基于DMP阳离子纳米粒递送siRNA体外抗小鼠结肠癌活性及姜黄素纳米粒的研究

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1、（药学院）二○一八届硕士研究生学位论文基于DMP阳离子纳米粒递送siRNA体外抗小鼠结肠癌活性及姜黄素纳米粒的研究StudyonAnti-mouseColonCancerActivityofdeliveringsiRNAbasedonDMPCationicNanoparticlesandCurcuminnanoparticles研究生姓名：李文婷指导教师：夏厚林教授门可助理研究员学科专业：药物分析学二○一八年五月学位论文基于DMP阳离子纳米粒递送siRNA体外抗小鼠结肠癌活性及姜黄素纳米粒的研究StudyonAnti-mous

2、eColonCancerActivityofdeliveringsiRNAbasedonDMPCationicNanoparticlesandCurcuminnanoparticles李文婷指导教师姓名：夏厚林教授门可助理研究员申请学位级别：硕士学位专业名称：药物分析学论文提交时间：2018年4月论文答辩时间：2018年5月二○一八年五月成都中医药大学2018届硕士学位论文摘要目前，肿瘤的治疗是世界医学研究的重点，而抗肿瘤药物及其递送系统的研究则是肿瘤治疗的关键。在对抗肿瘤中药有效成分与传统药物的研究中，由于其稳定性差、代谢过

3、快、体内生物利用度低而限制了它们的应用，而对于基因药物来说，同样它们存在体内不稳定，易被核酸酶降解，细胞摄取率低等问题使临床应用受到限制。因此，建立和寻求合适的载药系统成为了发展抗肿瘤中药有效成分、传统药物和基因药物实现安全有效的肿瘤治疗共同的需求。在前期的研究中，结合（2，3-二油酰基-丙基）-三甲胺（DOTAP）和甲氧基聚乙二醇-聚己内酯MPEG-PCL制备了混合型纳米粒（DMP）。然而，DMP作为基因载体仅限于质粒DNA的递送，DMP用于siRNA的递送从未被报道过。在本文中，通过优化DMP的制备工艺，制备得到适于递送s

4、iRNA的DMP，并用DMP递送MCL1siRNA（DMP/siMCL1）和Bcl-xlsiRNA（DMP/siBcl-xl）至C26细胞中对其体外抗小鼠结肠癌活性进行研究。姜黄素具有显著的抗肿瘤活性，但由于其稳定性差、难溶于水、体内生物利用度低而限制了姜黄素在体内的抗肿瘤作用。因此，本研究用聚合物纳米粒MPEG-PCL包裹姜黄素制备成姜黄素纳米粒，改善姜黄素的水溶性并提高其作用效果。首先对制备的阳离子纳米粒DMP的相关参数指标来对其理化性能特征进行评价：粒径分布、电位大小、复合siRNA能力、细胞毒性高低以及血清条件下的稳定

5、性和递送能力。通过对DMP的制备工艺进行筛选得到最佳制备工艺，制备所得的纳米粒具有46.4nm的平均粒径和44.1mV的zeta电位，带正电荷，均匀分散在水溶液中，多分散系数PDI为0.215。通过凝胶阻滞实验证明DMP具有负载siRNA的能力。细胞毒性实验表明，与PEI25K相比，DMP具有较低的细胞毒性。在体外血清转染实验中DMP显示低细胞毒性和高转染效率，有血清转染组与无血清转染组的转染效率差别不大，DMP的转染效率不受血清浓度的影响。其次，本实验使用MCL1siRNA和Bcl-xlsiRNA作为治疗靶点，研究它们体外抗

6、小鼠结肠癌活性。在体外基因沉默表达检测实验中，用MCL1siRNA和Bcl-xlsiRNA对C26细胞进行处理，通过荧光定量PCR法对其相应表达的mRNA的含量进行测定，结果表明与空白对照组相比，经过MCL1siRNA和Bcl-xlsiRNAI成都中医药大学2018届硕士学位论文转染的实验组，C26细胞表达的mRNA含量水平明显减少。在体外抗肿瘤活性的研究中，通过MTT实验和克隆形成实验来对细胞增殖能力进行考察。MTT实验结果表示，DMP/siMCL1与DMP/siBcl-xl的细胞生存率均低于对应相同浓度的DMP组，表明DM

7、P/siMCL1与DMP/siBcl-xl能抑制C26细胞的生长和增殖能力。在平板克隆形成实验中，DMP/siMCL1和DMP/siBcl-xl具有较高的克隆形成抑制率，对C26细胞的生长和增殖显示出较强的抑制作用。在凋亡实验中，我们用流式法对体外抗肿瘤细胞凋亡进行定量的测定，DMP/siMCL1与DMP/siBcl-xl的细胞凋亡率明显的高于相应的对照组与其他实验组，具有诱导细胞凋亡的作用。WesternBlot实验表明，相对于control、DMP以及DMP/ScramblesiRNA组，DMP/siBcl-xl组明显的降

8、低了Bcl-xl的蛋白水平的表达，且高浓度的DMP/siBcl-xl组作用更加明显。姜黄素具有显著的抗肿瘤活性，但由于其稳定性差、代谢过快、体内生物利用度低而限制了姜黄素在体内的抗肿瘤作用。为了实现以DMP纳米粒为基础的中药有效成分与基因药物的联合使用增强抗肿瘤的治疗效果，我