流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选

《流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences硕士学位论文二。一三年五月 IIlllIlllIlllIIllIIY2381716r⋯●■●■●』●●1l·～一lneInteraCtlonDe佩reenlnIlUenZaVlrUSandnostcellIaCtorSBy"白nbinLaiADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofBiochemistryandMolecularBiologyInstituteofMicrobiologyChineseAcademyofSciencesMay,2013 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体己经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书已使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人愿承担一切责任。学位论文作者签名：懈"Iml、年r月学位论文使用授权声明77日l本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：导师签名：嚣详；岩琴昌日期：认c’年r月哆日 摘要流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选赖文彬(生物化学与分子生物学)指导教师：叶听研究员流感病毒是属于正粘病毒科的负链RNA病毒。流感病毒大流行会给人类生命健康造成严重威胁。通过研究流感病毒与宿主细胞因子间的相互作用可以加深对流感病毒的认识，也可以为抗流感药物的开发提供新靶点。目前以达菲为代表的抗流感药物面临严重的耐药性问题，筛选新型的流感病毒抑制剂具有重要意义。流感病毒转录需要摘取宿主细胞mRNA的帽子结构作为引物来起始。DSIF和NELF是RNA聚合酶polII的转录延伸调节因子，可以使polII停滞在基因的启动子区，推测这个过程有利于病毒聚合酶摘取帽子结构。染色质免疫沉淀实验证明流感病毒感染后DSIF和NELF在看家基因的启动子区结合增强。将细胞中的DSIF敲低后，流感病毒的复制受到抑制，说明DSIF和NELF能够辅助流感病毒复制。宿主细胞MicroRNA能够调控病毒的复制过程。通过比较流感病毒复制差异明显的细胞系中MicroRNA表达谱，利用双荧光报告系统筛选出了可能与流感病毒M片段具有相互作用的MicroRNAMir-33a。Mir-33a能抑制流感病毒的复制，与M片段相互作用位点定位在57端1-340区域。同时也筛选出了能够间接抑制流感病毒的Mir-21，Mir-27a和Mir一194。利用流感病毒启动子报告细胞株HeLa-IAV-Luc从微生物代谢产物化合库中筛选出了能够抑制流感病毒的化合物Colletodiol。Colletodiol对血凝素蛋白(hema991utinin，HA)功能没有影响，能够抑制流感病毒RNA聚合酶的活性，导致病毒RNA合成受到抑制。关键词：流感病毒，DSIF，NELF，Mir-33a，HeLa-IAV-Luc细胞株，Colletodiol，流感病毒RNA聚合酶 ABSTRACTTheinteractionbetweeninfluenzavirusandhostcellfactorsandscreeningofinfluenzavirusinhibitorsWenbinLai(Biochemistryandmolecularbiology)DirectedbyDr．XinYeAbstractInfluenzavirusbelongstoOrthomyxoviridaewithagenomecomposedofsegmentedminusRNAs．Pandemicofinfluenzavirusisaseverethreattohumanhealth．Investigationoftheinteractionbetweeninfluenzavirusandhostcellfactorscanfacilitateourunderstandingoftheviruslifecycleandhelptoprovidenewtargetsitesforthedevelopmentofinfluenzavirusinhibitors．Thewidespreadofoseltamivirresistantvirusmakesthescreeningofnewanti-viralcompoundsmoresignificant．InfluenzavirustranscriptioninitiationneedstocapturetheCAPstructureofhostcellmRNAasprimers．DSIFandNELFaretwotranscriptionelongationregulatoryfactorswhichstoptheRNApolymearaseIIatthepromoterregionwhileunphosphorylated．WespeculatedthisprocessmightfacilitateCAPsnatchingofinfluenzaviralRNApolymerase．ChromatinimmunoprecipitationassayindicatedthatinfluenzavirusinfectioncouldenhancethebindingofDSIFandNELFatthepromoterregionofhouse-keepinggene．KnockdownofDSIFcouldblockthereplicationofinfluenzavirus．TheresultsshowedDSIFandNELFhadapositiveroleininfluenzavirusreplicationHostcellMicroRNAsparticipateintheregulationofvirusreplication．BycomparingtheexpressionlevelofMicroRNAsintwocelllinewhichdifferssignificantlyforinfluenzavirusreplication，wescreenedoutMir-33awhichmaytargettheMsegmentofinfluenzaAvirusthroughthedualluciferasereportsystem．ThetargetsiteofMir-33amightlocateinthe1-340areafromthe5'endoftheMsegment．Mir-33acouldinhibitthereplicationofinfluenzavirus．Besides，wealsosereenedoutMir-21，Mir-27aandMir-194whichinhibitedinfluenzavirusindirectly．HeLa-IAV-Lucisaninfluenzaviralpromoterreportercellline．WescreenedoutinfluenzavirusinhibitorColletodiolfromthecompoundsisolatedfrommicrobial 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选metabolitesthroughtheHeLa．IA讥Luccellline．Colletodioldidn’taffectthefunctionofhemagglutinin(HA)butblockedtheactivityofviralRNApolymeraseandresultedininhibitionofviralRNAsynthesis．Kevwords：influenzavirus，DSIF，NELF，Mir．33a，HeLa．IpⅣ-Luccellline，Colletodiol，viralRNApolymerase 目录第一章研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一节流感病毒综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。l1．1流感病毒简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．2季节性流感和流感大流行⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．3A型流感病毒的结构和组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．4流感病毒的复制周期⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3第二节宿主细胞转录系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72．1转录的过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．2转录延伸的调节⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第三节MicroRNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．93．1MicroRNA的成熟⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．93．2MicroRNA作用的机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103．3MicroRNA与病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第四节抗流感病毒药物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11第二章流感病毒调节宿主细胞转录起始机制的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第一节引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14第二节材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2使用仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3染色质免疫沉淀实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．4实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．5Lipofectamine2000转染NELF—A和spt5siRNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．6NELF-A和spt5siRNA转染后流感病毒的感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．7流感病毒感染后细胞样品的收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18第三节实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183．1流感病毒感染后会促进DSIF和NELF在基因启动子区的停留⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．183．2敲低DSIF可以抑制流感病毒的复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选第四节讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21第一节引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21第二节材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2所用仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．3实验所用溶液配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．4质粒的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．5质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．6流感病毒M片段截断体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．7细胞复苏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．8细胞培养与传代⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．9细胞冻存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．10PEI转染细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．11荧光素酶报告基因的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。272．12Lipofectamine2000转染MicroRNAmimic或inhibitor⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．13Lipofectamine2000转染质粒和MicroRNAmimic⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．14流感病毒感染细胞及样品收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．292．15SDS-PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．16WesternBlot实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．312．17RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．18MicroRNA的反转录和实时荧光定量实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32第三节实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．13’UTR双荧光素酶报告系统在不同细胞系的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．2HeLa细胞和293T细胞中MicroRNA表达情况的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3抑制流感病毒MicroRNA的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．4Mir-33a在流感病毒M片段上靶位点的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．5Mir-33ainhibitor可以促进流感病毒在HeLa细胞的复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯。373．6Mir-33a可以抑制流感病毒在A549细胞中的复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．7Mir-21，Mir-27a和Mir-194能够抑制流感病毒的复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39 目录第四节讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39第四章抗流感病毒化合物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41第一节引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l第二节材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．412．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯412．2抗流感病毒化合物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．3蛋白免疫印迹试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．4HA假病毒包装⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯432．5HA假病毒抑制试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯432．6流感病毒聚合酶复合体(vRNP)活性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯442．7RNA的提取和实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44第三节结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．1抗流感病毒化合物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2Colletodiol化合物不影响流感病毒进入细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．463．3Colletodiol化合物会显著抑制流感病毒聚合酶(vRNP)活性⋯⋯⋯⋯⋯．473．4Colletodiol化合物能够抑制流感病毒RNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48第四节讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49第五章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61 第一章研究进展第一节流感病毒综述1．1流感病毒简介流感病毒属于正粘病毒科，其基因组是由分段的负链RNA组成。根据核壳蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的差异，可将流感病毒分为A、B和C型，这三种型的流感病毒的测序结果表明，他们来源于共同的祖先，但是在遗传学上存在差异。根据病毒颗粒表面的糖蛋白神经氨酸酶(HA)和唾液酸酶(NA)的不同，A型流感病毒又可分为各种亚型。在流行的A型流感病毒中己发现17种HA和9种NA。目前为止已发现自然界存在有105种亚型，水禽中都有存在。目前能够引起人类间持续、广泛的大流行的A型流感病毒仅限于H1、H2、H3亚型和N1、N2亚型[1]。但是自1997年以来，还陆续出现了H5N1、H7N7和H9N2亚型禽流感病毒直接感染人的报道，尤其是H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染人群后会产生高致死率。2009年猪源性甲型H1N1在全世界流行和爆发，但是该毒株致死率较低。2013年发现的新型H7N9亚型流感病毒能直接从禽类感染人，但尚未发现该型流感病毒能在人际间传播[2]。1．2季节性流感和流感大流行流感是由流感病毒引起的传染性呼吸道疾病，可以分为季节性流感和流行性流感。流感的症状有的比较轻微，也有的较为严重，甚至可以导致死亡。季节性流感每年都能够在全球范围内引起严重的疾病和死亡，仅在美国每年就约有2500万至5000万人感染。20世纪以来世界范围内共有四次流感大爆发，其中以1918年西班牙流感最为严重，H1N1通过基因组的重组使禽流感病毒获得了感染人类的能力，在全球范围内导致了约5000万人的死亡[3]。1957年的亚洲流感(H2N2)导致了400万人的死亡，1967年的香港流感(H3N2)造成的死亡人数约为200万。2009年三月末爆发的墨西哥流感(H1N1)在人际间传播迅速，但 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选病毒致病力较低。1．3A型流感病毒的结构和组成电镜下，A型流感病毒呈球状或丝状结构，球状时直径为100nm，丝状时可达300nm。A型流感病毒(图1)的基因组由8条负链RNA片段组成，分别为PA，PBl，PB2，NP，HA，NA，NS和M。每条RNA片段都被NP蛋白包裹，并且与流感病毒聚合酶蛋白PBl，PB2和PA共同组成vRNP复合体。每条片段可以编码卜2种蛋白质。其中PBl，M，NS和PA片段均可以编码两种蛋白质。病毒编码的12种蛋白质中，PB2，PBl和PA三种蛋白构成流感病毒RNA聚合酶复合体，负责流感病毒基因组的转录和复制，在流感病毒复制周期中发挥着关键的作用[4]；基质蛋白Ml存在于病毒颗粒的基质中，流感病毒的vRNP复合体被其包裹，病毒颗粒外层则是从宿主细胞中获得的脂质双层膜；血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)和离子通道蛋白(M2)镶嵌在病毒颗粒的外膜中。HA与NA的分子比例约为4：1，M2与HA的分子LLfflJ约为1：10。NS片段能够编码两种非结构性蛋白NSl和NS2。NSl并不存在于成熟的病毒颗粒中，在病毒感染宿主细胞后才表达，主要作用是干扰宿主细胞自身的免疫反应，为病毒复制创造有利条件。NS2蛋白存在于成熟的病毒颗粒中，参与流感病毒蛋白的核输出过程[5]。近年来研究发现有的流感病毒PBl片段还能编码由87个氨基酸组成的蛋白PBl一F2，PBl一F2也是一种非结构性蛋白，可以引起宿主细胞的凋亡[6]。2012年新发现的PA片段移码产物PA—X蛋白能够抑制宿主细胞基因的表达，调节宿主细胞对病毒感染的反应[7]。 第一章研究进展图1流感病毒病毒粒子和基因组结构Fig．1Schematicdiagramofinfluenzavirusparticle流感病毒的启动子结构独特，RNA片段两端的非编码区各包含有一段启动子序列，包括57端的13个碱基和37端的12个碱基，两端序列合起来就是完整的病毒启动子。每条RNA片段的启动子在不同亚型的流感病毒中是高度保守的，而且5’和37两端的序列能够通过反向互补使基因组片段首尾相接形成锅柄状结构[8-10]。1．4流感病毒的复制周期如图2所示，流感病毒的复制周期可分为以下几个步骤：病毒侵染细胞，病毒vRNP复合物入核，病毒基因组转录和复制，病毒蛋白质合成及vRNP复合物出核，病毒包装及出芽[11]。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选图2流感病毒的复制周期Fig。2Illustrationoftheinfluenzavirusreplicationcycle1．4．1流感病毒吸附和进入宿主细胞流感病毒囊膜表面的血凝素HA蛋白能够识别宿主细胞表面的唾液酸受体，在受体介导的内吞作用下进入宿主细胞。流感病毒的宿主特异性是由HA与细胞表面唾液酸受体的结合方式决定的，感染人类的流感病毒其HA蛋白会识别通过2-6糖苷键与半乳糖相连的唾液酸分子，而感染禽类的流感病毒其HA蛋白则识别通过2—3糖苷键与半乳糖相连的唾液酸分子[12]。流感病毒进入内吞小体后通过与胞内体膜融合从而将病毒颗粒内的vRNP释放到细胞质中[13]。内吞小体的pH值对于病毒包膜与胞内体膜融合是至关重要的。在病毒与胞内体融合的过程中胞内体内的H+通过病毒表面的M2蛋白作为离子通道进入病毒颗粒内从而降低病毒颗粒内部pH值[14-15]。pH值的降低会导致HA蛋白构象发生改变，从而暴露出融合肽并最终介导病毒包膜和胞内体膜的融合，为vRNP复合物打开了入核的通道[16-17]。4 第一章研究进展1．4．2流感病毒vRNP复合物入核病毒颗粒内pH值的下降使得vRNP复合物与M1蛋白脱离并释放到细胞质中。流感病毒基因组的复制需要在宿主细胞核内进行，因此病毒vRNP被释放进入细胞质后，还有一个运输到细胞核内的过程。病毒vRNP的入核是由病毒蛋白携带的核定位信号(NuclearLocalizationSignal，NLS)介导的，通过这些核定位信号的引导将vRNP运输到细胞核中。研究发现仅NP上的核定位信号就能够引导vRNP的入核[18-21]。这是由于NP蛋白上有多个核定位信号，N端有一个强核定位信号[22-21]，在198—216位氨基酸之间有2个较弱的核定位序列[23]，而在32卜400位氨基酸之间还有第3个核定位序列[24-21]。NP蛋白上的核定位序列可以通过与核质运输蛋白相互作用进而利用宿主细胞入核机制将vRNP复合物运输至细胞核内[25]。1．4．3流感病毒mRNA的转录及基因组的复制由于流感病毒的聚合酶复合体起始mRNA的转录是引物依赖性的，因此在转录的过程中，流感病毒需要从宿主细胞mRNA中摘取57帽子结构来作为自身基因转录起始的引物[26—27]。在转录的过程中，聚合酶复合体不同亚基发挥着不同的功能。其中PB2亚基能够识别和结合宿主细胞转录mRNA时所产生的5’末端帽子结构[28-29]，PA亚基对于流感病毒的转录和复制都有至关重要的作用[30]，其核酸内切酶活性让其发挥了剪切宿主mRNA5’末端帽子的功能[31]。PBl亚基则主要负责结合模板并合成RNA[32-33]。流感病毒mRNA的成熟还要经过加PolyA尾以及剪切的过程。在vRNA模板的57末端具有由5—7个尿嘧啶组成的PolyU，流感病毒的聚合酶会在这段序列上反复地移动，合成病毒mRNA37端的PolyA结构[35—36]。新合成的mRNA会被转运到细胞核外并翻译出病毒的蛋白。流感病毒mRNA的剪切需要借助宿主细胞的剪切机制，并且会阻止细胞对细胞自身合成的mRNA进行剪切[37]。流感病毒基因组为单链负链RNA，所以要完成复制需要经历两个过程。首先，聚合酶会以vRNA为模板，合成一条与vRNA完全互补的正链RNA，称作互补RNA(complementaryRNA，cRNA)。与mRNA不同，cRNA的合成不需要引物起始，也没有在37末端加入PolyA的过程，由聚合酶直接起始并完成合成。关于流感5 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选病毒从转录到复制的具体转换机制一直不是很清楚，有假说提出在转录和复制时期的病毒聚合酶复合体的结构差异导致了其行使转录或复制功能。也有假说认为cRNA合成后也是被NP蛋白包裹着，因此可溶性NP蛋白量可能介导了转录到复制的转换过程[38]。cRNA合成后就可以以cRNA作为模板合成出负链的基因组vRNA，vRNA的合成也不需要引物的起始。近期的研究表明，在流感病毒复制过程中会产生22-27nt的小病毒RNA(smallviralRNA，svRNA)，其序列与流感病毒的vRNA的末端同源，可以与病毒RNA聚合酶复合体结合并起始vRNA的合成，这些svRNA被认为是能够调控流感病毒从转录到复制转换的过程[39]。1．4．4病毒蛋白质的表达和vRNP的核输出转录出的病毒mRNA转运到宿主细胞质中后就开始了病毒蛋白质的翻译。流感病毒蛋白的表达具有时序性[40]，其中NP和NSlmRNA和蛋白的合成发生在病毒复制的早期，而HA，NA，尤其是M1的转录和表达则发生在病毒复制的后期[41]。各种病毒蛋白表达的时序性差异是由蛋白主导的功能决定的。NP蛋白需要覆盖vRNA和cRNA从而协助病毒的复制，而NSl蛋白则要对抗宿主细胞的免疫反应，两种蛋白在复制的早期发挥着重要的功能，因此需要在病毒复制早期表达。M1蛋白即能抑制病毒mRNA的转录又能介导vRNP的出核，这就要求M1在复制后期才进行表达。只有含有负链的vRNP复合体才会被运输出细胞核外[41]。M1和NS2／NEP两种蛋白参与了vRNP的出核[42]。vRNP的出核需要依赖CRMl介导的出核机制。NP蛋白可以直接和CRMl蛋白发生相互作用，Ml蛋白的C末端可以结合vRNP复合物，M1蛋白的N末端可以结合NEP蛋白。而NEP蛋白通过GTP的水解可以结合到CRMl蛋白上。所以推测NEP蛋白通过M1蛋白作为桥梁与负链vRNP结合，随后NEP蛋白结合到CRMl蛋白上，通过CRMl介导的通路将vRNP复合物运输到核外[43—44]。1．4．5病毒颗粒的装配和释放vRNP进入细胞质后，流感病毒的组装和出芽就开始了。流感病毒是包膜病毒，病毒颗粒表面的囊膜来自于宿主的细胞膜。HA，NA和M2蛋白是形成病毒颗6 第一章研究进展粒所必须的[45]。流感病毒的装配和出芽在极性细胞顶端的细胞膜上进行，HA、NA和M2蛋白都定位于极性细胞的顶端。M2蛋白的尾巴对于病毒颗粒的形成是至关重要的，通过截断和突变技术证明M2的尾巴异常会导致包装出长条型的病毒颗粒[46]。位于双层膜下面的M1蛋白对于病毒颗粒包装时最后的封闭和出芽发挥着重要的作用[47]。准确的将全部8条基因组片段装配到病毒颗粒中是形成具有感染性病毒颗粒所必须的。8条基因组片段如何能够精确包装进入病毒颗粒的机制并不清楚，当前有两种假说试图解释这一复杂而精确的过程[40，48，49]。第一种假说是随机包装模型，该假说认为流感病毒的8条vRNA具有相同的包装信号，基因组片段在包装过程中是被随机分配到病毒颗粒中去的。而另外一种假说为选择性包装模型，该假说认为病毒的每种vRNA上都携带有特异的信号，通过这些特异的信号指导基因组8条片段特异性的分配到病毒颗粒中。随着越来越多病毒基因组片段5’和3’端包装信号的发现，人们更偏向于选择性包装模型这一假说[50-54]。流感病毒出芽后还会继续停留在细胞膜表面，因为病毒囊膜表面的HA蛋白能够与细胞表面的唾液酸受体结合。此时，病毒颗粒表面的NA会剪切唾液酸，最终完成病毒的释放过程。第二节宿主细胞转录系统流感病毒自身不能合成mRNA的帽子结构，需要从宿主细胞mRNA57端获取帽子结构及10-13个核苷酸作为转录起始的引物。宿主细胞内mRNA的转录是由聚合酶polymeraseII负责的，很多研究都证实细胞内的polymeraseII参与到流感病毒的转录和复制过程中[55-58]。2．1转录的过程转录的过程分为起始、延伸和终止三个步骤。转录的起始是包含多个步骤的复杂过程，包括RNA聚合酶的招募，转录起始位点DNA的解旋以及mRNA最初几个磷酸二酯键的形成。启动子的识别从RNA聚合酶polII以及基本转录因子(GeneralTranscriptionFactors，GTFs)结合到启动子上开始。形成前起始复合物(pre—initiationcomplex，PIC)需要polII，TFIIB，TFIID，TFIIE，7 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选TFIIF和TFIIH的参与，PIC的形成也受到了众多细胞因子的调控[59-60]。PIC形成并合成了mRNA的最初几个碱基后，转录就由起始阶段进入延伸阶段。在转录由起始转换到延伸的过程中，polII的CTD区(C-terminaldomain)的磷酸化状态起着重要的调节作用[61]。CTD区由多个七肽重复序列YSPTSPS组成，该重复序列上的多个位点可以发生磷酸化[62]。polII结合到启动子前其CTD区基本是未被磷酸化的。结合到启动子区后CTD上的5位丝氨酸被CDK7磷酸化，这被认为有利于polII从启动子上脱离向下游前进[63]。CTD上的5位丝氨酸磷酸化并不足以使polII进入高效的延伸阶段，而P-TEFb(PositivetranscriptionelongationfactorB)对于polII进入高效的延伸阶段发挥着重要调节作用[64]。转录的最后一个阶段即为转录的终止。转录的终止有两种模式。第一种模式为polyA信号指导的转录终止。前体mRNA被转录终止因子识别并在特异性位置剪切，随后进行37末端的多聚腺苷酸化，从而产生polyA信号，这个信号被特异因子识别，最终使polII从DNA链上释放从而终止转录。第二种模式为非polyA信号指导的转录终止，主要发生在较短的转录产物如snoRNA上[65]。这些RNA剪切位点本身具有核酶特性，可以自我催化剪切，从而产生供其他因子修饰的37末端和供核酸外切酶降解的未被修饰的57末端，人类有Xrn2核酸外切酶来实现，Xrn2追上polII时会促使转录终止[66]。2．2转录延伸的调节核酸类似物DRB(5，6-dichloro一卜4一D—ribofuranosylbenzimidaz01)处理细胞后，能够抑制95％mRNA的合成[67]。随着研究的深入，发现DRB的靶标并不是polII本身，而是CyclinTI／CDK9复合物即P-TEFb[68]。P-TEFb的加入并没有使polII体外延伸复合物活性增强，暗示着P-TEFb对polII的促进作用还有其它转录延伸抑制因子参与。后来的研究发现这些转录延伸抑制因子为DRBSensitivity—InducingFactor(DSIF)和NegativeELongationFactor(NELF)complex[69-70]。NELF结合到早期延伸复合物中需要DSIF的协助，而且这两种细胞因子对于抑制转录延伸都是必须的[71]。P-TEFb可以磷酸化polIICTD区的2位丝氨酸以及DSIF和NELF。DSIF被磷酸化后变成转录延伸促进因子并继续 第一章研究进展结合在转录延伸复合物上，NELF被磷酸化后会脱离转录延伸复合物。P-TEFb的激酶活性使得DSIF和NELF对转录延伸的抑制作用得到解除[72—73]。已有研究表明，流感病毒的RNA聚合酶在P-TEFb的帮助下结合到宿主细胞的polII上来获取新合成的mRNA57端的帽子结构[34]。DSIF和NELF能够使polII停滞在启动子的前段，这在空间上是有利于病毒获取帽子结构的。暗示着这两个细胞因子也可能参与了流感病毒的复制。第三节MicroRNAMicroRNA是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，其在生物体中发挥着重要的调节功能。MicroRNA可以通过与mRNA互补性结合后通过介导mRNA降解或抑制mRNA的翻译来发挥调节作用[74]。3．1MicroRNA的成熟刚转录出的MicroRNA前体常形成茎环发卡结构，而且含有大量的U／G碱基对，这个前体物需要经过一系列的加工过程才能形成成熟的MicroRNA。MicroRNA来自于基因组的基因间隔区或者pre-mRNA的内含子中，但是不论其来自何处，其加工成熟机制都是相同的。MicroRNA的转录是由聚合酶II完成的，转录出一段较长的MicroRNh原初转录物(pri-MicroRNA)。随后在细胞核中，RNA酶IIIDrosha—DGCR复合体在MicroRNA原初转录物(pri-MicroRNA)基部切割形成60一70个核苷酸的57末端具有磷酸基，37末端具有二核苷酸的前体MicroRNA(pre-MicroP斟A)[75]。转运蛋白Exportin-5能够结合pre—MicroRNA，并依赖Ran-GTP将pre-MicroRNA运输到到细胞质中[76-77]。pre-MicroRNA运输到细胞质后，Dicer酶可以识别pre-MicroRNA双链的57末端磷酸及37末端突出，并切断双链产生结构类似于siRNA的二聚体，在经过切割和核质转运后，RNA解旋酶作用于MicroRNA：MicroRNA*二聚体，其中MicroRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合并发挥作用，MicroRNA*则被降解[74-78]。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选3．2MioroRNA作用的机制MicroRNA能够结合到RISC复合体并将其引导至靶标mRNA来调节基因的表达。MicroRNA抑制基因表达的方式有两种：使mRNA发生剪切或抑制mRNA翻译。通过何种方式进行基因表达的调节取决于MicroRNA与目标mRNA序列之间的互补程度。如果MicroRNA将RISC复合体引导至互补程度较高的目标mRNA时，目标mRNA则会被剪切降解；如果MicroRNA与目标mRNA互补程度不够，mRNA的翻译将会被抑制[79-80]。对目标mRNA的剪切是由Argonaute(Ago)蛋白家族来完成的，人类的4种Ago蛋白中，只有A902具有剪切功能[8卜82]。当剪切完成以后，MicroRNA可以进入下一轮，继续进行目标mRNA的剪切。MicroRNA灵活发挥作用的机制使其调控mRNA的范围更加广阔。MicroRNA在目标mRNA上的识别位点大多分布在mRNA的57或37UTR中，少数存在于基因的开放阅读框ORF中，这很可能是由于真核细胞mRNA的37UTR区域在翻译水平上的调控中发挥着重要的作用。MicroRNA和靶标mRNA识别配对的过程中，MicroRNA5’末端的2-7位碱基与靶序列的互补非常重要，这个区域被称为MicroRNA的种子序列Seed区[83]。MicroRNASeed区的碱基与目标mRNA3’UTR完全互补将会导致mRNA翻译的抑制。同源MicroRNA的种子序列都是非常保守的，在用软件预测MicroRNA靶点的时候，这6个碱基与靶序列匹配的程度要比其他区域更加重要[84]。MicroRNA在发挥作用时，除了序列特异性外，目标mRNA的二级机构，其它细胞蛋白在目标mRNA上的结合情况等也都是重要的影响因素。3．3MicroRNA与病毒病毒作为胞内的致病原，其复制和传播都要依赖于宿主细胞分子的参与。这就意味着宿主细胞存活与病毒复制过程需要有合适的平衡。随着二者共生时间的不断延长，导致了病毒与宿主细胞间具有复杂的相互作用。随着Epstein—Barrvirus(EBV)小调节RNAs的发现，很快证明了病毒可以利用RNA沉默机制来同时调控自身的转录和细胞的靶基因[85]。MicroRNA具有很多优点，如可以通过下调基因表达来创造对病毒复制有利10 第一章研究进展的环境，分子量小，以及没有抗原性，这些都能够解释病毒进化出会编码有利于自身的MicroRNA的能力。SV40病毒编码的MicroRNAmiR-Slseed区与人类细胞编码的miR423-5p同源，且能够调节自身T抗原的表达以利于病毒复制[86]。hCMV和HSV-1也可以利用自身编码的MicroRNA调节病毒蛋白的表达，从而调控病毒自身的复制周期[87-88]。研究也发现流感病毒可以编码大小为22—27nt的smallviralRNAs(svRNAs)来调节病毒繁殖过程中转录到复制的转换[39]。牛白血病病毒可以编码类似于宿主miR-29的MicroRNABLV-miR-B4从而引起肿瘤的发生[89]。病毒在与细胞长期共生的过程中进化出了编码利于自身复制的MicroRNA的能力。而细胞也在这个过程中产生了多种能够对抗病毒感染的MicroRNA。随着高通量筛选技术和预测软件的完善，越来越多病毒编码的MicroRNA被发现，而宿主细胞中具有抑制病毒功能的MicroRNA也逐渐增加[90]。研究发现miR一24和miR一93可以抑制水泡性口炎病毒VSV蛋白的表达[91]；将miR一28，miR一125b，miR一150，miR一223和miR一382表达水平降低后发现艾滋病毒HIV的复制得到增强[92]；miR-122可以抑制乙肝病毒HBV的复制[93]；宿主细胞内的miR-323，miR-491和miR-654可以通过抑制流感病毒PBl基因的表达来阻断流感病毒的复制[94]。miR—let一7c则可以抑制流感病毒M1蛋白的表达[95]。病毒感染还可能会导致宿主细胞MicroRNA表达谱发生变化。1918年大流行的H1N1流感病毒和A／Texas／36／91病毒在对宿主的MicroRNA表达谱的影响方面有很大的差异，这种差异导致在1918重组毒株感染的细胞中，很多免疫相关基因的表达下调[96]。和正常的细胞相比，流感病毒感染后的细胞中与免疫，细胞周期，DNA损失和修复，凋亡以及细胞增殖等通路相关的MicroRNA表达都发生了明显的变化[97]。这些现象都表明了病毒很可能通过影响宿主MicroRNA的表达谱的变化创造有利于自身复制的条件。第四节抗流感病毒药物的筛选2009年猪源性H1N1流感病毒在世界范围内的大流行暴露了当前在控制流感病毒感染方面的弊端。疫苗是预先防止流感病毒大流行的最佳选择，但由于从病毒的鉴定到最后疫苗的生产发放之间的间隔长达6个月，而且疫苗本身也存在一 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选定的安全性问题，这些因素都限制了疫苗在流感病毒防控中发挥的作用。短期内抗病毒药物仍然是控制流感病毒传播的关键。当前已经批准上市的抗流感药物主要分为两类，神经氨酸酶(NA)抑制剂Zanamivir(扎纳米韦)和Oseltamivir(奥司他韦)[98]以及M2离子通道抑制剂Amantadine(盐酸金刚烷胺)和Rimantadine(金刚烷胺)[99]。Amantadine和Rimantadine能够在病毒进入细胞时通过阻断离子通道使病毒的vRNP复合物无法释放到宿主细胞质中从而抑制流感病毒的复制[i00]。也能通过改变病毒血凝素蛋白的构象来阻止病毒的释放[101]。Zanamivir和Oseltamivir可以抑制流感病毒神经氨酸酶的活性从而阻断病毒颗粒最后从宿主细胞释放[102—103]。由于对这两类药物产生抗性的流感病毒毒株不断出现和扩散，研发新型的流感病毒抑制剂具有重要意义。当前比较热门的抗流感药物的作用位点如图3所示，很多药物都已经进入临床试验阶段[104]。Favipiravir可以抑制流感病毒RNA聚合酶的活性，导致病毒基因组无法复制从而抑制流感病毒，现在已经进入临床3期试验阶段[105-106]。Laninamivir也是神经氨酸酶的抑制剂，但是与zanamivir相比其对神经氨酸酶的抑制持续时间更长，因此能够更长效的抑制流感病毒[107]。Laninamivir对神经氨酸酶N卜N9都有效，也能抑制oseltamivir耐药性毒株。Nitazoxanide能够阻断流感病毒血凝素蛋白的糖基化，从而使血凝素蛋白不能有效的在内质网和高尔基体间运输，最终导致血凝素无法运输至细胞表面从而抑制病毒复制[108]。此外一些免疫调节剂，针对病毒RNA或宿主细胞mRNA的siRNA等也正在试验阶段中。 第一章研究进展图3抗流感病毒药物作用位点Figure．3Targetsitesofinfluenzavirusinhibitors病毒聚合酶在转录和复制过程中发挥着核心的作用，组成聚合酶的几种蛋白发挥作用的关键区域都是比较保守的，这些区域的突变将会导致聚合酶活性的降低。因此针对聚合酶的抑制剂不容易产生耐药性。这使得以流感病毒聚合酶为靶点设计研发流感病毒抑制剂成为研究热点。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选第二章流感病毒调节宿主细胞转录起始机制的研究第一节引言流感病毒的转录是引物依赖的，需要流感病毒聚合酶从细胞的mRNA57端剪切下帽子结构CAP作为病毒转录起始的引物。宿主细胞内mRNA的转录由转录聚合酶PolII完成。已有研究证明流感病毒的vRNP复合物会与P-TEFb即CyclinTl／CDK9复合物发生相互作用，在CyclinTl／CDK9的帮助下结合到PolII上并完成摘帽的过程。CDK9可以磷酸化PolII丝氨酸二位，DSIF和NELF从而使转录进入延伸状态，这在空间上不利于流感病毒去获取CAP结构。因此我们推测在流感病毒感染的细胞中，vRNP结合的CDK9磷酸化活性降低，进而影响PolIISer一2的磷酸化以及DSIF和NELF的磷酸化。这将会导致PolII在promoter停滞的时间延长，从而更有利于病毒聚合酶获取细胞的CAP结构。从已获得的实验结果可以发现，流感病毒感染细胞后，DSIF和NELF在看家基因启动子区停留增强。将细胞中DSIF敲低后流感病毒的复制也受到明显的抑制。第二节材料和方法2．1实验材料HeLa和A549细胞由本实验室冻存，均培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，胎牛血清购自PAA公司，DMEM购自Gibco公司。ProteinAbeads购自GEhealth。蛋白酶抑制剂购自罗氏。NELF—A和spt5抗体订购于SantaCruze，Pol—II抗体购自Abcam公司。流感病毒M1和NP抗体由刘文军研究员馈赠。13-actin抗体购自SantaCruze公司。Lipofectamine2000购自LifeTechnology公司。NELF—A和spt5siRNA订购于广州锐博公司。SYBRGreenRealTimePCRMasterMix购自TOYOBO公司。14 第二章流感病毒调节宿主细胞转录起始机制的研究2．2使用仪器低温离心机购自eppendorf公司；细胞培养箱和常速离心机为Thermo公司产品；PCR仪购自Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自上海天能公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自北京君意东方公司。超声波细胞粉碎机购自宁波新芝公司。实时荧光定量PCR仪购自ABI。2．3染色质免疫沉淀实验染色质免疫沉淀实验washbuffer配方：Lowsaltwashbuffer(0．1％SDS，1％TritonX一100，2mMEDTA，20mMTris—HClpH8．0，150mMNaCl)：Highsaltwashbuffer(0．1％SDS，104TritonX一100，2mMEDTA，20mMTris—HClpH8．0，500mMNaCl)：LiClbuffer(0．25MLiCl，1％NP一40，104$DC，1mMEDTA，10mMTris—HClpH8．0)：TEbuffer(20mMTris—HClpH8．0，1mMEDTApH8．0)．HeLa细胞平铺于10cm平皿中，待其密度达到9004左右时，用WSN以高MOI值感染细胞，对照组不感染WSN。细胞第二天用于染色质免疫沉淀实验。2．3．1细胞的甲醛交联与超声破碎1．取出10cm平皿细胞，加入243gL3704甲醛，使得甲醛的终浓度为1％(培养基共有9mE)。2．37℃摇床上孵育10min。3．终止交联：加甘氨酸至终浓度为0．125M。吸入450此2．5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。4．吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5．加入3009LSOSlysisbuffer，裂解液中预先加入蛋白酶抑制剂，用细胞刮收集细胞于1．5mL离心管中，冰上裂解lOmin。6．超声破碎：30W功率，5S冲击10S间隙。共7次。】5 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选2．3。2除杂及抗体哺育1．超声破碎结束后，10000g4℃离心10min。去除不溶物质。2．留取3009L做实验，300gL中加入700gLChIPDilutionBuffer和10止的50×PIC。3．再各加入30gLProteinAAgarose／SalmonSpermDNA。4。C颠转混匀1h。4．1h后，在4。C静置10min沉淀，4000g离心1min。5．取上清。留取30此做为input。各取300gL加入两个1．5mL离心管中。一管中加入抗体(NELF和spt5抗体为10gL，PolII抗体加2gL)，另一管中加29LIgG抗体作为阴性对照。4℃颠转过夜。2．3．3免疫复合物的沉淀及清洗1．孵育过夜后，i0000g4℃离心10min，取上清。每管中加入30gLProteinAAgarose／SalmonSpermDNA。4℃颠转4h。2．4℃静置10min后，4000g离心1min。除去上清。3．依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4。C颠转10min，4℃静置i0min沉淀，4000g离心1min，除去上清。洗涤溶液：Lowsaltwashbuffer-onewashHighsaltwashbuffer——onewashLiClwashbuffer—-onewashTEbuffer-twowash4．清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100gLIO％SDS，100gL1MNaHC03，800gLddH20，共1mL。每管加入250gL洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500gL。2．3．4解交联1．解交联：每管q]DH*20IxL5MNaCl(NaCl终浓度为0．2M)。16 第二章流感病毒调节宿主细胞转录起始机制的研究2．混匀，65℃解交联过夜。2．3．5DNA样品的回收1．解交联结束后，每管加入l此RNaseA(MBI)，37。C孵育1h。2．每管加入10此0．5MEDTA，20I-tLlMTris．HCI(PH6．5)，2止10mg／mL蛋白酶K。65℃处理2h。3．DNA片段的回收一一OMEGA胶回收试剂盒。最终的样品溶于100此ddH20。2．4实时荧光定量PCR将染色质免疫沉淀实验后获得的DNA进行荧光定量，用于定量的引物序列如下：GAPDHPromoterFor57TACTAGCGGTTTTACGGGCG37GAPDHPromoterRev57TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA3’GAPDHCodingregionFor57TGAACTGCGTTGAGCTGCTTC37GAPDHCodingregionRev5’CCCTAGGACTCTGGGCTCACTCA37GAPDHPromoter引物PCR条件为95℃预变性3min；95℃，30s；65℃，30s；72℃，30s；45个循环。GAPDHCodingregion引物PCR条件为95℃预变性3min：95℃，30s；55℃，30s：72℃，30s；45个循环。2．5Lipofectamino2000转染NELF_A和spt5SiRNA1．将A549细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，铺于24孔培养板中，使细胞覆盖率达60一80％，置于5％C0。的细胞培养箱中37。C培养。2．24h后细胞转染前2h将细胞每孔换400pL10％PAAFBS的DMEM培养基；NELF—A和spt5siRNA在转染前先用DEPC水稀释并冻存于-80℃。3．在超净工作台中吸取相应量的siRNA(NELF_A2pL和spt55此)加入50此无血清、无抗生素的DMEM培养基中，用移液枪轻轻混匀。4．吸取2此Lipofectamine2000加入IOOBL无血清、无抗生素的DMEM培养基17 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选中，用移液枪轻轻混匀，室温孵育5min。5．将步骤4的液体按每管50此的量加入步骤3的液体中混合混匀，室温孵育15min。6．最后将混合液加入要转染的细胞中，，每孔加lOOpL，置5％C02的细胞培养箱中37℃培养。7．转染后6h将培养基更换为新鲜的含10％PAAFBS的DMEM培养基。2．6NELF-A和spt5siRNA转染后流感病毒的感染1转染24h后吸取适量的流感病毒A／WSN／33预先稀释于无血清的DMEM培养基中。2．将A549细胞中的培养液吸出，用PBS清洗三遍。3．将稀释好的病毒按每孔5009L加入培养板中，并置于37。CCO。培养箱中培养1．5h。4．将含有病毒的DMEM吸弃后再用PBS清洗三遍并加入含有血清的新鲜DMEM培养基继续培养。2．7流感病毒感染后细胞样品的收集1．感染病毒8h后吸弃培养基，用PBS将孔板中的细胞清洗3遍。2．每孔细胞加入100此的LysisBuffer，使用细胞刮将孔里的细胞刮下来，刮下的细胞用离心管收集，4。C裂解20min。3．将细胞裂解液于4。C12000g离心10min，离心后弃沉淀，收集细胞裂解液上清。4．将细胞裂解液上清与2×SDSPAGELoadingBuffer等体积混合，在沸水中煮5-10min使样品中蛋白变性。收集的样品用于WesternBlot实验。第三节实验结果3．1流感病毒感染后会促进DSlF和NELF在基因启动子区的停留根据实验室之前的研究推测流感病毒感染宿主细胞后会使转录起始复合物 第二章流感病毒调节宿主细胞转录起始机制的研究在启动子区停留时间延长，这个过程有利于流感病毒聚合酶复合体的摘帽。为了验证这一推测选取了两个参与抑制转录延伸调控的细胞因子DSIF和NELF，在流感病毒感染细胞后通过染色质免疫沉淀实验检测这两个转录因子在基因启动子区的结合情况。结果如图1所示，流感病毒感染后，DSIF和NELF在启动子的结合相比未染毒的正常细胞都有一定程度的增强。ADSIFBNELF爹爹。GAPDHpromoterregion爹霉GAPDHpromoterregion图l流感病毒的感染会增强DSIF和NELF在基因启动子区的结合Fig1InfluenzavirusinfectionpromotesDSIFandNELFstayatthepmmoterregion．HeLacellsin10cmdisheswereinfecledwithWSN．About14hlaterthecellsampleswerecollectedforChIPassayusingtheDSIForNELFantibody．ThebindingofDSIFandNELFinthepromoterregionwerequantifiedwiththeGAPDHpromoterprimem．3．2敲低DSIF可以抑制流感病毒的复制DSIF和NELF是转录延伸抑制因子，在基因转录时发挥重要的功能。为了研究这两个细胞因子在流感病毒复制过程中发挥的作用，将细胞中DSIF和NELF敲低后感染流感病毒，再通过WesternBlot技术检测流感病毒蛋白表达水平。实验结果如图2所示，在HeLa细胞和A549细胞中，敲低DSIF亚基Spt5后流感病毒M1和NP蛋白的表达都明显降低，说明流感病毒的复制受到了抑制。将细胞中NELF敲低后对流感病毒复制影响不大。由此推测DSIF在流感病毒复制过程中发挥了重要作用。54321OⅣ：△c—Jlo^苓5I321O芎△C一|IO．；兮 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选WSNsirNASpt5NELF—ANPM1actin+NELFSpt5NELFSpt5●_■黼艚⋯镧黪斓黼舻镧辫漱娜锎滞蔫”麟瓣删__镧赣鳓姆㈣燃嘲黑謦斓睽斓黼图2敲低DSIF亚基spt5可以抑制流感病毒复制Fig2KnockdownofDSIF'ssubunitspt5couldblockthereplicationofinfluenzavirus．HeLacellsandA549cellsweretransfectedwithspt5orNELF—AsiRNA．24hafterthetransfection，thecellswereinfectedwithWSN．Cellsampleswerecollectedforwestern-blotassay8haftervirusinfection．第四节讨论通过染色质免疫沉淀实验证明了流感病毒感染后会导致DSIF和NELF两个转录延伸抑制因子与看家基因的启动子的结合。通过siRNA技术将细胞中的DSIF敲低后会明显抑制流感病毒的复制。获得的实验结果证明了之前推测的正确性，即流感病毒感染后会促进聚合酶polII在基因启动子的停留，为病毒RNA聚合酶摘取帽子结构创造有利条件。流感病毒是通过何种机制来引发这一效应，是否会直接影响调控polII活性的上游细胞因子P-TEFb的活性，以及DSIF和NELF在病毒复制过程中发挥作用的机制等都需要进一步通过实验验证。 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选第三章宿主细胞抗流感病毒MioroRNA的筛选第一节引言MicroRNA是细胞内的一类非编码小RNA，可以通过与靶标mRNA的部分互补使其发生降解或抑制转录后的翻译，从而调节目的基因的表达。许多研究表明宿主细胞内的MicroRNA参与调控多种病毒的复制，已有研究证明293T细胞中存在着可以抑制流感病毒PBl基因的MicroRNA。为了筛选宿主细胞中作用于流感病毒(IAV)的MicroRNA，将流感病毒A／WSN／33全部8条基因组片段分别克隆到双荧光报告载体pmirGLO萤火虫荧光素酶基因的3’UTR以构建筛选系统。报告载体分别转入HeLa细胞和293T细胞中后检测报告基因活性差异显著。通过对HeLa细胞和293T细胞中MicroRNA表达谱的分析并结合软件预测结果挑选潜在的与流感病毒有相互作用的MicroRNA。通过此方法筛选出了可能与流感病毒有直接相互作用的Mir-33a，通过WesternBlot实验证明了Mir-21，Mir-27a和Mir-194也会抑制流感病毒的复制。第二节材料与方法2．1实验材料大肠杆菌Topl0感受态由本实验室制备，293T细胞、HeLa细胞和A549细胞由本实验室冻存，均培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，胎牛血清购自PAA公司，DMEM购自Gibco公司。pmirGLO双荧光素酶报告基因载体由周旭宇研究员馈赠，pmirGLO—PB2、pmirGLO—PBI、pmirGLO—PA、pmirGLO—HA、pmirGLO—NP、pmirGLO—NA、pmirGLO-M和pmirGLO-NS由本实验室构建。pyrobestDNA聚合酶、限制性内切酶SalI和XholI和DNA连接酶购自Takara公司，DNA回收试剂盒购自OMEGA公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购白Promega公司，转染试剂Polyethylenimine(PEI)购自polyscience．Inc，Lipofectamine2000购自Life&Technology公司。MicroRNAmimic购自广州锐博公司。流感病毒M1和NP蛋白抗体由中科院微生物所刘文军研究员馈赠。B-actin抗体购自Santa，1 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选Cruze公司。MLV逆转录酶购自Promega公司。SYBRGreenRealTimePCRMasterMix购自TOYOBO公司。2．2所用仪器低温离心机购自eppendorf公司；细胞培养箱为和常速离心机Thermo公司产品：PCR仪购自Bio—Rad公司；凝胶成像仪购自上海天能公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自北京君意东方公司；荧光光检测仪购自Progema公司。实时荧光定量PCR仪购自ABI。2．3实验所用溶液配方以下溶液，未加说明均用去离子水定容。1．PBS溶液137mMNaCl；2．7mMKCl；10mMNa2HP04；2IIlMKH2P04；盐酸调pH至7．4。2．TAE(50×)2MTriS；6．2％冰醋酸；100mMEDTA；3．LB培养基0．5％酵母提取物；0．5％NaCl；1％胰蛋白胨；4．GibcoDMEM培养基(1L)l袋DMEM粉末，3．7gNaHCO。，5．98gHepes，去离子水定容1L。pH调至7．2，O．2m滤膜过滤后置于4℃保存。5．胰酶0．25g胰酶溶于100mLPBS溶液中，用0．2m滤膜过滤后保存于4。C。6．细胞冻存液10％DMSO、30％PAA血清加上60％DMEM培养基。2．4质粒的转化1．取分装好的50此ToplO感受态于冰上融化；22 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选2．将待转化的质粒加入感受态中，轻轻混匀，于冰上孵育30mira3．将孵育后的感受态置于42。C水浴锅中热激90s；4．热激后的感受态中加入8009L无抗生素LB培养基，并于37℃摇床中以180r／min速度摇45min：5．将转化后的感受态于常温离心机中以75009速度离心5min，于无菌超狰台中吸弃6009LLB培养基后用移液枪将管底的菌体轻轻吹匀并均匀涂于平板上；6．将平板倒置于37℃培养箱中培养。2．5质粒的提取挑取阳性克隆转接入LB培养基中，220r／min37。C过夜培养，提取质粒，质粒提取的步骤如下：1．取出已经混浊的摇菌管，吸600此菌液加入1．5mL无菌离心管中，加入300此甘油，上下颠倒混匀，-80℃保存菌。2．将剩余菌液于4℃，5000g，离心5min。3．彻底弃上清，加入2509LBufferP1使细菌重悬。4．加入2509LBufferP2，轻轻上下颠倒混匀，室温放置5分钟。5．加入3509LBufferP3，上下颠倒5次混匀。6．常温13000g离心i0min，弃去沉淀。7．将上清加入QIAGEN-tip柱，13000g离心1min。8．将5009LBufferQG加入柱中，13000g离心1min。9．弃去收集管中液体，将7509LBufferOF加入柱中，13000g离心1min。10．弃去收集管中的液体，再次以13000g离心1min。1i．将柱子放入新的1．5mL离心管中，向柱中加入ElutionBuffer309L，室温孵育2min，13000g离心1min。12．收集管中液体，分别取lgL电泳鉴定和用分光光度计测定浓度，其余冻存一20℃备用。2．6流感病毒M片段截断体的构建将WSN流感病毒的M片段截成三段构建于pmirGLO载体上，所用引物序列如下：23 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选M(1—340)—匕游5’CCGCTCGAGAGCGAAAGCAGGTAGATATT3’M(卜340)下游5’ACGCGTCGACCTCTTAAGCTTCCTACA3’M(290-620)上游5’CCGCTCGAGATCCAAATAACATGGA3’M(290—620)]i游5’ACGCGTCGACCTTGCTCACTCGATCC3’M(590—1007)—E游5’CCGCTCGAGGCTAAGGCTATGGAGC3’M(590—1007)下游5’ACGCGTCGACAGTAGAAACAAGGTAGTTTT3’PCR扩增为50儿体系：pmirGLO—M模板1此pyrobestDNA聚合酶l此上游引物1此下游引物1此dNTPMixture4“LpyrobestbufferII5此ddH2037gLPCR程序：95℃，预变性10min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；20个循环，然后72℃，10min；CC，lOmin。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后使用OMEGADNA回收试剂盒进行回收，具体步骤如下：1．紫外照射下用刀片切下含有目的DNA片段的凝胶，将切下来的凝胶放入离心管中；2．加入适量的BindingBuffer，在55。C一60。C温度下孵育7min，直至凝胶全部融化。其间每隔2-3min通过摇晃或震荡混匀混合物。3．将700gLDNA／凝胶溶液加入HiBindDNA柱子中，将HiBindDNA柱子置于2mL收集管中10000g离心1min。4．倒去液体，将柱子重新放回离心管中。5．在HiBindDNA柱子中加入300pLBindingBuffer，10000g离心1min，弃去收集管中的液体。6．加入700uL的SPWWashBuffer清洗HiBindDNA柱子两次，10000g离心1min。24 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选7．弃去收集管中的液体，将空的HiBindDNA柱子在最大转速(913000g)下离心2min，8．将HiBindDNA柱子放置在新的1．5mL离-LI,管上，并于55。C烘干2min，随后加30一50止的ddH20入HiBindDNA柱子基质中，室温放置1min使DNA充分溶解。在130009速度下离心1min收集DNA溶液。回收好的DNA片段和pmirGLO载体用限制性内切酶SalI和XholI酶切4h，其中载体的酶切量为2ug。DNA片段的酶切反应体系如下：SalI2此XholI2此HBuffer5此DNA回收片段25此ddH2021gL酶切后的DNA片段和载体按照上述DNA回收步骤再次进行胶回收，然后将回收的片段和载体通过琼脂糖凝胶电泳定量，按照1：5的比例将载体和DNA片断进行连接反应，连接反应的体系如下：DNA片段12此pmirGLO载体片段2此DNA连接酶l此T4DNALigaseBuffer2灿ddH203此16。C水浴连接过夜后将连接产物转化入大肠杆菌ToplO中，挑取单克隆后提取质粒并进行双酶切鉴定。用限制性内切酶SalI和XholI进行酶切进行鉴定克隆是否为阳性。选取经过双酶切鉴定的阳性克隆测序，确定得到的为所需载体。检测为阳性的质粒分别为已插入了流感病毒片段的双荧光素酶检测质粒，分别命名为pmirGLO—M(1—340)，pmirGLO—M(290—620)矛口pmirGLO—M(590—1007)。2．7细胞复苏1．将细胞冻存管从液氮中取出，在37℃水浴中轻轻晃动使其快速融化。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选2．将冻存管放入离心机中在1000g下离心5min，吸弃冻存液。3．用1mL37℃的新鲜培养基轻轻吹散冻存管底部的细胞。4．将细胞悬浊液转移至培养皿，加入适量培养基后混匀，置于37。CC0。培养箱中培养。5．新复苏的细胞至少传代一次才能用于实验。2．8细胞培养与传代1．每次传代前2h换液。2．将培养液吸出，用过滤除菌的PBS溶液清洗细胞。注意清洗时要轻柔，以免将细胞从培养皿上冲掉。3．加入1mL0．25％胰酶，放入培养箱中进行消化。4．显微镜下可见细胞变圆并浮起时，往培养皿中加入约6mLDMEIII培养基，用吸管吹打，使细胞全部脱离培养皿且细胞完全分离。5．将吹打均匀的细胞分到新培养皿中。根据使用情况决定密度，一般一皿可传代分成3—4皿。6．在新培养皿中加入适量培养基，置于37。CC0。培养箱培养。2．9细胞冻存1．冻存前2h换液。2．取对数生长期细胞，用0．25％胰酶消化细胞并用无血清DMEld培养基将其移至15mL离心管中。3．1000g离心5min，使细胞沉于管底。4．去除胰蛋白酶及培养基，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻将细胞吹打均匀并进行计数，用冻存培养液将细胞最终密度调为5—10×106／mL。5．将细胞分装于冻存管中，每管卜1．5mL。在冻存管上标明细胞名称，冻存时间及操作者。6．将冻存管先于一20。C冰箱放置1h，然后放入-80*C冰箱过夜，最后移入液氮内。 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选2．10PEI转染细胞1．将生长在10cm培养皿中状态良好的细胞从培养箱中取出，吸弃培养基上清，加入2mLPBS清洗后再加入lmL0．25％胰酶消化1min，吸弃胰酶，再加入6mL含有10％血清的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打分散细胞；2．将细胞均匀分布于相应的培养皿中，使细胞覆盖率达到70％一80％，置于含有5％C02的细胞培养箱中37℃培养24h；3．选取状态良好的细胞进行转染，转染前2h给细胞更换新鲜的含有lO％ffn清的DMEM培养基。4．在细胞间超净工作台内吸取pmirGLO、pmirGLO—PB2、pmirGLO—PBl、pmirGLO—PA、pmirGLO—HA、pmirGLO—NP、pmirGLO—NA、pmirGLO—U、pmirGLO—NS各0．5ug，分别加入1509L生理盐水用移液器混匀；5．吸取13．59L2ug／gL的PEI，与1．35mL的生理盐水混合，用移液器混合均匀；6．将稀释好的质粒分别加入150pLPEI溶液混匀，室温孵育15min；7．将混合好的质粒一PEI溶液以每孔lOOgL均匀加入24孔板中，然后将细胞放入37"C培养箱培养；8．转染后6h换液并于30h后收取细胞样品进行Luciferaseassay检测。2．11荧光素酶报告基因的检测1．取适当的5XPassiveLysisBuffer(PLB)稀释于蒸馏水中至1X。2．用LuciferaseAssayBufferII溶解冻干粉LuciferaseAssaySubstrate配制成LARIIReagent冻存于一20℃；3．将Stop＆GLOsubstrate按照1：50的比例加入Stop＆GLO中配制成Stop&GLOReagent；4．将生长于24孔板中转染了荧光素酶报告基因系统的293T细胞从细胞培养箱中取出，弃掉孔板中的培养基，用PBS清洗一遍；5．在24孔板中每孔加入1509LPassiveLysisBuffer，然后将24孔板放在水平摇床上室温摇动15min使细胞完全裂解； 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选6．将上一步24孔板中的细胞裂解液转移至1．5mL小离心管中，4℃最大转速离心30S：7．将LARIIReagent分装每管509L，取IOI上L细胞裂解液加入，用移液器混合10次后调取荧光检测仪上的双荧光检测程序检测报告基因Firefly荧光素酶的活性，随后将509L的Stop＆GLOReagent加入上述反应体系中，用移液器混合10次后，用荧光检测仪检测内参Reni11a荧光素酶的活性，并记录最终两种荧光素酶活性的比值作为结果。2．12Lipofectamino2000转染MicroRNAmimiC或inhibitor1．将A549细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，铺于24孔培养板中，使细胞覆盖率达60-80％，置于5％C0。的细胞培养箱中37℃培养；2．24h后细胞转染前2h将细胞每孔换4009L10％PAAFBS的DMEM培养基；MicroRNAmimic或inhibitor在转染前先用DEPC水稀释成浓度为20uM储存液并分装于无RNase的离心管中。3．在超净工作台中根据使用浓度吸取相应量的MicroRNAmimic或inhibitor加入1509L无血清、无抗生素的DMEM培养基中，用移液枪轻轻混匀；4．吸取39LLipofectamine2000加入1509L无血清、无抗生素的DMEM培养基中，用移液枪轻轻混匀，室温孵育5min；5．将步骤3和4的液体混合混匀，室温孵育15min；6．最后将混合液加入要转染的细胞中，，每孔加IOOpL，每个样品三个重复，置5％C02的细胞培养箱中37℃培养；7．转染后6h将培养基更换为新鲜的含10％PAAFBS的DMEM培养基。2．13Lipofeotamino2000转染质粒和MicroRNAmimic1．将293T细胞用O．25％胰酶消化，轻轻地吹散，铺于24孔培养板中，使细胞覆盖率达70-80％，置5％C02的细胞培养箱中37。C培养；2．24h后细胞转染前2h将细胞每孔换400肛L10％PAAFBS的DMEM培养基；3．在超净工作台中吸取159LMicroRNAmimic储存液入1．5mL无菌EP管中，再加入600ng双荧光载体质粒，随后加入150pL无血清、无抗生素的DMEM培养28 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选液，用移液枪混匀；4．吸取3此Lipofectamine2000入另一1．5mL无菌EP管中，再加入150¨L无血清、无抗生素的DMEM培养液，轻轻用移液枪混匀，室温孵育5min；7．将步骤3和4的液体混合混匀，室温孵育20min；8．最后将混合液加入要转染的细胞中，每孔加100pL，每个样品三个重复，置于5％C02的细胞培养箱中37℃培养；9．转染后6h将培养基更换为新鲜的含10％PAAFBS的DMEM培养基。2．14流感病毒感染细胞及样品收集1．将生长在lOcm培养皿的A549或HeLa细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，铺于24孔培养板中，使细胞覆盖率达70-80％，置5％C0。的细胞培养箱中37"C培养：2．24h后吸取适量的流感病毒A／WSN／33预先稀释于无血清的DMEM培养基中，3．将A549细胞中的培养液吸出，用PBS清洗三遍，4．将稀释好的病毒按每孔500“L加入培养板中，并置于37"CCO。培养箱中培养1．5h5．将含有病毒的DMEM吸弃后再用PBS清洗三遍并加入含有血清的新鲜DMEM培养基继续培养。6．感染病毒8h后吸弃培养基，用PBS将孔板中的细胞清洗3遍；7．每孔细胞加入100IxL的LysisBuffer，使用细胞刮将孔里的细胞刮下来，刮下的细胞用离心管收集，4℃裂解20min；8．将细胞裂解液于4℃12000g离心10min，离心后弃沉淀，收集细胞裂解液上清；9．将细胞裂解液上清与2XSDSPAGELoadingBuffer等体积混合，在沸水中煮5—10min使样品中蛋白变性。1．将制备凝胶的玻璃板装于配胶架上；2．确定凝胶的浓度和体积，先配制分离胶；29 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选3．加入TEMED后，混匀，立即注入玻璃板间隙，并为浓缩胶留出足够的空间(梳齿长约1cm)，然后在在剩余的空隙加满异丙醇；4．待分离胶聚合完成(约25min)后，倒掉上层的异丙醇，尽可能地吸干胶板上残留的异丙醇；实验所用的凝胶为10％的分离胶，其配方如下：30％丙烯酰胺1．7mL1．5MTris—HCl(DH8．8)1．3mL10％SDS0．05mL10％过硫酸铵0．05mLTEMED0．02mL加去离子水至容积5mL5．配置浓缩胶(每块凝胶的用量约为1．5mL)，配方如下：30％丙烯酰胺0．33mL1MTris—HCl(pH6．8)0．25mL10％SDS0．02mL10％过硫酸铵O．02mLTEMED0．002mL加去离子水至体积2mL混匀后注入玻璃板间隙，小心插入洗净的梳子，避免混入气泡，垂直放置于室温下15min：6．将样品与2×SDSLoadingBuffer等体积混合，沸水中煮沸约5min；7．在浓缩胶聚合凝结后，用去离子水冲洗胶孔，将胶板放入蛋白电泳槽中固定，槽中加入1×的SDS电泳缓冲液至淹没外部电极可正常电泳为止；8．将样品按照次序上样，同时加入蛋白质分子量预染marker；空置的胶孔加入LoadingBuffer补齐；9．接通电源，进行电泳，先将电压调至80V，待样品迁移至分离胶后将电压调至120V，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部，切断电源；30 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选2．16WesternBIot实验1．取下PAGE凝胶浸泡在转膜缓冲液中；2．剪裁下大小合适的PVDF膜，将膜完全浸入甲醇i0S、去离子水5min、转膜缓冲液i0min；3．剪裁下与转膜夹大小相当的滤纸浸泡在转膜缓冲液中；4．按照从正极到负极的顺序依次将滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸放置到转膜夹上，夹紧并放入电转仪内并倒入转膜缓冲液，转膜缓冲液要覆盖转膜区域；5．转膜条件：NP、M1和13-actin蛋白于150mA恒定电流电转45min；6．转膜结束后将PVDF膜取出，用TBST在水平摇床上清洗5min；7．将PVDF膜放入5％牛奶中于室温水平摇床上封闭1h；8．将封闭好的PVDF膜用TBST清洗3次，每次5min，然后加入配制在5％牛奶中的一抗，37℃孵育1h或者4℃孵育过夜；9．用TBST将结合过一抗的PVDF膜于水平摇床上清洗3次，每次i0min；10．洗好的PVDF膜加入TBST配制的辣根过氧化物酶标记的二抗在37。C摇床孵育1h；11．用TBST清洗PVDF膜3次，每次10min；12．将PVDF膜取出，用滤纸吸干残留的液体，平放在保鲜膜上，加上等体积混合好的显色液(A液：B液--i：1)，反应2min，用保鲜膜包裹好；13．将包裹好的PVDF膜固定于压片夹上并在暗室中用x光胶片曝光收集信号；14．取出X光片放入显影液中浸泡1min；15．将X光片用水清洗后放入定影液中；16．取出并且将X光片烘干，分析实验结果。2．17RNA的提取1．24孔板中每孔细胞加入200uLTrizolReagent，收集样品，在15—30℃的条件下放置5min：2．按照Trizol1／5的体积加入氯仿，剧烈震荡15S，放置2-3min，然后4℃1200g离心15min，离心后分为3层，RNA存在于上层水样层中； 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选3．RNA沉淀。水样上层转移到干净的无UNase离心管中，将异丙醇以Trizol1／2的体积加入，混合后的样品在15-30℃下静置10min，4"C12000g离心10min，RNA沉淀附着在离心管壁和管底；4．RNA洗脱。移去上层悬液，用75％的乙醇洗涤沉淀一次，所用体积与Trizol的使用体积相同，7500g离心5min；5．RNA沉淀于空气中干燥5-10min(不能完全干燥)，然后用20uLDEPC水将样品溶解。2．18MicroRNA的反转录和实时荧光定量实验1．对提取的RNA进行反转录预先用DEPC水将Mir一33a和对照U6snRNA的反转引物稀释成62．5nM浓度的工作液。反转体系为259L先吸取RNAtemplate99L和反转引物工作液2此，混匀后瞬时离心，70"C放置10min，冰浴2min。再按以下体系加入进行RT反应RTbuffer5×5此dNTPmix(2．5mU)2pLRNaseinhibitor(40U／pL)0．59L反转录酶(200U／pL)0．5此DEPC水至25此RT反应程序为：42℃60min，70℃10min。2．MicroRNh的荧光定量将RNA反转为eDNA后就可以进行实时荧光定量了。MicroRNAqPCR的反应体系如下：SYBRGreenMix9此RTproduct2此UicroUNhforwardprimer2pLUicroUNAreverseprimer29LDEPC水至20此PCR程序为95"C预变性5min；95"C10s60"C20s70"C25s40个循环。≈， 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选第三节实验结果3．13’UTR双荧光素酶报告系统在不同细胞系的表达为了筛选宿主细胞内具有抑制流感病毒活性的MicroRNA，我们利用pmirGL0双荧光素酶载体作为工具进行筛选。将流感病毒WSN／H1N1的八条基因组片段分别插入报告基因萤火虫荧光素酶37UTR的多克隆位点中。再将质粒转染进细胞中，如果细胞中有作用于流感病毒基因组片段的MicroRNA，荧光素酶基因的表达就会受到抑制(图1)。3’-UTRDuaIIuciferaseReportermiRNAscreeningsystemluc2virussegment／◆主图1筛选宿主细胞内抑制流感病毒MicroRNA的报告基因系统FiglReportersystemforscreeninghostMicroRNAswhichinhibitinfluenzavirus．将携带有流感病毒基因组各个片段的pmirGL0载体转染到HeLa细胞中，36h后检测萤火虫荧光素酶表达情况，所得数据皆为与内参海肾荧光素酶活性的比值。结果如图2A所示，除了NS片段以外，其他七条流感病毒基因组片段报告基因都有比较明显的抑制，说明HeLa细胞内存在能够与流感病毒基因组片段相互作用的MicroRNA。又将携带有流感病毒基因组各个片段的pmirGLO载体转染到293T细胞中，36h后检测荧光素酶活性。所得结果如图2B所示，各个报告基因所受到的抑制明显要弱于HeLa细胞，暗示这两种细胞细胞系中与流感病毒相互凶 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选作用的MicroRNA存在较大差异。AHebeelI293TcolI图2流感病毒荧光素酶报告载体在宿主细胞内的活性检测Fig．2Luciferaseactivitiesofreporterplasmidsofinfluenzavirusinhostcells．A：pmirGLOplasmidandpmirGLOplasmidsinsertedwithinfluenzaviralgenesegmentsweretransfectedintoHeLacells．relativeluciferaseactivitiesweremeasured36hposttransfection．B：pmirGLOplasmidandpmirGLOplasmidsinsertedwithinfluenzaviralgenesegmentsweretransfectedinto293Tcells，relativeluciferaseactivitiesweremeasured36hposttransfection．3．2HeLa细胞和293T细胞中MicroRNA表达情况的比较由于携带有流感病毒基因组片段的报告基因在HeLa细胞和293T细胞中活性差异较大，HeLa细胞中报告基因受到明显的抑制。因此将这两种细胞MicroRNA表达情况进行了比对，将HeLa细胞里面特有的或者表达量相对293T细胞比较高的MicroRNA列表如下。推测正是由于这些HeLa细胞特异的或高表达的MicroRNA导致了携带有流感病毒基因组片段的报告基因在HeLa细胞里受到明显的抑制。B萤^I芍仃o∞碍童一SJ口^l董。匣|，口I^；Q幅器再．I。J一2-Jo^l肖19Z 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选表一与293T细胞比较HeLa细胞里特异或高表达的MicroRNATable1MicroRNAsspecificorhighexpressedinHeLacellcomparedwith293TcellSpecificinHeLaHighexpressedinHeLamir-21mir-27ami卜194mir-23amir-31Jet-7fmlr-125bIet．7imir-29amir-30cmir-33aIet·7dmir-423·5pmir-98mir-99bmir·-100mir-324··5pmir-23b3．3抑制流感病毒IlicroRNA的筛选用RNA22软件将上述的MicroRNA分别与流感病毒的八个基因组片段进行靶位点预测，综合预测结果挑选出了7条可能与流感病毒基因组片段具有相互作用的MicroRNA，分别是Mir-21，Mir-23a，Mir一27a，Mir-33a，Mir一194，let-Td和let一7i。合成了这些MicroRNA的模拟物并分别与携带有流感病毒基因组片段的报告载体共转入293T细胞以验证它们之间是否有相互作用。结果如图3所示，Mir-33a可能和流感病毒M片段之间有相互作用。其它MicroRNA对流感病毒各个片段没有明显的效果。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选1．21．00．80．60．40．20．0MlmiccontrolMir-21mimiCMi心3amlmic图3Mir一33a可能靶向流感病毒基因组M片段Fig3Mir-33amaytargetstheMsegmentofinfluenzavirus．MicroRNAmimicsormimiccontrolwereCO—transfectedwithreportplasmidsinto293Tcells．36haftertransfectioncelllysateswerecollectedforluciferaseassay．Theresultsrepresentthemean4-SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．3．4Mir-33a在流感病毒M片段上靶位点的定位为了定位Mir-33a在流感病毒M片段上的靶位点，将流感病毒的M片段截成三段，每段都有三十个碱基重叠，截断体分别连在pmirGLO载体上，再与Mir一33amimic共转入293T细胞，36h后收取细胞样品检测荧光素酶活性。结果如图4所示，pmirGLO-M(1-340)与Mir-33amimic共转后萤火虫荧光素酶活性抑制情况与pmirGLO—M(卜1007)最接近，预示着Mir-33a的靶位点可能定位在M片段的卜340区域。其具体的靶位点还需要用软件预测结合定点突变技术来最终确定。》篁>一_U母0∞四-Im《一O=一0>一_玛一O匣 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选≮l／i哆．,,o,O多l／／图4Mir-33a的靶位点位于M片段的1-340区域Mir．33amimicFig．4Mir-33a’Stargetsitelocatesinthe1-340areaofinfluenzavirusMsegment．ThetnmcationsofinfluenzavirusMsegmentwereinsertedintopmirGLOplasmidandthenCO·transfectedwithMir-33amimicormimiccontr01．36haftertransfectioncelllysateswerecollectedforluciferaseassay．Theresultsrepresentthemean土SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．3．5Mir-33ainhibitor可以促进流感病毒在HeLa细胞的复制Mir-33a在HeLa细胞里是高表达的，而在293T细胞里是不表达的。流感病毒在293T细胞里的复制要好于HeLa细胞，所以推测HeLa细胞里面高表达的Mir-33a可能会抑制病毒复制。为了验证这一推测，合成了Mir-33ainhibitor并转入HeLa细胞，将HeLa细胞里的Mir-33a水平降低后感染流感病毒，8h后检测流感病毒蛋白表达情况。结果如图5所示，转染了Mir-33ainhibitor的HeLa细胞，流感病毒蛋白的表达水平增强了。说明了HeLa细胞里面高表达的Mir一33a会抑制流感病毒的复制。2O8642O1O》=>；o俺o∞一_Iok—u丁Jo，一苗一。叱 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选Mi卜33ainhibitor一50nMNPM1p-actin图5抑制HeLa细胞的Mir-33a可以促进流感病毒复制Fig．5InhibitionofMir-33ainHeLacellscopLdenhanceinfluenzavirusreplication．HeLacellsweretransfectedwithMir-33ainhibitororinhibitorcontr01．HeLacellswereinfectedwithWSN24haftertransfection．Cellsampleswerecollected8hafterinfectionforwestern—blotassy3．6Mir-33a可以抑制流感病毒在A549细胞中的复制为了进一步验证Mir-33a对流感病毒复制的影响，在不表达Mir一33a的A549细胞中转入Mir一33amimic，24h后感染流感病毒并在感染8h后检测流感病毒蛋白表达情况。结果如图6所示，A549细胞中转染Mir一33amimic后，流感病毒的复制受到明显的抑制。Mir-33amimicNPM1p-actin一+■_瀵鲢 第三章宿主细胞抗流感病毒MicroRNA的筛选图6Mir-33a可以抑制流感病毒的复制Fig．6Mir-33acouldinhibitinfluenzavirusreplication．A549cellsweretransf-ectedwithMir-33amimicormimiccontr01．ThenA549cellswereinfectedwithWSN24haftertransfection．Cellsampleswerecollected8hafterinfectionforwestern-blotassy．3．7Mir-21，Mir-27a和Mir-194能够抑制流感病毒的复制通过对比293T细胞和HeLa细胞中MicroRNA表达谱挑选出的其它几条MicroRNA在双荧光报告系统上并没有与流感病毒基因组片段有明显相互作用。为了验证这些MicroRNA是否可以影响流感病毒复制，在A549细胞中转入MicroRNA的模拟物24h后感染流感病毒，感染8h后检测细胞中病毒的蛋白水平。结果如图7所示，Mir-21，Mir一27a和Mir-194三条MicroRNA可以明显的抑制A549细胞中流感病毒的复制。NCMir-21Mir-27aMit-194NP潮一M1斓麟13-actin图7Mir-21，Mir一27a和Mir-194能够抑制流感病毒复制Fig．7Mir-21，Mir-27aandMir-194copLdinhibitthereplicationofinfluenzavirus．A549cellsweretransfectedwithMicroRNAmimicsormimiccon仃01．ThenA549cellswereinfectedwithWSN24haftertransfection．Cellsampleswerecollected8hafterinfectionforwestern—blotassy．第四节讨论通过双荧光报告载体系统筛选出了可能对流感病毒M片段有相互作用的MicroRNAMir-33a。通过构建M片段的截断体确定了Mir-33a在M片段上的作用位点定位于57端的1-340区域。利用Mir一33ainhibitor降低HeLa细胞中 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选Mir一33a的水平后，流感病毒的复制得到增强。在A549细胞中转染Mir一33a后能够抑制流感病毒的复制。Mir-33a与M片段的作用位点还要继续通过软件预测并结合定点突变技术确定。Mir-33a对M片段编码的两种蛋白表达情况有何影响，通过何种机制抑制流感病毒的复制等还需要进一步验证。有研究证实M1蛋白过早表达会抑制流感病毒vRNP复合物的活性从而抑制流感病毒的复制。推测Mir-33a可能会影响M1蛋白表达的水平和时序，通过影响vRNP的活性抑制流感病毒的复制。利用双荧光报告系统并没有筛选出其他可能与流感病毒基因组片段有明显相互作用的MicroRNA。通过检测病毒蛋白水平发现Mir-21，Mir-27a和Mir一194能够抑制流感病毒复制。这些MicroRNA并不能直接与病毒基因组片段相互作用，可能通过调节细胞免疫功能或靶向参与流感病毒复制的细胞因子来抑制流感病毒。具体机制还需要进一步验证。 第四章抗流感病毒化合物的筛选第一节引言流感病毒对人类的生命健康构成了重大威胁，过去爆发的全球流感大流行都造成了严重的后果，其中以1918年爆发的西班牙流感最为严重，这次流感病毒的流行导致了全球将近5000万人死亡。当前流感病毒的防控和治疗主要依靠疫苗和抗病毒药物。每年流行的流感病毒毒株难以预测，疫苗的生产周期相对较长以及疫苗本身的安全性问题等给疫苗的使用带来了一定的局限性。当前用于抗流感病毒的药物主要分为两大类：神经氨酸酶(NA)抑制剂Zanamivir(扎纳米韦)和Oseltamivir(奥司他韦)以及M2离子通道抑制剂Amantadine(盐酸金刚烷胺)和Rimantadine(金刚烷胺)。现在世界范围内流行的流感病毒毒株大部分都已对M2抑制剂产生了抗性，而对NA抑制剂有耐药性的流感病毒毒株也已经在全球范围内迅速传播。因此，开发新型的抗流感病毒药物以及治疗方法具有非常重要的意义。流感病毒的vRNP复合物由PBl，PB2，PA和NP蛋白组成。在流感病毒的生命周期中发挥着至关重要的作用，其发挥功能的关键区域结构也比较保守。因此筛选针对vRNP的化合物不仅能有效的抑制流感病毒的复制，而且可以有效的避免病毒产生耐药性。HeLa—IAV-Luc细胞株是将pREP4一F1uA—Luc质粒转染到HeLa细胞中构建而成的。pREP4一FluA—Luc质粒57端包含有流感病毒NP片段的UTR区域，其后连接着萤火虫荧光素酶的编码基因。在流感病毒vRNP存在的条件下，萤火虫荧光素酶才能正常表达。因此流感病毒vRNP的活性可以通过荧光素酶的活性来衡量。HeLa-IAV-Luc细胞株可作为筛选抗流感化合物的有效工具。第二节材料与方法2．1实验材料293T和A549细胞来自于本实验室冻存细胞，培养于含有10％胎牛血清(PAA)的DMEM培养基中(Giboco)。HeLa—IAV—Luc稳定细胞株由本实验室人员构建。41 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选将pREP4一FluA—Luc质粒转染到HeLa细胞中30h后向细胞培养基中持续加入潮霉素(2001上g／mL)筛选两周，之后细胞培养基中维持潮霉素浓度为100肛g／mL。用于筛选的化合物(98种)由中科院微生物所车永胜研究员馈赠，溶于DMSO中并冻存于-20"C中。WSN的PBl、PB2、PA和NP的cDNA来自于中国疾控中心周剑芳研究员并克隆于pcDNA3．1载体中。携带WSNNS基因启动子的报告载体vNS—Luc来自于弗莱堡大学的MartinSchwemmLe。pNLLucE—R—HIV—Luc质粒来自于中科院微生物所田波研究员。pEWSN-HA和pCAGGS-NA质粒来自于中科院微生物所高福研究员。检测流感病毒NP和M1蛋白的抗体由中科院微生物所刘文军研究员馈赠，13-actin抗体购自SantaCruze公司。荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。MLV逆转录酶购自Promega公司。2．2抗流感病毒化合物的筛选1．将生长于lOcm皿的HeLa—IhV-Luc细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺在96孔细胞培养板上(1．5×104cells／well)，置于37℃C02培养箱中培养12h。2．吸取溶于DMSO的化合物加入50此无血清DMEM培养基中使其浓度达到40012g／mL。并吸取适量的DMSO作为阴性对照，Ribavirin作为阳性对照。3．以MOI值为5计算所需的病毒量，吸取病毒稀释于无血清的DMEM培养基中。4．吸取步骤3中稀释好的病毒50儿分别与步骤2稀释好的化合物混合，使化合物的终浓度为200ug／mL。5．用PBS清洗96孔板中的HeLa-IAV-Luc细胞，重复三次。6．将步骤4混好的液体加入每个孔中，将96孔板置于37℃C02培养箱中培养。7．14小时后将有明显细胞毒性的化合物排除，剩余的则吸弃孔中的液体并用PBS清洗细胞3遍。随后每孔加入50此的裂解液并将96孔板置于摇床上裂解15min。所得的样品用Steady—Glo荧光素酶底物检测荧光素酶的活性。2．3蛋白免疫印迹试验1．将生长于lOcm皿的A549细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺在24孔细胞培养板上，使其密度达到70％左右，置于37。CCO。培养箱中培养。42 第四章抗流感病毒化合物的筛选2．24h后吸取适量的WSN病毒加入500肛L无血清的DMEM培养基中。3．用PBS清洗A549细胞，重复3次4．将稀释好的病毒加入细胞中，在流感病毒感染的0—1．5h，1．5—4．5h和4．5—8h三个时间段分别加入化合物(20pg／mL)处理细胞。5．8h后统一用裂解液收取细胞样品，每孔加入50此细胞裂解液，收集样品并在冰上裂解20min。6．将样品与2×SDSLoadingBuffer等体积混合，沸水中煮沸约5min；在经过SDS-PAGE后转膜继而进行Westernblot实验。用流感病毒NP和M1蛋白的抗体来检测病毒蛋白表达水平的变化，B—actin作为内参。2．4HA假病毒包装1．将生长于lOcm皿的293T细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺于6cm皿上，使细胞密度达到80％左右，将细胞置于37℃C0。培养箱中培养。2．转染前2h给细胞换上新鲜的培养基。使细胞处于良好的状态。3．于无菌超净台中分别吸取1．5pgpNLLucE—R—HIV—Luc、pEWSN—HA和pCAGGS—NA三种质粒一起加入500pL无血清的DMEM培养基中。4．吸取27ugPEI转染试剂加入500pL无血清的DMEM培养基中。5．将2和3的液体混匀，总体积为lmL，孵育15min后加入6cm皿中，与培养基混匀后重新放入37℃CO。培养箱中培养。6．转染后6h将培养皿中的液体吸弃，换上新鲜的培养基。7．转染后48h收集细胞和培养基冻存于一80℃冰箱待用。2．5HA假病毒抑制试验1．将生长于lOcm皿的293T细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺于24孔细胞培养板上，使其密度达到70％。将细胞置于37。CCO。培养箱中培养24h。2．将冻存于-80。C冰箱的HA假病毒取出，待其融化后以70009速度离心5min，保留上清。3．吸取lOOpL假病毒上清液加入400¨L无血清DMEM中，加入化合物使其终浓度为(20pg／mL)。DMSO作为阴性对照。4穹 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选4．用PBS清洗293T细胞，随后加入混好的假病毒。5．感染6h后吸弃培养基换入新鲜培养基并维持药物浓度。感染36h后用裂解液收取细胞样品检测荧光素酶活性。2．6流感病毒聚合酶复合体(vRNP)活性检测1．将生长于lOcm皿的293T细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺于24孔细胞培养板上，使其密度达到70％。将细胞置于37。CCO：培养箱中培养24h。2．转染前2h给每孔细胞换上400pL新鲜培养基。在无菌超净台中各吸取克隆于pcDNA3．1载体中的流感病毒聚合酶复合体表达载体PA、PBl、PB2、NP和报告载体vNS-LuclOOng以及内参pRL—TK20ng加入50此无血清的DMEM培养基中混匀。3．吸取3．1ugPEI转染试剂加入50pL无血清的DMEM培养基中混匀。5．将2和3的液体混匀，孵育15min。随后加入要转染的细胞中。6．转染6h后吸弃液体换上新鲜的培养基，同时加入化合物使其浓度为20pg／mL。7．48h后收取细胞裂解液用来检测荧光素酶活性。2．7RNA的提取和实时荧光定量PCR1．将生长于lOcm皿的A549细胞用0．25％胰酶消化，轻轻地吹散，均匀的铺于24孔细胞培养板上。将细胞置于37。CCO。培养箱中继续培养24h。2．吸取适量的WSN病毒稀释于lmL无血清的DMEM培养基中3．用PBS清洗A549细胞三遍，每孔加入稀释好的病毒500肛L。将细胞放入37。CC02培养箱中继续培养1．5h。4．细胞感染病毒1．5h后吸弃培养基，用PBS清洗细胞3遍后加入新鲜的培养基，并维持化合物浓度为20pg／mL。另一孔中加入DMSO作为阴性对照。5．感染8h后先吸弃培养基再用PBS清洗细胞一次，随后加入250pLTrizol收取细胞样品并提取RNA。6．用MLV逆转录酶反转录流感病毒的vRNA、cRNA、mRNA和细胞的18srRNA。其中vRNA和cRNA使用流感病毒末端保守序列作为引物进行反转录，mRNA使用01igodT反转录，而18srRNA则是使用随机引物反转录。44 第四章抗流感病毒化合物的筛选7．取等量的eDNA样品对流感病毒的M1片段进行实时荧光定量PCR，反转录和M1荧光定量的引物序列如表1所示：表1反转录和PCR所用引物Table1PrimersforreversetranscriptionandPCRreactionvRNA-1forRTvRNA一2forRTcRNaforRTPCR—M1-FPCR-m1-RPCR一18s-FPCR-18s-RAGCGAAAGCAGGAGc从从GCAGGAGTAGAAACAAGGTGCCAGAGTCTATGAGGGAAGAATGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGGT从CCCGTTGAACCCCATTCCATCCAATCGGTAGTAGCG第三节结果3．1抗流感病毒化合物的筛选为了筛选具有抗流感病毒活性的化合物，HeLa—IAV—Luc细胞在MOI值为5的WSN病毒感染状态下分别加入98种化合物(200pg／mL)处理14小时，DMS0作为阴性对照，利巴韦林(Ribavirin)作为阳性对照，通过在显微镜下观察将具有明显细胞毒性的化合物排除，之后用裂解液收取剩余细胞检测报告基因荧光素酶活性。如图1A所示，经过筛选后2种化合物显示出具有抑制流感病毒的活性，分别为Colletodiol和Hydroxymonocerin。Colletodiol化合物抑制效果优于Hydroxymonocerin，因此选取其作进一步研究。图1B所示为化合物Colletodiol的分子结构式。为了鉴定Colletodiol发挥抑制病毒效果的最小浓度，分别选取了一系列浓度重复以上实验。如图1C所示，Colletodiol在浓度减小至20肛g／mL时，仍能比较有效地抑制流感病毒，因此Colletodiol化合物的使用浓度最终确定为20pg／mL。45 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选AC≯歹≯≯／B图l具有抑制流感病毒活性的化合物HOOFig．1ChemicalcompoundsthatcaninhibitsinfluenzaAvirus．(A)HeLa-IAV-LuccellswereinfectedwithInfluenzaA／WSN／33atanMOIof5，andtreatedwith20099／mLchemicalcompoundsorribavirinaspositivecontrolfor14h．DMSOwasusedasanegativecontr01．Thenthecelllysateswereharvestedforluciferaseassay．TherelativeluciferaseactivitywascalculatedagainstDMSOcontr01．(B)ChemicalstructureofcompoundColletodiol(C)HeLa-IAV-LuccellswereinfectedwithInfluenzaA／WSN／33atanMOIof5andtreatedwith2009／mLColletodiolorlOgg／mLribavirinfor14h．Thenthecelllysateswereharvestedforluciferaseassay．Theresultsrepresentthemean士SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．3．2CoIIetodi0I化合物不影响流感病毒进入细胞为研究Colletodiol化合物抑制流感病毒的机理，分别在流感病毒感染的0-I．5h、1．5-4h和4-8h三个时间点加入Colletodiol化合物处理A549细胞，8h后统一收集细胞样品进行western-blot实验检测流感病毒复制情况。结果如2Ol6●2O1O奢|^薯．●t≤，一耋．乏2O0Bl2O，O毒；葛-．1警基03一●^l譬1筮 第四章抗流感病毒化合物的筛选图2A所示，在流感病毒感染细胞的0-1．5h，Colletodiol并不发挥作用，在流感病毒进入细胞后，Colletodiol抑制病毒的效果逐渐显现。这一结果也通过HA假病毒抑制试验得到验证，如图2B所示，Colletodiol并不影响HA假病毒在293T细胞的复制。从图2A和2B的结果可以得出结论，化合物Colletodiol并不影响流感病毒姒蛋白介导的流感病毒进入细胞的过程。ATimeofaddition(h)BO一1．51．5—44．8M1潮黛赛麓镧■》—_——r—t图2Colletodiol化合物不影响流感病毒侵染细胞Fig．2Colletodioldoesn’taffecttheinfluenzavirusentryintocells．(A)A549cellswereinfectedwithWSN．Colletodiolwasaddedat0-1．5．1．5-4．5and4．5—8htoafinalconcentrationof20I．tg／mL．Thecelllysateswereallcollectedat8handappliedtoimmunoblotanalysis．(B)293TcellswereinfectedwithHApseudovimsandtreatedwith201ag／mLColletodiolfor48h．Thecelllysateswereharvestedforluciferaseassay．TherelativeluciferaseactivitywascalculatedagainstDMSOcontr01．Theresultsrepresentthemean4-SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．3．3CoIetodioI化合物会显著抑制流感病毒聚合酶(vRNP)活性Colletodiol化合物并不影响流感病毒进入细胞，其发挥抑制效果是在流感病毒进入细胞后，因此我们推测Colletodiol化合物可能会影响流感病毒聚合酶的活性。为了验证这一推测，将流感病毒聚合酶复合体的PA、PBl、PB2和NP蛋白的表达载体与报告载体vNS—Luc和内参pRL—TK共同转入293T细胞中，用Colletodiol化合物处理48h后检测荧光素酶活性。报告载体vNS-Luc在萤火虫47●2O86●2OjO蕾I^刁u一。■再‘。皇兰；叠■-●比／‰，№ 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选荧光素酶基因的57端插入了流感病毒NS片段的启动子，该启动子需要流感病毒聚合酶复合体识别并启动翻译。如果流感病毒聚合酶活性受到影响，荧光素酶的表达也会随之下降。结果如图3所示，Colletodiol化合物能显著的降低流感病毒聚合酶的活性。图3Colletodiol化合物能显著抑制流感病毒聚合酶活性Fig．3Colletodiolinhibitstheinfluenzavirus’polymeraseactivitydramatically．293TcellsweretransfectedwithplasmidsforexpressinginfluenzaAvirus(,6dWSN／33orAdCalifomia／07／2009)PB1，PB2，PA，NPandvNS·LucwithpRL—TKasaninternalcontr01．Aftertreatedwith20pg／mLColletodiolfor48h，thecelllysateswereharvestedforluciferaseassay．Theresultsrepresentthemean4-SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．3．4ColletodioI化合物能够抑制流感病毒RNA的合成流感病毒的vRNP活性对于病毒的mRNA，vRNA和cRNA合成至关重要。如图3所示，Colletodiol化合物能够显著降低流感病毒vRNP的活性，因此推测该化合物会影响病毒RNA的合成。A549细胞在感染WSN病毒后用Colletodiol或DMS0处理，8h后收取样品提取RNA用于实时荧光定量PCR。结果如图4所示，Colletodiol化合处理后流感病毒的mRNA，vRNA和cRNA的合成都显著下降。 第四章抗流感病毒化合物的筛选．梦$’Dh^sOColletodioI图4Colletodiol可以抑制流感病毒RNA的合成Fig．4Colletodiolinhibitsthesynthesisofinfluenzavirus’RNA．A549cellsin24一wellplatewereinfectedwithWSNandtreatedwithColletodiolorDMSO．Thecellswereharvested8hpostinfectionandthetotalRNAswereisolatedwithTRIzolreagent，thenmRNA，vRNAandcRNAofM1werequantifiedbyreal-timefluorescencequantitativePCR．TheRNAlevelwasnormalizedto18srRNAincells．Theresultsrepresentthemean4-SDofthreeindependentexperimentsperformedintriplicate．第四节讨论流感病毒对人类的健康构成了重大威胁，开发新型的流感病毒抑制药物具有重要的意义。本研究通过HeLa-IAV-Luc报告细胞株从化合物库中筛选出了具有抑制流感病毒活性的化合物Colletodiol。该化合物不能抑制流感病毒HA蛋白的功能，对流感病毒侵入细胞没有影响，能够显著的抑制流感病毒的vRNP活性。由于vRNP活性降低，流感病毒的mRNA、vRNA和cRNA的合成都受到了抑制。Panantadine(盐酸金刚烷胺)和Rimantadine(金刚烷胺)作为M2离子通道的抑制剂可以阻止H+离子进入病毒颗粒从而导致病毒RNA无法释放到细胞质中。Zanamivir(扎纳米韦)和Oseltamivir(奥司他韦)能够抑制流感病毒神经氨酸酶的活性，组装好的流感病毒无法从细胞表面释放，从而抑制了病毒的扩散。耐药性流感病毒的出现和不断扩散限制了这两种抑制剂的使用。当前世界各地的许多研究都致力于开发新型的抗流感药物以应对流感病毒对传统抗流感药物的492O8642010O0O∞o—aoo《Z比一矗三>∞>筝再一∞叱 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选耐药性。通过对传统药物Zanamivir进行修饰改造，使其对具有抗药性的流感病毒也能重新发挥抑制效果[109]。将参与流感病毒繁殖的宿主细胞因子作为靶点，也能有效的抑制流感病毒。DASl81是一种唾液酸酶融合蛋白，通过结合细胞表面的唾液酸受体阻止流感病毒进入细胞内，目前已经进入临床试验阶段[ii0]。本研究中筛选的化合物Colletodiol能够显著抑制流感病毒聚合酶的活性，针对流感病毒聚合酶的抑制剂在抗药性方面更有优势，因为聚合酶负责流感病毒的转录和复制等诸多功能，发生突变通常会影响其活性，因此流感病毒聚合酶复合体相对保守。本研究是第一次发现该化合物能够抑制流感病毒复制，Colletodiol的结构类似物GrahamimycinA是已知的具有广谱抑菌活性的化合物。根据GrahamimycinA的分子结构推测其可能作为迈克尔加成反应(MichaelAddition)的受体，通过与多种酶的相互作用而抑制微生物的生长繁殖[111]。Colletodiol抑制流感病毒聚合酶活性的机制还需要加以验证，本研究仅在细胞水平对Colletodiol化合物抑制流感病毒的机理进行了初步探索，该化合物是否能通过其他途径发挥抑制流感病毒的作用，以及在动物模型上的抑制效果和临床应用价值等还需要进一步的验证。 第五章结论通过研究流感病毒与宿主细胞间的相互作用可以帮助我们更好的认识流感病毒，也可以为抗流感药物的研发提供新思路。本研究初步探索了流感病毒感染时与宿主细胞转录系统的相互作用，证明了宿主细胞转录系统在流感病毒复制过程中具有重要的作用。利用双荧光报告载体筛选出了能与流感病毒M片段有相互作用的MicroRNfiMir-33a，初步确定了作用位点区域，同时筛选出与病毒基因组片段无直接相互作用但也能抑制流感病毒复制的MicroRNA。利用HeLa-IAV-Luc报告细胞株从微生物代谢化合物库中筛选出了具有抑制流感病毒活性的化合物Colletodiol，并对其抑制流感病毒的机制进行了探索。I流感病毒的感染使DSIF和NELF两个转录延伸抑制因子在基因启动子区结合增强，将细胞中的DSIF敲低后流感病毒的复制受到抑制。2宿主细胞Mir-33a与流感病毒M片段具有相互作用，其相互作用位点定位于M片段57端的1-340区域，A549细胞中过表达Mir-33a可以抑制流感病毒的复制，降低HeLa细胞中Mir-33a的表达水平可以促进流感病毒的复制。3Mir-21，Mir-27a和Mir-194与流感病毒各基因组片段无直接相互作用，但也能抑制流感病毒的复制。4真菌次生代谢产物Colletodiol具有抑制流感病毒复制的作用，Colletodiol对流感病毒血凝素功能没有影响，能抑制病毒RNA聚合酶的活性，导致病毒mRNA，vRNA和cRNA的合成受到明显抑制。 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选参考文献[2】[3】【4]【5】[6】【7】【8]【9】BouvierNM，PaleseP．Thebiologyofinfluenzaviruses．Vaccine，2008，26Suppl4：D49．53．“Q，ZhouL，ZhouM，ChenZ，LiF，WuH，XiangN，ChenE，TangF’WangD，MengL，HongZ，TuW：CaoYLiL，DingF，LiuB，WangM，XieR，GaoR，LiX，BaiT，ZouS，HeJ，HuJ，XuYChaiC，WangS，GaoYJinL，ZhangYLuoH，YuH，GaoL，PangX，LiuGShu巧Yang彤UyekiTM，WangKWuFFengZ．PreliminaryReport：EpidemiologyoftheAvianInfluenzaA(H7N9)OutbreakinChina．TheNewEnglandjournalofmedicine，2013．JohnsonNP,MuellerJ．Updatingtheaccounts：globalmortalityofthe1918·1920”Spanish”influenzapandemic．BgLletinofthehistoryofmedicine，2002，76(1)：105-115．BraamJ，MLmanenI，KrugRM．MolecgLar-ModelofaEukaryoticTranscriptionComplex—FunctionsandMovementsofInfluenza-PProteinsduringCappedRna-PrimedTranscription．Cell,1983，34(2)：609—618．NeumannGHughesMT,KawaokaY．InfuenzaAvirusNS2proteinmediatesvRNPnuclearexportthroughNES—independentinteractionwithhCRMl．EmboJ。2000，19(24)：6751．6758．WatanabeT，WatanabeS，KawaokaYCellgLarNetworksInvolvedintheInfluenzaVirusLifeCycle．CellHostMicrobe，2010，7(6)：427—439．JaggerBW：WiseHM，KashJC，WaltersKA，WillsNM，XiaoYL，DunfeeRL，SchwartzmanLM，OzinskyA，BellGL，DaltonRM，LoA，EfstathiouS，AtkinsJF,FirthAE．TaubenbergerJK,DigardP．Anoverlappingprotein—codingregionininfluenzaAvirussegment3modgLatesthehostresponse．Science，2012，337(6091)：199-204．DesselbergerU，RacanielloVR，ZazraJJ，PaleseP．3'-Terminaland5'-TerminalSequencesofInfluenza-a,Influenza·-BandInfluenza-CVirus·-RnaSegmentsAreHighlyConservedandShowPartialInvertedComplementarity．Gene，1980，8(3)：315—328．HsuMT,ParvinJD，GuptaS，KrystalM，PaleseP．GenomicRnasofInfluenza-VirusesAreHeldinaCkcULarConformationinVirionsandinInfected-CellsbyaTerminalPanhandle．PNatlAcadSciUSA，1987，84(22)：8140-8144．RobertsonJS．5’and3’TerminalNucleotide·SequencesoftheRnaGenomeSegmentsofInfluenza-Virus．NucleicAcidsRes，1979，6(12)：3745—3757．samjiT．InfluenzaA：understandingthevirallifecycle．TheYalejournalofbiologyandmedicine，2009，82(4)：153-159．ConnorRJ，KawaokaYWebsterRGPapLsonJC．Receptorspecificityinhuman，avian，andequineH2andH3influenzavirusisolates．Virology，1994，205(1)：17—23．SieczkarskiSB，WhittakerGR．Influenzaviruscanenterandinfectcellsintheabsenceofclathrin—medimedendocytosis．Journalofvirology，2002，76(20)：10455-10464．MatlinKS，ReggioH，HeleniusA，SimonsK．Infectiousentrypathwayofinfluenzavirusinacaninekidneycellline．TheJournalofcellbiology，1981，91(3Pt1)：601-613．PintoLH，HolsingerLJ，LambRA．InfluenzavirusM2proteinhasionchannelactivity．＆II,1992，69(3)：517—528．StegmannT．Membranefusionmechanisms：theinfluenzahemagglutininparadigmand52叫U刁纠卅习qnⅡ口n 参考文献【17】【18】【19】【20】【21]【22】[23】[24】【25】[26】[27】[28】[29】【30】【31】itsimplicationsforintracellIftLarfusion．Traffic，2000，l(8)：598-604．StegmannT'MorseltHW：ScholmaJ'WilschutJ．FusionofinfluenzavirusinanintracelllaLaracidiccompartmentmeasuredbyfluorescencedequenching．Biochimicaetbiophysicaacta，1987，904(1)：165—170．CrosJF,Garcia．SastreA．PaleseP．AnunconventionalNLSiscriticalforthenuclearimportoftheinfluenzaAvirusnucleoproteinandribonucleoprotein．Traffic，2005，6(3)：205．213．JonesIM，ReayPA，PhilpoaKL．NuclearlocationofallthreeinfluenzapolymeraseproteinsandanuclearsignalinpolymerasePB2．TheEMBOjournal，1986，5(9)：2371．2376．NietoA，delaLullaS，BarcenaJ，PortelaA，OrtinJ．ComplexstructureofthenucleartranslocationsignalofinfluenzaviruspolymerasePAsubunit．TheJournalofgeneralvirology，1994，75(Pt1)：29—36．WangP，PaleseP，O’NeillRE．TheNPI-1／NPI-3(karyopherinalpha)bindingsiteontheinfluenzaavirusnucleoproteinNPisanonconventionalnuclearlocalizationsignal．Journalofvirology，1997，71(3)：l850一l856．NeumannGCastrucciMR，KawaokaYNuclearimportandexportofinfluenzavirusnucleoprotein．Journalofvirology，1997，71(12)：9690-9700．WeberF，KochsGGruberS，HailerO．AclassicalbipartitenuclearlocalizationsignalonThogotoandinfiuenzaAvirusnucleoproteins．Virology，1998，250(1)：9-18．BlaLlido＆Gomez-PuertasP'AlboC，PortelaA．SeveralproteinregionscontributetodeterminethenuclearandcytoplasmiclocalizationoftheinfluenzaAvirusnucleoprotein．TheJournalofgeneralvirology，2000，81(Pt1)：135-142．OrNeillRE，PaleseP．NPI—l，thehumanhomologofSRP-l，interactswithinfluenzavirusnucleoprotein．Virology，1995，206(1)：116-125．PlotchSJ，BoI．tLoyM，KrugRM．Transferof5'-terminalcapofglobinmRNAtoinfluenzaviralcomplementaryRNAduringtranscriptioninvitro．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1979，76(4)：1618-1622．PlotchSJ，BolaLoyM，MLmanenI，KrugRM．Auniquecap(m7GpppXm)-dependentinfluenzavirionendonucleasecleavescappedRNAstogeneratetheprimersthatinitiateviralRNAtranscription．Cell,1981，23(3)：847-858．FriedlandDE，ShoemakerMT,XieYWangYHagedomCH，GossDJ．Identificationofthecapbindingdomainofhumanrecombinanteukaryoticproteinsynthesisinitiationfactor4Eusingaphotoaffinityanalogue．Proteinscience?apublicationoftheProteinSociety，1997，6(1)：125—131．MLmanenI，BroniBA，KrugRM．RoleoftwooftheinfluenzaviruscorePproteinsinrecognizingcap1structures(m7GpppNm)onRNAsandininitiatingviralRNAtranscription．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1981，78(12)：7355-7359．FodorE，CrowM，MingayLJ，DengT，SharpsJ，FechterP，BrownleeGG．AsingleaminoacidmutationinthePAsubunitoftheinfluenzavirusRNApolymeraseinhibitsendonucleolyticcleavageofcappedRNAs．Journalofvirology，2002，76(18)：8989-9001．DiasA，BouvierD，CrepinT'McCarthyAA，HartDJ，BaudinF，CusackS，RuigrokRW．Thecap—snatchingendonucleaseofinfluenzaviruspolymeraseresidesinthePAsubunit．53 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选[32][33】【34】[35]【36】【37】[38]【39]【40】[41】[42】[43】【44]【45】【46][47】【48】Nature，2009，458(7240)：914-918．GonzalezS，OrtinJ．DistinctregionsofinfluenzavirusPB1polymerasesubunitrecognizevRNAandcRNAtemplates．TheEMBOjournal，1999，18(13)：3767-3775．LiML，RamirezBC，KrugRM．RNA-dependentactivationofprimerRNAproductionbyinfluenzaviruspolymerase：differentregionsofthesameproteinsubunitconstitutethetworequiredRNA—bindingsites．TheEMBOjournal，1998，17(19)：5844—5852．ZhangJ，“GYeX．CyclinT1／CDK9interactswithinfluenzaAviruspolymeraseandfacilitatesitsassociationwithcellgLarRNApolymeraseII．Journalofvirology，2010，84(24)：12619-12627．LiX．PaleseP．CharacterizationofthepolyadenylationsignalofinfluenzavirusRNA．Journalofvirology，1994，68(2)：1245-1249．LuoGX，LuytjesWjEnamiM，PaleseP．ThepolyadenylationsignalofinfluenzavirusRNAinvolvesastretchofuridinesfollowedbytheRNAduplexofthepanhandlestructure．Journalofvirology，1991，65(6)：2861—2867．LU鬈QianX写KrugRMjTheinfluenzavirusNS1protein：anovelinhibitorofpre-mRNAsplicing．Genes＆development，1994，8(15)：1817-1828．BeatonAR，KrugRM．TranscriptionantiterminationduringinfluenzaviraltemplateRNAsynthesisrequiresthenucleocapsidproteinandtheabsenceofa5’cappedend．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1986，83(17)：6282-6286．PerezJT,VarbleA，SachidanandamR，ZlatevI，ManoharanM，Garcia-SastreA，tenOeverBR．InfluenzaAvirus—generatedsmallRNAsreggLatetheswitchfromtranscriptiontoreplication．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2010，107(25)：11525-11530．SmithGL，HayAJ．Replicationoftheinfluenzavirusgenome．Virology，1982，1l8(1)：96-108．ShapiroGI，GurneyT'Jr．，KrugRM．Influenzavirusgeneexpression：controlmechanismsatearlyandlatetimesofinfectionandnuclear-cytoplasmictransportofvirus—specificRNAs．Journalofvirology，1987，61(3)：764-773．CrosJF,PaleseETraffickingofviralgenomicRNAintoandoutofthenucleus：influenza,ThogotoandBornadiseaseviruses．Virusresearch，2003，95(1—2)：3-12．AkarsuH，BurmeisterWP'PetosaC，PetitI，MI．tLlerCWjRuigrokRW,BaudinF．CrystalstructureoftheM1protein-bindingdomainoftheinfluenzaAvirusnuclearexportprotein(NEP／NS2)．TheEMBojournal,2003、22(18)：4646—4655．BaudinF’PetitI，WeissenhomW：RuigrokRW．InvitrodissectionofthemembraneandRNPbindingactivitiesofinfluenzavirusM1protein．Virology，2001，281(1)：102·108．NayakDP,BalogunRA，YamadaH，ZhouZH，BarmanS．Influenzavirusmorphogenesisandbudding．Virusresearch，2009，143(2)：147—161．1watsuki．HorimotoK，HorimotoT，NodaT，KisoM，MaedaJ，WatanabeS，MuramotoYFujiiK，KawaokaYThecytoplasmictailoftheinfluenzaAvirusM2proteinplaysaroleinviralassembly．Journalofvirology，2006，80(11)：5233—5240．ChenBJ，LambRA．Mechanismsforenvelopedvirusbudding：CansomevirusesdowithoutanESCRT?Virology，2008，372(2)：221—232．BancroftCT,ParslowTGEvidenceforsegment—nonspecificpackagingoftheinfluenzaa 参考文献[49】【50】【51】【52]【53]【54]【55】[56】[57】【58】[59】[60】[61】[62】[63】【64】virusgenome．Journalofvirology,2002，76(14)：7133—7139．EnamiM，SharmaGBenhamC，PaleseP．AninfluenzaviruscontainingninedifferentRNAsegments．Virology，1991，185(1)：291—298．FujiiKFujiiYNodaT'MuramotoYWatanabeT，TakadaA，GotoH，HorimotoT，KawaokaYImportanceofboththecodingandthesegment-specificnoncodingregionsoftheinfluenzaAvirusNSsegmentforitsefficientincorporationintovirions．Journalofvirology，2005，79(6)：3766-3774．FujiiKGotoH，Watanabe正YoshidafKawaokarSelectiveincorporationofinfluenzavirusRNAsegmentsintovirions．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2003，100(4)：2002-2007．LiangYHangYParslowTGcis—ActingpackagingsignalsintheinfluenzavirusPB1，PB2，andPAgenomicRNAsegments．Journalofvirology,2005，79(16)：10348-10355．MuramotoYTakadaA，FujiiK，NodaT’1watsuki-HorimotoK，WatanabeS，HorimotoT，KidaH，KawaokaY．HierarchyamongviralRNA(vRNA)segmentsintheirroleinvRNAincorporationintoinfluenzaAvirions．Journalofvirology，2006，80(5)：2318·2325．WatanabefWatanabeS，NodafFujiiZKawaokaZExploitationofnucleicacidpackagingsignalstogenerateanovelinfluenzavirus-basedvectorstablyexpressingtwoforeigngenes．Journalofvirology，2003，77(19)：10575—10583．AmorimMJ，DigardP．InfluenzaAvirusandthecellnucleus．Vaccine，2006，24(44·46)：6651．6655．Engelhardt013lSmithM，FodorE．AssociationoftheinfluenzaAvirusRNA-dependentRNApolymerasewithcell}．tLarRNApolymeraseII．Journalofvirology，2005，79(9)：5812．5818．MayerD，MolawiK，Martinez—SobridoL，GhanemA，ThomasS，BaginskyS，GrossmannJ，Garcia-SastreA，SchwemmLeM．IdentificationofcelllaLarinteractionpartnersoftheinfluenzavirusribonucleoproteincomplexandpolymerasecomplexusingproteomic-basedapproaches．Journalofproteomeresearch，2007，6(2)：672-682．Rameix-WeltiMA，TomoiuA，DosSantosAfonsoE，VanderWeftS，Na触hN．AvianInfluenzaAviruspolymeraseassociationwithnucleoprotein，butnotpolymeraseassembly,isimpairedinhumancellsduringthecourseofinfection．Journalofvirology，2009，83(3)：1320-1331．LiB，CareyM，Workman几．Theroleofchromatinduringtranscription．Ce以2007，128(4)：707-719．RoederR(2TranscriptionalreglaLationandtheroleofdiversecoactivatorsinanimalcells．FEBSletters，2005，579(4)：909-915．PhatnaniHP,GreenleafAL．PhosphorylationandfunctionsoftheRNApolymeraseIICTD．Genes＆development，2006，20(21)：2922—2936．BuratowskiS．ProgressionthroughtheRNApolymeraseIICTDcycle．Molec#Larcell,2009，36(4)：541—546．MyersLC，GustafssonCM，BushnellDA，LuiM，Erdjument-BromageH，Tempst只KombergRD．TheMedproteinsofyeastandtheirfunctionthroughtheRNApolymeraseIIcarboxy-terminaldomain．Genes＆development,1998，12(1)：45·54．PeterlinBM，PriceDH．ControllingtheelongationphaseoftranscriptionwithP-TEFb．MolecpLarcell,2006，23(3)：297-305．55 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选【65】[66】【67】[68】【69】【70】【71】【72】[73】[74】【75】[76】[77】【78】[79】【80】SteinmetzEJ，WarrenCL，KuehnerJN，PanbehiB，AnsariAZ，BrowDA．Genome-widedistributionofyeastRNApolymeraseIIanditscontrolbySenlhelicase．MolecktLarcell，2006，24(5)：735-746．WestS，GromakN，ProudfootNJ．Human5’一>3’exonucleaseXrn2promotestranscriptionterminationatCO-transcriptionalcleavagesites．Nature，2004，432(7016)：522．525．SehgalPB，DarnellJE，Jr．，TammI．TheinhibitionbyDRB(5，6一dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole)ofhnRNAandmRNAproductioninHeLacells．Cell,1976，9(3)：473—480．MarshallNF,PriceDH．PurificationofP-TEFb．atranscriptionfactorrequiredforthetransitionintoproductiveelongation．TheJournalofbiologicalchemistry，1995，270(21)：12335．12338．Wada互Takagi正YamaguchiKFerdousA。Imai正HiroseS，SugimotoS，YanoK，HartzogGA，WinstonF'BuratowskiS，HandaH．DSIF,anoveltranscriptionelongationfactorthatregI．tLatesRNApolymeraseIIprocessivity,iscomposedofhumanSpt4andSpt5homologs．Genes＆development,1998，12(3)：343—356．YamaguchiYTakagiT，WadaT，YanoK，FuruyaA，SugimotoS，HasegawaJ，HandaH．NELF,ampLtisubunitcomplexcontainingRD，cooperateswithDSIFtorepressRNApolymeraseIIelongation．Cell，1999，97(1)：41-51．RennerDB，YamaguchiYWadaT，HandaH，PriceDH．AhighlypurifiedRNApolymeraseIIelongationcontrolsystem．TheJournalofbiologicalchemistry,2001，276(45)：42601—42609．IvanovD，KwakYT，GuoJ，GaynorRB．DomainsintheSPT5proteinthatmodp_LateitstranscriptionalregpLatoryproperties．MolecgLarandcell#Larbiology，2000，20(9)：2970．2983．KimJB，SharpPA．PositivetranscriptionelongationfactorBphosphorylateshSPT5andRNApolymeraseIIcarboxyl-terminaldomainindependentlyofcyclin-dependentkinase-activatingkinase．TheJournalofbiologicalchemistry,2001，276(15)：12317．12323．BartelDEMicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction．cP，，，2004，116(2)：281·297．LeeYAhnC，HanJ，ChoiH，KimJ，YimJ，LeeJ，ProvostP'RadmarkO，KimS，KimVN．ThenuclearRNaseIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing．Nature，2003，425(6956)：415-419．KimVN．MicroRNAprecursorsinmotion：exportin-5mediatestheirnuclearexport．Trends加cellbiology，2004，14(4)：l56—159．LundE，GuttingerS，CaladoA，DahlbergJE，KutayU．NuclearexportofmicroRNAprecursors．Science，2004，303(5654)：95-98．VolpeTA，KidnerC，HallIM，TengGGrewalSI，MartienssenRA．RegpLationofheterochromaticsilencingandhistoneH3lysine一9methylationbyRNAi．Science，2002，297(5588)：1833—1837．HutvagnerGZamorePD．AmicroRNAinam／aLtiple-turnoverRNAienzymecomplex．Science，2002，297(5589)：2056—2060．ZengYYiR，CrtLlenBR．MicroRNAsandsmallinterferingRNAsCaninhibitmRNA56 参考文献[81】[82】【83】【84][85】【86】[87】【88】【89】【90】【91】【92】【93】[94】【95】expressionbysimilarmechanisms．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2003，100(17)：9779—9784．LiuJ，CarmellMA，RivasFV,MarsdenC13lThomsonJM，SongJJ，HammondSM，Joshua-TorL．HannonGJ．Argonaute2isthecatalyticengineofmammalianRNAi．Science，2004，305(5689)：1437-1441．MeisterGLandthalerM，PatkaniowskaA，DorsettYTengGTuschlT．HumanArgonaute2mediatesRNAcleavagetargetedbymiRNAsandsiRNAs．MoleclVLarcell,2004，l5(2)：l85-197．LaiEC．MicroRNAsarecomplementaryto3’UTRsequencemotifsthatmediatenegativepost-transcriptionalregpLation．Naturegenetics，2002，30(4)：363·364．LewisBP,ShihIH，Jones-RhoadesMW：BartelDP,BurgeCB．PredictionofmammalianmicroRNAtargets．Cell，2003，115(7)：787-798．PfefferS，ZavolanM，GrasserFA，ChienM，RussoJJ，JuJ，JohnB，EnrightAJ，MarksD，SanderC，TuschlT．Identificationofvirus·encodedmicroRNAs．Science，2004，304(5671)：734-736．SBLlivanCS，GrundhofrAT'TevethiaS，PipasJM，GanemD．SV40-encodedmicroRNAsregI．tLateviralgeneexpressionandreducesusceptibilitytocytotoxicTcells．Nature，2005，435(7042)：682-686．GreyF’AntoniewiczA，AllenE，SaugstadJ，McSheaA，CarringtonJC，NelsonJ．Identificationandcharacterizationofhumancytomegalovirus-encodedmicroRNAs．Journalofvirology，2005，79(18)：12095—12099．Umbach几，KramerMF'JurakI，KarnowskiHW,CoenDM，ClaLlenBR．MicroRNAsexpressedbyherpessimplexviruslduringlatentinfectionregp．LateviralmRNAs．Nature，2008，454(7205)：780-783．KincaidRP,BurkeJM，SlaLlivanCS．RNAvirusmicroRNAthatmimicsaB—celloncomiR．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2012，109(8)：3077—3082．LieberD，HaasJ．VirusesandmicroRNAs：atoolboxforsystematicanalysis．W／teyinterdisciplinaryreviews．RNA，2011，2(6)：787—801．OtsukaM，JingQ，GeorgelP'NewL，ChenJ，MolsJ，KangYJ，JiangZ，DuX，CookR，DasSC，PattnaikAK，BeutlerB，HanJ．Hypersusceptibilitytovesicp．LarstomatitisvirusinfectioninDicerl-deficientmiceisduetoimpaledmiR24andmiR93expression．Immunity，2007，27(1)：123—134．HuangJ，WangF，ArgyrisE，ChenK，LiangZ，TianH，HuangWSquiresKVerlinghieriGZhangH．CelllaLarmicroRNAscontributetoHIV-1latencyinrestingprimaryCD4+Tlymphocytes．Naturemedicine，2007，13(10)：1241-1247．WangS，QiuL，YanX，JinW：WangYChenL，WuE，YeX，GaoGF,WangF，ChenYDuanZ，MengS．LossofmicroRNA122expressioninpatientswithhepatitisBenhanceshepatitisBvirusreplicationthroughcyclinG(1)-modlaLatedP53activity．Hepatology,2012，55(3)：730·741．SongL，LiuH，GaoS，Jiang彤Huang彤CellI_tLarmicroRNAsinhibitreplicationoftheH1N1influenzaAvirusininfectedcells．Journalofvirology，2010，84(17)：8849-8860．MaYJ，YangJ，FanXL，ZhaoHB，HuW：LizP,YuGC，DingXR，WangJZ，BoXC，ZhengXF,ZhouZ，WangSQ．CelllaLarmicroRNAlet-7cinhibitsM1proteinexpression57 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选oftheHlNlinfluenzaAvirusininfectedhumanlungepithelialcells．JournalofceZf儿orandmolecttLarmedicine,2012，16(10)：2539．2546．[96]LiYChanEY,LiJ，NiC，PengX，RosenzweigE，TumpeyTM，KatzeMGMicroRNAexpressionandvirlaLenceinpandemicinfluenzavirus-infectedmice．Journalofvirology，2010，84(6)：3023—3032．【97】LovedayEK，SvintiVDiederichS，PasickJ，JeanF．Temporal．andstrain-specifichostmicroRNAmolec：此arsignaturesassociatedwithswine-originH1N1andavian-originH7N7influenzaAvirusinfection．Journalofvirology，2012，86(11)：6109-6122．[98】DeClercqE．AntiviralagentsactiveagainstinfluenzaAviruses．Naturereviews．Drugdiscovery，2006，5(12)：1015—1025．[99】PintoLH，LambRA．Controllinginfluenzavirusreplicationbyinhibitingitsprotonchannel．MolecpLarbioSystems，2007，3(1)：18—23．[100】WangC，TakeuchiK，PintoLH，LambRA．IonchannelactivityofinfluenzaAvirusM2protein：characterizationoftheamantadineblock．Journalofvirology，1993，67(9)：5585．5594．[101】GrambasS，HayAJ．MaturationofinfluenzaAvirushemagglutinin—estimatesofthepHencounteredduringtransportanditsreggLationbytheM2protein．Virology，1992，190(1)：11一18．[102】GubarevaLV,KaiserL，HaydenFG．Influenzavirusneuraminidaseinhibitors．Lancet，2000，355(9206)：827-835．[103】vonItzsteinM，WhWYKokGB，PeggMS，DyasonJC，JinB，VanPhanT'SmytheML，WhiteHF,Oliversw,eta1．Rationaldesignofpotentsialidase-basedinhibitorsofinfluenzavirusreplication．Nature，1993，363(6428)：418—423．[104]BoltzDA，AldridgeJR，Jr．，WebsterRGGovorkovaEA．Drugsindevelopmentforinfluenza．Drugs，2010，70(11)：1349—1362．【105】FurutaYTakahashiK，FukudaYKunoM，KamiyamaT，KozakiK，NomuraN，EgawaH，MinamiS，WatanabeYNaritaH，ShirakiK．Invitroandinvivoactivitiesofanti-influenzaviruscompoundT-705．Antimicrobialagen捃andchemotherapy，2002，46(4)：977—981．【106】FurutaYTakahashiK，Kuno-MaekawaM，SangawaH，UeharaS，KozakiK，NomuraN，EgawaH，ShirakiK．MechanismofactionofT-705againstinfluenzavirus．Antimicrobialagen捃andchemotherapy，2005，49(3)：981—986．[107】KoyamaK，TakahashiM，OitateM，NakaiN，TakakusaH，MiuraS，OkazakiO．CS一8958，aprodrugofthenovelneuraminidaseinhibitorR-125489，demonstratesafavorablelong—retentionprofileinthemouserespiratorytract．Antimicrobialagen船andchemotherapy，2009，53(11)：4845-4851．【108】RossignolJF,LaFraziaS，ChiappaL，CiucciA，SantoroMGThiazolides，anewclassofanti-influenzamolecgLestargetingviralhemagglutininatthepost-translationallevel．TheJournalofbiologicalchemistry，2009，284(43)：29798—29808．【109】LeeCM，WeightAK，HaldarJ，WangL，KlibanovAM，ChenJ．Polymer-attachedzanamivirinhibitssynergisticallybothearlyandlatestagesofinfluenzavirusinfection．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2012，109(50)：20385-20390．【l10】Triana-BaltzerGB，BabizkiM，ChanMC，WongAC，AschenbrennerLM，CampbellER, 参考文献LiQX，ChanRW,PeirisJS，NichollsJM，FangEDAS181，asialidasefusionprotein，protectshumanairwayepitheliumagainstinfluenzavirusinfection：aninvitropharmacodynamicanalysis．TheJournalofantimicrobialchemotherapy，2010，65(2)：275．284．【111】GurusiddaiahS，RonaldRC．Grahamimycins：antibioticsfromCytosporasp．Ehrenb．W．FP．L-13A．Antimicrobialagentsandchemotherapy，1981，19(1)：153—165．59 流感病毒与宿主细胞因子的相互作用和抗流感病毒化合物的筛选发表论文赖文彬1，汪世雄，叶听+．(2013)Colletodiol降低聚合酶活性抑制流感病毒(WSN／HINl)复制．缓璧物糊55(11)．60 致谢首先要感谢我的导师叶听研究员，很荣幸能够成为叶老师的一名学生。叶老师在论文选题，文献阅读，实验设计以及结果分析和论文撰写等方面进行了大量细致的指导。在三年研究生学习生涯中，叶老师扎实的专业知识，缜密的科研思维，严谨的学术态度让我受益颇多。她对我专业的指导和培养将使我终生受益。在我即将毕业之时，向叶老师致以最真挚的谢意。衷心感谢中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫重点实验室的田波院士，高福研究员，刘文军研究员，朱宝利研究员，孟颂东研究员，周旭宇研究员以及真菌地衣系统学重点实验室的车永胜研究员在实验和论文上给予的指导。感谢实验室的童晓梅，胡毅，张金方在实验室管理和维护方面的辛勤付出以及在我实验方面给予的指导和帮助。感谢实验室的同学李刚，李军辉，张军杰，刘婷，邓敏，卫茜，杜朝阳，黄艳，孙丽萍，王烨涛，姜良珍，汪世雄，刘宁宁，张廷红，焦童，胡磊，秦玉洁等帮助我的实验JII页N进行并度过了美好的实验室生活。感谢刘晓玲，陆西山等在实验材料上给予的帮助。感谢微生物所2010级的所有同学，是你们让我的研究生生活更加丰富多彩。衷心感谢我的父母和兄弟姐妹们，正是他们一直以来的理解，支持和关爱激励着我不断前进，超越自我。最后感谢所有关心和支持我的老师同学和朋友们!