约。Thl7细胞的分化由TGF．p启动。低浓度的TGF．B能联合IL．6诱导RORl,t的产生，促进Thl7细胞的分化，而高浓度的TGF．p则可增加Foxp3的表达，诱导Th细胞向Treg分化【46】。当T细胞内ROR，l,t与Foxp3同时表达时，用IL．6或IL．21处理Foxp3，可以降低其对对RORvt的抑制作用，从而增加Thl7的表达。Thl7细胞与Treg保持相对平衡时，机体才能有健全的免疫状态【4。71。2．4Thl7细胞在再障发病中的作用机制Thl7细胞主要通过其分泌的细胞因子在自身免疫、炎症、骨质破坏等反应中发挥作用，IL．23与成熟Thl7细胞表面的受体(IL．23R)结合后，能扩增Thl7细胞的分化和功能【321。Regis等人应用流式细胞术检测AA患者和正常人外周血及骨髓中Treg细胞、Thl7细胞表面标志物CD3+CD8‘IL．17+T细胞，结果提示AA患者Treg细胞表达下降，CD3+CD8。IL．17+T细胞表达增高【4引。GuYan等人研究发现AA患者外周血单个核细胞和骨髓中IL．17mRNA较正常对照组表达增高，血浆中IL．17、IL．8等细胞因子表达升高【49】。毛彦娜等收集新发再障患儿及健康儿童骨髓，采用流式细胞术检测骨髓单个核细胞IL．23R+CD4+／CD4+比例，用ELISA法检测骨髓上清液IL．6、IL．17、IL．23的水平，结果显示，再障患儿IL一23R+CD4+／CD4+比例、IL．6、IL．23和IL．17水平著高于对照组【50】。25 综述综上所述，Thl7细胞及其相关细胞因子参与再障的发病，可能机制为IL一23异常分泌，刺激Thl7细胞分泌IL—17增多，导致细胞因子IL．6、IL．8、TNF—Q、IFN-r、IL-12等大量产生，诱导Th0细胞向Thl细胞分化，Thl／Th2细胞比例失调，导致T细胞免疫失常，或者异常增高的IL-23通过分泌的删吖刺激CD8+T细胞长生，通过Fas／FasL途径引起造血细胞的凋亡，最终造成骨髓造血衰竭【5l】。3展望目前临床应用免疫抑制剂治疗儿童慢性再生障碍性贫血降低了本病早期死亡率，使预后得到了极大的改善。Thl7细胞是一种新的与免疫调节功能密切相关的T细胞亚群，对Thl7细胞及其相关细胞因子IL-17、IL一23的分化、调控及功能进行深入研究，将有助于进一步完善机体的免疫调节机制，有助于进一步阐明再障的免疫学发病机制，并为再障的免疫靶向治疗提供新的方向。目前，抗IL．17抗体已被应用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病等，并取得明显成效，细胞因子的靶向治疗能否应用于儿童慢性再障的治疗仍需进一步的研究。．26 参考文献(综述)参考文献杨颖哲，汤静燕．再生障碍性贫血的诊断治疗进展[J】．国际儿科学杂志，2010，37(1)：56．59KorthofET，B6k矗ssyAN，HusseinAA．Managementofacquiredaplasticanemiainchildren[J]．BoneMarrowTransplant．，2013，48(2)：191—195．陆再英，钟南山主编．内科学[M】第七版，北京：人民卫生出版社，2008，578．581．NakaoS，FengX，SugimoriC．Inlmunepathophysiologyofaplasticanemia[J]．IntJHematol，2005，82(3)：196—200．YoungNS，BacigalupoA，MarshJC．Aplasticanemia：pathophysiologyandtreatment[J]．BiolBloodMarrowTransplant，2010，16(1)：119-125TsudaH，YamasakiH．TypeIandtypeIIT-cellprofilesinaplasticanemiaandrefractoryanemia[J]．AmJHematol，2000，64(4)：271-274．SloandEM，ScheinbergP，MaciejewskiJ，eta1．Briefcommunication：Successfultreatmentofpurered-cellaplasia诵thananti—interleukin-2receptorantibody(daclizumab)【J】．AnnInternMed，2006．144(3)：181．185GeisslerK，KabmaE，KollarsM，eta1．Interleukin一10inhibitsinvitrohematopoieticsuppressionandproductionofinterferon—gammaandtumornecrosisfactoealphabyperipheralbloodmononuclearcellsfrompatients州thaplasticanemia[J】．HematolJ，2002．3(4)：206．213LoB，RamaswamyM．DeterminationofapoptosissensitivityinspecificTcellsubsetsfromhumanperipheralbloodbyutilizingamultiparameterfluorescenceactivatedcellsorting—basedtechnique[J]．MethodsMolBiol，2013，979：33-41ShanNN，HuY，LiuX．ImbalancedExpressionofT-betandTCellImmunoglobulinMucin-3inPatientswiⅡlAplasticAnemia[J]．JClinImmunol，2013，19：1-6FontenotJD，GavinMA，RudenskyAY，eta1．Foxp3programsthedevelopmentandfunctionofCD4+CD25+regulatoryTcells[J]．NatImmunol，2003，4：330—336KhattriR，CoxT，YasaykoSA，eta1．AnessentialroleforscurfininCD4+CD25+Tregulatorycells[J]．NatureImmunol2003，4：337-342SakaguchiS．NaturallyarisingCD4+regulatoryTcellsforimmunologicself-toleranceandNegativecontrolofimmuneresponses[J]．AnnaRevImmunol，2004，22：531-562ShiJ，GeM，LuS．IntrinsicimpairmentofCD4(+)CD25(+)regulatoryTcellsinacquiredaplasticanemia[J]．Blood，2012，120(8)：1624—1632CostantinoCM，BaecherAllanCM，HailerDA．HumanregulatoryTcellsandautoimmunity[J】．EurImmunol，2008，38(4)：921-924SolomouEE，RezvaniK，MielkeS，eta1．DeficientCD4+CD25+FOXP3十Tregulatorycellsinacquiredaplasticanemia[J]．Blood，2007，l10(5)：1603-160627，，，，伽U刁习卅习q皿pH陋№p哆pH阻n阻¨Ⅲ 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个人简历在校期间发表的学术论文及成果个人简历王丹风，女，汉族，生于1987年9月，2011年毕业于河南科技大学临床医学系，同年9月考入郑州大学第三附属医院，攻读儿科学硕士，研究方向为小儿血液与肿瘤。发表论文王西阁，王丹凤，周玉洁，等．慢性再生障碍性贫血患儿血清IL．17、IL．23的变化及l临床意义[J】．山东医药，2012，52(45)：58．60王西阁，周玉沽，王丹凤，等．再生障碍性贫血患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性及相关基因表达的研究[J】．中国当代儿科杂志，2013，15(1)：25．2830 致谢两年的研究生生活在转眼间就要结束了，马上要告别菁菁校园走向工作岗位，在这里我要感谢每一位陪我走过这两年时光的，给我无私帮助和支持的老师及同学。首先，衷心的感谢我的导师王西阁教授，恩师严谨的治学态度、精益求精的工作精神、宽容的待人风范使我受益匪浅。在这两年时I'．-I里，在学>--j上对我严格要求，在生活中给予无微不至的关怀。感谢恩师在此文章从构思至最终写作完成过程中的悉心指导。感谢我的父母、弟弟、妹妹多年来对我的支持和关爱。感谢邹丽萍教授、王秀芳教授、贾天明教授、徐发林副教授、吉玲副教授、尚利宏副教授、杜开先副教授、张艳丽老师、乔俊英老师、李四保老师、李凡老师等在儿内各科室轮转期间对我学>-j的指导和帮助。感谢血液科赵雪莲老师、李林老师、王宇护士长在临床学习及标本收集过程中给予的无私帮助。感谢儿科实验室冯建飞老师及郑大一附院儿科实验室赵晓明老师在实验标本收集阶段提供的帮助。．感谢我的师姐王晓格、王檬、周玉洁在工作、学>-j中给我的无私帮助。最后，向我的同学朱敏杰、郭智兰、王帆、王璇表示衷心感谢，感谢她们陪我度过两年难忘的时光。