抗流感病毒中药的筛选

《抗流感病毒中药的筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：密级：否HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTER’SDEGREEDISSERTATION抗流感病毒中药的筛选SCREENINGOFEFFECTIVEANTI-INFLUENZAVIRUSDRUGSFROMTRADITIONALCHINESEMEDICINES研究生:王芳芳CANDIDATE：WANGFANGFANG学号:2016302120108STUDENTNO.：专业:兽医硕士MAJOR：MASTEROFPROFESSIONALDEGREEINVETERINARYMEDICINE导师:周红波教授SUPERVISOR：PROFESSORZHOUHONGBO徐高原博士DOCTORXUGAOYUAN中国武汉WUHAN，CHINA二○一八年六月June，2018 华中农业大学硕士学位论文抗流感病毒中药的筛选Screeningofeffectiveanti-influenzavirusdrugsfromtraditionalChinesemedicines研究生:王芳芳学号:2016302120108指导教师:周红波教授徐高原博士学位类型:兽医硕士领域：华中农业大学动物医学院中国·武汉CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversityWuhan,China 抗流感病毒中药的筛选目录摘要..............................................................................................................................iAbstract.......................................................................................................................iii缩略语表（Abbreviation）.......................................................................................vi1前言.........................................................................................................................11.1研究问题的由来..........................................................................................11.2文献综述......................................................................................................11.2.1流感病毒简介...................................................................................11.2.1.1流感病毒的分类与结构........................................................11.2.1.2流感病毒的复制....................................................................21.2.1.3流感病毒对宿主细胞的影响................................................31.2.2神经氨酸酶研究进展.......................................................................31.2.2.1神经氨酸酶结构....................................................................31.2.2.2神经氨酸酶生物学功能........................................................41.2.3神经氨酸酶抑制剂研究进展...........................................................41.2.4中药抗流感病毒研究进展...............................................................51.2.4.1中药间接抗流感病毒............................................................51.2.4.2中药直接抗流感病毒............................................................61.2.4.3中药综合抗流感病毒............................................................71.2.5黄连素简介.......................................................................................71.3研究的目的与意义......................................................................................82实验材料与方法.....................................................................................................92.1实验材料......................................................................................................92.1.1毒株、细胞及鸡胚...........................................................................92.1.2质粒...................................................................................................92.1.3抗体...................................................................................................92.1.4抑制剂.............................................................................................102.1.5引物.................................................................................................102.1.6主要药品的配制.............................................................................112.1.7主要试剂、酶及试剂盒.................................................................112.1.8主要培养基及其配制.....................................................................122.1.9主要试剂和缓冲液的配制.............................................................122.1.10主要耗材及仪器设备...................................................................13I 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.2实验方法....................................................................................................142.2.1无内毒素质粒提取及鉴定.............................................................142.2.2细胞相关实验.................................................................................152.2.2.1细胞复苏..............................................................................152.2.2.2细胞培养..............................................................................152.2.2.3细胞冻存..............................................................................152.2.2.4细胞转染..............................................................................162.2.2.5双荧光素酶报告实验..........................................................162.2.2.6流感病毒聚合酶活性测定实验..........................................162.2.3病毒相关实验.................................................................................172.2.3.1病毒的增殖..........................................................................172.2.3.2病毒的细胞接种..................................................................172.2.3.3血凝（HA）实验................................................................172.2.3.4病毒TCID50的测定.............................................................182.2.4实时荧光定量PCR.........................................................................182.2.4.1RNA的提取..........................................................................182.2.4.2去DNA及反转录反应........................................................192.2.4.3实时荧光定量PCR..............................................................192.2.5蛋白相关实验.................................................................................202.2.5.1细胞总蛋白的提取..............................................................202.2.5.2免疫共沉淀实验步骤..........................................................202.2.5.3SDS-PAGE电泳....................................................................212.2.5.4蛋白质转膜..........................................................................212.2.5.5Westernblot实验..................................................................222.2.6CCK-8方法检测药物对细胞的毒性实验......................................222.2.7神经氨酸酶活性抑制实验.............................................................222.2.8统计学处理.....................................................................................233结果与分析...........................................................................................................243.1流感病毒NAIs的筛选及其抗病毒效果验证..........................................243.1.1筛选出对流感病毒NA活性有明显抑制作用的中药复合物.....243.1.2检测所筛选出的中药复合物的细胞毒性.....................................313.1.2.1显微镜下孵育相应浓度的中药复合物的细胞状态..........313.1.2.2CCK-8试剂盒所检测中药复合物相应浓度下的细胞活性343.1.3体外实验验证中药复合物的抗流感病毒效果.............................36Ⅱ 抗流感病毒中药的筛选3.1.3.1中药复合物D1抗流感病毒效果.......................................363.1.3.2中药复合物G3抗流感病毒效果.......................................373.1.3.3中药复合物H5抗流感病毒效果.......................................373.1.3.4中药复合物X4抗流感病毒效果.......................................383.1.3.5中药复合物S7抗流感病毒效果........................................383.1.4中药复合物X4对其他亚型流感病毒的抑制效果......................393.1.4.1中药复合物X4对221（H1N1）流感病毒的抑制效果...393.1.4.2中药复合物X4对W1（H9N2）流感病毒的抑制效果...403.2黄连素抗流感病毒作用研究....................................................................403.2.1黄连素抑制流感病毒聚合酶活性及其组装.................................403.2.1.1黄连素抑制流感病毒聚合酶活性......................................403.2.1.2黄连素抑制流感病毒聚合酶组装......................................413.2.2黄连素抑制宿主细胞内MAPKs通路激活mTOR通路.............423.2.3黄连素通过抑制MAPKs通路抑制流感病毒的增殖..................433.2.4黄连素通过抑制MAPKs通路抑制流感病毒的复制、转录......443.2.5黄连素抑制了流感病毒诱导的细胞因子的产生.........................453.2.6黄连素间接抑制了p65的磷酸化.................................................474讨论.......................................................................................................................485总结.......................................................................................................................515.1主要结论....................................................................................................515.2需要进一步探讨的问题............................................................................51参考文献...................................................................................................................52致谢...........................................................................................................................61III 抗流感病毒中药的筛选摘要流行性感冒病，是一种由流感病毒（influenzavirus，IV）引起的具有高度传染性的急性呼吸道人畜共患疾病。流感病毒给养殖业造成巨大经济损失，同时给人类健康带来严重威胁，因此，人们一直在寻求有效的防治措施。流感病毒是基因组分节段的正黏病毒，亚型众多变异快，因此用疫苗预防难以达到预期效果。市面上流通的两类抗流感病毒药物：M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂（neuraminidaseinhibitors，NAIs），近年来，也不断有针对它们的耐药毒株被报道。因此，开发新的抗流感病毒药物迫在眉睫。本研究以A/PuertoRico/8/1934（H1N1）（简称PR8）为模式病毒，从43种中药复合物中，筛选出对流感病毒神经氨酸酶（neuraminidase，NA）活性抑制明显的中药复合物，并通过体外实验验证其抗病毒效果，选取抑制效果最为明显的中药复合物，进一步验证其对其他亚型流感病毒的抑制效果。同时，本实验室在前期的研究中，通过体外、体内实验发现了药物黄连素具有明显的抗流感病毒效果，因此，本论文对黄连素的抗病毒作用进行了研究。本研究通过对流感病毒NAIs的筛选，为实验室下一步开发出对流感病毒具有高度敏感性的、能与黄连素联合使用的、多靶点作用的药物奠定了基础。主要研究内容和结果如下：1筛选出对流感病毒NA活性有明显抑制作用的中药复合物中药复合物以100mg/mL浓度为起始，进行10倍倍比稀释至0.1mg/mL，与PR8流感病毒在37℃温箱中孵育45min后，加入底物孵育1h后，终止反应，检测荧光值，计算NA活性抑制率。通过NA活性抑制实验，从43份中药复合物中，筛选出6种NA活性抑制明显的中药复合物，分别为A3、D1、G3、H5、X4、S7，其在1mg/mL时，NA活性抑制率仍在30%以上。2检测所筛选出的中药复合物的细胞毒性将所筛选出的6种中药复合物，以1mg/mL为初始浓度，进行2倍倍比稀释，显微镜下观察细胞状态，定性判断其细胞毒性后，进一步用CCK-8试剂盒，定量检测细胞活性。中药复合物G3、S7的浓度在1000µg/mL及以下、X4的浓度在500µg/mL及以下、以及D1、H5的浓度在250µg/mL及以下时，眼观均未见明显的细胞病变，而且细胞存活率均在90%以上，本研究选取中药复合物的相应浓度，进行体外抗流感病毒效果验证。A3细胞毒性太大，不进行细胞上的抗流感病毒效果验证。3体外实验验证中药复合物的抗流感病毒效果PR8流感病毒感染MDCK细胞后，相应浓度的中药复合物孵育细胞，24h后，通过血凝（HA）实验、TCID50（50%tissuecultureinfectivedose）实验检测流感病i 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文毒的病毒滴度，发现中药复合物X4对PR8流感病毒的抑制效果最为明显，其浓度在500µg/mL、250µg/mL及125µg/mL时，都有明显的抑制效果，D1、H5浓度在250µg/mL时，G3浓度在1000µg/mL时，都对PR8流感病毒有很好的抑制作用，而S7浓度在1000µg/mL及以下时，对PR8流感病毒没有作用。因此，选取最有抑制效果的中药复合物X4，进一步验证其对其他亚型流感病毒的抑制效果。4中药复合物X4对其他亚型流感病毒的抑制效果选取H1N1猪流感病毒（A/swine/Hubei/221/2016(H1N1)，简称221）和H9N2禽流感病毒（A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)，简称W1），病毒感染MDCK细胞后，加入相应浓度的中药复合物X4，24h后，通过测定细胞上清中流感病毒的NA活性抑制率、血凝价和TCID50，验证其对其他亚型流感病毒的抑制效果。结果表明，X4的浓度在500µg/mL时，对上述2种亚型流感病毒都有很好的抑制效果，其浓度在250µg/mL时，对221（H1N1）流感病毒仍有很好的抑制效果，提示X4可能具有成为广谱抗流感病毒药物的潜力。5黄连素抗流感病毒作用研究通过检测流感病毒聚合酶活性和组装情况，发现黄连素抑制了流感病毒聚合酶的活性和组装；Westernblot检测MAPKs及mTOR通路中的重要信号分子的活化水平，发现黄连素抑制了MAPKs通路，激活了mTOR通路；MAPKs通路的抑制剂和黄连素作用于PR8流感病毒感染的细胞，通过TCID50实验检测病毒滴度，Westernblot检测流感病毒NP蛋白水平，相对实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qRT-PCR）检测流感病毒NP的cRNA和mRNA水平，发现黄连素通过抑制MAPKs通路，抑制了流感病毒的复制和转录，从而抑制了流感病毒的增殖；感染了PR8流感病毒的细胞，用相对荧光定量检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、CCL5、IFN-β的mRNA水平，Westernblot检测pro-IL-1β、p65及p-p65蛋白水平，发现黄连素抑制了流感病毒诱导的细胞因子的产生。综上所述，通过NA活性抑制实验和体外细胞上抗流感病毒效果验证，本研究从43种中药复合物中，筛选出了6种NA活性抑制效果明显的中药复合物，其中中药复合物X4有成为理想的NAIs的潜力，同时，本研究发现黄连素通过抑制流感病毒聚合酶的活性和组装来抑制流感病毒的复制和转录，它还可以通过抑制MAPKs通路，来发挥抗流感病毒作用。中药复合物X4及X4与黄连素联用时的抗流感病毒效果，本实验室后期将在小鼠体内进行进一步验证。关键词：流感病毒；中药复合物；NAIs；黄连素；抗病毒ⅱ 抗流感病毒中药的筛选AbstractInfluenzadiseaseisahighlycontagiousacuterespiratoryzoonosiswhichiscausedbyinfluenzavirusbeingabbreviatedasIV.IVcauseshugeeconomiclossestothebreedingindustryandatthesametimethreatenshumanbeing’shealthheavily.Therefore,peoplehavebeenseekingeffectivepreventionandtreatmentmeasures.IVwhosegenomeissegmentedbelongstoOrthomyxoviridaefamily.Therearemanyvariationsinsubtypes,soitisdifficulttoachievetheexpectedeffectwithvaccineprevention.Therearetwotypesofanti-IVdrugscirculatingonthemarket:M2ionchannelinhibitorsandneuraminidaseinhibitors(NAIs).Inrecentyears,therehavebeenmanyreportsofdrug-resistantstrainsagainstthem.Takentogether,itisurgenttodevelopnovelanti-IVdrugs.Inthisstudy,influenzavirusA/PuertoRico/8/34(H1N1)beingsimplifiedasPR8wasusedasamodelvirus.Wescreeneddrugswhichhadremarkableinhibitionsonneuraminidase(NA)activityofIVfrom43traditionalChinesemedicine(TCM)compounds.Furthermore,theirantiviraleffectswereverifiedonMDCKcells.Inthenextstep,weverifiedtheanti-IVeffectsonothersubtypesbychoosingthemosteffectiveTCMcompound.Meanwhileourpreviousstudiesfoundthatberberinehadobviousanti-IVeffectsthroughinvitroandinvivoexperiments;hencewehadstudiedtheantiviraleffectsofberberineinthisstudy.ThroughthescreeningofNAIsofIV,thisstudylaysthefoundationforthedevelopmentofhighlysensitiveandmulti-targetdrugscombinatedwithberberineefficientlyforIV.Themainresearchcontentsandresultsareasfollows:1ScreeningofTCMcompoundswithsignificantlyinhibitoryeffectsonNAactivityofIVTheconcentrationsofTCMcompoundswerediluted10-foldto0.1mg/mLfrom100mg/mL.AfterincubationwiththePR8influenzavirusinaincubatorat37°Cfor45min,thesubstratewasaddedandincubatedfor1handthenstoppedthereaction.Afterthat,thefluorescencevaluewasmeasured.BycalculatingtheinhibitionratesofNAactivity,weselected6compoundsfrom43TCMcompounds.TheinhibitionratesofNAactivityoftheselectedcompoundswerestillabove30%at1mg/mL.TheywereA3,D1,G3,H5,X4,andS7.iii 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2DetectingcytotoxicityofselectedTCMcompoundsTheselected6TCMcompoundswerediluted2-foldfrom1mg/mL.Thestateofthecellswasobservedunderamicroscope,andthecytotoxicityoftheTCMcompoundswasqualitativelyjudgedbyusingtheCCK-8kit.Undertheconcentrationof1000μg/mLofG3andS7,andundertheconcentrationof500μg/mLofX4,andundertheconcentrationof250μg/mLofD1,H5,noobviouscelllesionswereobservedandthecellviabilityrateswereabove90%.Inthisstudy,thecorrespondingconcentrationsoftheTCMcompoundswereselectedtoverifytheeffectofanti-IVinvitro.Becauseofhighcytotoxicity,A3wasnotusedoncellstoverifytheanti-IVeffects.3Invitroexperimentsverifytheanti-IVeffectsofTCMcompoundsMDCKcellswereinfectedwithPR8influenzavirus,andthentheywereincubatedwithcorrespondingconcentrationsofTCMcompounds.After24hours,virustitersweredeterminedbyhemagglutinin(HA)testandTCID50assay.ItwasfoundthatTCMcompoundX4hadthemostnotableinhibitoryeffectonPR8influenzavirus,andconcentrationsof500μg/mLand250μg/mLand125μg/mLwerebotheffective.Concentrationof250μg/mLofD1andH5andconcentrationof1000μg/mLofG3,itshowedthattheybothhadgoodinhibitoryeffectsonPR8influenzavirus.Concentrationsof1000μg/mLorbelowofS7,theydidn’tshowtheinhibitoryeffectsonPR8influenzavirusneither.Therefore,TCMX4withmostinhibitoryeffectwasselected,makingfurthervalidationofitsinhibitingeffectonothersubtypesofIV.4Theanti-IVeffectsonothersubtypesofTCMX4WeselectedtwosubtypesofIV,includingH1N1influenzavirus(A/swine/Hubei/221/2016(H1N1),simplifiedas221)andH9N2influenzavirus(A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2),simplifiedasW1).MDCKcellswereinfectedwitheachsubtypeofIVrespectively,andthentheywereincubatedwithcorrespondingconcentrationsofTCMX4.After24hours,virustitersincellsupernatantweredeterminedbyNAactivitytestandhemagglutinin(HA)testandTCID50assay,makingthevalidationofTCMX4’sinhibitingeffectonothersubtypesofIV.TheresultsshowedthattheTCMX4withtheconcentrationof500μg/mLhadagoodinhibitioneffectontheabovetwosubtypesofIV.MeanwhileTCMX4withtheconcentrationof250μg/mLstillhadagoodinhibitioneffecton221influenzavirus.ItpromptthatTCMX4mayhasthepotentialofdevelopingabroad-spectrumanti-IVdrug.ⅳ 抗流感病毒中药的筛选5Studyonanti-IVeffectsofberberineBydetectingtheactivityandassemblyofviralpolymerases,itwasfoundthatberberineaffectedbothofthem.TheactivationlevelsofimportantsignalingmoleculesintheMAPKsandmTORsignalingpathwaysweredetectedbyWesternblot,andtheresultsshowedthatberberineinhibitedtheMAPKspathwaysandactivatedmTORpathway.AddinginhibitorsofMAPKspathwaysandberberinerespectivelyinPR8-culturedA549cells,thevirustitersweremeasuredbyTCID50assay,andtheproteinlevelofviralNPwasdetectedbyWesternblot,andthecRNAandmRNAlevelsofviralNPgeneweredeterminedbyrelativequantitativereal-timePCR(qRT-PCR)test,andtheresultsshowedthatberberineattenuatedthereplicationandtranscriptionofIVbyinhibitingMAPKspathways,thusreducingtheproliferationofIV.AddingberberineinPR8-culturedcells,after24hours,themRNAlevelsofcytokinesweremeasuredbyrelativeqRT-PCR.Expressionsofdetectedcytokinegeneswerealldown-regulatedtoasignificantlylowerlevelincludinginterleukin(IL)-1beta,IL-6,IL-8,tumournecrosisfactor(TNF)-alpha,chemokine(C-Cmotif)ligand5(CCL5)andinterferon(IFN)-beta.Simultaneouslytheproteinlevelsofpro-IL-1beta,p65andp-p65weredeterminedbyWesternblot.TheresultsshowedthatberberinedecreasedtheproductionofcytokinesinducedbyPR8influenzavirus.Inconclusion,throughtheNAactivityinhibitionassayandtheverificationoftheantiviraleffectsoncellsinvitro,thisstudyscreened6TCMcompoundswithmarkedinhibitoryeffectsonNAactivityfrom43TCMcompounds,inwhichtheTCMcompoundX4hadpotentialtobecomeidealNAIs.Inaddition,thisstudyfoundthatberberineattenuatedviraltranscriptionandreplicationofIVbyweakeningtheactivityandassemblyofpolymerases.Moreover,itcouldalsoexertantiviraleffectsbyinhibitingMAPKssignalpathway.Weprobablywillverifytheanti-IVeffectsofX4andthecombinationofX4withberberineinmiceinfurther.Keywords:Influenzavirus;TCMcompounds;NAIs;Berberine;Antiviralv 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文缩略语表（Abbreviation）英文简写英文全称中文全称及注释4-MU4-methylumbelliferone4-甲基伞形酮2′-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuramin4-MUNANA4-甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸-icacidsodiumsalthydrateA549humanlungcancercellline人肺癌细胞系AMPK5'AMP-activatedproteinkinase腺苷酸活化蛋白激酶AMVavianmyeloblastosisvirus禽类成髓细胞性白血病病毒BSAbullserumalbumin牛血清蛋白CCK-8cellcountkit-8细胞计数试剂盒chemokine(C-Cmotif)ligand5/趋化因子（C-C基元）配体5/CCL5/regulatedonactivation,normalTcellexpressed调节激活正常T-细胞表达分泌因RANTESandsecreted子CKcontrolcheck空白对照CVB3CoxsackievirusB3B3型柯萨奇病毒DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜ERKextracellularsignalregulatedkinase细胞外信号调节激酶FBSfetalbovineserum胎牛血清FDAFoodandDrugAdministration美国食品药品监督管理局FIfluorescenceintensity荧光强度HAhemagglutinin血凝素蛋白HMGB1highmobilitygroupbox1protein人高迁移率族蛋白B1Hpihourpostinfection感染后小时IC5050%inhibitoryconcentration半数抑制浓度IFNinterferon干扰素ISG15IFN-stimulatedgene15干扰素刺激基因15ILinterleukins白介素IPimmunoprecipitation免疫沉淀transcriptionalactivityofIFN-stimulatedISRE顺式激活干扰素刺激反应元件responseelementIVinfluenzavirus流感病毒JNKc-JunN-terminalkinasec-Jun氨基末端激酶ⅵ 抗流感病毒中药的筛选Mmatrixprotein基质蛋白MAPKmitogenactivatedproteinkinases丝裂原活化蛋白激酶MAVSmitochondriaantiviralsignalingprotein线粒体抗病毒信号蛋白MDCKMadin-Darbycaniekidneycells犬肾细胞丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信MEK1/2MAPKandERKkinase1/2号调节激酶激酶1/2MES2-(N-morpholino)-ethanesulfonicacid2-（N-吗啉代）乙磺酸mTORmammaliantargetofrapamycin哺乳动物雷帕霉素靶蛋白Mx2myxovirus(influenzavirus)resistance2黏液病毒（流感病毒）抵抗蛋白2NAneuraminidase神经氨酸酶NAIsneuraminidaseinhibitions神经氨酸酶抑制剂NCnitrocellulosefiltermembrane硝酸纤维素膜NKnaturalkillercell自然杀伤细胞NLSsnuclearlocalizationsignals核定位信号NPnucleoprotein核蛋白ODopticaldensity光密度p-p65phosphorylatedp65磷酸化p65PApolymeraseacid酸性聚合酶PB1/2polymerasebase1/2碱性聚合酶1/2PGE2prostaglandinE2前列腺素E2PI3Kphosphatidylinositol-3-kinases磷脂酰肌醇-3-激酶PKRproteinkinaseR蛋白激酶RqRT-PCRquantitativereal-timePCR实时荧光定量PCRRNaseLribonucleaseL核糖核酸内切酶LSDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SPFspecificpathogen-free无特定病原体的TBSTTris-buffered-salinewithTween含Tween的Tris缓冲盐体系TCID5050%Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量TCMtraditionalChinesemedicine传统中药TNFαtumournecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子阿尔法TPCKtolylsulfonylphenylalanylchloromethylketone甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮Tristri(Hydroxymethyl)aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷vRNPsvirusribonucleoprotaincomplex病毒的核糖核蛋白复合物vii 抗流感病毒中药的筛选1前言1.1研究问题的由来流感病毒是感染人的主要病原，能导致季节性的流行甚至全球性的大流行（Nguyenetal2012），它同时还能感染禽类及其他动物，给人类的健康和全球经济造成巨大的损害。流感病毒众多的型及亚型，以及因为抗原飘移和抗原转变，而导致的流感病毒抗原的高度变异性，使得常规流感疫苗不能有效地阻止其传播、并防控流感的爆发性流行（刘艾林等2009，Barik2012）。因此，对于流感，主要依赖于药物预防与治疗（Wangetal2006）。而早就有研究报道，流感病毒株的耐药性已经十分普遍（Haugeetal2009），并且耐药率还在不断升高（Abdel-Mageedetal2014，Belardoetal2015，StevaertandNaesens2016）。因此，本实验室致力于找到一种新型的抗流感病毒的药物，为流感病毒的预防和治疗提供新视野。1.2文献综述1.2.1流感病毒简介1.2.1.1流感病毒的分类与结构流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属，为分节段的单股负链RNA的包膜病毒（CoxandSubbarao1999）。根据流感病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）和基质蛋白1（matrix1，M1）不同的抗原性，流感病毒分为4型，A（甲）、B（乙）、C（丙）型（邹积振等2017，Hauseetal2013），以及2011年从猪体内分离到的（Chiapponietal2016）、跟C型基因组具有50%相似性的D（丁）型（Hauseetal2013）。A型流感病毒（influenzaAvirus，IAV）根据其表面不同的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶，分为18种HA亚型和11种NA亚型（邹积振等2017，Wuetal2014，Yangetal2018）。A型流感病毒粒子一般呈球形，由包膜（双层囊膜）、基质蛋白和核心三部分组成（于淼2016，BouvierandPalese2008）。包膜的主要来源是流感病毒所感染宿主细胞的细胞膜，A型流感病毒包膜上镶嵌有3种跨膜蛋白，HA、NA和基质蛋白2（matrix2，M2），包膜上突出的HA、NA通常也被称为刺突。HA所占膜蛋白比重最大，约为NA的4倍（Bouvieretal2008），M2最少。流感病毒的M1蛋白位于包膜下方，是构成病毒骨架的基本结构，连同包膜一起，作为外部结构保护着病毒内部的核心组分，即包裹着病毒基因组的病毒核糖核蛋白（viralribonucleoproteins，1 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文vRNPs）。分节段基因组的每一个节段，在其一端均连着自己的聚合酶复合体（polymerasebasicprotein1/2，PB1/PB2及polymeraseacidicprotein，PA），其余部分均被NP包裹着形成vRNP，所有基因组节段共同组成vRNPs（Baudinetal1994，Bouvieretal2008）。1.2.1.2流感病毒的复制流感病毒的复制过程，与其他病毒的复制过程基本上是相似的，都可以概括为吸附、融合、脱壳、组装和释放这5个阶段，只要影响病毒复制过程中的任一阶段，就能影响病毒的复制。而NA在流感病毒的释放阶段发挥着重要的作用（Matrosovichetal2004），抗流感病毒药物以NA为靶点进行筛选就是基于这样的原理。流感病毒的复制，首先NA水解黏液层内黏膜蛋白中的神经氨酸残基，使其黏度降低，从而让病毒穿透黏液层到达易感上皮细胞表面（Alameetal2016），这一过程一般发生在人类的鼻、咽喉和肺以及禽类的肠内（田莉2011，Coxetal1999，Steinhauer1999）。然后HA去掉信号肽，形成无活性的前体HA0，HA0被切割形成HA1和HA2（Steinhauer1999），HA1上的受体结合区与宿主细胞表面的唾液酸受体结合，使流感病毒吸附到宿主细胞上。之后，病毒粒子经过受体－配体介导的内吞（endocytosis）过程侵入宿主细胞，形成内体。内体与酸性溶酶体发生作用，当内体环境中的pH改变至5以下呈酸性时，HA2就会改变构象，其位于N端的融合肽游离出来，插入内体膜中，使内体膜与流感病毒囊膜发生融合，M2跨膜蛋白型离子通道开放，氢离子进入，流感病毒的内核发生酸化；vRNPs从病毒的M1蛋白上释放下来，进入到细胞质中（Bouvieretal2008，Wuetal2014），之后病毒的RNPs通过病毒蛋白的核定位信号（nuclearlocalizationsignals，NLSs）进入宿主细胞核内（CrosandPalese2003，Bouvieretal2008）。此时，病毒复制的前3个步骤，吸附、融合、脱壳已全部完成。流感病毒基因组是负链RNA，转录时病毒以宿主细胞内的RNA聚合酶Ⅱ合成的前体mRNA提供的5’帽子结构为引物（Amorimetal2007，Kowalinskietal2012），以vRNA为模板，用自身的聚合酶复合体PA、PB1、PB2，催化转录生成的cRNA和mRNA，分别为合成子代病毒RNA和翻译产生蛋白质的模板。在胞质核糖体中合成的PA、PB1、PB2和NP转移至细胞核，与新合成的子代病毒RNA组装成vRNPs，同流感病毒其余的3种蛋白M2、HA和NA一起被运送至宿主细胞膜上，并装配成为子代病毒（于淼2016，Bouvieretal2008）。2 抗流感病毒中药的筛选成熟的子代病毒粒子以出芽的方式从宿主细胞内释放出来，NA裂解存在于宿主细胞表面或病毒囊膜表面的唾液酸残基，使成熟的子代流感病毒与宿主细胞表面脱离，同时阻止病毒本身的聚集，开始下一步周而复始的感染和复制过程。1.2.1.3流感病毒对宿主细胞的影响流感病毒作为一个外界刺激，它能诱导机体产生一系列反应。流感病毒能激活宿主细胞内的MAPK（mitogenactivatedproteinkinases，丝裂原活化蛋白激酶）通路（Leeetal2005），如A/X-31H3N2流感病毒在感染鼠巨噬细胞系的早期能激活MAPK通路（Cannonetal2014）。ERK（extracellularsignalregulatedkinase，细胞外信号调节激酶），JNK（c-JunN-terminalkinase，c-Jun氨基末端激酶），p38是MAPK家族的3个亚族。MAPK通路通过3级激酶级联反应被激活，MEK1/2（MAPKandERKkinase1/2，丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶激酶1/2）是ERK的上游激酶。ERK/MAPK通路参与细胞的增殖、分化与生长；P-38/MAPK通路调节细胞因子的产生及凋亡；JNK/MAPK通路调节细胞的凋亡、分化、增殖以及炎症反应。细胞内其他的一些信号分子也能对MAPK通路进行调节，比如，AKT可以抑制ERK/MAPK和JNK/MAPK通路。流感病毒能调节宿主细胞mTOR（mammaliantargetofrapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）通路。PI3K/AKT/mTOR能抑制细胞凋亡，调节细胞的增殖，在肿瘤细胞中高度活化。A型流感病毒H5N1能通过抑制mTOR通路，促进细胞自噬导致的细胞死亡（Maetal2011）。流感病毒能诱导宿主细胞产生细胞因子。如1997年感染H5N1流感病毒的病人，就能够在血清中检测到高浓度的趋化因子（Peirisetal2004）；H9N2流感病毒也可以上调促炎因子和趋化因子的产生（Farzinetal2016）。细胞因子可以由NF-κB通路、JNK通路、p38通路转录产生，其种类有很多，有趋化因子，比如CCL5（chemokine(C-Cmotif)ligand5，趋化因子（C-C基元）配体5）；白细胞介素（interleukins，IL），如IL-1β、IL-6是促炎因子，IL-8具有趋化作用；干扰素（interferons，IFN），如IFN-β，能抑制病毒的增殖；肿瘤坏死因子（tumournecrosisfactors，TNF），如TNF-α，能加强机体的炎症反应。1.2.2神经氨酸酶研究进展1.2.2.1神经氨酸酶结构A型流感病毒NA的11种亚型，用系统发育树可以将其分为3类，第一类包括N1、N4、N5、N8，第二类包括N2、N3、N6、N7、N9，N10和N11属于第三类（Wu3 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文etal2014）。NA蘑菇状的头部是由一个同源四聚体组成的，每一个单体都由6个完全相同的β折叠螺旋着组成（Vargheseetal1983，Bouvieretal2008）。NA与底物直接接触的催化位点（9个氨基酸残基）以及支撑着催化位点结构的11个氨基酸残基，从N1到N9，都是高度保守的。这为寻找到广谱的抗流感药物提供了理论基础。通过X射线晶体成像技术，发现第一类NA的活性位点旁边有一个凹槽，以供配体结合（Russelletal2006）。这一结构特点不仅增加了筛选到有效药物的可能性，而且使基于NA结构的计算机虚拟筛选成为了现实（Liuetal2005），极大提高了高通量筛选药物的效率。1.2.2.2神经氨酸酶生物学功能流感病毒NA通过水解黏液层多糖上的唾液酸残基，使流感病毒可以轻易穿透黏液层到达易感细胞的表面（Alameetal2016）；NA也在流感病毒与细胞结合过程中发挥作用，H5N1流感病毒的N1，其Arg152，Arg156，Glu276，Glu277和Arg292残基在病毒与细胞结合中发挥着比H5更大的作用（Yangetal2013）；NA可以水解已被感染细胞表面多糖结构上的神经氨酸（唾液酸）基团，使得子代流感病毒从宿主细胞内出芽时，能从宿主细胞表面释放；NA还能水解病毒粒子表面的唾液酸残基，阻止病毒的聚集，使得流感病毒能从宿主细胞扩散到周围未被感染的正常细胞（Wuetal2014）；有研究表明，NA不仅在病毒出芽阶段起作用，而且能通过水解NK（naturalkillercell，自然杀伤细胞）细胞表面的唾液酸，使NK细胞表面的NKp46受体不能识别HA，从而介导流感病毒的免疫逃避（Bar-Onetal2013）；NA的大范围缺失会使流感病毒在宿主体内感染性大幅下降，缺失237个氨基酸的H3N2（LRVp9）流感病毒与野生型相比，体内病毒vRNA的拷贝数减少了一个lg（Annetal2016）。1.2.3神经氨酸酶抑制剂研究进展NA在流感病毒的感染、复制和扩散过程中起着十分关键的作用，许多针对NA活性的抑制剂（NAIs）都能有效地阻止流感病毒复制，而且NAIs对流感病毒A、B型都能起作用，不容易产生耐药性，因此在实验室所筛选到NAIs很有希望成为新的抗流感病毒药物（Yietal2003）。对于流感病毒的NAIs的筛选，一直是研究热点。2014年12月，帕拉米韦（peramivir）作为一种新型的NAIs，被FDA（FoodandDrugAdministration，美国食品药品监督管理局）批准上市。在这之前，只有奥司他韦（oseltamivir）和扎那米韦（zanamivir）两种NAIs在美国市场上流通。此3种药物虽然有很好的抗流感病毒效果，但是都有一定的副反应。比如帕拉米韦会导致中4 抗流感病毒中药的筛选性粒细胞减少、胃肠道功能紊乱（Alameetal2016），奥斯他韦会导致恶心、呕吐、腹泻、腹痛、头痛还有神经精神病症状，比如自残和精神错乱（Barik2012）。而且，因为流感病毒NA基因的突变，针对上述药物的耐药毒株正在不断增加（Abedetal2009，Choetal2013）。因此，科研工作者一直在寻求更加安全和有效的NAIs。利用分子对接、分子动力学模拟等计算机技术，进行针对性的设计、合成有潜力的NA活性抑制的化合物，在体外实验能得到很好的抗流感病毒效果（Wangetal2017），这也许是未来寻找新药的趋势（Changetal2011）。NAIs的抑制剂也可以从传统中药中筛选。玉屏风散，由黄芪、白术、防风煎熬而成的中药制剂，在培养的上皮细胞上，能通过抑制A型流感病毒的NA活性，阻止病毒的释放和扩散（Duetal2015）；从乌拉尔甘草根部提取出的多酚类化合物，也能抑制NA活性（Ryuetal2010）；牡丹属紫牡丹的乙酸乙酯和乙醇提取物均明显抑制流感病毒的NA活性（Lietal2016）；大豆异黄酮和色原酮，对NA的活性也有明显的抑制作用（Duetal2015）；蛇莓、枫香树、紫草、苦楝皮这4种中药都对流感病毒的NA活性表现出很强的抑制，均可以减少A型流感病毒感染细胞所导致的细胞病变（Tianetal2011）；黄连解毒汤中的有效成分被证明对H1N1流感病毒的NA活性有明显的抑制效果（Zhouetal2017）；从荞麦属的金荞麦中提取出的芦丁、橘皮苷、原花青素B2和槲皮苷，都对流感病毒的NA活性有很好的抑制作用（Zhangetal2017）；红花黄素A通过与NA非活化位点结合，对流感病毒N1、N2两个亚型的NA活性均有抑制作用（Yuetal2015）；从山葡萄中提取出的8种化合物能通过非竞争性抑制作用于流感病毒NA，具有显著的抗流感病毒效果（Nguyenetal2011）。1.2.4中药抗流感病毒研究进展中药被用来治疗流感已经有几千年的历史，具有资源丰富、价格低廉的优点，同时，现今对流感病毒的防控出现了一系列问题，包括流感病毒耐药性日益严重，不断出现病毒突变株以及毒力更强的毒株（Barik2012），加上可用药物成本昂贵，疫苗开发之间的时间滞后（Aroraetal2011），广大的科研工作者因此把目光更多地放到了中药及其有效成分抗流感病毒的研究上。1.2.4.1中药间接抗流感病毒中药通过调节宿主细胞内的生理生化反应或（和）免疫反应，实现对流感病毒增殖的间接抑制。5 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文黄酮类化合物，可以从蒲公英和接骨木果当中提取，通过激活宿主细胞内的天然免疫，发挥抗流感病毒的作用（Dongetal2014）。草珊瑚，中药里的一种退热解毒药，在提高机体防御系统的同时，通过下调NF-κB通路抑制炎症因子的产生，减少流感病毒感染造成的肺部损伤（Caoetal2012）。柴胡提取物，低剂量时通过显著性下调趋化因子RANTES（regulatedonactivationnormalTcellexpressedandsecreted，调节激活正常T-细胞表达分泌因子）的分泌，抑制流感病毒感染导致的细胞病变（Suetal2011）。连翘苷是中药里的一种经典的抗流感药物，它通过调节MAVS（mitochondriaantiviralsignalingprotein，线粒体抗病毒信号蛋白）介导的抗病毒信号通路，以及通过下调NF-κB通路抑制炎症反应，降低宿主细胞对流感病毒的易感性（Chenetal2017）。大青叶，可以通过调节宿主细胞内的代谢途径，参与调控细胞内的信号通路，发挥抗流感病毒作用（Chenetal2013）。当归和丹参可以通过抑制新型炎症因子HMGB1（highmobilitygroupbox1protein，人高迁移率族蛋白B1）的产生，对因感染H5N1流感病毒，而产生大量促炎因子的小鼠起到保护作用（Allevaetal2010）。穿心莲中的主要成分，穿心莲内酯能降低H5N1流感病毒在小鼠肺部的病毒载量，也能抑制病毒诱导产生的IL-6、IL-8等促炎因子，减轻机体的损伤，具有良好的临床应用前景（Caietal2016）。1.2.4.2中药直接抗流感病毒中药与流感病毒的重要蛋白或（和）参与复制的宿主因子作用，直接影响病毒的复制周期，抑制其增殖，发挥抗流感病毒作用。木番荔枝碱、迷迭香碱通过与HA与唾液酸受体结合的位点结合，阻止流感病毒进入宿主细胞，发挥抗流感病毒作用（Changetal2011）。山荷叶素，通过抑制空泡ATP酶的活性，阻止内吞体酸化，使病毒粒子无法进行脱壳这一步骤，从而抑制流感病毒的增殖（Chenetal2013），但是它的治疗窗窄，很容易产生毒性作用，会产生恶心、腹泻、心率加速等副反应。石榴的多酚提取物安石榴苷能抑制H3N2流感病毒vRNA的复制，抑制流感病毒导致的红细胞凝集，具有抗病毒作用（Haidarietal2009）。蒲公英的水提取物，能抑制流感病毒聚合酶的活性，降低流感病毒NP的mRNA水平，抑制流感病毒的增殖（Heetal2011）。6 抗流感病毒中药的筛选银翘散中的银翘酯苷通过减少流感病毒复制过程中M1蛋白的产生，干扰新生子代病毒粒子的出芽，从而抑制流感病毒的复制（Lawetal2017）。中药成分对流感病毒NA活性的抑制在前文（1.2.3神经氨酸酶抑制剂研究进展）有详细介绍。1.2.4.3中药综合抗流感病毒中药还可以同时对宿主和病毒作用，既能调节宿主的免疫反应或（和）生理生化反应，又能直接抑制流感病毒的重要蛋白或（和）参与其复制的宿主因子，综合发挥抗流感病毒作用。中药制剂玉屏风散，主要成分有黄芪、白术、防风，在临床上用于物理性感冒和病毒性流感。它可以通过调节炎症反应和吞噬能力，发挥抗病毒作用；也可以促进编码如下抗病毒蛋白基因的mRNA的表达，包括编码RNaseL（ribonucleaseL，核糖核酸内切酶L）、编码Mx2（myxovirus(influenzavirus)resistance2，黏液病毒（流感病毒）抵抗蛋白2）、编码PKR（proteinkinaseR，蛋白激酶R）和ISG15（IFN-stimulatedgene15，干扰素刺激基因15）的mRNA，同时可以上调位于抗病毒蛋白基因上游的ISRE（transcriptionalactivityofIFN-stimulatedresponseelement，顺式激活干扰素刺激反应元件）的转录活性；还可以抑制A型流感病毒的NA活性，发挥抗病毒作用（Duetal2015）。1.2.5黄连素简介黄连素（berberine，BBR）又称盐酸小檗碱，或小檗碱，可以从毛茛科植物黄连、芸香科植物黄檗的干燥根茎中提取到，是一种天然的异喹啉类植物性生物碱（Kuoetal2004，Lietal2017），属于季胺类化合物。黄连素具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗癌、抗氧化、抑菌、降脂、降糖等（左茹等2014，Lietal2017），同时黄连素在抗心律失常、抗高血压、促子宫收缩等方面还具有显著的作用。在中药里黄连素常被用来治疗胃肠道感染性疾病，比如腹泻、痢疾等。在传统中草药配方如二仙汤中含有的黄连素，通过抑制NF-κB和AKT的活化抑制破骨细胞的形成和活性，进而抑制骨质疏松症（张瑞2017）。黄连素通过诱导肿瘤细胞内的活性氧（ROS）水平升高，促进肿瘤细胞的凋亡（郎超2017）。黄连素在甲状腺癌细胞中，能显著性下调磷酸化AKT1的表达，通过干扰PI3K-AKT和MAPK信号通路，诱导线粒体的凋亡，阻断细胞的G0/G1分裂周期，抑制细胞的增殖和迁移（Lietal2017）。黄连素还具有神经保护功能，通过上调脑源性神经营养7 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文因子和磷酸化AKT的表达，减少纹状体的凋亡，减轻大脑的缺血性损伤（Yangetal2018）。黄连素具有广泛的生物活性，在真菌、细菌、寄生虫、病毒感染时均能发挥作用（Orhanetal2007，Weietal2013）。黄连素在病毒复制阶段能有广谱的抗病毒效果，它能通过降低JNK和p38的磷酸化水平，抑制MAPK通路，减轻B3型柯萨奇病毒感染所导致的心肌炎症状（Daietal2017）。也有报道称，它对流感病毒有很好的抑制效果（Zhouetal2017），它作用于蛋白质的翻译后期，通过抑制流感病毒蛋白的转运和成熟，抑制流感病毒的复制，同时，它在小鼠腹腔巨噬细胞系（RAW264.7）中，能抑制流感病毒诱导产生的TNF-α和PGE2（Ceciletal2011）。体内实验表明，黄连素还可以将感染流感病毒的小鼠的存活率提高35%（Wuetal2011）。1.3研究的目的与意义本实验室通过筛选抑制流感病毒NA活性的中药，以及体外实验中对其进行抗流感病毒效果的验证，筛选出其他抗流感病毒药物。同时，本实验室前期通过中药对流感病毒聚合酶活性影响的筛选，发现黄连素具有很好的抗流感病毒效果，因此本论文继续对它的抗病毒作用进行了研究。本研究为开发出一种更加有效的、多靶点同时作用的、可以和黄连素联合用药的新型抗流感病毒药物奠定了基础。8 抗流感病毒中药的筛选2实验材料与方法2.1实验材料2.1.1毒株、细胞及鸡胚H1N1流感病毒（A/PuertoRico/8/1934(H1N1)，简称PR8）、H1N1猪流感病毒（A/swine/Hubei/221/2016(H1N1)，简称221）、H9N2禽流感病毒（A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)，简称W1）均由本实验室分离、鉴定、保存。病毒在使用前经9日龄SPF鸡胚在37℃增殖，测定病毒血凝价后，分装，存于-20℃。人肺癌细胞（A549）、犬肾细胞（MDCK）均由本实验室保存，分别用含10%FBS（fetalbovineserum，胎牛血清）的F-12、DMEM在含5%CO2的37℃培养箱中培养。SPF鸡胚购自山东益吉达生物科技有限公司。2.1.2质粒pcDNA3.1+载体质粒、pcDNA-PA、pcDNA-PB1、pcDNA-PB2、pcDNA-NP、polI质粒、polI-Luc及RL-TK质粒均由本实验室保存。2.1.3抗体流感病毒兔抗NP（GTX125989）多克隆抗体，兔抗PA（GTX118991）多克隆抗体，兔抗PB1（GTX125923）多克隆抗体，及兔抗PB2（GTX125926）多克隆抗体均购自GeneTex（AltonPkwyIrvine，USA）。鼠抗HA（PMK003M）标签抗体，鼠二抗及兔二抗均购自PMK生物科技有限公司（中国武汉）。兔抗p38MAPK#14451单克隆抗体，兔抗p-p38MAPK#4092单克隆抗体、兔抗NF-κBp65#8242T单克隆抗体，及兔抗p-p65#3033T单克隆抗体均购自CellSignaling（Beverly，MA，USA）。鼠抗GAPDH（AC002）单克隆抗体，兔抗IL-1β（A11369）多克隆抗体，兔抗ERK（A13344）多克隆抗体，兔抗p-ERK（AP0472）多克隆抗体，兔抗JNK（A7724）多克隆抗体，兔抗p-JNK（AP0473）多克隆抗体，兔抗AKT（A7270）多克隆抗体，及兔抗p-AKT（AP0304）蛋白多克隆抗体均购自ABclonal（Boston，USA）。9 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.1.4抑制剂MEK1/2抑制剂U0126（ab120241），p38抑制剂SB203580（ab146589），及JNK抑制剂SP600125（ab120065）均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。2.1.5引物实验中用到的引物序列见表1、表2。表1反转录RNA所用引物序列Table1SequencesofprimersforreversetranscriptionRNA用途所检测RNA类型引物序列vRNAAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTC反转录cRNAAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTmRNATTTTTTTTTTTTTTTTTT表2相对实时荧光定量PCR所用引物序列Table2SequencesofprimersforrelativeqRT-PCR基因引物名称引物序列CCL5-FCCTCATTGCTACTGCCCTCTCCL5CCL5-RGGTGTGGTGTCCGAGGAATAIL-1β-FGCAACTGTTCCTGAACTCAACTIL-1βIL-1β-RATCTTTTGGGGTCCGTCAACTIL-6-FAGGAGACTTGCCTGGTGAAAIL-6IL-6-RCAGGGGTGGTTATTGCATCTIL-8-FTTGGCAGCCTTCCTGATTTCIL-8IL-8-RTCTTTAGCACTCCTTGGCAAAACIFN-β-FGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAIFN-βIFN-β-RATAGATGGTCAATGCGGCGTCTNF-α-FACGGCATGGATCTCAAAGACAACCTNF-αTNF-α-RTGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTNP-FGCGTTCAGCCCACTTTCTCGNPNP-RGGGTTCGTTGCCTTTTCGTCGAPDH-FTGCCAACGTGTCGGTTGTGAPDHGAPDH-RTGTCATCATATTTGGCAGGTTT10 抗流感病毒中药的筛选2.1.6主要药品的配制43份中药都配制为100mg/mL的储存液，用分析天平称取0.1000g中药复合物，加入1mL灭菌蒸馏水，80℃水浴加热溶解30min（每5min上下颠倒混匀1次），常温14000r/min离心5min，取上清分装，-20℃保存，用前用无血清的DMEM稀释成所需浓度。药物黄连素（标准品购自天津美伦生物公司）用二甲基亚砜（DMSO）配制为20mg/mL的储存液，临用前用无血清的F-12稀释成所需的浓度，即75μg/mL。奥司他韦（商品名：达菲/特敏福，Tamiflu）购自瑞士罗氏药业，每一粒胶囊中奥司他韦的有效含量为75mg。用DMSO配制为10mg/mL的储存液，4℃保存，临用前用无血清的DMEM稀释成1mg/mL，在细胞上所使用的浓度为20μg/mL。2.1.7主要试剂、酶及试剂盒胰蛋白胨、酵母粉及琼脂糖粉均购自生工生物工程有限公司；核酸分子量标准物购自大连宝生物工程公司；新生牛血清购自北京全式金生物技术有限公司；转染试剂lipofectamine2000、TRIzol购自美国Invitrogen公司；哺乳动物蛋白裂解液购自CWBIO北京康为生物科技有限公司；0.25%胰酶（EDTA）、青链霉素均购自吉诺生物医药有限公司；TPCK胰酶购自美国Sigma公司；脱氧核糖核苷酸酶DNaseI购自美国Ambion公司；氯仿（A.R）、异丙醇（A.R）、和无水乙醇（A.R）均购自国药集团化学试剂有限公司；无DNase/RNase去离子水（DNase/RNase-FreeDeionizedWater）购自北京天根生化科技有限公司；反转录酶AMV购自日本Takara公司；荧光定量染料SYBRGreenMaster购自德国Roche公司；Bradford蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒购自美国Promega公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；4-甲基伞形酮（4-MU）、2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）均购自东京化成工业株式会社TCL；4-甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸（MU-NANA）购自美国Sigma公司；11 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文无水CaCl2购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。2.1.8主要培养基及其配制DMEM、F-12购自美国HyClone公司；Opti-MEM购自美国Gibco公司；LB液体培养基：用普通电子天平，称取胰蛋白胨10.00g，酵母粉5.00g，NaCl5.00g，加入800mLddH2O，充分搅拌溶解，用5MNaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌15min，室温保存。2.1.9主要试剂和缓冲液的配制PBS配制：用普通电子天平，称取NaCll8.00g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.24g及KCl0.21g，溶于950mL三蒸水中，充分搅拌溶解，调节pH值到7.4，定容至1000mL，0.45μm滤膜过滤后，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存。50×TAE缓冲液：用普通电子天平，称取Tris242.00g及Na2EDTA·2H2O37.20g，加入800mL的去离子水，充分搅拌溶解，然后加入57.1mL的醋酸，充分混匀，再加去离子水定容至1000mL，室温保存。5×SDSproteinloading：用普通电子天平，称取溴酚蓝（BPB）0.25g，SDS5.00g，加入12.5mLTris-HCl（1M，pH6.8），待固体溶解后，加入25mL甘油，补水定容至50mL，室温保存。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：用普通电子天平，称取甘氨酸94.00g、Tris-base15.10g及SDS5.00g，加入约800mL的去离子水，充分溶解后，定容至1000mL，室温保存。转膜缓冲液：用普通电子天平，称取甘氨酸14.40g及Tris-base3.00g，加入约600mL去离子水，充分溶解后，定容至800mL，加入200mL甲醇，现配现用。10×TBST缓冲液：用普通电子天平，称取NaCl88.00g及Tris-base24.20g，加入800mL去离子水，充分溶解后，加入5mLTween-20及10mL浓盐酸充分混匀，定容至1000mL，室温保存。Westernblot所用封闭液：1%BSA，用普通电子天平，称取0.50gBSA溶解于50mLTBST中，现配现用。4-甲基伞形酮（4-MU）标准液：用分析天平，称取0.0004g4-MU粉剂,将其加入到适量乙醇中，充分搅拌溶解后加水至10mL，配制成浓度为200μM的溶液（配制过程避光操作），4℃保存。12 抗流感病毒中药的筛选NA活性抑制实验反应缓冲液：用分析天平，称取3.1725g2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）和0.2220gGaCl2，溶解于500mL蒸馏水中，用NaOH调节pH值到6.5，最终MES的浓度为32.5mM，GaCl2浓度为4mM，4℃保存。甲基伞形酮神经氨（糖）酸钠盐水合物（MU-NANA）底物配制：将棕色试剂瓶内的5mgMU-NANA溶解于100mL配制好的MES反应缓冲液中。即先用量筒量取100mLMES反应缓冲液，从量筒中吸取1mLMES反应缓冲液注入到棕色试剂瓶内，上下颠倒溶解底物后，吸取出液体至干净的容器内，此步骤重复5次后，将量筒内剩余的MES反应缓冲液倒入容器内，配制成储存浓度为100μM的溶液（配制过程避光操作），-20℃保存，使用时，稀释成工作浓度为20μM的试剂。NA活性抑制实验反应终止液：用分析天平，称取3.1725g甘氨酸，将其溶解于250mL乙醇（分析纯）中，加入去离子水250mL，用NaOH调节pH至10.7，4℃保存。阿氏液：用普通电子天平，称取2.05g葡萄糖、0.80g柠檬酸钠、0.06g柠檬酸和0.42g氯化钠加蒸馏水至100mL，溶解，过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min，室温保存。1%鸡红细胞悬液：采集至少三只2-6月龄的SPF公鸡或无流感病毒和流感病毒抗体的非免疫鸡的血液与等量的阿氏液混合，将混合液转移至15mL离心管中，加入4倍体积的PBS混匀，以1000r/min离心5min，去掉血浆和白细胞层，然后重复上述过程3遍，最后吸取红细胞沉淀，用PBS配制成1%（v/v）的红细胞悬液，4℃保存。2.1.10主要耗材及仪器设备细胞板、细胞冻存管、细胞离心管均购自美国Corning-Coster公司；pHSJ-4pH计购自上海精密科学仪器有限公司；电子分析天平购自Mettler-Toledo公司；摇床购自常州澳华仪器有限公司；Nanodrop核酸定量测定仪购自美国ThermoFisher公司；Biochmi凝胶成像系统购自美国UVP公司；点热恒温水浴锅购自江苏医疗器械厂；超净工作台购自北京哈东联仪器制造有限公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；InfiniteM200多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司；13 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ViiA7实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；核酸电泳系统、蛋白电泳系统和蛋白转膜仪购自美国Bio-Rad公司；EnVision多功能酶标仪购自美国PerkingElmer公司。2.2实验方法2.2.1无内毒素质粒提取及鉴定1）将PR8流感病毒聚合酶系统质粒及RL-TK质粒对应的菌液置于大瓶中培养。2）大瓶摇菌后，50mL离心管分装菌液，两两配平，4℃8000r/min离心10min。3）弃去上清，并用移液器尽可能吸尽残余液体，每管加2mLsolutionI（已加RNaseA）重悬菌体之后分装到2mL离心管中，每管500μL。4）每管再加500μLsolutionII，轻柔颠倒数次，直到上清清亮（准备：提前将BufferN3放置在冰上，冷冻离心机降温至4℃）。5）加入250μLBufferN3，轻柔地颠倒数次，至形成白色絮状物，4℃12000r/min离心10min。6）将上清转入新的1.5mLEP管中，4℃12000r/min离心5min，再次沉淀白色絮状物。7）将上清转入新的1.5mLEP管中，加入0.1倍体积的ETR，轻轻混勻后放置于冰上10min，每2min颠倒1次。混匀后溶液变浑浊，置冰上后变清亮（准备：HiBindTmDNAMini柱II中提前加入200μLBufferGPS浸润，静置时间大于5min，室温12000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体）。8）将加有ETR的EP管42℃水浴5min，此时溶液再次变浑浊，室温12000r/min离心3min，ETR溶液沉于管底。9）小心将上清转移到新的2mL的EP管中（切勿吸入蓝色ETR），加0.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温静置10min。10）转入浸润过的HiBindTmDNAMini柱II中，每次最多700μL，静置2min，室温12000r/min离心1min。11）弃去收集管中的液体，加入500μLBufferHB洗柱子，室温12000r/min离心1min。12）弃去收集管中的液体，加入700μLDNAwashbuffer（已加乙醇）洗柱子，室温12000r/min离心1min，重复一次。13）弃去收集管中的液体，室温12000r/min空柱离心2min。14）将柱子放入新的EP管中，置于50℃烘箱中5min，同时将Endotoxin-freeEB也放入烘箱。14 抗流感病毒中药的筛选15）取80μL预热的Endotoxin-freeEB洗脱液，加入柱子中央，静置2min，室温12000r/min离心2min，检测质粒浓度。16）配制1%琼脂糖凝胶：25mLTAE中加入0.25µg琼脂糖，微波炉中加热熔解，待熔解好的液体微温不烫时，加入适量EB替代物，混匀后，倒入制胶板中，插入鉴定用的加样梳，待其凝固。17）取1μL质粒加入DNAloadingbuffer，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。18）将跑完的凝胶放置于紫外灯下，检测质粒条带大小及RNA浓度。19）将所提取到的，质粒条带大小正确及RNA浓度低的质粒，分装成20μL每管，-20℃保存。2.2.2细胞相关实验2.2.2.1细胞复苏1）从液氮罐中取出冻存的细胞（A549、MDCK），迅速浸入37℃温水中，并不时摇动使其尽快融化。2）从37℃水浴锅中取出冻存管，在超净台中，将管口在酒精灯外焰上过1遍后，打开盖子，吸出细胞悬液，注入至1.5mL的灭菌的EP管中，室温1000r/min离心2min。3）弃去上清，吸取1mL含10%FBS的培养基（F-12、DMEM）,重悬细胞，将细胞重悬液接种小培养瓶，于含5%CO2的37℃培养箱中静置培养。2.2.2.2细胞培养1）待细胞长满单层后，用无菌的PBS清洗细胞所在的细胞瓶底壁，洗2次。2）用适量的0.25%胰酶（EDTA）消化贴壁细胞，并不时在显微镜下观察细胞形态，当细胞收缩变圆时，轻轻晃动细胞培养瓶底，使细胞全部脱落。3）加入含10%FBS的培养基（F-12、DMEM），终止胰酶的消化，并用吸管反复吹打细胞，使其呈单个悬浮状态，按所需比例传至细胞培养板及细胞培养瓶中。2.2.2.3细胞冻存1）预先配制冻存液，一般DMSO、胎牛血清、无血清培养基的比例为1:3:6，4℃冰箱保存预冷。2）将长满单层的细胞消化吹打，使其呈单个悬浮状态。15 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3）吸取细胞悬浮液加入15mL离心管中，室温1000r/min离心5min，弃去上清。4）用配制好的冻存液重悬细胞沉淀，每支冻存管中加入1mL重悬细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。5）置于细胞冻存盒（浸润异丙醇），于-80℃冰箱冻存过夜，次日转入液氮罐。2.2.2.4细胞转染当A549细胞在培养板（24孔板为例）中长至80%时可进行转染。1）转染时，取两个无菌的1.5mLEP管，一管中将适量质粒（24孔板每孔最多转1µg质粒）加入100μLOpti-MEM并混匀，另一管中将所需脂质体Lipofectamine2000（质粒质量与脂质体体积的比值为1:2）加入100μLOpti-MEM并混匀，短暂离心收集管壁液体后，室温静置15min。2）将两管液体混匀，短暂离心收集管壁液体后，室温静置5min。3）吸弃培养板中的含10%FBS的F-12，换成新鲜Opti-MEM后，将上述混合液缓缓滴入培养板细胞液面，于含5%CO2的37℃培养箱中培养。4）转染6h后换液，换成黄连素浓度为75µg/mL含有10%FBS的F-12。2.2.2.5双荧光素酶报告实验1）细胞转染报告质粒24h后，弃去板孔中的培养基，用PBS清洗1次。2）24孔板每孔加入80μL1×Passivelysisbuffer，置于摇床上裂解15min后，用多功能酶标仪检测荧光信号。3）于白色96孔板的每孔中加入10μL细胞裂解上清（切勿吸到细胞碎片）和40μLluciferase检测底物，立即上机检测萤火虫荧光素酶荧光信号，读取数据1。4）然后立即加入40μLStopbuffer（含1×stop底物），上机检测海肾荧光素酶荧光信号，读取数据2。5）相对荧光强度=数据1/数据2。2.2.2.6流感病毒聚合酶活性测定实验1）将PR8流感病毒聚合酶复合体PB1、PB2、PA和NP基因连接到真核表达质粒pcDNA3.1+上。2）A549细胞接种24孔板，待其丰度长至80%时，pcDNA-PA、pcDNA-PB1、pcDNA-PB2、pcDNA-NP以及报告质粒polI-Luc（所用质粒质量比值为1:2:2:4:2）、16 抗流感病毒中药的筛选内参质粒RL-TK（每孔10ng）共转染A549细胞，每3个孔其质粒用量按前所述顺序分别为0.25µg、0.5µg、0.5µg、1.0µg、0.5µg、30ng。3）转染6h后换液，换为黄连素浓度为75µg/mL的含10%FBS的F-12，孵育24h后裂解细胞收获蛋白裂解液，采用上面介绍的双荧光报告系统检测黄连素对流感病毒聚合酶活性的影响。2.2.3病毒相关实验2.2.3.1病毒的增殖1）将PR8流感病毒原液用灭菌PBS作适当倍数的稀释，1mL无菌注射器通过绒毛尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚（0.2mL/枚）。2）以熔化的石蜡封口，置于37℃温箱中孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，无菌收获孵育72h鸡胚的尿囊液。3）室温12000r/min离心3min，将上清转移至新的EP管内，测定血凝价后，置于-80℃保存。2.2.3.2病毒的细胞接种PR8流感病毒感染长满单层的细胞。1）首先将病毒原液按所需量进行稀释，用不含血清的培养基洗两遍细胞后，加入稀释好的病毒液，在含5%CO2的37℃培养箱中孵育1h。2）完全弃去每孔病毒液，无菌PBS洗2次后，换成含相应浓度药物的无血清培养基（培养基内TPCK浓度为0.25µg/mL）。3）在含5%CO2的37℃培养箱中继续培养，于需要的时间点取样。2.2.3.3血凝（HA）实验以测一个病毒样品为例。1）在96孔尖底血凝板上选择一行（12个孔），每孔加入50µLPBS（或0.9%的生理盐水）。2）在第1个孔里加50µL病毒样品，吹吸混匀后，吸取50µL混合液至第2个孔里，依此类推，进行2倍倍比稀释，直至稀释至第11个孔，弃去50µL混合液。3）每孔加入50µL新鲜的1%鸡红细胞悬液，第12个孔作为红细胞对照。稍稍震荡后，放入37℃温箱中，15min后，观察红细胞凝集情况。17 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文判定标准：＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集。＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集。＋＋：红细胞形成一个环状，四周有小凝集块，即50％凝集。＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集。－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度，作为该病毒液的红细胞凝聚效价，即一个血凝单位。2.2.3.4病毒TCID50的测定1）将收获的PR8流感病毒上清液进行10倍（在900μL无血清的DMEM中加-11入100μL病毒上清）倍比稀释至10。2）MDCK细胞适量接种到96孔细胞培养板上，当细胞长满单层时，用无菌PBS洗涤细胞2次，然后将每个稀释度接种96孔细胞板1纵列（8孔），每孔100μL，最后一列细胞只加100μLDMEM作为阴性对照。3）病毒与细胞孵育1h后，弃去上清，用无菌的PBS洗涤细胞2次，加入TPCK浓度为0.25µg/mL的无血清的DMEM，之后将细胞板置于含5%CO2的37℃培养箱中培养。4）每天观察细胞病变，待细胞病变严重或培养3d后，取上清进行血凝（HA）实验，以出现血凝现象为阳性。按照Reed-Muench或Karber法计算PR8流感病毒的TCID50。2.2.4实时荧光定量PCR2.2.4.1RNA的提取1）12孔板每孔加入500μLTRIzol，颠倒混匀数下，待细胞裂解脱落后收集至无RNA酶的1.5mLEP管中，充分颠倒混匀，冰上静置15min。2）加入100μL氯仿，涡旋混匀15sec，置于冰上15min，于4℃12000r/min离心15min。3）上清液转移到另一个无RNA酶的1.5mLEP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，置于冰上10min，于4℃12000r/min离心10min。4）弃去上清，加入用DEPC（diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水配制的75%乙醇1mL，洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，于4℃7500r/min离心5min，此步骤重复2次。18 抗流感病毒中药的筛选5）弃去上清，小心吸去残留乙醇，并将EP管盖子打开，置于超净台风干10min-15min。6）用20μLDEPC水溶解RNA沉淀，并检测RNA浓度。2.2.4.2去DNA及反转录反应反转后用于做荧光定量的RNA样品在反转前必须用DNaseI去除其中的基因组DNA，每1μgRNA用1μLDNaseI处理，37℃水浴反应30min，之后加入等量的终止液，65℃灭活10min，再次检测RNA的浓度。反转录体系如表3。表3RNA反转录体系Table3ReactionsystemofRNAreversetranscription试剂用量AMV酶1.0μL5×AMVbuffer4.0μLRRI0.5μLdNTP2.0μL反转引物1.0μLRNA1μgDEPC水补充至20μL反转录程序：42℃60min，72℃15min。2.2.4.3实时荧光定量PCR本研究均使用SYBR相对实时荧光定量PCR的方法对基因（流感病毒NP基因、细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、CCL5、IFN-β）的表达水平进行检测，整个反应过程中的荧光信号由ABIViiA7实时荧光定量PCR仪收集。实时荧光定量PCR体系如表4。表4实时荧光定量PCR反应体系Table4ReactionsystemofqRT-PCR试剂用量cDNA模板1.0μL上游引物0.25μL下游引物0.25μLSYBRGreenmix10.0μLDEPC水补充至20μL19 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文反应程序：95℃10min；95℃15sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec，-△△共40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec。相对定量的计算采用2Ct方法，所有基因的检测，均使用GAPDH作为内参。2.2.5蛋白相关实验2.2.5.1细胞总蛋白的提取以12孔板A549细胞为例：1）弃去细胞板中培养基，用预冷的PBS洗1次，之后用PBS将细胞吹下并转移到洁净的1.5mLEP管中，4℃1000r/min离心5min，弃去上清。2）每管加入100µL哺乳动物蛋白抽提试剂或细胞IP（immunoprecipitation）裂解液，冰浴30min，每隔5min上下颠倒混匀1次。3）4℃12000r/min离心10min，将上清转移至新的洁净EP管中，采用标准的Bradford方法测量蛋白浓度。2.2.5.2免疫共沉淀实验步骤以6孔板A549细胞为例：1）细胞转染24h后，吸净培养基，细胞用预冷的PBS洗1次。2）每孔加入150µL预冷的细胞IP裂解液，细胞裂解、处理以及离心方法同上。3）检测离心后的上清液中的蛋白浓度，根据蛋白浓度，吸取2份含500μg细胞总蛋白的上清，一份根据体积加入相应量的5×SDSproteinloading，混匀后，100℃水浴10min，取20μL进行SDS-PAGE电泳，用Westernblot检测目的蛋白是否表达。另一份含500μg细胞总蛋白的上清用于免疫共沉淀：1）将500μg蛋白样品加到1.5mLEP管中，补加500μL细胞裂解液，加入1μg捕获抗体（鼠抗HA标签抗体），于4℃轻柔旋转6h，使抗体与诱饵蛋白（带HA标签的流感病毒NP）形成复合物。2）ProteinA/GSepharose（PAGS）：吸取PAGS（一个样品吸取30μL），用细胞IP裂解液洗3次，每次4℃3000r/min离心3min，使PAGS沉淀，吸弃上清。3）向抗体/蛋白复合物中加入20μL用细胞IP裂解液处理过的PAGS，旋转摇匀4h。4）4℃3000r/min离心3min，使结合抗体/蛋白复合物的PAGS沉淀下来，小心吸弃上清，注意PAGS非常容易吹散，管中可以留10μL-20μL上清。20 抗流感病毒中药的筛选5）于沉淀的PAGS中加入500μL裂解液，颠倒混匀，4℃3000r/min离心3min弃上清，洗去未与PAGS结合的杂蛋白，此步骤重复4次。6）弃去上清的沉淀中加入40μLIP裂解液，再加入10μL的5×SDSproteinloading，混合后于100℃水浴10min，室温12000r/min离心后取20μL样品，进行SDS-PAGE电泳以及Westernblot实验。2.2.5.3SDS-PAGE电泳1）制胶前准备：将玻璃板、样品梳用洗涤剂洗净，用去离子水冲洗数次，再用酒精擦拭、晾干，将洗净的玻璃板在桌面上组装完毕后放入夹板中，按紧后放入架子固定，即可配胶。2）倒胶：将配制好的所需浓度的聚丙烯酰胺分离胶（所检测的蛋白分子量越大，分离胶的浓度越低），添加到两玻璃板的间隙中，之后在分离胶上面覆盖一层去离子水，室温放置，待分离胶凝固聚合后，倒出水，用吸水纸吸净残留的去离子水，再将配制好的浓缩胶加到分离胶之上，立即插入样品梳，同时避免样品梳与凝胶之间出现气泡，室温放置，待胶凝固后小心拔出梳子。3）电泳：在电泳槽中加入适量电泳缓冲液（覆盖加样孔），加入样品（每个孔加入相同的总蛋白量），连接电泳系统，先在80V电压下进行电泳，等溴酚蓝指示剂跑到分离胶之后，将电压调至120V，等溴酚蓝指示剂跑到胶底时结束电泳，卸下胶板，小心将胶剥离进行转膜。2.2.5.4蛋白质转膜膜的选择基于待转蛋白质的分子量，小于20kD的蛋白质不可使用0.45μm的硝酸纤维素膜（nitrocellulosefiltermembrane，NC膜），以免蛋白透过膜孔丢失。下面以湿转法介绍转膜步骤：1）凝胶处理：根据蛋白Marker，按照蛋白大小将凝胶切下。2）根据凝胶大小，裁剪合适的滤纸和NC膜，裁剪好后浸泡到转膜缓冲液中。3）打开转膜架，用缓冲液浸透海绵垫，置于转膜架黑色筛孔板上，并依次按“下层海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-上层海绵”的顺序装置好，此过程避免产生气泡。4）将固定好的转膜架装入缓冲液槽，注满预冷的转膜缓冲液。5）连接电极，200mA电流转膜1h（如转膜成功，则胶上无明显蛋白Marker痕迹），取出NC膜用TBST洗3次，置于1%的BSA中，准备蛋白Westernblot实验。21 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.2.5.5Westernblot实验1）转膜结束后，取下NC膜，TBST洗3次，每次10min，之后将其置于1%BSA中，摇床摇荡封闭1h。2）封闭结束后，NC膜用TBST洗3次，每次10min，之后加入一抗（1:5000），摇床摇荡孵育2h或者4℃过夜。3）吸取的一抗放于-20℃保存，NC膜用TBST洗3次，每次10min。4）加入二抗（1:10000）置于摇床摇荡作用1h后，用TBST洗3次，每次10min。5）采用Thermo的ECL显色试剂盒（显色液1:1配置）进行显色，合理调整曝光时间。2.2.6CCK-8方法检测药物对细胞的毒性实验1）MDCK细胞接种于96孔板，长至80%丰度后，弃去旧培养基。2）加入用含10%FBS的DMEM2倍倍比稀释的待测中药复合物（Tamiflu为对照）稀释液（每个稀释度均做6个重复，记为sample），100μL/孔，同时设定药物对照（只加药没有细胞，记为sblank）、正常细胞对照（不加药物，记为control）和培养基对照（只加培养基，没有细胞，记为cblank）。注意：96孔板的边界用培养基填满，不作为指标检测孔，避免孔内液体蒸发所造成的误差。3）在含5%CO2的37℃培养箱中孵育24h，加10μL/孔CCK-8试剂后孵育1h，450nm波长测定OD（opticaldensity）值。4）计算不同浓度的药物在细胞上的存活率。公式为细胞活性（%）=（ODsample—ODsblank）/（ODcontrol—ODcblank）×100%。2.2.7神经氨酸酶活性抑制实验1）加样：96孔黑色酶标板的每孔中加入15μLPR8流感病毒（作为NA的来源，用反应缓冲液MES稀释），再向每孔中加入5μL中药复合物稀释液（用MES稀释，记为sample）或等体积的MES（作为阴性对照，记为control）或等体积的oseltamivir（Tamiflu）药液（作为阳性药物对照），每个稀释度均做2种处理（一组处理是病毒加中药复合物加底物，另一组是病毒加中药复合物加缓冲液，二者最终所测得的数值的差值作为病毒的NA活性，以排除药物的自发荧光），每个处理做3个重复。2）药物与病毒孵育：将酶标板平放在桌上，上下、前后、左右振荡酶标板，将溶液混勻，之后，把酶标板放在37℃温箱孵育45min。22 抗流感病毒中药的筛选3）药物和病毒的混合液与底物孵育：加入30μL底物MU-NANA（20μM）或等体积的反应缓冲液到每孔中（作为空白对照，记为blank），将酶标板在37℃温箱避光孵育1h（如果只需要检测细胞上清中流感病毒的NA活性，前2步舍去，直接从此步骤开始）。3）终止反应，测定NA活性：每孔中加入50μL反应终止液来终止反应。在激发波长和发射波长分别为355nm和460nm下，用EnVision多功能酶标仪检测产物4-甲基伞形酮（4-MU）的荧光强度（fluorescenceintensity，简称FI）。4）计算NA活性抑制率，公式为：NA活性抑制率=100%—（NAsample—NAblank）/（NAcontrol—NAblank）×100%。2.2.8统计学处理实验的同一处理均有3个重复，数据间的差异性，使用GraphPadPrism7软件中的未配对双尾t-test进行统计分析，以P<0.05差异有显著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）。使用GraphPadPrism7软件中的非线性拟合中的log(inhibitor)vs.response(threeparameters)对所筛选出中药的IC50进行计算。23 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3结果与分析3.1流感病毒NAIs的筛选及其抗病毒效果验证3.1.1筛选出对流感病毒NA活性有明显抑制作用的中药复合物中药复合物原始浓度为100mg/mL，本研究把它们进行10倍倍比稀释，做100mg/mL、10mg/mL、1mg/mL及0.1mg/mL4个浓度梯度。相应浓度的中药复合物与PR8流感病毒孵育，通过神经氨酸酶活性抑制实验，计算中药复合物各浓度下的NA活性抑制率。进而选择其浓度在1mg/mL时，NA活性抑制率仍在30%以上的中药复合物，进行体外细胞上抗流感病毒效果验证。根据这个标准，本研究从43种中药复合物中筛选出了6种中药复合物，分别是A3、D1、G3、H5、X4、S7（图1），所筛选出的6种中药复合物的IC50值见表5，其IC50曲线见图2。24 抗流感病毒中药的筛选25 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文26 抗流感病毒中药的筛选27 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文28 抗流感病毒中药的筛选图143种中药复合物4个浓度梯度下的NA活性抑制率Fig.1InhibitionratesofNAactivityof43TCMcompoundswith4concentrationgradients29 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文表5所筛选出中药复合物的IC50值Table5ThevaluesofIC50ofselectedTCMcompounds中药复合物A3D1G3H5X4S7IC50(mg/mL)4.751.002.691.011.760.86图2所筛选出中药复合物的IC50曲线Fig.2ThecurvesofIC50ofselectedTCMcompounds30 抗流感病毒中药的筛选3.1.2检测所筛选出的中药复合物的细胞毒性将所筛选到的中药复合物以1mg/mL为初始浓度，进行2倍倍比稀释，显微镜下观察中药复合物孵育2h、10h、24h时MDCK的细胞状态，定性判断中药复合物的细胞毒性，之后用CCK-8试剂盒，在450nm的检测波长下，检测中药复合物孵育24h后，细胞上清的OD值，根据OD值，定量判定细胞存活率。本研究选取细胞状态良好，且细胞存活率在90%以上的中药复合物浓度，进行体外抗流感病毒效果验证，同时，用20µg/mL的oseltamivir（Tamiflu）作为抗病毒的阳性对照。3.1.2.1显微镜下孵育相应浓度的中药复合物的细胞状态中药复合物D1以相应浓度孵育MDCK细胞2h后，在显微镜下观察细胞状态，当其浓度为500µg/mL时，与对照CK相比，细胞可见明显病变，250µg/mL的浓度下，细胞可见轻微病变；孵育10h后，D1浓度为500µg/mL的细胞病变加重，而D1浓度为250µg/mL的细胞较之2h时病变减轻，再结合孵育24h时，各浓度的细胞状态，500µg/mL浓度下的细胞病变进一步加重，而250µg/mL浓度下的细胞与对照相比，眼观见不到明显的病变，很可能是细胞自身通过代谢反应，消解了D1在250µg/mL浓度下的毒性，而500µg/mL的浓度过高，超出了细胞自身的解毒能力。D1的浓度在125µg/mL时，孵育2h、10h、24h眼观均未见到明显的细胞病变（图3）。中药复合物G3以1000µg/mL、500µg/mL的浓度孵育细胞，2h、10h、24h眼观均未见到明显的细胞病变（图4）。中药复合物H5以500µg/mL的浓度孵育细胞，随着时间的推移，细胞病变越来越明显，而在250µg/mL、125µg/mL的浓度下孵育的细胞，2h、10h、24h眼观均未见到明显的细胞病变（图5）。中药复合物X4以500µg/mL、250µg/mL、125µg/mL的浓度孵育细胞，2h、10h、24h眼观均未见到明显的细胞病变（图6）。中药复合物S7以1000µg/mL、500µg/mL的浓度孵育细胞，2h、10h、24h眼观均未见到明显的细胞病变（图7）。中药复合物A3以1000µg/mL、500µg/mL、250µg/mL、125µg/mL及62.5µg/mL的浓度孵育细胞2h时，在各个浓度下细胞均死亡，细胞毒性太大，不进行细胞上的抗流感病毒效果验证。31 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ckTamiflu500μg/mL250μg/mL125μg/mL2h10h24h图3中药复合物D1各浓度下孵育2h、10h、24h的细胞状态（4×40倍）Fig.3Thecellstateof3timepointspostincubationbydifferentconcentrationsofTCMD1ckTamiflu1000μg/mL500μg/mL2h10h24h图4中药复合物G3各浓度下孵育2h、10h、24h的细胞状态（4×40倍）Fig.4Thecellstateof3timepointspostincubationdifferentconcentrationsofTCMG332 抗流感病毒中药的筛选ckTamiflu500μg/mL250μg/mL125μg/mL2h10h24h图5中药复合物H5各浓度下孵育2h、10h、24h的细胞状态（4×40倍）Fig.5Thecellstateof3timepointspostincubationbydifferentconcentrationsofTCMH5ckTamiflu500μg/mL250μg/mL125μg/mL2h10h24h图6中药复合物X4各浓度下孵育2h、10h、24h的细胞状态（4×40倍）Fig.6Thecellstateof3timepointspostincubationbydifferentconcentrationsofTCMX433 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ckTamiflu1000μg/mL500μg/mL2h10h24h图7中药复合物S7各浓度下孵育2h、10h、24h的细胞状态（4×40倍）Fig.7Thecellstateof3timepointspostincubationdifferentconcentrationsofTCMS73.1.2.2CCK-8试剂盒所检测中药复合物相应浓度下的细胞活性通过显微镜下观察细胞病变，定性判断中药复合物不同浓度的细胞毒性之后，本研究选择眼观未见明显细胞病变的中药复合物浓度，进一步用CCK-8试剂盒定量判定，加药的细胞与正常细胞对照相比，细胞活性是否是在90%以上。96孔板接种的MDCK细胞铺满单层后，弃去培养基，每孔加入100µL用含10%FBS的DMEM稀释好的中药复合物，每一个稀释度做6个重复，同时做药物对照（只加药没有细胞）、正常细胞对照（不加药）、培养基空白对照（只加培养基没有细胞）。中药复合物孵育24h后，每孔加入10µLCCK-8试剂，在含5%CO2的37℃培养箱中反应1h后，450nm检测OD值。计算中药复合物各浓度下的细胞存活率，发现眼观未见明显细胞病变的药物浓度，其细胞活性均在90%以上（图8）。即中药复合物G3、S7的浓度为1000µg/mL及以下，X4的浓度为500µg/mL及以下，D1、H5的浓度为250µg/mL及以下时，细胞的存活率均在90%以上。下一步，本研究选用相应中药复合物浓度进行体外细胞上抗病毒效果验证时，就可以排除药物的细胞毒性干扰。34 抗流感病毒中药的筛选图8中药复合物不同浓度下的细胞活性Fig.8CellviabilityofdifferentconcentrationsofTCMcompounds35 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.1.3体外实验验证中药复合物的抗流感病毒效果通过前面的细胞毒性检测，本研究确定了5种中药复合物，D1、G3、H5、X4和S7，对细胞无毒性的浓度界限，本研究选用在安全剂量范围内的浓度，进行体外细胞上抗流感病毒效果验证，同时将20µg/mL的oseltamivir（Tamiflu）作为阳性对照。PR8流感病毒感染MDCK细胞1h后，细胞上清换成含相应中药复合物浓度的无血清的DMEM，作用24h后，取上清，通过血凝（HA）实验、TCID50实验检测PR8流感病毒的病毒滴度。2种不同的实验方法在检测病毒滴度的敏感性与准确性上有所差异，本研究采用TCID50实验的结果对中药复合物的抗流感病毒效果进行判断，血凝（HA）实验作为一个辅助性的参考。本研究发现5种中药复合物中，X4（图12）对PR8流感病毒的抑制效果最为明显，其在500µg/mL、250µg/mL及125µg/mL时，都有明显的抑制效果，D1（图9）、H5（图11）在250µg/mL时，G3（图10）在1000µg/mL时，皆有明显的抑制作用。S7在1000µg/mL及以下浓度时，均对PR8流感病毒没有抑制效果（图13）。综上所述，本研究认为X4对PR8流感病毒的抑制效果最为显著，其临床实用价值最大，因此，在下一步，选取其他亚型的流感病毒，进一步验证X4的抗流感病毒效果。3.1.3.1中药复合物D1抗流感病毒效果本研究选择中药复合物D1的250µg/mL、125µg/mL这2个浓度，oseltamivir（Tamiflu）20µg/mL为阳性对照，用血凝（HA）实验、TCID50实验检测流感病毒滴度，以TCID50实验的结果作为判断标准。结果表明，中药复合物D1在250µg/mL时，对PR8流感病毒有很好的抑制效果（图9）。图9中药复合物D1对PR8流感病毒的抑制效果Fig.9TheinhibitoryeffectsofTCMD1forPR8influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。36 抗流感病毒中药的筛选3.1.3.2中药复合物G3抗流感病毒效果本研究选择中药复合物G3的1000µg/mL、500µg/mL这2个浓度，oseltamivir（Tamiflu）20µg/mL为阳性对照，用血凝（HA）实验、TCID50实验检测流感病毒滴度，以TCID50实验的结果作为判断标准。结果表明，中药复合物G3在1000µg/mL时，对PR8流感病毒有很好的抑制效果（图10）。图10中药复合物G3对PR8流感病毒的抑制效果Fig.10TheinhibitoryeffectsofTCMG3forPR8influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。3.1.3.3中药复合物H5抗流感病毒效果本研究选择中药复合物H5的250µg/mL、125µg/mL这2个浓度，oseltamivir（Tamiflu）20µg/mL为阳性对照，用血凝（HA）实验、TCID50实验检测流感病毒滴度，以TCID50实验的结果作为判断标准。结果表明，中药复合物H5在250µg/mL时，对PR8流感病毒有很好的抑制效果（图11）。图11中药复合物H5对PR8流感病毒的抑制效果Fig.11TheinhibitoryeffectsofTCMH5forPR8influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。37 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.1.3.4中药复合物X4抗流感病毒效果本研究选择中药复合物X4的500µg/mL、250µg/mL、125µg/mL、62.5µg/mL这4个浓度，oseltamivir（Tamiflu）20µg/mL为阳性对照，用血凝（HA）实验、TCID50实验检测流感病毒滴度，以TCID50实验的结果作为判断标准。结果表明，中药复合物X4对PR8流感病毒的抑制效果很明显，其在500µg/mL、250µg/mL及125µg/mL时，都有明显的抑制效果（图12）。图12中药复合物X4对PR8流感病毒的抑制效果Fig.12TheinhibitoryeffectsofTCMX4forPR8influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。3.1.3.5中药复合物S7抗流感病毒效果本研究选择中药复合物S7的1000µg/mL、500µg/mL这2个浓度，oseltamivir（Tamiflu）20µg/mL为阳性对照，用血凝（HA）实验、TCID50实验检测流感病毒滴度，以TCID50实验的结果作为判断标准。结果表明，中药复合物S7在1000µg/mL及以下浓度时，均对PR8流感病毒没有抑制效果（图13）。图13中药复合物S7对PR8流感病毒的抑制效果Fig.13TheinhibitoryeffectsofTCMS7forPR8influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。38 抗流感病毒中药的筛选3.1.4中药复合物X4对其他亚型流感病毒的抑制效果本研究选取对PR8流感病毒抑制效果最为显著的中药复合物X4和其他亚型的流感病毒，包括221（H1N1）和W1（H9N2）流感病毒；中药复合物X4的浓度为500µg/mL、250µg/mL和125µg/mL，将20µg/mL的oseltamivir（Tamiflu）作为阳性对照；各亚型流感病毒感染MDCK细胞后，加入用无血清的DMEM稀释成相应浓度的中药复合物X4，24h后，通过测定细胞上清中流感病毒的NA活性抑制率、血凝价和TCID50，验证中药复合物X4对其他亚型流感病毒的抑制效果。实验结果表明，X4的浓度在500µg/mL时，对上述2种亚型流感病毒都有很好的抑制效果（图14、图15），其浓度在250µg/mL时，对221（H1N1）流感病毒仍有很好的抑制效果（图14），说明X4具有广谱的抗流感病毒能力。3.1.4.1中药复合物X4对221（H1N1）流感病毒的抑制效果221（H1N1）流感病毒感染MDCK细胞后，加入用无血清的DMEM稀释成相应浓度的中药复合物X4，24h后，测定细胞上清中流感病毒的NA活性抑制率、血凝价和TCID50，发现中药复合物X4的浓度在500µg/mL和250µg/mL时，对221（H1N1）流感病毒仍有很好的抑制效果（图14）。图14中药复合物X4对221（H1N1）流感病毒的抑制效果Fig.14TheinhibitoryeffectsofTCMX4for221(H1N1)influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。39 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3.1.4.2中药复合物X4对W1（H9N2）流感病毒的抑制效果W1（H9N2）流感病毒感染MDCK细胞后，加入用无血清的DMEM稀释成相应浓度的中药复合物X4，24h后，测定细胞上清中流感病毒的NA活性抑制率、血凝价和TCID50，发现中药复合物X4的浓度在500µg/mL时，对W1（H9N2）流感病毒仍有很好的抑制效果（图15）。图15中药复合物X4对W1（H9N2）流感病毒的抑制效果Fig.15TheinhibitoryeffectsofTCMX4forW1(H9N2)influenzavirus注：显著性均以PR8为对照，数值明显比PR8高的实验组不进行显著性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。3.2黄连素抗流感病毒作用研究3.2.1黄连素抑制流感病毒聚合酶活性及其组装3.2.1.1黄连素抑制流感病毒聚合酶活性24孔板上接种A459细胞，长至80%丰度后，PR8流感病毒聚合酶系统质粒pcDNA-PA、pcDNA-PB1、pcDNA-PB2、pcDNA-NP以及报告质粒polI-Luc、内参质粒RL-TK共转染A459细胞，每一个处理做3个重复，质粒用量按前所述顺序分别为0.25µg、0.5µg、0.5µg、1.0µg、0.5µg、30ng，转染6h后换液，换为黄连素浓度为75µg/mL的含10%FBS的F-12。转染24h后，弃去培养基，PBS洗1次，40 抗流感病毒中药的筛选每孔加入80µL双荧光裂解液，37℃摇床上裂解细胞15min后，通过荧光值检测双荧光素酶活性。与未加药的对照相比，黄连素对PR8流感病毒聚合酶的活性有明显的抑制（图16）。图16黄连素对PR8流感病毒聚合酶活性的影响Fig.16TheeffectofberberineonpolymerasesactivityofPR8influenzavirus3.2.1.2黄连素抑制流感病毒聚合酶组装6孔板上接种A549细胞，长至80%丰度后，共转染PR8流感病毒聚合酶系统质粒pcDNA-PA、pcDNA-PB1、pcDNA-PB2及pcDNA-NP，以及提供病毒RNA的polI质粒，质粒用量按前所述顺序分别为0.25µg、0.5µg、0.5µg、1.0µg、0.5µg，转染6h后换液，换为黄连素浓度为75µg/mL的含10%FBS的F-12。转染24h后，弃去培养基，预冷的PBS洗1次，每孔加入150µL蛋白IP裂解液，冰上裂解30min后，按免疫共沉淀的实验要求处理蛋白样（处理前的蛋白总量均为500µg），之后用Westernblot检测聚合酶及NP蛋白。黄连素使NP蛋白垂钓到的聚合酶蛋白PA、PB1、PB2均大幅减少（图17），说明黄连素抑制了流感病毒聚合酶的组装。41 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图17黄连素对PR8流感病毒聚合酶组装的影响Fig.17TheeffectofberberineonpolymerasesassemblyofPR8influenzavirus3.2.2黄连素抑制宿主细胞内MAPKs通路激活mTOR通路12孔板上接种A549细胞，细胞铺满单层后，感染PR8流感病毒，病毒液在含5%CO2的37℃培养箱孵育1h后，弃去病毒液，换为黄连素浓度为75µg/mL的无血清的F-12。24h后，弃去培养基，预冷的PBS洗1次，每孔加入100µL预冷的哺乳动物蛋白抽提试剂，冰上裂解30min后，按跑SDS-PAGE胶的实验要求处理蛋白样，之后用Westernblot检测MAPKs及mTOR通路中的一些关键信号分子的活化水平（每一个泳道蛋白总量一致）。不论接毒与否，黄连素处理过的实验孔，都下调了p38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平，同时上调了AKT蛋白的磷酸化水平，说明黄连素能直接影响MAPKs及mTOR通路，对于感染PR8流感病毒的实验孔，黄连素对上述通路的调节幅度更大，42 抗流感病毒中药的筛选更明显（图18）。p38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平降低，说明p38、ERK、JNK蛋白的活化程度降低，MAPKs通路被抑制；AKT蛋白的磷酸化水平升高，说明AKT蛋白的活化程度升高，AKT蛋白的活化，会抑制MAPKs通路，激活mTOR通路。说明黄连素通过调节MAPKs及mTOR通路中的一些关键信号分子蛋白的磷酸化水平，改变它们的活化水平，实现对MAPKs通路的抑制以及对mTOR信号通路的激活。图18黄连素对宿主细胞内MAPKs和mTOR信号通路的影响Fig.18TheeffectofberberineonMAPKsandmTORsignalingpathwaysinthehost3.2.3黄连素通过抑制MAPKs通路抑制流感病毒的增殖本研究选用MAPKs通路的抑制剂，MEK1/2（ERK上游的激酶）的抑制剂U0126、p38的抑制剂SB203580、和JNK的抑制剂SP600125，连同黄连素，在PR8流感病毒感染A549细胞1h后，分别将其加入到细胞上清，4h后，收取细胞上清及用蛋白抽提试剂裂解细胞收取蛋白样，分别进行TCID50实验及Westernblot检测流感病毒NP蛋白水平（每一个泳道蛋白总量一致）。MAPKs通路的抑制剂与黄连素处理的实验组，都显著抑制了流感病毒的TCID50及NP蛋白水平（图19、图20）。说明黄连素通过抑制MAPKs通路，抑制了流感病毒的增殖。43 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图19黄连素和MAPKs信号通路抑制剂对PR8流感病毒滴度的影响Fig.19TCID50ofPR8treatedwithberberineandinhibitorsofMAPKssignalingpathways图20黄连素和MAPKs信号通路抑制剂对PR8NP蛋白水平的影响Fig.20WesternblotofNPtreatedwithberberineandinhibitorsofMAPKssignalingpathways3.2.4黄连素通过抑制MAPKs通路抑制流感病毒的复制、转录将U0126、SB203580、SP600125这3种MAPKs通路的抑制剂，连同黄连素，在PR8流感病毒感染A549细胞1h后，分别加入到细胞上清，24h后，用TRIzol裂解细胞，收取RNA样。提取RNA后，进行cRNA和mRNA的反转录，最后用相对qRT-PCR检测病毒NP基因的含量。MAPKs通路的抑制剂与黄连素处理的实验组，都显著抑制了流感病毒NP基因的cRNA和mRNA水平（图21、图22）。说44 抗流感病毒中药的筛选明黄连素通过抑制MAPKs通路，抑制了流感病毒的复制与转录，从而抑制了流感病毒的增殖。图21黄连素和MAPKs信号通路抑制剂对PR8流感病毒NPcRNA水平的影响Fig.21ThelevelofNPcRNAtreatedwithberberineandinhibitorsofMAPKssignalingpathways图22黄连素和MAPKs信号通路抑制剂对PR8流感病毒NPmRNA水平的影响Fig.22ThelevelofNPmRNAtreatedwithberberineandinhibitorsofMAPKssignalingpathways3.2.5黄连素抑制了流感病毒诱导的细胞因子的产生PR8流感病毒感染A549细胞1h后，换成含黄连素75µg/mL的无血清的F-12，孵育24h后，用TRIzol裂解细胞，收取RNA样。提取出RNA之后，测定浓度，取1µgRNA，用AMV逆转录酶反转成cDNA，最后用相对qRT-PCR检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、CCL5、IFN-β的mRNA水平。用黄连素处理的实验组，上述细胞因子的mRNA水平均显著下降（图23），结合前面的实验结果，说明黄连素通过抑制流感病毒的增殖及抑制MAPKs通路的激活，抑制了病毒诱导的细胞因子的产生，从而减轻了机体的炎症反应。45 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图23黄连素对PR8流感病毒诱导产生的细胞因子水平的影响Fig.23TheeffectsofberberineoncytokinesinducedbyPR8influenzavirus46 抗流感病毒中药的筛选3.2.6黄连素间接抑制了p65的磷酸化PR8感染A549细胞1h后，换成含黄连素75µg/mL的无血清的F-12，在细胞上孵育24h后，用哺乳动物蛋白抽提试剂裂解细胞，收取蛋白样。测定蛋白浓度后，取相同量的蛋白，进行SDS-PAGE。跑胶转膜后，用Westernblot检测流感病毒NP、pro-IL-1β、p65及p-p65的蛋白水平。用黄连素处理的实验组，NP、pro-IL-1β、p-p65的蛋白水平都明显下降（图24），结合之前的实验结果，说明NF-κB通路这一产生细胞因子的途径，也被黄连素通过抑制流感病毒的增殖，间接抑制p65的磷酸化，从而抑制了p65的活化，进而抑制NF-κB通路。图24黄连素对PR8流感病毒诱导的p65磷酸化水平的影响Fig.24Theeffectsofberberineonphosphorylationofp65inducedbyPR8influenzavirus47 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文4讨论抗流感病毒药物的筛选有很多种靶点，比如参与流感病毒从靶细胞的胞外进入到胞内这一过程的病毒蛋白和宿主因子，是理想的抗病毒药物的靶点（Edingeretal2014）。病毒基因组要从胞外的病毒粒子到细胞核内的转录和复制位点，病毒粒子如何从胞外进入胞内十分关键。因此，在这一过程发挥作用的比如与宿主细胞唾液酸受体结合的HA蛋白，就是一个潜在的筛选抗流感病毒药物的靶点，通过噬菌体肽库展示技术呈现HA的特异性补体片段，能抑制流感病毒的增殖（Asanumaetal2008）。流感病毒的M2蛋白，是一个已经被证明的有效的抗流感病毒药物靶点。流感病毒复制过程中，M2离子通道在酸化内吞体，促使内吞体膜跟溶酶体膜发生融合这一过程中，发挥关键作用。A型流感病毒的M2蛋白还能阻止自噬小体与溶酶体的融合，抑制细胞的凋亡，完成自身的复制（Gannageetal2009）。靶向M2蛋白的抑制剂，临床上使用的有金刚烷胺和金刚乙胺，不过因为其抑制剂只对A型流感病毒有效，而且会很快产生耐药性（Barik2012），还可能有严重的中枢神经系统症状这一副作用，因此极大限制了它在临床上的应用。流感病毒的RNA聚合酶，也是筛选抗病毒药物的一个有效的靶点（Shietal2013）。RNA聚合酶在流感病毒的复制和转录过程中，发挥着十分关键的作用，其核酸内切酶功能，在流感病毒的转录和翻译过程中作用巨大，抑制它的活性会抑制流感病毒的增殖（Aminetal2017），PA蛋白N端的核酸内切酶活化位点是一个潜在的抗流感病毒药物筛选靶点（Aietal2015）。本论文研究的黄连素就具有抑制流感病毒聚合酶活性和组装的作用。流感病毒NA蛋白，在子代病毒从宿主细胞内出芽时，NA能切断病毒与宿主表面的唾液酸连结，释放子代病毒，使病毒能进一步扩散和再感染（Barik2012）。研究表明，NA还可能介导流感病毒的免疫逃避（Bar-Onetal2013）。在1970年代NA就已经被认为是筛选抗病毒药物的靶点，靶向它的两种药物奥司他韦和扎那米韦，在临床上抗病毒效果明显，充分证明了这个靶点的有效性（Air2012，Baueretal2012）。虽然NAIs在流感病毒的预防和治疗中被广泛应用，但是它们的耐药毒株也在不断产生（KarthickandRamanathan2013），因此本研究希望寻找到一种新的有效的NA活性抑制剂。流感病毒的各型中，A型流感病毒宿主最为广泛，危害最大，曾导致人类史上的4次大流行，分别是1918年的西班牙流感，1957年的亚洲流感，1968年香港流感，和2009年甲型H1N1流感（CoxandSubbarao2000，Dawoodetal2009，Wuetal2014）。A型流感病毒的第一类NA，活性位点旁边特殊的凹槽结构，使药物能更有48 抗流感病毒中药的筛选效地与NA结合，充分发挥作用，减少了漏筛的可能性。因此，本论文选择N1亚型，即以季节性流感A型流感病毒PR8（H1N1）为模式病毒，进行流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选。NA活性检测有2种方法，一种是以4-MUNANA为底物的荧光检测方法，还有一种是以唾液酸的衍生物为底物的化学发光检测方法（Wetheralletal2003），基于操作简便可控、易于排除实验外无干因素的考量，本研究选用第一种方法，即通过检测荧光值来测定NA活性。中药在我国有着悠久的使用历史，有很多种中药制剂被用于治疗流感，比如黄连解毒汤，能抑制H1N1流感病毒的NA活性（Zhouetal2017），玉屏风散既能促进机体抗病毒蛋白的产生，又能抑制流感病毒NA活性（Duetal2015），以及痰热清注射液，可以降低流感病毒在肺部的病毒滴度（Zhuetal2018）；也有一些从中药中提取出来的化合物被证明有显著的抗病毒效果，比如从金荞麦中用乙酸乙酯提取出的芦丁、橘皮苷、原花青素B2和槲皮苷，对流感病毒NA活性有很好的抑制作用（Zhangetal2017）。因此，从传统中药中寻找到一种低毒性的天然的NAIs是很有可能的（Duetal2015）。本研究通过NA活性抑制实验，从43种中药复合物中，初步筛选出了6种中药复合物，分别为A3、D1、G3、H5、X4和S7，其对PR8流感病毒的NA活性均具有很好的抑制效果。之后，通过体外MDCK细胞上验证其抗病毒效果，发现中药复合物X4不仅对细胞的毒性小，而且对PR8流感病毒的抑制效果也最为明显，其在500µg/mL、250µg/mL及125µg/mL时，都有明显的抑制效果。本论文寻找有效的NA活性抑制剂时，是以PR8（H1N1）为模式病毒，因为A型流感病毒NA蛋白的N1-N9亚型，其活性位点的关键氨基酸序列是保守的，因此，从理论上讲，如果药物对PR8流感病毒的NA活性有很好的抑制效果，那么，它对其他亚型的流感病毒也应该有效。通过各亚型的流感病毒感染MDCK细胞后，孵育中药复合物X4，测定细胞上清的病毒滴度，验证了这一推测，中药复合物X4确实对其他亚型的流感病毒也具有较好的抑制效果，尤其对本实验所分离、鉴定、保存的2016年的221流感病毒株，具有很好的抑制效果，这一结果表明，所筛选到的中药复合物X4，对于现今可能的流行毒株具有明显的抑制效果。有报道表明，许多生物碱类的化合物，对NA活性都有很好的抑制作用（于淼2016），因而，下一步，本实验室后期可能会利用分子对接模拟技术，对筛选到的中药复合物X4进行有效成分分析，找到对流感病毒NA活性有很好抑制效果的单体化合物。神经氨酸酶抑制剂可以缩短流感病毒病的病程，被推荐用于临床普通病人及有高并发症风险的病人（Abrahametal2016），并且是唯一一类被推荐用于防控流感的49 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文流行和大流行的抗病毒药物（AbedandBoivin2017），因此，本论文以流感病毒NA为靶点，所筛选到的中药复合物，具有一定的临床应用价值。有研究表明，联合用药能发挥药物的协同作用，更有效地发挥抗流感病毒作用（Belardoetal2015），因此，本论文继续对本实验室前期研究所发现的黄连素进行了抗流感病毒作用研究，希望能开发出一种中药复合物与黄连素联合使用时，对流感病毒具有高敏感性的、多靶点作用的、不易产生耐药性的新型药物。黄连素是传统中药中一种天然的异喹啉类生物碱，可以调节细胞内的生化功能，发挥广泛的药理作用。例如，黄连素通过调节甲状腺癌细胞内的PI3K-AKT和MAPK通路，发挥抗癌作用（Lietal2017）；也可以通过AMPK（5'AMP-activatedproteinkinase，腺苷酸活化蛋白激酶）通路调节细胞的代谢，起到治疗糖尿病和预防肥胖的作用（LeeYunetal2006）；还可以通过抑制PGE2（prostaglandinE2，前列腺素E2）的产生，在体内和体外发挥抗炎作用（Kuoetal2004）；还能通过抑制产气荚膜梭菌的NA活性抑制细菌的生长（Kimetal2014）。在病毒感染过程中，黄连素能通过抑制JNK/MAPK通路，抑制B3型柯萨奇病毒（CVB3）的复制（Daietal2017），黄连素能抑制呼吸道合胞体病毒诱导的p38/MAPK通路，发挥抗炎作用，而且能抑制病毒蛋白和mRNA的合成，进而抑制病毒的增殖（Shinetal2015）。对于流感病毒的感染，有研究表明，黄连素可能通过抑制病毒复制后期所需的蛋白质的转运和成熟，抑制病毒的增殖（Ceciletal2011）；黄连素的衍生物能抑制流感病毒的NA亚基，抑制不同亚型的流感病毒毒株的增殖（Enkhtaivanetal2017）；黄连素能通过抑制病毒的感染及炎症介质的释放，进而抑制流感病毒诱导的病毒性肺炎（Wuetal2011）。本论文在A549细胞上对黄连素的抗流感病毒作用进行了研究，发现黄连素的抗病毒作用，体现在宿主和病毒两方面，一方面，黄连素通过对流感病毒聚合酶活性与组装的抑制，及对MAPKs通路的抑制，抑制病毒的复制、转录，从而抑制病毒的增殖；另一方面是对MAPKs通路的抑制和间接抑制p65磷酸化，抑制了病毒诱导的细胞因子的产生，减轻了机体的炎症反应带来的损伤，还有对mTOR通路的激活，增强了宿主细胞的活力，加强了机体对病毒的抵抗能力。本研究明确了黄连素的抗流感病毒作用途径，但是，所筛选到的中药复合物X4与黄连素联合使用，是否会具有更高效的抗流感病毒作用，还需要进一步的体外和体内实验对其进行研究。50 抗流感病毒中药的筛选5总结5.1主要结论以PR8（H1N1）为模式病毒，通过NA活性抑制实验，从43份中药复合物中筛选出6种NA活性抑制良好的中药复合物，A3、D1、G3、H5、X4、S7。之后通过显微镜下观察细胞状态，CCK-8试剂盒检测细胞活性，选择对细胞无毒性的浓度，在MDCK细胞上进行抗流感病毒效果验证，发现中药复合物X4的抑制效果最为明显，进一步的实验表明，X4对其他亚型的流感病毒也具有较好的抑制效果。黄连素能抑制流感病毒聚合酶活性与组装，以及抑制MAPKs通路，抑制病毒的复制、转录，从而抑制病毒的增殖；黄连素抑制MAPKs通路及间接抑制p65的磷酸化，抑制了病毒诱导的细胞因子的产生，减轻了机体的炎症反应；同时激活mTOR通路，增强宿主细胞的活力，加强机体对病毒的抵抗。5.2需要进一步探讨的问题中药复合物X4及X4与黄连素联合使用，在体内是否对流感病毒有很好的抑制效果，需要进一步的动物实验来验证。能否通过分子对接模拟技术，找到中药复合物X4中的有效成分，并进一步进行验证，这也是本实验室接下来需要开展的工作。51 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文参考文献1.郎超．黄连素通过GRP78膜转位诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究．[硕士学位论文]．太原：山西大学，2017．2.刘艾林，王海娣，杨帆，杜冠华．抗流感神经氨酸酶抑制剂的研究进展．药学学报，2009，935-942．3.田莉．中药中神经氨酸酶抑制剂的筛选及其抗流感病毒实验研究．[博士学位论文]．长春：吉林大学，2011．4.于淼．中药单体化合物中神经氨酸酶抑制剂的筛选及其抗流感病毒活性的研究．[博士学位论文]．长春：吉林大学，2016．5.张瑞．黄连素对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的初步研究．[博士学位论文]．南京：南京大学，2017．6.邹积振，程凯慧，陈为京，于志君．A型流感病毒研究进展．安徽农业科学，2017，99-102．7.左茹，曹雪滨，张文生．黄连素药理作用研究进展．环球中医药，2014，568-572．8.Abdel-MageedWM,BayoumiSAH,ChenCX,VavrickaCJ,LiL,MalikA,DaiHQ,SongFH,WangLQ,ZhangJY,GaoGF,LvYL,LiuLH,LiuXT,SayedHM,ZhangLX.BenzophenoneC-glucosidesandgallotanninsfrommangotreestembarkwithbroad-spectrumanti-viralactivity.BioorganMedChem,2014,22:2236-2243.9.AbedY,BazM,BoivinG.ANovelNeuraminidaseDeletionMutationConferringResistancetoOseltamivirinClinicalInfluenzaA/H3N2Virus.JInfectDis,2009,199:180-183.10.AbedY,BoivinG.AReviewofClinicalInfluenzaAandBInfectionsWithReducedSusceptibilitytoBothOseltamivirandZanamivir.OpenForumInfectDi,2017,4(3):ofx105.11.AbrahamMK,PerkinsJ,VilkeGM,CoyneCJ.InfluenzaintheEmergencyDepartment:Vaccination,Diagnosis,andTreatment:ClinicalPracticePaperApprovedbyAmericanAcademyofEmergencyMedicineClinicalGuidelinesCommittee.JEmergMed,2016,50:536-542.12.AiHX,ZhengFL,DengFB,ZhuCY,GuY,ZhangL,LiXJ,ChangAK,ZhaoJ,ZhuJF,LiuHS.Structure-BasedVirtualScreeningforPotentialInhibitorsofInfluenzaAVirusRNAPolymerasePASubunit.IntJPeptResTher,2015,21:149-156.13.AirGM.Influenzaneuraminidase.InfluenzaOtherResp,2012,6:245-256.52 抗流感病毒中药的筛选14.AlameMM,MassaadE,ZaraketH.Peramivir:ANovelIntravenousNeuraminidaseInhibitorforTreatmentofAcuteInfluenzaInfections.Frontiersinmicrobiology,2016,7:450.15.AllevaLM,CaiC,ClarkIA.UsingComplementaryandAlternativeMedicinestoTargettheHostResponseduringSevereInfluenza.Evid-BasedComplAlt,2010,7:501-510.16.AminSA,AdhikariN,GayenS,JhaT.Anintegratedligand-basedmodellingapproachtoexplorethestructure-propertyrelationshipsofinfluenzaendonucleaseinhibitors.StructChem,2017,28:1663-1678.17.AmorimMJ,ReadEK,DaltonRM,MedcalfL,DigardP.NuclearexportofinfluenzaAvirusmRNAsrequiresongoingRNApolymeraseIIactivity.Traffic,2007,8:1-11.18.AnnJ,AbedY,BeaulieuE,BouhyX,JolyMH,DubeK,CarbonneauJ,HamelinME,MallettC,BoivinG.Impactofalargedeletionintheneuraminidaseproteinidentifiedinalaninamivir-selectedinfluenzaA/Brisbane/10/2007(H3N2)variantonviralfitnessinvitroandinferrets.InfluenzaOtherResp,2016,10:122-126.19.AroraR,ChawlaR,MarwahR,AroraP,SharmaRK,KaushikV,GoelR,KaurA,SilambarasanM,TripathiRP,BhardwajJR.PotentialofComplementaryandAlternativeMedicineinPreventiveManagementofNovelH1N1Flu(SwineFlu)Pandemic:ThwartingPotentialDisastersintheBud.Evid-BasedComplAlt,2011,2011:586506.20.AsanumaH,Matsumoto-TakasakiA,SuzukiY,TamuraS,SataT,KusadaY,MatsushitaM,Fujita-YamaguchiY.InfluenzaPR8HA-specificFabfragmentsproducedbyphagedisplaymethods.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2008,366:445-449.21.Bar-OnY,GlasnerA,MeningherT,AchdoutH,GurC,LankryD,VitenshteinA,MeyersAFA,MandelboimM,MandelboimO.Neuraminidase-Mediated,NKp46-DependentImmune-EvasionMechanismofInfluenzaViruses.CellRep,2013,3:1044-1050.22.BarikS.Newtreatmentsforinfluenza.BmcMed,2012,10:104.23.BaudinF,BachC,CusackS,RuigrokRW.StructureofinfluenzavirusRNP.I.InfluenzavirusnucleoproteinmeltssecondarystructureinpanhandleRNAandexposesthebasestothesolvent.EmboJ,1994,13:3158-3165.24.BauerK,DurrwaldR,SchlegelM,PfarrK,TopfD,WiesenerN,DahseHM,WutzlerP,SchmidtkeM.NeuraminidaseinhibitorsusceptibilityofswineinfluenzaAviruses53 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文isolatedinGermanybetween1981and2008.MedMicrobiolImmun,2012,201:61-72.25.BelardoG,CenciarelliO,LaFraziaS,RossignolJF,SantoroMG.SynergisticEffectofNitazoxanidewithNeuraminidaseInhibitorsagainstInfluenzaAVirusesInVitro.AntimicrobAgentsCh,2015,59:1061-1069.26.BouvierNM,PaleseP.Thebiologyofinfluenzaviruses.Vaccine,2008,26Suppl4:D49-53.27.CaiW,ChenS,LiY,ZhangA,ZhouH,ChenH,JinM.14-Deoxy-11,12-didehydroandrographolideattenuatesexcessiveinflammatoryresponsesandprotectsmicelethallychallengedwithhighlypathogenicA(H5N1)influenzaviruses.AntiviralRes,2016,133:95-105.28.CannonG,CallahanMA,GronemusJQ,LowyRJ.EarlyActivationofMAPKinasesbyInfluenzaAVirusX-31inMurineMacrophageCellLines.PlosOne,2014,9(8):e105385.29.CaoHJ,TanRR,HeRR,TangLP,WangXL,YaoN,DuanWJ,HuYA,YaoXS,KuriharaH.SarcandraglabraExtractReducestheSusceptibilityandSeverityofInfluenzainRestraint-StressedMice.Evid-BasedComplAlt,2012,2012:236539.30.CecilCE,DavisJM,CechNB,LasterSM.InhibitionofH1N1influenzaAvirusgrowthandinductionofinflammatorymediatorsbytheisoquinolinealkaloidberberineandextractsofgoldenseal(Hydrastiscanadensis).IntImmunopharmacol,2011,11:1706-1714.31.ChangTT,SunMF,ChenHY,TsaiFJ,FisherM,LinJG,ChenCYC.ScreeningfromtheWorld'sLargestTCMDatabaseAgainstH1N1Virus.JBiomolStructDyn,2011,28:773-786.32.ChangTT,SunMF,ChenHY,TsaiFJ,LinJG,ChenCYC.KeyfeaturesfordesigningM2protonchannelantiswinefluinhibitors.JournaloftheTaiwanInstituteofChemicalEngineers,2011,42:701-708.33.ChenH,JieC,TangLP,MengH,LiXB,LiYB,ChenLX,YanC,KuriharaH,LiF,HeRR.NewinsightsintotheeffectsandmechanismofaclassictraditionalChinesemedicinalformulaoninfluenzaprevention.Phytomedicine,2017,27:52-62.34.ChenHW,ChengJX,LiuMT,KingK,PengJY,ZhangXQ,WangCH,ShrestaS,SchooleyRT,LiuYT.Inhibitoryandcombinatorialeffectofdiphyllin,av-ATPaseblocker,oninfluenzaviruses.AntivirRes,2013,99:371-382.54 抗流感病毒中药的筛选35.ChenJF,DongX,LiQ,ZhouX,GaoSH,ChenRB,SunLN,ZhangL,ChenWS.BiosynthesisoftheactivecompoundsofIsatisindigoticabasedontranscriptomesequencingandmetabolitesprofiling.BMCgenomics,2013,14:857.36.ChiapponiC,FacciniS,DeMattiaA,BaioniL,BarbieriI,RosignoliC,NigrelliA,FoniE.DetectionofInfluenzaDVirusamongSwineandCattle,Italy.EmergInfectDis,2016,22:352-354.37.ChoHG,ChoiJH,LeeHK,MunSK,LeeJB,JhoEH,KangC,LimYH.Oseltamivir-resistantinfluenzavirusesisolatedinSouthKoreafrom2005to2010.ArchVirol,2013,158:2365-2370.38.CoxNJ,SubbaraoK.Influenza.Lancet,1999,354:1277-1282.39.CoxNJ,SubbaraoK.Globalepidemiologyofinfluenza:pastandpresent.AnnuRevMed,2000,51:407-421.40.CrosJF,PaleseP.TraffickingofviralgenomicRNAintoandoutofthenucleus:influenza,ThogotoandBornadiseaseviruses.VirusRes,2003,95:3-12.41.DaiQ,ZhangD,YuH,XieW,XinR,WangL,XuX,HeX,XiongJ,ShengH,ZhangL,ZhangK,HuX.BerberineRestrictsCoxsackievirusBType3ReplicationviaInhibitionofc-JunN-TerminalKinase(JNK)andp38MAPKActivationInVitro.MedSciMonit,2017,23:1448-1455.42.DawoodFS,JainS,FinelliL,ShawMW,LindstromS,GartenRJ,GubarevaLV,XuX,BridgesCB,UyekiTM.Emergenceofanovelswine-origininfluenzaA(H1N1)virusinhumans.TheNewEnglandjournalofmedicine,2009,360:2605-2615.43.DongWJ,WeiXL,ZhangFY,HaoJF,HuangF,ZhangCL,LiangW.AdualcharacterofflavonoidsininfluenzaAvirusreplicationandspreadthroughmodulatingcell-autonomousimmunitybyMAPKsignalingpathways.SciRep-Uk,2014,4:7237.44.DuCYQ,ZhengKYZ,BiCWC,DongTTX,LinHQ,TsimKWK.YuPingFengSan,anAncientChineseHerbalDecoction,InducesGeneExpressionofAnti-viralProteinsandInhibitsNeuraminidaseActivity.PhytotherRes,2015,29:656-66.45.DuX,XuanBX,ShenZW.ChemicalConstituentswithNeuraminidaseInhibitoryActivesfromCampylotropisHirtella.ActaChimSinica,2015,73:741-748.46.EdingerTO,PohlMO,StertzS.EntryofinfluenzaAvirus:hostfactorsandantiviraltargets.JournalofGeneralVirology,2014,95:263-277.55 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文47.EnkhtaivanG,MuthuramanP,KimDH,MistryB.Discoveryofberberinebasedderivativesasanti-influenzaagentthroughblockingofneuraminidase.BioorganMedChem,2017,25:5185-5193.48.FarzinH,ToroghiR,HaghparastA.Up-RegulationofPro-InflammatoryCytokinesandChemokineProductioninAvianInfluenzaH9N2Virus-InfectedHumanLungEpithelialCellLine(A549).ImmunolInvest,2016,45:116-129.49.GannageM,DormannD,AlbrechtR,DengjelJ,TorossiT,RamerPC,LeeM,StrowigT,ArreyF,ConenelloG,PypaertM,AndersenJ,Garcia-SastreA,MunzC.Matrixprotein2ofinfluenzaAvirusblocksautophagosomefusionwithlysosomes.CellHostMicrobe,2009,6:367-380.50.HaidariM,AliM,CasscellsSW,MadjidM.Pomegranate(Punicagranatum)purifiedpolyphenolextractinhibitsinfluenzavirusandhasasynergisticeffectwithoseltamivir.Phytomedicine,2009,16:1127-1136.51.HaugeSH,DudmanS,BorgenK,LackenbyA,HungnesO.Oseltamivir-ResistantInfluenzaVirusesA(H1N1),Norway,2007-08.EmergingInfectiousDiseases,2009,15:155-162.52.HauseBM,DucatezM,CollinEA,RanZG,LiuRX,ShengZZ,ArmienA,KaplanB,ChakravartyS,HoppeAD,WebbyRJ,SimonsonRR,LiF.IsolationofaNovelSwineInfluenzaVirusfromOklahomain2011WhichIsDistantlyRelatedtoHumanInfluenzaCViruses.PLoSpathogens,2013,9(2):e1003176.53.HeW,HanHM,WangW,GaoB.Anti-influenzaviruseffectofaqueousextractsfromdandelion.VirolJ,2011,8:538.54.KarthickV,RamanathanK.Virtualscreeningforoseltamivir-resistanta(H5N1)influenzaneuraminidasefromtraditionalChinesemedicinedatabase:acombinedmoleculardockingwithmoleculardynamicsapproach.Springerplus,2013,2(1):115.55.KimJH,RyuYB,LeeWS,KimYH.NeuraminidaseinhibitoryactivitiesofquaternaryisoquinolinealkaloidsfromCorydalisturtschaninoviirhizome.BioorganMedChem,2014,22:6047-6052.56.KowalinskiE,ZubietaC,WolkerstorferA,SzolarOH,RuigrokRW,CusackS.StructuralanalysisofspecificmetalchelatinginhibitorbindingtotheendonucleasedomainofinfluenzapH1N1(2009)polymerase.PLoSpathogens,2012,8:e1002831.57.KuoCL,ChiCW,LiuTY.Theanti-inflammatorypotentialofberberineinvitroandinvivo.CancerLetters,2004,203:127-137.56 抗流感病毒中药的筛选58.LawAHY,YangCLH,LauASY,ChanGCF.AntiviraleffectofforsythosideAfromForsythiasuspensa(Thunb.)VahlfruitagainstinfluenzaAvirusthroughreductionofviralM1protein.JEthnopharmacol,2017,209:236-247.59.LeeDCW,CheungCY,LawAHY,MokCKP,PeirisM,LauASY.p38mitogen-activatedproteinkinase-dependenthyperinductionoftumornecrosisfactoralphaexpressioninresponsetoavianinfluenzavirusH5N1.JVirol,2005,79:10147-10154.60.LeeYunS,KimWooS,KimKangH,YoonMyungJ,ChoHyeJ,ShenY,YeJ-M,LeeChulH,OhWonK,KimChulT,Hohnen-BehrensC,GosbyA,KraegenEdwardW,JamesDavidE,KimJaeB.Berberine,anaturalplantproduct,activatesAMP-activatedproteinkinasewithbeneficialmetaboliceffectsindiabeticandinsulin-resistantstates.Diabetes,2006,55:2256-2264.61.LiJH,YangXY,HuangLF.Anti-InfluenzaVirusActivityandConstituentsCharacterizationofPaeoniadelavayiExtracts.Molecules,2016,21(9)pii:E1133.62.LiL,WangX,SharvanR,GaoJ,QuS.Berberinecouldinhibitthyroidcarcinomacellsbyinducingmitochondrialapoptosis,G0/G1cellcyclearrestandsuppressingmigrationviaPI3K-AKTandMAPKsignalingpathways.BiomedPharmacother,2017,95:1225-1231.63.LiuAL,CaoHP,DuGH.Drugscreeningforinfluenzaneuraminidaseinhibitors.SciChinaSerC,2005,48:1-5.64.MaJ,SunQ,MiR,ZhangH.AvianinfluenzaAvirusH5N1causesautophagy-mediatedcelldeaththroughsuppressionofmTORsignaling.JournalofGeneticsandGenomics,2011,38:533-537.65.MatrosovichMN,MatrosovichTY,GrayT,RobertsNA,KlenkHD.Neuraminidaseisimportantfortheinitiationofinfluenzavirusinfectioninhumanairwayepithelium.JVirol,2004,78:12665-12667.66.NguyenHT,FryAM,GubarevaLV.Neuraminidaseinhibitorresistanceininfluenzavirusesandlaboratorytestingmethods.AntivirTher,2012,17:159-173.67.NguyenTNA,DaoTT,TungBT,ChoiH,KimE,ParkJ,LimSI,OhWK.InfluenzaA(H1N1)neuraminidaseinhibitorsfromVitisamurensis.FoodChem,2011,124:437-443.68.OrhanI,OzcelikB,KaraogluT,SenerB.AntiviralandantimicrobialprofilesofselectedisoquinolinealkaloidsfromFumariaandCorydalisspecies.ZNaturforschC,2007,62:19-26.57 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文69.PeirisJSM,YuWC,LeungCW,CheungCY,NgWF,NichollsJM,NgTK,ChanKH,LaiST,LimWL,YuenKY,GuanY.Re-emergenceoffatalhumaninfluenzaAsubtypeH5N1disease.Lancet,2004,363:617-619.70.RussellRJ,HaireLF,StevensDJ,CollinsPJ,LinYP,BlackburnGM,HayAJ,GamblinSJ,SkehelJJ.ThestructureofH5N1avianinfluenzaneuraminidasesuggestsnewopportunitiesfordrugdesign.Nature,2006,443:45-49.71.RyuYB,KimJH,ParkSJ,ChangJS,RhoMC,BaeKH,ParkKH,LeeWS.InhibitionofneuraminidaseactivitybypolyphenolcompoundsisolatedfromtherootsofGlycyrrhizauralensis.BioorgMedChemLett,2010,20:971-974.72.ShiFY,XieYC,ShiLF,XuWF.ViralRNAPolymerase:APromisingAntiviralTargetforInfluenzaAVirus.CurrMedChem,2013,20:3923-3934.73.ShinHB,ChoiMS,YiCM,LeeJ,KimNJ,InnKS.Inhibitionofrespiratorysyncytialvirusreplicationandvirus-inducedp38kinaseactivitybyberberine.IntImmunopharmacol,2015,27:65-68.74.SteinhauerDA.Roleofhemagglutinincleavageforthepathogenicityofinfluenzavirus.Virology,1999,258:1-20.75.StevaertA,NaesensL.TheInfluenzaVirusPolymeraseComplex:AnUpdateonItsStructure,Functions,andSignificanceforAntiviralDrugDesign.MedResRev,2016,36:1127-1173.76.SuW,XuHF,HuangH.Invitroanti-influenzaAH1N1effectofextractofBupleuriRadix.ImmunopharmImmunot,2011,33:433-437.77.TianL,WangZY,WuH,WangS,WangY,WangYY,XuJW,WangLY,QiFC,FangML,YuDH,FangXX.Evaluationoftheanti-neuraminidaseactivityofthetraditionalChinesemedicinesanddeterminationoftheanti-influenzaAviruseffectsoftheneuraminidaseinhibitoryTCMsinvitroandinvivo.JEthnopharmacol,2011,137:534-542.78.VargheseJN,LaverWG,ColmanPM.Structureoftheinfluenzavirusglycoproteinantigenneuraminidaseat2.9Aresolution.Nature,1983,303:35-40.79.WangXY,JiaW,ZhaoAH,WangXR.Anti-influenzaagentsfromplantsandtraditionalChinesemedicine.PhytotherRes,2006,20:335-341.80.WangZ,ChengLP,ZhangXH,PangW,LiL,ZhaoJL.Design,synthesisandbiologicalevaluationofnoveloseltamivirderivativesaspotentneuraminidaseinhibitors.BioorgMedChemLett,2017,27:5429-5435.58 抗流感病毒中药的筛选81.WeiHL,WangS,XuF,XuLF,ZhengJR,ChenY.Evaluationofa13-hexyl-berberinehydrochloridetopicalgelformulation.DrugDevIndPharm,2013,39:534-539.82.WetherallNT,TrivediT,ZellerJ,Hodges-SavolaC,McKimm-BreschkinJL,ZambonM,HaydenFG.Evaluationofneuraminidaseenzymeassaysusingdifferentsubstratestomeasuresusceptibilityofinfluenzavirusclinicalisolatestoneuraminidaseinhibitors:Reportoftheneuraminidaseinhibitorsusceptibilitynetwork.JClinMicrobiol,2003,41:742-750.83.WuY,LiJQ,KimYJ,WuJ,WangQ,HaoY.InVivoandinVitroAntiviralEffectsofBerberineonInfluenzaVirus.ChinJIntegrMed,2011,17:444-452.84.WuY,WuY,TefsenB,ShiY,GaoGF.Bat-derivedinfluenza-likevirusesH17N10andH18N11.Trendsinmicrobiology,2014,22:183-191.85.YangJ,YanH,LiS,ZhangM.BerberineAmelioratesMCAOInducedCerebralIschemia/ReperfusionInjuryviaActivationoftheBDNF-TrkB-PI3K/AktSignalingPathway.NeurochemicalResearch,2018,43:702-710.86.YangZW,HaoDX,CheYZ,YangJH,ZhangL,ZhangSL.Mutation-inducedspatialdifferencesinneuraminidasestructureandsensitivitytoneuraminidaseinhibitors.ChinesePhysB,2018,27:018704.87.YangZW,YangYC,WuF,FengX.Computationalinvestigationofinteractionmechanismsbetweenjugloneandinfluenzavirussurfaceglycoproteins.MolSimulat,2013,39:788-795.88.YiX,GuoZR,ChuFM.Studyonmolecularmechanismand3D-QSARofinfluenzaneuraminidaseinhibitors.BioorganMedChem,2003,11:1465-1474.89.YuM,WangY,TianL,WangYY,WangXZ,LiangWG,YangJY,YuDH,MaTH,FangXX.SafflominAinhibitsneuraminidaseactivityandinfluenzavirusreplication.RscAdv,2015,5:94053-94066.90.ZhangX,CaoY,LiJH,LiuAL,LiuHB,HuangLF.NeuraminidaseInhibitoryActivityandConstituentCharacterizationofFagopyrumdibotrys.Molecules,2017,22(11)pii:E1998.91.ZhouXL,LiHT,ShiZL,GaoSJ,WeiSZ,LiK,WangJB,LiJY,WangRL,GongM,ZhaoYL,XiaoXH.InhibitionactivityofatraditionalChineseherbalformulaHuang-Lian-Jie-Du-Tanganditsmajorcomponentsfoundinitsplasmaprofileonneuraminidase-1.SciRep-Uk,2017,7(1):15549.59 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文92.ZhuHY,ChenMC,ShiXL,ShiCC,HuangCG.Materialbasisstudiesofanti-InfluenzaAactiveingredientsinTanreqingInjection.BiomedChromatogr,2018,32:e4097.60 抗流感病毒中药的筛选致谢两年的研究生生活已经进入了尾声，我站在人生的路口，回望来时的路，不禁感慨不已，多么好的年岁啊，感谢上天的馈赠，感恩有你。在实验室这一个大家庭中，感谢陈焕春院士与金梅林教授提供的实验平台与指导，感谢张安定教授在课题上提供的指导，感谢我的导师周红波教授，周老师言传身教，其严谨的学术态度和对细节的精益求精，让我认识到了自己的粗疏大意，培养了我对学术的敬畏之心。感谢实验室师兄弟姐妹给予我的帮助和关怀，从他（她）们身上，我学会了实验的基本操作技能和实验设计的基本思路，同时，还让我能见贤思齐，吸收他（她）们为人处事的闪光点，不断完善自身。在实验室之外，感谢我的舍友们，她们的体贴与帮助，让我想起她们就能会心微笑；感谢一起读研的11E3的小伙伴们，与他（她）们的见面寒暄，情感交流以及学业上的互帮互助，给予了我同道前行的充实感；感谢我们16级兽医班的班长和支书，他们的认真负责，让我们能及时收到重要消息，及时填写申请学位所需的各种材料。在牵动我心神的千里之外，感谢我的父母，他（她）们也许无能也无力参与我的梦想，但是，他（她）们殷殷关切的絮语，藏着包容与鼓励的眼神，为我的成长而骄傲的神色，都是我消除疲累的灵丹，给予我继续前行的动力与勇气。因为他（她）们的存在，我与这世界才有了联系，我才有根，祝愿我的父母身体康健，无病无痛。遇见他（她）们，我之幸运，上天如此眷顾，受之有愧，我立志于做一个传灯者，尽我所能，将我在科研、学习和生活中所得到的温暖传递出去。61