广西猪jev+fc792分离株全基因序列测定和分析及rt-lamp建立和e基因抗原域原核表达

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1、广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种十分重要的人畜共患的急性传染病，其主要流行于亚洲的东部和东南部以及澳大利亚等地区，其引起的死亡率可达20％以上。根据世界卫生组织的统计，乙脑年发病人数已达35000例，其中中国的发病人数占到了80％。JEV可感染猪，引起妊娠母猪流产、公猪睾丸肿大和仔猪神经系统疾病，给

2、养猪业造成了巨大的损失。猪是JEV主要的储存和扩散宿主，因此对猪感染乙脑的诊断与防制具有重要的公共卫生学意义。首先，本研究以JEVSA14为模板设计JEV特异性引物，分7段扩增JEV广西分离株FC792全基因，经序列测定与拼接后得到FC792分离株全基因组序列。FC792株全长10977个核苷酸，其中5’非编码区有95个核苷酸，3’非编码区有586个核苷酸，开放阅读框含10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。核苷酸与氨基酸同源性分析发现FC792株与国内外JEV代表毒株的核苷酸同源性为84．6％．99．7％，氨

3、基酸同I源性为96．2％．99．4％。其中与SAl4．14．2和YUNNAN0901株核苷酸同源性分别为99．7％和99．6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．2％。遗传进化分析表明FC792株属于基因ⅡI型，且与YUNNAN0901和SAl4．14．2株的遗传进化关系最为接近。FC792株与YUNNAN0901株核苷酸的差异率仅为o．45％，氨基酸差异率为O．76％，结构蛋白含有5个氨基酸的差异。其次，本研究建立了JEVRT-LAMP检测方法，并进行了反应体系和反应条件的优化，灵敏度实验表明本研究建立的JEV

4、RT-LAMP检测方法的检测极限为O．5pg，特异性实验证明其具有较高的特异性。与RT-Nested．PCR比较，两种方法检出率的符合率为90．9％。而且反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察，大大缩短了检测时间。第三，克隆出JEVFC792株包含E基因抗原域I和抗原域II的基因片段Ea，成功构建出原核表达质粒pET．32a．Ea。用JEV阳性猪血清作为一抗进行Western．blot分析，初步表明重组蛋白Ea具有抗原性，纯化复性重组蛋白Ea，免疫小鼠2次，间隔1周，二免一周后眼球采血、分离血清，经包被JE

5、V全病毒的ELISA试剂盒检测为阳性，说明Ea具有抗原性；ELSIA检测为阳性的小鼠血清进行病毒的中和试验，结果表明免疫组小鼠血清具有中和JEV的能力，中和抗体效价为1：70，说明Ea具有较好的免疫原性。II关键词：乙型脑炎RT-LAMP全基因组序列测定与分析E基因免疫原性IIIGENOMESEQUENCINGANDANALYSISOFPIG旭VGUANGXIISOLATESTRAINFC792，ESTABLISHINGTHEMETHODOFTHERT-LAMP,ANDPROKARYOTICEⅫRESSIONT髓E

6、GENEOFFC792STRAINABSTRACTJapaneseencephalitis(厄)isacuteinfectionsdisease，whichcausedbyJEV，andit’Soneofmostimportantdeseaseforbothhumanandlivestock．MainlyOccursintheEasternandsouthEasternofAsia，Australiaandotherregionsandcountries，itsmortalityratedupto20％．Accor

7、dingtotheWorldHealthOrganization，thenumberofJEincidencehadreachedto35000eachyear，amongthemChinaaccountedfor80％．JEVcaninfectpigs，causingtheabortionofpregnantSOWS，boarstesticularswellingandpigletsnervoussystemdisease，SOascausedhugelossestothepigindustry．Pigsaret

8、hemainstorageandproliferationhostforJEV，SOtherehasimportantpublichealthsignificancetodiagnosisandcontrolofpigsinfectedwith厄V．VThisstudy，usedtheJEVSA14strain’Sgenomesequenceastempla