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AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选学位申请人：刁朝蕾指导教师：刘桂林副教授学科专业：风景园林学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月五日 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：巧]<§^11签字日期：年<月#日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河:ji�农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河jb农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：巧劍蕃导师签名：rt签字曰期：年<月J曰签字曰期:卞tt年/月/曰学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址:邮编: 分类号：S432.4单位代码：10086密级：公开学号：2012421银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选ThePathogenIsolationandFungicidesScreeningofRootRotofGinkgobiloba学位申请人：刁朝蕾指导教师：刘桂林副教授学科专业：风景园林学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月五日 摘要银杏常被应用于城市绿化，目前在国内各地均出现夏季焦叶现象，严重影响了其景观效果。调查发现，焦叶的银杏植株普遍存在根系腐烂的现象，且焦叶现象越严重，根系腐烂程度越严重。为找出银杏根系腐烂的主要致病菌及有效防治药剂，从而缓解银杏焦叶问题。本文对染病根系进行了病原菌分离及鉴定，在室内与田间进行了防治药剂筛选试验，最终通过研究杀菌剂对土壤微生物群落的影响确定最佳防治药剂。主要研究如下：（1）采用组织分离法，对4个地方的银杏根系病健组织进行病原菌分离，共分离得到21个菌株，其中19个真菌菌株，2个细菌菌株。经过柯赫氏法则验证，确定了2个真菌菌株SJZ-4，SJZ-5具有较强的致病性，为导致银杏根系腐烂的主要病原菌。根据菌落生长特征、外表形态及分生孢子形态等，初步确定这2个菌株均为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。（2）采用菌丝生长速率法，利用带毒培养基对5种药剂进行室内毒力试验。结果表明，在供试浓度范围内，5种药剂对银杏根腐病病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用。化学药剂中苯醚甲环唑抑菌效果较好：菌株SJZ-4的EC50值为120.2263μg/ml，其他药剂EC50的值均在143.7655μg/ml以上；菌株SJZ-5的EC50值为189.0067μg/ml，其他药剂EC50的值均在210.3378μg/ml以上。生物药剂枯草芽孢杆菌对2种病原菌均产生优异的拮抗作用，稀释9600倍时对两种菌的抑制率均在95%以上。（3）采用灌根的方式将5种药剂施入土壤中进行田间防治试验，以药剂控制焦叶效果作为衡量指标间接反应根腐病的防治效果。以焦叶程度的分级作为衡量指标，稀释300倍的枯草芽孢杆菌控制效果最好；苯醚甲环唑及多菌灵的田间控制效果次之；噻霉酮、恶霉灵控制效果相对较差，但也起到控制作用。以银杏焦叶面积率作为衡量指标时，苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌控制效果显著的高于其他几个处理，银杏焦叶面积率在20%以下。以银杏焦叶病情指数为衡量指标时，枯草芽孢杆菌的控制效果最好，为71.11%；苯醚甲环唑次之，控制效果为56.31%，多菌灵、噻霉酮、恶霉灵的控制效果依次为48.54%，28.64%，12.62%。综上所述，经药剂处理后银杏根腐病得到有效控制，在一定程度上缓解了焦叶问题，生物药剂枯草芽孢杆菌防治效果最好。（4）药剂进入土壤后，通过对土壤中镰刀菌菌落数量的测定可知，施药之后，土壤中镰刀菌的数量显著低于对照，随着时间的延长镰刀菌数量呈现趋于对照的趋势；生物防治药剂枯草芽孢杆菌则持续显著的抑制了镰刀菌的数量。通过对根际和根围土壤中微生物菌落数量的测定分析得出，根际土壤中微生物数量高于根围土壤中微生物数量。用药初期（30d后），经噻霉酮、枯草芽孢杆菌、多菌灵杀菌剂处理的土壤中细菌的数量显著增加，而真菌、放线菌的数量明显受到抑制；苯醚甲环唑、恶霉灵则显著抑制了土壤中各种微生物的数量。用药后期（105d），土壤中各微生物的数量呈现趋于对照的趋势。综合以上分析可知，枯草芽孢杆菌持续显著的抑制了 镰刀菌的数量，而对真菌、细菌、放线菌数量的影响低于苯醚甲环唑、多菌灵。从用药安全性、可持续发展的角度综合考虑可知，枯草芽孢杆菌是防治根腐病进而缓解银杏夏季焦叶问题的最佳药剂。关键词：银杏；根腐病；病原菌；杀菌剂；土壤微生物 ThePathogenIsolationandFungicidesScreeningofRootRotofGinkgobilobaAuthor：DiaoChaoleiSupervisor：Prof.LiuGui-linMajor：LandscapearchitectureAbstractGinkgobilobaisoftenappliedtourbangreening.Inrecentyears,yellowleavesofGinkgobilobaishappenedinsummeratmanyplaces,whichisaffecteditslandscape.Accordingtoinvestigation,mostyellowleavesofGinkgobilobahasrotroot.Thephen-omenonismoreserious,moreseriousthedegreeofrootrot.Inordertofindoutthemainpathogenicbacteriaofroot-rotofGinkgobilobaanditseffectivefungicides,torelievethephenomenonofyellowleavesofGinkgobiloba.UsingtherootofGinkgobilobaastheexperimentalmaterials,thepathogenwasisolatedwiththemethodoftissueisolationandmorphologicalcharacteristicswasidentified.TheeffectsoffungicidestorootrotofGinkgobilobawerestudiedwithmyceliagrowthrateindoors.Thescreeningfungicideswereusedinfieldexperiment.Atlast,studyingfungicideseffectonsoilmicrobialcomm-unitytodeterminethebestfungicides.Themianfindingwereasfollows:1.UsingtherootofGinkgobilobafrom4placesastheexperimentalmaterials,thepathogenwasisolatedwiththemethodoftissueisolation.21strainswereisolated,including19fungis,2bacteriums.PathogenicityoffungalisolatesobtainedfromthesesampleswastestedbyverifialstandardmeansoftheKoch'sPostulation.2isolatesnamedSJZ-4,SJZ-5wereobtainedfromtherootofGinkgobiloba.Pathogenictestindicatedthatthe2separatemattershadpathogenic.Basedonthecolonymorphology,growthcha-racteristics,andmacroconidiumunderamicroscope,thepathogenoftherootofGinkgobilobawereidentifiedasFusariumoxysporum.2.Thetoxicitiesof5fungicidesonpathogensofrootrotofGinkgobilobawereassayedwithmyceliagrowthrateindoors.Theresultindicatedthat:Atthetestrange,5fungicidesinhibitedthemycelialgrowthofpathogensoftherootrotofGinkgobiloba.Thetoxicitiesofdifenoconazoleworkedeffectively.OntargetsstrainnamedSJZ-4wasthestrongestwithEC50valuesof120.2263μg/ml,thetoxicitiesofotherfungicideswithEC50valuesofmorethan143.7655μg/ml.OntargetsstrainnamedSJZ-5wasthestrongestwithEC50valuesof189.0067μg/ml,thetoxicitiesofotherfungicideswithEC50valuesofmorethan210.3378μg/ml.BacillussubtilisshowedantagonismtoSJZ-4,SJZ-5.Bacillussubtiliswasdiluted9600times,itcaninhibitedthemycelialgrowthof pathogensoftherootrotofGinkgobiloba,withtheinhibitionrateofmorethan95%.3.Byirrigation,the5fungicideswereusedinfieldexperiment,usingthedegreeofyellowleavesasindirectstandardtoreflecttheeffectofrootrot.Usingthedegreeofyellowleavesasstandard,bacillussubtilisdiluted300timeswithpurewaterworkedeffectively,difenoconazoleandcarbendazimfollowedbybacillussubtilis,benziothiazolinoneandhymexazolshowedlesseffective.Usingtheareapercentageofyellowlaevesasstandard,difenoconazoleandbacillussubtilisshowedbettereffectivetotheyellowleavesofGinkgobiloba,withareapercentagebelow20%.Thosesignificantlyhigherthanotherfungicides.Usingthemeandiseaseindexasstandard,bacillussubtilisworkedbestly,withcontroleffectof71.11%.Difenoconazolefollowedbybacillussubtilis,withcontroleffectof56.31%.Carbendazim,benziothiazolinoneandhymexazolhadcontroleffectreaching48.54%,28.64%,12.62%.Aboveall,5fungicidesshowedeffectivetotherootrotandyellowleavesofGinkgobiloba,bacillussubtilisworkedsignificantlyeffectively.4.5fungicideswereirrigatedintosoil.BydeterminingthequantityofFusarium,theresultindicatedthat:Afterirrigation,thequantityofFusariumwassignificantlylowerthanthecontrol;ThequantityofFusariumshowedtendencytoapproachecontrolwiththetimeextension;BacillussubtiliscontinuouslysignificantlyinhibitedthequantityofFusarium.Bydeterminingthemicrobequantityofrhizospheresoil,theresultindicatedthat:Microbequantityofrhizospheresoilnearbytherootswashigherthantherhizospheresoilawaybytheroots.30daysafterirrigatedfungicides,thesoilirrigatedbybenziothiazolinone,bacillussubtilis,carbendazimhadhigherquantityofbacteriumthanthesoilirrigatedbyotherfungicides,thequantityoffungi,actinomycetewereinhibited.Thesoilirrigatedbydifenoconazoleandhymexazolinhibitedthemicrobequantityofrhizospheresoil.105daysafterirrigatedfungicides,themicrobequantityofrhizospheresoilirrigatedfungicidesshowedthetendencytoclosethemicrobequantityofsoilwihoutirrigatedfungicides.Accordingtoanalysis,bacillussubtiliscontinuouslysignificantlyinhibitedthequantityofFusarium.Themicrobequantityofrhizospheresoilirrigatedbybacillussubtiliswashigherthantherhizospheresoilirrigatedbydifenoconazoleandcarbendazim.Takingintoaccounttheperspectiveofsafety,sustainabledevelopment,bacillussubtiliswasthemosteffectivelyfungicidestorelievetherootrotandyellowleavesofGinkgobiloba.Keywords：Ginkgobiloba;theroot-rot;pathogen;fungicide;soilmicrobe. 目录1引言........................................................................................................................................................11.1银杏概况.........................................................................................................................................11.1.1银杏的形态特征.....................................................................................................................11.1.2银杏的生态习性.....................................................................................................................21.1.3银杏的地理分布.....................................................................................................................21.1.4银杏常见病虫害.....................................................................................................................21.1.5银杏的价值及其应用.............................................................................................................31.2植物根腐病研究现状.....................................................................................................................41.2.1根腐病的症状.........................................................................................................................41.2.2植物根腐病病原物的分离及鉴定原则.................................................................................51.2.3植物根腐病的主要类型.........................................................................................................51.3镰刀型植物根腐病的防治措施.....................................................................................................61.3.1农业技术防治措施.................................................................................................................71.3.2生物防治措施.........................................................................................................................71.3.3化学药剂防治措施.................................................................................................................81.4杀菌剂对土壤微生物数量的影响.................................................................................................91.4.1土壤微生物数量的影响因素.................................................................................................91.4.2杀菌剂对土壤微生物数量的影响.......................................................................................101.5研究目的及意义...........................................................................................................................112银杏根腐病病原菌的分离..................................................................................................................122.1试验材料.......................................................................................................................................122.1.1病原菌分离及接种试验材料...............................................................................................122.1.2病原菌分离使用的培养基、试剂和仪器设备...................................................................122.2试验方法.......................................................................................................................................122.2.1试验材料的采集...................................................................................................................122.2.2病原菌的分离及纯化...........................................................................................................122.2.3病原菌形态学鉴定方法.......................................................................................................132.3结果与分析...................................................................................................................................132.3.1病原菌初次分离结果...........................................................................................................132.3.2病原菌室内接种结果...........................................................................................................142.3.3病原菌室外盆栽接种结果...................................................................................................152.3.4病原菌再分离结果...............................................................................................................152.3.5病原菌形态学鉴定结果.......................................................................................................162.4小结与讨论...................................................................................................................................163银杏根腐病病原菌室内毒力试验及田间试验..................................................................................173.1试验材料.......................................................................................................................................17 3.1.1室内毒力试验材料..............................................................................................................173.1.2室内毒力试验所用器材......................................................................................................173.1.3田间试验材料......................................................................................................................173.2试验方法......................................................................................................................................173.2.1室内毒力试验方法..............................................................................................................173.2.2田间试验方法......................................................................................................................183.2.3田间试验调查方法..............................................................................................................183.3结果与分析..................................................................................................................................193.3.1菌株SJZ-4室内毒力试验结果...........................................................................................193.3.2菌株SJZ-5室内毒力试验结果...........................................................................................193.3.3银杏焦叶程度控制效果......................................................................................................203.3.4银杏焦叶面积控制效果......................................................................................................213.3.5银杏焦叶病情指数..............................................................................................................213.4小结与讨论..................................................................................................................................224银杏根腐病杀菌剂对土壤微生物数量的影响..................................................................................234.1试验材料......................................................................................................................................234.1.1试验材料..............................................................................................................................234.1.2试验所用的培养基和仪器设备...........................................................................................234.2试验方法......................................................................................................................................234.2.1土壤采集的方法..................................................................................................................234.2.2根际土壤菌悬液配置方法...................................................................................................244.2.3根围土壤菌悬液配置方法...................................................................................................244.2.4土壤微生物数量计数方法...................................................................................................244.2.5数据统计及分析的方法......................................................................................................244.3结果与分析..................................................................................................................................254.3.1土壤中镰刀菌数量的变化规律...........................................................................................254.3.2土壤中真菌数量的变化规律...............................................................................................274.3.3土壤中细菌数量的变化规律...............................................................................................294.3.4土壤中放线菌数量的变化规律...........................................................................................314.4小结与讨论..................................................................................................................................344.4.1小结......................................................................................................................................344.4.2讨论......................................................................................................................................345结论......................................................................................................................................................36参考文献.................................................................................................................................................37附录.......................................................................................................................................................41在读期间发表的学术论文......................................................................................................................43作者简历.................................................................................................................................................44致谢.....................................................................................................................................................45 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选1引言银杏（GinkgobilobaLinn）因其树体高大、树形优美、叶形独特、叶色鲜艳、树龄长久、病虫害少以及对环境极强的适应能力，在城市绿化和园林美化中被大量运用，是著名的园林绿化景观树种之一。目前在银杏的应用中出现了许多问题，如银杏夏季焦叶现象和银杏假死现象。据调查统计2013年北京市长安街、王府井大街、北京西站街的银杏焦叶率达到72%，2013年石家庄市槐安路的银杏焦叶率达到53%，唐山建设路的银杏焦叶率达到42.3%，保定市复兴路栽植多年的银杏树焦叶率高达70%以上，由此可见银杏夏季焦叶现象广泛分布在各个地区。2015年3月17日最新报道，北京长安街东单至正义路路段75棵银杏因夏季焦叶现象严重已被更换为北京市市树国槐。银杏焦叶问题已成为制约银杏应用的最大障碍。导致银杏焦叶的原因就目前的研究资料显示，除与其栽培位置、高温、干旱、[1-3]土壤透气性差等立地条件因素有关外；根系腐烂为导致银杏焦叶的一个主要因[4][5]素。吴佐斌在调查蓝田县大银杏树时发现，银杏根腐病可导致叶片焦枯。吴锡琴在安徽省研究表明，银杏根腐病可导致植物地上部分出现早期黄化，后期干枯。据[6]李轩在北京、河北、山东等地调查后发现，银杏夏秋季出现焦叶都与根系腐烂有关：春末夏初高温干燥期，根系得不到充分的水分供给，无法保证叶片正常的蒸腾，导致叶片受到高温灼伤，开始出现焦叶现象。盛夏雨季，高温高湿天气频现，暴雨频发，导致根系腐烂，丧失吸水能力，叶片持续缺水，最终使植物焦叶的现象更加严重。根系腐烂是导致银杏夏季8~9月份出现新焦叶植株的原因，也是导致焦叶更加严重的根本原因，且表现为焦叶现象越严重，根系腐烂程度越严重。但前期试验仅限从气候、水分含量上进行了分析研究，并未对根系腐烂原因进行研究，因此本研究进行了深一步的试验和研究。1.1银杏概况银杏不仅树姿雄伟，叶形秀美，寿命长，病虫害少，而且具有绿化观赏、药用、保健、食用、材用等价值。改革开放以来，我国各行各业迅速发展，人们在物质文明得到满足的同时，对周围环境的美化要求也逐步提高，而银杏美化环境的效果尤为突出，被作为行道树、庭荫树、观赏树广泛应用于城市绿化建设。1.1.1银杏的形态特征银杏（GinkgobilobaLinn）为银杏科、银杏属落叶乔木，又名白果、公孙树、鸭掌树等，为第四纪冰川后，唯一在我国保存下来的1科1属1种的孑遗植物，故[7]有“活化石和植物界的熊猫”之称。银杏雌雄异株，树体可高达40m，干部直径达3m以上；树皮为灰褐色，深纵裂；主枝斜出，近轮生，枝有长枝、短枝之分；1 河北农业大学硕士学位（毕业）论文叶扇形，边缘浅波状，秋季变黄；种子核果状，椭圆形或近球形，熟时橘黄色，被[8]白粉，外种皮肉质，有臭味；中种皮骨质；内种皮膜质。银杏的根系主要由主根[9]和侧根组成，银杏的实生苗根系具有明显的主、侧根，主根发达，垂直分布较深。其根系有两个特点：一根系为肉质根，具有较厚的皮层且含水量高，保证了银杏顽强的生命力；二是一旦根系受到损伤，自身的生长愈合速度缓慢，新根生长迟缓。1.1.2银杏的生态习性银杏喜温暖和阳光充足的环境，属于耐寒、耐旱、不耐荫蔽的树种。喜适当湿润且排水良好的土壤，适于生长在水热条件比较优越的亚热带季风区。在酸性土（pH4.5）、石灰性土（pH8.0）中均可生长良好，而以中性或微酸土最适宜，不耐积水之地，较能耐旱，但在过于干燥处及多石山坡或低湿之地生长不良。初期生长较慢，萌蘖性强。雌株一般20年左右开始结实，500年生的大树仍能正常结实。一般3月下旬至4月上旬萌动展叶，4月上旬至中旬开花，9月下旬至10月上旬种子成熟，10月下旬至11月落叶。1.1.3银杏的地理分布银杏地理分布广泛，自然分布于我国北纬22~42°东经97~124°之间，年平均气温14~18℃，绝对低温不低于-20℃的气候范围内，在冬春温寒干燥或温凉湿润，夏季温暖多雨的气候条件下，生长良好。垂直分布一般在海拔400~1000m之间，云[10]南、四川的个别地区可达3000m以上。国内各地的名胜古刹、寺院庵庙和园林胜处，千年乃至数千年的银杏古树屡见不鲜。江苏省泰兴市有千年古银杏及百年银杏群。山东省莒县定林寺有3000多年生古银杏。四川省都江堰市古银杏为三国时期[9]张松手植。河南省义马市、黑龙江省鸡西市分别有银杏胚株和叶片的化石。在中[11]国历史博物馆陈列着40~50万年前“北京猿人”采食银杏的复原形象。这些都充分说明在很久以前，银杏就在我国有分布。1.1.4银杏常见病虫害银杏以其独特的姿态，倍受人们的喜爱，广泛应用在园林绿化中。一般在自然生长状况下，它具有很强的抗性，病虫害较少，但并不是没有。银杏常见的病害有：茎腐病、叶枯病、干枯病、炭疽病、黄化病等。针对这些病害，不少科学工作者这[12]提出了一些合理的防治措施。吴晓明，许康升等，提出防治银杏茎腐病可在银杏干旱、少雨、高温季节来临之前，用1∶70倍硫酸亚铁溶液来灌根，这样做可有效[13]地控制病原菌侵入，同时消除土壤中许多种病原菌的繁殖。邓荫伟，李晓铁等认为导致银杏叶枯病的主要原因有三个方面：一是植株水肥管理不合理，常年使用化学肥料使土壤板结，从而透气性差致使植物根系的生长不良；二是植物树体养分由2 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选于负荷挂果而严重失调；三是植物基部因雨季积水，造成根系腐烂。因此可在银杏[14]叶枯病发病初期采用50%多菌灵600倍喷雾防治。丁伯长认为银杏干枯病主要发生在树势衰弱的银杏植株上，应加强管理强壮树势，同时要及时刮除发病部位，并用0.1%升汞水，1%硫酸亚铁溶液，石灰涂白剂或1:100波尔多液涂抹伤口，以达到[15]防治病菌扩散的目的。王克福，刘永云等分析出现银杏叶片黄化的主要原因是土壤不适、施肥不合理、干旱、病虫害等原因，防治措施为改良土壤的通透性、合理施肥、喷洒杀菌剂等。银杏的主要虫害有天牛、白果大袋蛾、蓟马和银杏超小卷叶蛾。蓟马蛀食银杏幼嫩叶片，可在生长前期喷2.5%敌杀死乳油2000倍液或20%速灭杀丁乳油3000倍[16]液，也可用40%乐果或氧化乐果乳油l000~l500倍液进行防治。程国青针对银杏超小卷叶蛾提出的防治方法是在银杏生长初期减掉被虫害的枝条，之后用800倍敌敌畏喷洒树体一次，另外在3月中旬使用涂白剂涂刷树干杀死越冬虫卵，涂白剂的[17]配方为：5Kg生石灰、100g敌敌畏、1Kg食盐、20Kg清水调制配成。1.1.5银杏的价值及其应用1.1.5.1银杏的观赏价值造园学家陈植学者提出：观赏树木要具备形态美、色彩美、风韵美三个基本特[18]征。首先，银杏树姿雄伟壮丽、叶形优美似扇形，无论是作为庭荫树、行道树还是观赏树，都具有挺拔的树姿、形态优美；其次，银杏属于彩色叶树种，在色彩[19]上丰富多彩，早春浅绿、夏季碧绿、秋色叶金黄、冬季落叶，季相景观丰富，满足造园时对植物色彩的需求；银杏的风韵美则体现在人们赋予它的精神内涵：银杏为冰川时期的孑遗树种，有着悠久的历史文化底蕴，其寿命长，千年银杏是我国的国宝，象征着健康长寿、睿智和健硕，体现着中华名族的传统美德。1.1.5.2银杏的经济价值银杏因具有材质坚硬、富有弹性、易加工等特点，被广泛应用在制作家具、建筑、室内装修等方面；另外，银杏的种子含有丰富的营养可食用。银杏种仁又可入药，有止咳化痰、通经、利尿的作用；将银杏种仁捣烂之后涂于手上有治疗皮肤皲裂的功效。此外，银杏的种皮及叶片有毒，有杀虫的作用，因此种植时会节约一定的经济成本，同时能够保护环境。1.1.5.3银杏在园林中的应用（1）在道路绿化中的应用银杏在道路中的应用主要是作为行道树，因具备树冠大、荫浓、落叶迟且落叶期短等优点，是行道树的优良树种，能够起到美化、遮荫和防护的作用。银杏树姿雄伟壮丽、分支点高，作为行道树不影响交通；成年大树，树姿挺拔，枝叶茂密可以很好的起到为行人车辆遮荫和保护路面的功能。同时银杏在道路绿化中还可以起[20]到净化空气的作用，叶片可以吸收二氧化硫和一些汽车尾气。在道路绿化色彩上，银杏作为秋色叶树种可以起到丰富季相景观的作用，从而使道路景观在色彩上更加3 河北农业大学硕士学位（毕业）论文鲜艳亮丽。例如在绿化带中，将银杏与紫叶矮樱间植，并配置一些低矮的花灌木，不仅在空间上有富有层次感，而且色相上又有很大的变化，可以避免道路绿化时易产生的空间单调感，而使道路绿化产生和谐的韵律感和节奏感。（2）在公园和风景区绿化中的应用公园、风景区是人们休闲、旅游、放松身心的常去之处，同时公园和风景区的绿化程度能在一定程度上反应一个城市的整体绿化水平。因此在对公园、风景区进行绿化时，需要运用不同种类的植物进行搭配，从而营造出一种层次有致、舒适宜人的植物景观。银杏作为一种树形优美、病虫害少且具有深厚文化底蕴的树种，是公园、风景区绿化时的必备树种。以银杏作为行道树，秋季一片金黄，能营造出优美的景观大道。将银杏作为孤赏树孤植或丛植在绿地中，可独立成景，挺拔的树姿，丰富的层次感，给人以美的感受。或将银杏与草坪地被、花灌木组合成景；或配以楼台亭榭、山石小品，巧妙构成空间层次。目前，人们也常将银杏种植于公园、街[17]道、广场，给人以“峻峭雄奇、华贵典雅”之感。（3）在公共绿地、居住区和校园中的绿化应用在公共绿地、居住区和校园中的绿化应用，银杏可孤植挺立于较大面积的草坪、花坛、园路转弯处或交叉路口处，以欣赏其雄伟壮丽的姿态。也可群植于开阔的草坪上，以欣赏其林立挺拔的树干，给人以恬静的美感。银杏也可与其它植物配植，构成美观的树丛或生态群落。通过高矮搭配，乔灌穿插，落叶与常绿、观叶与观花植物相互交织的手法，构成一个花叶兼具、色彩丰富、错落有致的景观群落。1.2植物根腐病研究现状1.2.1根腐病的症状植物根部常见的病害有根腐病、白绢病、紫纹羽病、折纹羽病、根癌病以及立[21]枯病、炭疽病、红腐病等，又以根腐病最为常见。春夏交替时是植物根腐病的高发时期。植物根系受到损伤，地上部分通常会表现为：叶片色泽不正常，色淡而放叶延迟，叶型变小，植株矮化，容易发生枯萎现[22]象，最后是全株枯死。研究发现，根腐病即植物根部发生褐变腐烂，不能正常吸收土壤中的养分和水分，而造成植物缺水枯萎现象，严重时则植物死亡。导致根腐病的因素为致病真菌，该类真菌常附于病残体或土壤中。待每年春季(3月下旬)开始呈现出活性，特别是当光照不足或土壤湿度高温度低的情况下，致病菌活性高，极易感染植物苗木。在染病初期，首先感染根腐病的为根部少量支根或根尾部须根；随着病害的加重，主根逐渐感病，表现为其表皮出现黑斑，呈现向周围扩展的趋势，此时植物的外表显示健康。持续被病害感染一段时间后，病害蔓延至肉质茎杆致使其表面变黑，部分根系发生腐烂现象，难以吸收水分和养分，供养不足使得植物新生叶片发黄，甚至在中午叶片大量蒸发出水分的时候，叶片萎蔫。随着病害加重，木质部完全感4 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选病，根皮与髓部褐变分离，整个根系腐烂，表现为叶片持续萎蔫，逐渐枯萎，最终导致植物死亡。1.2.2植物根腐病病原物的分离及鉴定原则在植物根腐病的研究中，柯赫氏法则（Koch’sRule）是植物根腐病病原物的分离和鉴定普遍采用的法则，此原则得到植物病理界研究工作的普遍认同，并得到广泛应用，在病原物的确定中有着重要的指导作用。柯赫氏法则又称柯赫氏假设（Koch’sPostulates），是确定侵染性病害病原物的操作程序。柯赫氏法则主要包括下列4项必要步骤：①在发病植物上常伴随有一种病原微生物存在；②该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯净培养物；③将纯培养物接种到相同品种的健康植株上，出现症状相同的病害；④从接种[23]发病的植物上再分离到其纯培养物，性状与接种物相同。1.2.3植物根腐病的主要类型引起植物根腐病病害的病原有两类：一种是非侵染性病原如积水、有毒废水、施肥不当、土壤酸碱度不适等，此类病原所致根病不具有传染性；一种是侵染性病原主要由病原菌引起的，这类病原物大多属于土壤习居性或半习居性微生物，寄主范围广，腐生能力强，一旦定殖下来便很难根除，所致根病具有传染性。引起根腐病的病原菌大致有镰刀菌、疫霉菌、腐霉菌、丝核菌等其他菌。1.2.3.1镰刀菌镰刀菌导致的根腐病在我国十分常见，特别是尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌。通过[24]对病原菌的分离鉴定，徐秉良得出结论：导致孜然芹根腐病的病原菌为尖孢镰刀[25]菌。茄病镰刀菌和茄病镰刀菌蓝色变种能导致茄根发生根腐病；同时也有研究证[26][27][28][29][30][31]明，镰刀菌还能够导致大豆、香荚兰、麦冬、沙打旺、油茶、灯盏花等发生根腐病。尖孢镰刀菌与茄病镰刀菌共同作用，复合侵染，能够导致苜蓿根腐[32]病，且其发病了远高于两种致病菌单独接种的发病率。国内研究发现，导致根腐病的镰刀菌还有：腐皮镰刀菌、黄色镰刀菌、李瑟组层生镰刀菌、拟枝孢镰刀菌等。[33]在国外有研究表明，引起埃及棉花根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌；可使小茴香发生不同程度根腐病的致病菌有尖孢镰刀菌、双胞镰刀菌、茄病镰孢菌、木贼镰[34]胞菌、串珠镰孢菌以及砖红镰刀菌；尖孢镰刀菌同时还可以引起东非一些国家的[35]高粱发生根腐病和茎腐病；引起阿根廷花生根部发生褐腐病的主要病原菌之一为[36]茄类镰孢菌。1.2.3.2疫霉菌疫霉菌大多寄生，能够诱发许多重要的植物病害。早在1948年，美国印第安纳州发生严重的大豆疫霉根腐病，由于检测技术落后，直至1954年才确定其致病菌为[37]疫霉菌。在我国安徽灵璧县也发生过大规模的大豆根腐病，王子迎对种植大豆的5 河北农业大学硕士学位（毕业）论文土壤采样，在实验室内进行了病原菌分离与鉴定，最终确定了三种疫霉菌可导致大[38]豆致病。通过对南京花卉苗圃中非洲菊的发病植株根部进行病原菌分离及鉴定，得到46种真菌，又将全部真菌接种到健康非洲菊上，最终发现，11种疫霉菌能够[39][40]导致非洲菊发生根腐病。疫霉菌也能够与镰刀菌共同侵染植物根部，黄芳发现，当烟草疫霉菌致使西葫芦病发后，接种尖孢镰刀菌能够加重病害。[41][42]在国外，Wangetal发现疫霉菌可以引起大豆的根腐病。Pettittaetal研究发现疫霉属真菌Phytophthora可以引起苗木的根腐病，辣椒疫霉菌(Phytophthora.capsici)可以引起辣椒出现根腐病。1.2.3.3丝核菌[43]陈雅君针对黑龙江省8个县，进行了花苜蓿种植调查发现，发现在该8个地区根腐病发病严重，发病率高，最高可达到92%，最终研究确定，丝核菌是主要致[44]病菌。旷玲针对无梗五加根腐病进行调查研究，取样分析，最终确定其致病菌为[45]立枯丝核菌。还有专家学者研究发现，立枯丝核菌还能够导致葫芦巴根腐病、甜[46][47][48]菜根腐病、草坪根腐病和大豆根腐病。1.2.3.4腐霉菌通过对花芸豆根腐以及其致病菌的研究，王春华发现导致新疆花芸豆根腐病的病原菌有：终极腐霉菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、立枯丝核菌等。可见，花芸豆根腐病是由多种病原菌复合侵染所致，其中致病能力最强，导致发病率最高的为终[49][50]极腐霉菌。赵思峰等通过对新疆各地区甜菜根腐病样分离，从中获得81个腐霉菌分离物，根据形态特征、生物学特性和菌体可溶性蛋白电泳测定，确定最主要[51]的致病菌为瓜果腐霉和简囊腐霉。研究表明，瓜果腐霉菌还能够导致大豆根腐病、[47]草坪根腐病。1.2.3.5其他菌[52]链格孢菌被确认为郑州地区冷季草坪根腐病的主要致病菌，同时链格孢菌还[53]能够导致三七根腐病；石洁对保定市冷季草坪根腐病的研究发现，其最主要的致[54]病菌之一为离孺孢菌。另外能导致植物发生根腐病的还有假单胞杆菌、小杆线虫[54][52]、德氏霉菌、弯孢菌、丝囊霉属等病原菌。总之，引起根腐病的病原菌有多种类型，许多学者对各种不同类型植物的根腐病有过大量的研究，有关此方面的研究的文献也较多，但针对有些植物根腐病的病因、发生机理、防治措施还没有彻底弄清，所以这方面的工作还有待进一步深入研[55]究。1.3镰刀型植物根腐病的防治措施镰刀菌侵染引起植物发生根腐病是常见的真菌病害之一，病菌从根部危害植物，从而造成植物地上部分发生病变或者枯死。镰刀型植物根腐病的防治方法有多种，概括起来有农业技术防治、生物防治、化学药剂防治等。6 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选1.3.1农业技术防治措施农业技术的防治措施主要是通过对植物本身和土壤进行处理的方法来达到防治根腐病的目的。（1）通过选择育种、杂交育种、转基因技术等方式培育一些抗性品种；（2）种植植物时把好质量关，选择长势强、病虫害少的植株；（3）采用火烧、蒸汽处理等方法及时清除土壤中的病原菌；（4）合理轮作，加强田园的管理；（5）经常深翻土壤，改良土壤的结构增加土壤的透气性；（6）合理灌溉和及时排涝；（7）合理施用无机肥，当使用有机肥时要充分腐熟。1.3.2生物防治措施生物防治是一种理想的防治方法，具有污染少、持久性强等特点。生物防治的种类主要包括真菌、细菌、放线菌、真菌与细菌混合等种类。（1）真菌真菌中对木霉和丛枝菌根真菌(AM)及非致病尖孢镰刀菌研究与应用比较多。木霉广泛的分布在土壤、空气中，具有易分离、易培养等优点，能对植物病原菌产生[56]颉颃作用并具有强烈分解纤维素的能力。有研究表明，木霉主要颉颃的对象之一是真菌寄生，在真菌寄生的过程中，木霉能分泌产生一些降解酶如纤维素酶、蛋白[57]酶等，这些物质能够降解细胞壁，从而抑制真菌繁殖。目前木霉被报道用于防治尖孢镰刀菌的种类有哈茨木霉(Trichoderma.harzianum)、绿色木霉(Trichoderma.viride)和拟康氏木霉(Trichoderma.pseudokoningii)，其中对哈茨木霉的研究成果比较成熟和深入，通过电镜扫描可知哈茨木霉对尖孢镰刀菌的菌丝具有强[58,59]烈的寄生作用，还能分泌胞外溶菌酶，从而达到减轻植物病害的目的。总之木霉作为一种具有重要开发价值的自然资源，在农业生物防治领域被广泛的研究、开[60]发和利用。丛枝菌根真菌能够侵入到黄瓜的根系内，从而提高了黄瓜的抗性。丛枝菌根真菌(AM)在自然界中与植物根系具有互惠互利的作用，它具有促进植物的生长、提高[61]植物产量、改善植物品质，增强植物的抗逆性等特点。王倡宪，秦岭等在研究黄瓜根系时发现丛枝菌根真菌能够影响黄瓜根系的次生代谢产物，丛枝菌根真菌能够[62]侵入到黄瓜的根系内，从而提高了黄瓜的抗性。李敏、刘润进等在大田条件下研究发现丛枝菌根真菌能够改善作物的营养状况，还能选择性地抑制根围的部分病原物，从而减少尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病的发病率及发病指数。非致病尖孢镰刀菌是土壤中天然的防护屏障，能够减少植物发生镰刀菌性病害，它利用的是植物之间弱株系交互保护作用原理。目前国内外专家学者都致力于此项研究之中，许多能有效防治尖孢镰刀菌病害的非致病尖孢镰刀菌已从健康植物组织7 河北农业大学硕士学位（毕业）论文[63][64]中提取出来。Postma认为在植物寄主导管中非致病尖孢镰刀菌和致病菌尖孢镰刀菌之间存在竞争关系，通过用致病菌F.oxysporumf.sp.dianthi和几个非致病尖孢镰刀菌侵染康乃馨，结果表明部分非致病菌能减少致病菌在茎中的定殖，进而降低病害严重度。(2)细菌细菌在防治植物病害上具有很大的潜力，目前已研究出18个属的细菌对植物的土传病害有作用，细菌抑制本质是通过产生一些抗菌素和营养竞争等来达到抑制其[65][66]他病原菌的目的。殷晓敏通过对香石竹根围菌落的研究发现荧光假单胞细菌对香石竹尖孢镰刀菌病害有抑制作用。另外芽孢杆菌也广泛应用在生物防治进程中，[67]对许多病原菌具有拮抗作用。(3)放线菌放线菌广泛存在于土壤之中，目前在生物防治中具有广阔的应用前景。但由于条件限制，多数放线菌未被分离出来，分离出来的放线菌只占放线菌丰富资源的[68]10-20%，因此对未被分离放线菌的研究开发是目前的主要任务之一。潘争艳等通过对放线菌Ⅲ-61和A-21在黄瓜枯萎病、番茄和辣椒灰霉病病原菌研究表明，放线菌对黄瓜尖孢镰刀菌枯萎病的防效率分别达到65.15%和60.61%，对番茄灰霉病和[69]辣椒灰霉病的防效率在62.49%~89.76%。王芳等利用PDA平板对峙法和制备发酵菌原液，用放线菌株对尖孢镰刀菌孢子萌发、营养竞争、菌丝生长和重寄生作用进行了研究。结果表明：放线菌对尖孢镰刀菌的菌丝生长有抑制作用，拮抗距离达到25.70mm，菌丝生长抑制率为75.97%，孢子萌发抑制率为58.23%；而且放线菌株与尖孢镰刀菌的交接处没有发现明显的重寄生现象。(4)真菌与细菌混合目前研究最多的是将荧光假单胞菌与非致病镰刀菌共同施用，联合抑制致病性[70]镰刀菌。Baker采用此方法验证其对黄瓜镰刀菌枯萎病的防治效果，实践证明，共[71]同作用的抑制效果优于单独菌类的效果。Alabouvette也做过类似研究，试验结果表明，从土壤中分离出来的非致病镰刀菌和假单胞杆菌株共同应用，其效果优于单独使用非致病镰刀菌，可以有效地防治番茄尖孢镰刀菌病害。1.3.3化学药剂防治措施化学药剂被广泛应用在防治镰刀菌病害中，因其具有高效、速效、操作方便、适应性广及经济效益显著的特点。但是防治效果依然存在着很多问题，例如杀菌剂的品种单一、持效期短、效果差的问题。另外镰刀的病害一般为土壤中病原菌侵入植物根系内从而造成植物萎蔫或者枯死，所以常规采用的喷雾、灌根、拌土等方法所起的作用比较微弱，从而对根腐病的防治效果不佳。因此，未来的研究方向需要开发出具有高效杀菌力、药效持效期长的新型杀菌剂。[72]赵兴红等在对辣椒枯萎病进行研究时发现，该病害是由半知菌亚门尖孢镰刀菌引起的。采用菌丝生长速率法测定了5种药剂对辣椒枯萎病的毒力作用，结果表8 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选明：甲霜·噁霉灵、噁霉灵、百菌清、科佳、腐霉利均对镰刀菌菌丝有一定的抑制作用，其中500倍的科佳试剂对镰刀菌的抑制作用最强，抑制率达到95.4%，而甲霜·噁霉灵的抑制作用最差，抑制率仅为8%；由此可见科佳试剂对由镰刀菌引起的辣椒枯萎病的抑制效果最好。[73]薛应钰在室内采用菌丝生长速率法测定了4种单剂和2种复配杀菌剂对镰刀菌的毒力，试验结果表明，抑制效果40%福星乳油>70%甲基托布津可湿性粉剂>50%扑海因可湿性粉剂>50%多菌灵可湿性粉剂，40%福星乳油的抑制作用最好，EC50的值为0.0538μg/ml；2种复配剂中对镰刀菌抑制效果的最佳配方为40%福星乳油∶10%世高可分散粒剂=3∶1，其EC50的值为0.0142μg/ml。[74]骆平西在对文山三七根腐病病原菌进行了分离，得到了3个菌株，经鉴定这三个菌株菌分别为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和链格孢菌；室内毒力试验测定结果表明，70%甲基硫菌灵的250倍稀释液、根康、25%多菌灵、对这3种镰刀菌菌的抑制效果最好，抑制率达到100%。人参根系被病原菌侵染之后呈黑褐色，木质部与根皮部分离，在侵染初期苗木地上部分无明显症状，侵染中后期人参的叶片会出现变黄的趋势，最后整棵植物因[75][76]根系受损而萎蔫死亡。王燕等在研究人参根腐病时发现导致人参根腐病的致病菌为腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporium)，这两种菌均为半知菌亚门镰孢菌属的真菌；主要危害人参幼苗的根部和根茎部。试验结果表明，8%井冈·32%蜡芽菌WP的EC90值为0.56mg/L、50%多菌灵WP的EC90值为6.65mg/L，这两种单剂的抑制效果最好；复配药剂中具有增效作用的药剂配比有5个，其中2∶3的2亿/g木霉菌WG+97.8%多菌灵TC配比增效作用最为明显，其共毒系数为822.26；50%多菌灵WP和2亿/g木霉菌WG+97.8%多菌灵TC2∶3配比在田间表现出较好的防效，防效均在65%以上。[77]王凡等在室内采用菌丝生长速率法测定了核桃根腐病菌（Fusariumspp.）对8种杀菌剂的敏感程度，试验结果表明，8种杀菌剂对核桃根腐病菌菌丝生长均有一定的抑制作用，其中咪鲜胺对核桃根腐病菌的抑菌效果最佳，抑制中浓度（EC50）为0.2141mg/L；其次为申嗪霉素，EC50为0.2304mg/L；满穗和阿米西达的抑菌作用较差，且抑制作用与浓度呈正相关，相关系数均在0.96以上。1.4杀菌剂对土壤微生物数量的影响1.4.1土壤微生物数量的影响因素影响土壤微生数量的因素有很多，例如：植物类型、发育时期及长势，土壤的[78]类型，土壤处理、叶面处理、环境因素等。[79]左华清等在研究柑桔根际微生物时发现，因柑桔种类的不同导致根际微生物数量的平均值相差很多，根际细菌数量最多的是温州蜜柑，柚的细菌数量年平均值最低，而根际真菌数量和放线菌数量最多的是红桔品种。棉花感病品种和抗病品种9 河北农业大学硕士学位（毕业）论文之间，抗病品种根际微生物的数量显著高于感病品种，这种差距极显著地表现在真菌的数量上；同时不同抗性的棉花品种根际微生物的种类也不同，抗病品种真菌种类中曲霉、青霉的数量比较多，而感病品种中黑根霉、链孢霉、粉红粘帚霉的数量[80,81]比较多。1.4.2杀菌剂对土壤微生物数量的影响农药进入土壤后会对土壤微生物的数量产生一定的影响，在土壤中施用杀菌剂、杀虫剂以及除草剂等类型农药时，这些药剂可以直接改变根际微生物的数量和种类。[82]张急文等通过研究表明，铜离子及乙草胺施用之后，土壤中的细菌、放线菌、自生固氮菌、硅酸盐细菌、磷细菌数量急剧减少，表现出强烈的急性毒性反应，而土壤中真菌的数量则呈现增加的趋势，表现出显著的刺激效应。[83]冯波等在模拟土壤生态系统中研究了百菌清对土壤微生物数量的影响，试验结果表明，百菌清对细菌的数量具有明显的抑制作用，这种作用在试验初期与药剂的浓度呈正相关；而对放线菌数量的影响小于细菌，对真菌数量的影响不明显，但这种作用是暂时的，随着药效的减弱，土壤中微生物的数量逐渐恢复正常。[84]肖丽等在室内模拟条件下选择西北干旱半干旱地区具有代表性的灰漠土土壤，采用稀释平板法初步研究了土壤中施用多菌灵对土壤微生物数量的影响，试验结果表明，多菌灵对多放线菌数量的影响作用不大，促进了细菌数量的增加，抑制了真菌数量的增加，且对真菌的抑制作用随着多菌灵浓度的增大而增大。[85]冯自力等研究了棉花田中常用的杀菌剂：50%多菌灵、50%福美双、40%五氯硝基苯、20%甲基立枯磷对土壤中微生物群落数量的影响，试验结果发现，经4种药剂处理后，棉花田中细菌、真菌、放线菌的数量有显著的变化，随药剂浓度的增加细菌数量逐渐降低，对微生物数量的影响为细菌>真菌>放线菌；4种杀菌剂相比较，对土壤中细菌数量的影响：50%多菌灵影响效果最大，20%甲基立枯磷影响最小；对真菌数量的影响：50%福美双影响效果最大，20%甲基立枯磷影响效果最小；对放线菌数量的影响：50%多菌灵影响效果最大，40%五氯硝基苯影响最小。[86]杜宇峰等采用室内培养法研究了外源除草剂苯噻草对水稻田微生数量的影响，结果表明：土壤中不同种类的微生物菌落对苯噻草表现出不同的生理反应，它能使好氧细菌的数量增加，但对真菌和放线菌的生长产生了不利的影响。[87]吕镇梅等研究发现除草剂二氯喹啉酸对水稻田土壤中微生物数量影响规律为，二氯喹啉酸浓度为1.33ug/g时促进真菌数量的增加，高于此浓度时抑制真菌数量的增加；施药初期对放线菌的数量有一定影响，随着时间延长，影响作用逐渐减弱。[88]Singh等的研究结果显示在试验期内（30d）百菌清（10mg/kg）对土壤中细[89]菌产生不良的影响，呈现出持续抑制细菌数量增长的趋势。OmarSA在田间试验条件下研究了施用溴苯氰（3.0mg/kg）会增加土壤中细菌和放线菌的数量；而在高浓度时抑制细菌、放线菌和真菌的数量。10 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选1.5研究目的及意义银杏被广泛应用在城市绿化和园林建设之中，随着近些年来环境污染越来越为严重，银杏在应用过程中也出现各种各样的问题，如银杏叶枯病、银杏黄化病、银杏病虫害等，针对以上这些问题，许多专家学者做过一定的理论研究。但针对目前银杏出现大面积焦叶问题的研究报道较少，许多研究也未找到银杏焦叶的主导因子。[6]在本试验的前期，李轩做了大量有关导致银杏焦叶因子的调查，得出的结论是，银杏前期出现焦叶是由于气温高、湿度低形成的干热风的问题；后期出现焦叶的问题则是由于银杏根系出现腐烂、坏死。针对干热风提出的缓解建议是多次灌水和打孔埋管浇水，但未对导致银杏根系腐烂的原因进行深入研究，因此本研究具有十分重要的意义。本研究通过对银杏根腐病病原菌的分离与鉴定，确定其主要致病菌，同时在室内与田间进行了防治药剂筛选，最终通过分析各药剂对土壤微生物数量的影响，找出防治银杏根腐病的最佳药剂，从而为解决银杏焦叶问题提供一定的理论依据。11 河北农业大学硕士学位（毕业）论文2银杏根腐病病原菌的分离2.1试验材料2.1.1病原菌分离及接种试验材料病原菌分离的试验材料：不同地区银杏根系的病健组织，分别来源于石家庄槐安西路、唐山建设路、保定长城北大街、河北农业大学西校区。病原菌接种的试验材料：室内接种的试验材料来自河北农业大学西校区校园内的健康银杏根系，室外盆栽试验苗为1~2年生的扦插苗，株高约30cm。2.1.2病原菌分离使用的培养基、试剂和仪器设备2.1.2.1PDA培养基马铃薯：200g，琼脂：18g，蔗糖：18g，蒸馏水：1000ml.2.1.2.2主要试剂0.1%升汞，75%酒精。2.1.2.3主要仪器设备超净工作台，高压灭菌锅，显微镜，培养箱等。2.2试验方法2.2.1试验材料的采集于2013年9月分别采集石家庄、唐山、保定的银杏根系，将采集的样品用塑料袋装好，防止水分散失，并及时带回实验室。采回的植物根系放入4℃冰箱内暂存，试验时取出，观察找到根系的病健交界组织，用于分离病原菌。2.2.2病原菌的分离及纯化2.2.2.1病原菌分离及纯化的方法[90]采用组织分离法对供试各地银杏根系病健组织进行病原菌的分离，病健组织即植物发病根茎的病健交界处。用清水洗净根系，滤纸吸干水分，在超净工作台内用无菌解剖刀切取银杏的病健组织。对根系进行表面消毒：70%酒精中消毒30s，用无菌水冲洗1次，0.1%升汞中消毒30s，用无菌水反复冲洗3次。取若干块组织，放置于PDA培养基上，在25℃恒温条件下培养。每天观察，当组织块周围长出许多不同种类的菌丝时，用接种针挑取菌落边缘少许菌丝，放入预先制好的平板PDA培养基上，按不同菌株分别标上记号，置于25℃恒温培养箱中培养数日，获得纯净12 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选培养物。2.2.2.2病原菌接种及再分离的方法（1）病原菌室内伤口接种方法将从银杏根系病健组织分离得到的菌株分别接种到健康银杏根系上，进行菌株回接试验，观察各菌株的致病性。具体接种试验方法为：在河北农业大学校园内选取没被损伤的健康银杏根系，粗度约为0.8cm，用清水洗净泥土，并用75％酒精进行根系表面消毒。将处理过的根系分成9组，设8处理组和1个对照组，每组5根。然后用经酒精和火焰灭菌的小刀在根系上切开一小伤口，将初次分离得到的纯净培养物用接种针分别接入伤口，每一菌株接种一组，注意接种时每换接一种菌株必须将接种针在火焰上灭菌，防止菌株间的交叉感染。接种完毕后，取培养皿，在培养皿内放入两张滤纸，并用水打湿以保持培养皿内湿度。将经接种处理后的根系组放入同一培养皿中，贴上标签，放入25℃培养箱中培养，每天观察一次，观察伤口有无出现腐烂并记录观察结果。（2）病原菌室外盆栽接种试验方法将经纯化的病原菌接种到健康银杏盆栽苗根部，观察各菌株的致病性。具体操作方法为：将纯化的2种菌株，在试验进行之前各培养20皿，待菌落长满培养皿后（约30d），将培养皿中的菌丝连同培养基倒入盛有无菌水的容器中制成菌水混合液。接种的银杏苗木根部用无菌刀切出伤口，设2个处理组与1个对照组，每组内设置10个重复。然后将处理组苗木根部分别浸入菌水混合液中约15min，对照组则浸入无菌水中做同样处理。栽植后，用剩余的菌水混合液浇灌处理组苗木，而对照组用无菌水浇灌，待其生长45d后进行观察，并记录结果。（3）菌株接种后再分离方法在银杏根系接种部位附近，取变色或腐烂的根系，从病健交界处切取少许组织。按上述组织分离法将组织块进行表面消毒后，置于PDA平板培养基上，在25℃恒温培养箱中培养数日，待菌丝长出后经纯化得到再分离菌株。2.2.3病原菌形态学鉴定方法真菌病原鉴定的方法之一是通过形态学的方法来鉴定，因此将原接种菌株与再分离得到的菌株接种在PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养，观察菌丝及基质颜色、菌落形态等，待有分生孢子长出时，分别制片并在显微镜下观察。通过比较它们之间的各种特征，确定再分离菌株与原接种菌株是否为同一菌株。2.3结果与分析2.3.1病原菌初次分离结果为了找出导致银杏根系腐烂的主要致病菌，采用组织分离法对病原菌进行13 河北农业大学硕士学位（毕业）论文分离。不同地区病原菌分离结果见表2-1。从表中可知，此次分离共得到21个菌株，其中19个真菌菌株，2个细菌菌株。将分离得到的菌株根据菌落生长特征、外表形态及显微镜下观察分生孢子形态等进行比较和归类，最终归类为6个真菌菌株：SJZ-1（TS-4，BDC-1，HB-1），SJZ-2（BDC-4），SJZ-3（HB-3），SJZ-4（TS-3，BDC-3，HB-2），SJZ-5（TS-1，BDC-2，HB-4），SJZ-6（TS-2，BDC-5），2个细菌菌株：SJZ-7，HB-5。将这8个菌株进行室内伤口接种试验，对接种后根系表现症状及致病情况进行观察。表2-1各地银杏根系分离得到的菌株及种类Table2-1ThetypeofstrainaboutisolationofrotrootofGinkgobiloba采集地点菌株编号菌落主要特征病原种类PlaceNumberCharacteristicsofstrainTypeofstrainSJZ-1白色菌丝，菌落为青绿色，浓密真菌SJZ-2白灰色菌丝，上面有黑色斑点，生长较快真菌SJZ-3黑色疏松菌丝真菌石家庄槐安SJZ-4菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状真菌西路SJZ-5白色菌丝，生长快，棉絮毛状（青莲色）真菌SJZ-6菌丝带褐色，丝状，生长快真菌SJZ-7乳白色粘稠状细菌TS-1白色菌丝，生长快，棉絮毛状真菌TS-2褐色菌丝，生长较快真菌唐山建设路TS-3菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状真菌TS-4菌丝白色，菌落淡青色平铺真菌BDC-1菌丝白色，基质略带青色真菌BDC-2白色菌丝，生长快，绒毛状真菌保定长城北BDC-3菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状真菌大街BDC-4菌丝白灰色绒状，疏松真菌BDC-5菌丝略带红色，疏松真菌HB-1菌丝乳白，浓密，菌落青色真菌HB-2菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状真菌河北农业大HB-3菌丝黑色，疏松，生长快真菌学HB-4白色菌丝，生长快，绒毛状真菌HB-5黄色粘稠状细菌注：SJZ代表石家庄槐安西路，TS代表唐山建设路，BDC代表保定长城北大街，HB代表河北农业大学，数字为菌株顺序号。2.3.2病原菌室内接种结果室内接种试验结果如表2-2。从上表可以看说，SJZ-1，SJZ-3，SJZ-4，SJZ-5，14 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选SJZ-6五个菌株接种伤口处根系出现腐烂或变黑，其余伤口处无发病迹象，发病率分别为10%，20%，100%，90%，10%，其余为0。SJZ-1，SJZ-3，SJZ-6仅有少数伤口变黑；SJZ-4，SJZ-5伤口变黑数较多，且根系出现腐烂，皮层和木质部分离。由此可见，SJZ-4，SJZ-5的致病性远高于其他菌株，可能为导致银杏根系腐烂的致病菌。表2-2初步分离菌株室内伤口接种法试验结果Table2-2Theresultofpathogenseparationbywoundinoculationindoors接种菌株接种根数接种总伤口数伤口腐烂或变黑数发病率%SJZ-1510110%SJZ-251000SJZ-3510220%SJZ-451010100%SJZ-5510990%SJZ-6510110%SJZ-751000HB-551000CK51000注：表中每根做两个伤口，发病率%=伤口腐烂或变黑数/总伤口数。CK为对照组，仅划伤口，不接种菌株。2.3.3病原菌室外盆栽接种结果按上述盆栽试验方法，将SJZ-4，SJZ-5两种菌分别接种到健康银杏根系上，45d后进行观察，试验结果见表2-3。从表中可以看出接种菌株的银杏根系发病率分别为80%，90%，而对照的发病率为20%。由此可见，SJZ-4，SJZ-5两个菌株具有较强的致病性，能够导致银杏根系出现腐烂（见附图4）。表2-3银杏盆栽苗接种试验结果Table2-3TheresultofpathogenseparationonpottedtransplantsofGinkgobiloba接种菌株接种苗数发病苗数发病率%SJZ-410880%SJZ-510990%CK10220%2.3.4病原菌再分离结果采用组织分离法对发病的银杏根系进行再分离，分离得到的菌株编号为SJZ-4'，SJZ-5'。将上述两个菌株与原菌株分别接种在PDA培养基上，待孢子长出后制片在显微镜下进行观察对比，试验结果见表2-4。由表可知，再分离得到的菌株SJZ-4'、SJZ-5'与原菌株SJZ-4，SJZ-5相比较，菌株生长速率较一致，菌落的形态特征及分15 河北农业大学硕士学位（毕业）论文生孢子性状相同，经鉴定为同一菌株。表2-4再分离菌株与原菌株性状比较Table2-4Thecomparedofcharacteristicofthere-isolateandisolatestrain菌株生长速率菌落特征大型分生孢子SJZ-46.60mm/d菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状镰刀型、有隔膜SJZ-4'7.10mm/dSJZ-511.15mm/d菌丝白色，棉絮状，基物表面青莲色，有蓝绿色镰刀型、有隔膜SJZ-5'10.58mm/d菌丝团2.3.5病原菌形态学鉴定结果SJZ-4菌株：平均生长速率约为6.60mm/d；在PDA培养基上菌丝白色，轮状向外扩展，绒毛状；大型分生孢子呈镰刀型，稍弯，向两端较均匀地逐渐变尖，有隔膜。大小约为17.5μm×5.1μm（见附图1a，1b）。SJZ-5菌株：平均生长速率约为11.15mm/d；在PDA培养基上菌丝白色，生长快，棉絮状，基物表面青莲色，有蓝绿色菌丝团；大型分生孢子呈镰刀型，微弯，向两端较均匀地逐渐变尖，有隔膜。大小约为27.5μm×5.25μm（见附图2a，2b）。[91]经查阅中国农业出版社2004年出版的《植物病原真菌学》：SJZ-4，SJZ-5菌株符合尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的形态特征。2.4小结与讨论将采自石家庄槐安西路、唐山建设路、保定长城北大街、河北农业大学4个地方的银杏根系，采用组织分离法进行病原菌的分离，共得到21个菌株，将这些菌株进行比较和归类，最终获得6个真菌菌株：SJZ-1，SJZ-2，SJZ-3，SJZ-4，SJZ-5，SJZ-6，2个细菌菌株：SJZ-7，HB-5。经过柯赫氏法则验证初步确定了2个真菌菌株SJZ-4、SJZ-5具有较强的致病性，是导致银杏根系腐烂的主要病原菌。根据菌落生长特征、外表形态及分生孢子形态等，初步确定这两个菌株均为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。[92]曹福亮在《中国银杏》一书中提到引起银杏根腐病的病原菌主要有两种：一种是由丝核菌(RhizoctoniasolaniKiihn)引起的，另一种是由镰刀菌(Fusariumsp.)引起的，两者很少混合侵染，以镰刀菌较为常见；有很多研究也证实尖孢镰刀菌能引[26,27,33]起甜菜、棉花、大豆等发生根腐病，该试验结果与上述报道一致。本次试验是从一些形态学的指标初步确定了导致石家庄、唐山、保定银杏根系腐烂的致病菌为尖孢镰刀菌，还需将来从分子水平上进行鉴定和验证，另外在其他地方还需进行更多的野外接种以及大田接种试验等，有待于进一步深入研究。16 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选3银杏根腐病病原菌室内毒力试验及田间试验3.1试验材料3.1.1室内毒力试验材料银杏根系致病菌菌株SJZ-4，SJZ-5。供试杀菌剂共5种，药剂名称、净含量及生产厂家见表3-1。表3-1试验供试药剂及其来源Table3-1Thetestedfungicidesandtheirorigin药剂名称剂型净含量稀释倍数来源500，1000，2000，4000，8000，陕西西大华特科技实业苯醚甲环唑水分散粒剂30%16000，32000，CK有限公司500，1000，2000，4000，8000、江阴市农药二厂有限公多菌灵可湿性粉剂80%16000，32000，CK司400，800，1600，3200，6400，12800，陕西西大华特科技实业恶霉灵水剂8%25600，CK有限公司200，400，800，1600，3200、6400，陕西西大华特科技实业噻霉酮涂抹剂1.6%12800，CK有限公司50亿活芽150，300，600，1200，2400，4800，保定市科绿丰生化科技枯草芽孢杆菌可湿性粉剂孢/克9600，CK有限公司3.1.2室内毒力试验所用器材室内毒力试验试验器材：超净工作台、φ9cm的培养皿、PDA培养基、1ml移液管、接种针、打孔器、移液枪等。3.1.3田间试验材料河北农业大学西校区校园内银杏，胸径约12cm。试验药剂同3.1.1。3.2试验方法3.2.1室内毒力试验方法[90]采用菌丝生长速率法进行杀菌剂室内毒力测定：将5种供试药剂用无菌水按二倍法稀释，设7个浓度梯度（见表3-1），以无菌水为对照。待PDA平板培养基冷却到40~50℃时，每9ml培养基中加入1ml的药剂摇匀，注入直径为9cm的培养皿中制成带毒培养基平板。每种药剂浓度按由高到低的顺序，每个处理重复3次。17 河北农业大学硕士学位（毕业）论文待带毒培养基冷却后将预先培养好的病原菌平板用打孔器打成直径为7mm的菌饼，置于带毒培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养。培养3~5d后，取出培养皿采用“十”字交叉法测量菌落直径（以mm表示），计算抑制率，求出药剂的毒力方程和有效中浓度EC50。依据下列公式计算抑制率：对照菌落生长直径处理菌落生长直径菌丝生长抑制率%100%对照菌落生长直径注：菌落的直径=测得菌落直径—菌饼，计算抑制率时，先取三个重复的平均值，再套入公式内计算抑制率。将抑制率换算成机率值，药剂稀释倍数转化成浓度之后取对数值，建立“浓度[93]对数—机率值”直线方程，即Y=a+bX（Y为机率值，X为浓度的对数）。进行相关显著性分析，根据直线回归方程，当Y=5时，求得X值的负对数即为EC50的值，比较病原菌对各种药剂的敏感程度（EC50的值越小，防治效果越好）。3.2.2田间试验方法田间试验于2014年6月初在河北农业大学校园内实施，4种化学药剂稀释倍数选取EC90值，根据室内毒力直线回归方程，当Y=9时，算出的值即为EC90值。生物药剂枯草芽孢杆菌的稀释倍数采用其推荐值（稀释300倍）。每个处理选择16株长势较一致的银杏，采用灌根的方式每株树施用50Kg的药剂，以喷洒清水做对照处理。[6]据李轩在试验前期调查显示，夏季以后出现焦叶的银杏植株表现为焦叶现象越严重，根系腐烂的程度越严重。因此田间试验的防治效果以控制银杏焦叶程度作为衡量指标，间接反应对根腐病的防治效果。2014年9月统计银杏焦叶程度、焦叶面积、焦叶病情指数。3.2.3田间试验调查方法3.2.3.1银杏焦叶程度焦叶程度的分级标准参照朱克恭提供的银杏叶枯病病害分级标准：Ⅰ级，植株上无或很少有病叶（焦叶），焦叶不超过总量的5%；Ⅱ级，焦叶数明显，但在20%以下；Ⅲ级，焦叶量较多，占20%~40%；Ⅳ级，焦叶多，占50%~70%；Ⅴ级，焦[94]叶大量，在80%以上。3.2.4.2银杏焦叶面积根据银杏的生长状况，每个处理选取30片叶子，分成3组，分别计算其焦叶面积占整个叶片面积的百分比。3.2.4.3银杏焦叶病情指数18 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选在每个处理内选取3株具有代表性的银杏，每株分东西南北4个方向取200片叶子，按分级标准进行目测分级，并计算病情指数及控制效果。计算公式为：病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)控制效果（%）=（对照病情指数—处理病情指数）/对照病情指数×100%病情指数的分级标准为0级：仅出现黄边；Ⅰ级：出现焦边；Ⅱ级：出现焦边且焦边的宽度<1/3叶面宽度；Ⅲ级：出现焦叶，1/3<焦叶宽度<1/2；Ⅳ级：焦叶宽度>1/2叶面宽度。3.3结果与分析3.3.1菌株SJZ-4室内毒力试验结果供试5种杀菌剂对菌株SJZ-4的室内毒力测定结果如表3-2。结果表明，在供试浓度范围内，4种化学药剂对银杏根腐病病原菌SJZ-4的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，且抑制作用与浓度呈正相关，相关系数均在0.90以上。以苯醚甲环唑的抑菌效果最好，EC50为120.2263μg/ml，其次为多菌灵和恶霉灵，其EC50分别为143.7655μg/ml，225.3867μg/ml。噻霉酮也有一定的抑菌作用，但是效果不理想，EC50的值到达486.8291μg/ml。生物制剂枯草芽孢杆菌对菌株SJZ-4表现出强烈的拮抗作用，稀释9600倍时抑制率为95.36%，菌株在培养基内向上纵向生长，横向不生长（见附图3a）。表3-25种供试药剂对银杏根腐病病原菌（SJZ-4）菌丝生长的回归方程及EC50Table3-2RegressionequationandEC50of5fungicidestorootrotofGinkgobiloba(SJZ-4)药剂名称毒力回归方程相关系数EC50FungicidesRegressionequationCorrelationμg/ml苯醚甲环唑y=2.6903+1.1105x0.9930120.2263多菌灵y=2.6512+1.0886x0.9857143.7655恶霉灵y=0.0510+2.1033x0.9030225.3867噻霉酮y=1.8725+1.1638x0.9838486.8291枯草芽孢杆菌———3.3.2菌株SJZ-5室内毒力试验结果供试5种杀菌剂对菌株SJZ-5的室内毒力测定结果如表3-3。结果表明，在供试浓度范围内，4种化学药剂对银杏根腐病病原菌SJZ-5的菌丝生长也均有不同程度的抑制作用，且抑制作用与浓度呈正相关，相关系数均在0.98以上。以苯醚甲环唑的抑菌效果最好，EC50为189.0067μg/ml。多菌灵和噻霉酮的抑菌作用次之，其EC50分别为210.3378μg/ml，283.2492μg/ml。恶霉灵抑菌效果最差，EC50的值到达19 河北农业大学硕士学位（毕业）论文390.5160μg/ml。生物制剂枯草芽孢杆菌同样对菌株SJZ-5表现出强烈的拮抗作用，最低浓度的抑制率为96.54%（见附图3b）。表3-35种供试药剂对银杏根腐病病原菌（SJZ-5）菌丝生长的回归方程及EC50Table3-3RegressionequationandEC50of5fungicidestorootrotofGinkgobiloba(SJZ-5)药剂名称毒力回归方程相关系数EC50FungicidesRegressionequationCorrelationμg/ml苯醚甲环唑y=2.5590+1.0723x0.9961189.0067多菌灵y=1.8708+1.3471x0.9941210.3378恶霉灵y=1.9579+1.1738x0.9952390.5160噻霉酮y=2.1073+1.1796x0.9828283.2492枯草芽孢杆菌———3.3.3银杏焦叶程度控制效果据观察在8月份之前银杏焦叶现象不同处理间差异不明显，从9月份开始，焦叶程度不断加深，统计数据如下。由图3-1可知，2014年经药剂处理的银杏焦叶程度均低于未经药剂处理的对照组，由此可见喷洒杀菌剂会缓解部分银杏焦叶问题。其中枯草芽孢杆菌控制焦叶效果最好，62.50%的银杏夏季景观效果良好，严重焦叶的程度仅为6.25%；苯醚甲环唑控制焦叶效果仅次于枯草芽孢杆菌，超过50%的银杏焦叶程度不明显；多菌灵、噻霉酮、恶霉灵控制焦叶效果较差，与对照相比效果不明显。70%60%CK50%苯醚甲环唑噻霉酮40%枯草芽孢杆菌焦叶发生率30%多菌灵Yellowleavesincidence20%恶霉灵10%0%Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级Ⅴ级焦叶等级Thedegreeofyellowleaves图3-12014年9月银杏焦叶发生率Fig.3-1TheproportionofyellowleavesinSeptember201420 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选3.3.4银杏焦叶面积控制效果田间试验各处理间银杏焦叶面积率详见表3-4，从表中可以看出，对照组银杏焦叶面积率达到50%，经处理后的银杏植株焦叶面积率均有所下降。恶霉灵、噻霉酮的焦叶面积程度与对照相比差异不明显，各处理间差异不显著；多菌灵与对照相比差异显著；苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌与对照相比差异极显著，处理间差异不显著。经噻霉酮、多菌灵处理的银杏植株焦叶面积率在30%以下；苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌使银杏植株焦叶面积率为20%以下。由此可见，经杀菌剂处理后有效地缓解了银杏焦叶问题，多菌灵、苯醚甲环唑控制焦叶效果较好，枯草芽孢杆菌控制焦叶效果最好。表3-4银杏焦叶面积率Table3-4Theresultofareapercentageofyellowlaeves字母标记结果处理名称稀释倍数均值5%显著水平1%极显著水平CK050.80%aA恶霉灵20035.10%abcABC噻霉酮20029.89%abcABC多菌灵50025.88%bcABC苯醚甲环唑30019.27%cBC枯草芽孢杆菌30015.51%cC3.3.5银杏焦叶病情指数银杏焦叶病情指数及防治效果见表3-5。从表中可知，各药剂在控制焦叶方面均有一定的效果。枯草芽孢杆菌和苯醚甲环唑的控制效果最好，控制效果分别为71.11%，56.31%；其次是多菌灵，控制效果为48.54%；恶霉灵、噻霉酮的控制效果较差，分别为12.62%，28.64%。各处理的病情指数进行方差分析可知，恶霉灵的病情指数与对照相比无显著差异，其他处理的病情指数显著低于对照。噻霉酮显著高于多菌灵、苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌；多菌灵与苯醚甲环唑之间无显著差异，显著高于枯草芽孢杆菌；苯醚甲环唑显著高于枯草芽孢杆菌。表3-5各处理银杏焦叶病情指数及控制效果Table3-5ThediseaseindexandcontroleffectofyellowleavesofGinkgobiloba病情指数控制效果处理名称病情指数平均值（%）CK52.7554.2547.5051.50a—恶霉灵43.5046.7544.7545.00a12.62噻霉酮37.2532.5040.5036.75b28.64多菌灵24.2527.7527.5026.50c48.54苯醚甲环唑22.2520.7524.5022.50c56.31枯草芽孢杆菌12.7515.5016.3814.88d71.1121 河北农业大学硕士学位（毕业）论文3.4小结与讨论在室内离体条件下，30%苯醚甲环唑、80%多菌灵、8%恶霉灵、1.6%噻霉酮、枯草芽孢杆菌药剂在供试浓度范围内对2种银杏根腐病病原菌均有一定的抑制作用，化学药剂中苯醚甲环唑抑菌效果最好，菌株SJZ-4，SJZ-5的EC50值分别为120.2263μg/ml，189.0067μg/ml；而生物药剂枯草芽孢杆菌与2种病原菌均产生优异的拮抗作用，药剂稀释9600倍时对两种菌的抑制率均在95%以上，在培养基内表现为菌丝向上纵向生长，横向不生长。田间试验以银杏焦叶程度作为衡量指标，稀释300倍的枯草芽孢杆菌控制焦叶效果最好，62.5%的银杏夏季不焦叶或者仅轻微焦叶，而严重焦叶的发生程度仅为6.25%。苯醚甲环唑及多菌灵的田间控制效果略差，但严重焦叶的发生程度均低于25%。以银杏焦叶面积率作为衡量指标，苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌控制焦叶的效果极显著的高于对照，使银杏焦叶面积率在20%以下。以银杏焦叶病情指数为衡量指标时，枯草芽孢杆菌的防治效果最佳，为71.11%；苯醚甲环唑次之，防治效果为56.31%，多菌灵、噻霉酮、恶霉灵的防治效果依次为48.54%，28.64%，12.62%。综上所述，化学药剂中苯醚甲环唑控制焦叶效果较好，而生物防治药剂枯草芽孢杆菌在控制银杏夏季焦叶问题方面效果最好，由此可知苯醚甲环唑、枯草芽孢杆菌防治根腐病的效果较好。综合室内、田间试验数据分析可知，枯草芽杆菌、苯醚甲环唑在抑制尖孢镰刀菌方面及防治银杏根腐病方面效果较好。苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂，是使用最广泛的杀菌剂之一；通过抑制真菌和细菌的细胞膜成分合成，从而破坏细胞膜的结构和功能，以达到杀菌的目的。枯草芽孢杆菌是一种生防细菌，是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一；主要通过营养[95][96]竞争、空间位点竞争、产生抑菌物质等来抑制植物病原菌。孙晓宇等和孔建等[97]研究结果表明枯草芽孢杆菌对镰刀菌具有较强的拮抗作用；刘春兰报道多菌灵对[98]棉花尖孢镰刀菌有优良的抑制作用，而恶霉灵抑制作用较差；李梦姣等报道多菌[99]灵和苯醚甲环唑对芝麻尖孢镰刀菌也有很强的抑制作用；董海等研究表明，苯醚甲环唑能有效地抑制由镰刀菌引起的水稻立枯病。该试验结果与上述报道一致。统计数据时，由于无法对银杏根系做全面的统计，所以以银杏叶部焦叶严重程度间接反应根腐病的严重程度，此方法虽能够反应问题但存在一定的局限性，因此还需使用更加合适的指标作为衡量标准。田间试验均取EC90的稀释倍数施入土壤，但药剂的防治效果不同可能是由于土壤对不同药剂的吸附作用不同。另外银杏根腐病只是导致银杏夏季焦叶的一个主要因素，焦叶的发生还与高温、干旱、种植形式等其他因素有关，因此本试验仅在一定程度上缓解了焦叶问题，并未从根本上解决其问题。22 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选4银杏根腐病杀菌剂对土壤微生物数量的影响4.1试验材料4.1.1试验材料供试土壤为喷施药剂前后的银杏根际土壤和根围土壤。4.1.2试验所用的培养基和仪器设备4.1.2.1培养基配方表4-1培养基配方Table4-1Formulaofmedium培养基名称培养基配方MediumFormulaofmedium镰刀菌培养基（Nash和蛋白胨15g，琼脂20g，KH2PO4(磷酸二氢钾)1g，MgSO4▪7H20Snyder蛋白胨、五氯硝基苯（七水硫酸镁）0.5g，五氯硝基苯1g，1%链霉素0.3ml，蒸馏水（PCNB）培养基）1000mlKH2PO4(磷酸二氢钾)1g，MgSO4▪7H20（七水硫酸镁）0.5g，葡萄糖真菌培养基（马丁氏培养基）10g，蛋白胨5g，琼脂18g，1%孟加拉红3.3ml，1%链霉素0.3ml（抑制放线菌），蒸馏水1000ml细菌培养基（牛肉膏蛋白胨牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂18g，葡萄糖10g，1%NaOH，琼脂培养基）蒸馏水1000mlKH2PO4（磷酸二氢钾）0.5g，KNO3（硝酸钾）1g，NaCl0.5g，放线菌培养基（改良高氏一MgSO4▪7H20（七水硫酸镁）0.5g，FeSO4▪7H20（七水合硫酸亚铁）号培养基）0.01g，淀粉20g，琼脂18g，1%NaOH，3%重铬酸钾（每300ml培养基加1ml以抑制细菌和霉菌），蒸馏水1000ml4.1.2.2主要仪器设备超净工作台、灭菌箱、高压灭菌锅、离心机、光照培养箱、PH试纸、移液枪、枪头等。4.2试验方法4.2.1土壤采集的方法试验采用多点取样的方法，在经处理的16株银杏中随机抽取3株作为样本，分23 河北农业大学硕士学位（毕业）论文别采集银杏植物根际土与根围土壤，然后混匀备用。采集样本时沿树基部开挖，挖至银杏根系集中的分布区域，使主根暴露，从主根上剪取下毛根放入事先标记好的采集袋内，将样品带回实验室于4℃冷藏备用。另外取根系分布集中区域的土壤，采用烘干法测定含水率，以计算每克干土中的微生物数量。4.2.2根际土壤菌悬液配置方法去除根系上松散的土壤，用无菌刀将根系剪成长度一致的小段，称取10g根系，-1置于装有90ml无菌水的锥形瓶内，连续震荡20min，静置30s后制成10根际土壤菌悬液。按10倍稀释法进行稀释：取1ml上述菌悬液，置于装有9ml无菌水的离-2-3-4心管中混合均匀，此为10土壤菌悬液，如此反复得到一系列稀释浓度（10，10，-5-610，10）。另外取10ml根际土壤菌悬液置于表面皿中称重，烘干后称重换算得到根际土壤的重量。4.2.3根围土壤菌悬液配置方法将根系从采集袋内取出，称取附在根上的松散土壤10g，置于装有90ml无菌水-1的锥形瓶内（10），连续震荡20min，静置30s后制成根围土壤菌悬液。将菌悬液-2-3-4-5-6按根际土壤菌悬液的稀释方法依次稀释成10，10，10，10，10。4.2.4土壤微生物数量计数方法采用稀释平板法对土壤中可分离微生物进行计数。每种菌选择2~3个稀释浓度-1-2-4-5-6-3-4-5（镰刀菌用10，10；细菌用10，10，10；放线菌用10，10，10；真菌用-2-3-410，10，10），每个浓度作3次重复，每个平板内用微量取液器吸取上清液100μl置于培养基中，用无菌涂抹棒将菌液均匀涂于平板上。将接种后的平板置于培养箱中培养：镰刀菌培养3~5d，细菌培养1~3d，放线菌培养5~7d，真菌培养5~7d后观察并计数。4.2.5数据统计及分析的方法4.2.5.1数据统计统计数据时，选取镰刀菌、真菌菌落数在5~100个之间的平板作为菌落总数测定的范围，细菌和放线菌平均菌落数在30~200个之间的平板作为菌落总数测定的[100]范围。当某个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该稀释浓度的平板菌落数乘以稀释倍数作为菌落总数。按以下公式计算：1000平均菌落数×稀释倍数×1001g干土中的菌落数1—土壤含水率24 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选4.2.5.2数据分析采用DPSV7.05数据处理软件及MicrosoftExcel2003进行数据分析。4.3结果与分析4.3.1土壤中镰刀菌数量的变化规律4.3.1.1根际土壤中镰刀菌数量变化规律经不同药剂处理后银杏根际土壤中可分离镰刀菌数量变化规律如图4-1，从图中可知，施药前6月份镰刀菌数量比较多，此时气温、环境适合，给微生物的繁殖提供了大量有利的条件，在施药后7、8月份时，镰刀菌数量急剧减少，之后9月份镰刀菌数量呈回升的趋势。对施药后同一月份不同处理之间镰刀菌数量进行p检验可知，不同处理之间差异极显著（p<0.01）。3530CK）4/g25苯醚甲环唑1020噻霉酮枯草芽孢杆菌15多菌灵Quantityoffusarium10镰刀菌数量（恶霉灵506.1（施药前）7.18.19.15日期（Date)图4-1银杏根际土壤中镰刀菌数量动态变化Fig.4-1FusariumquantitativedynamicofrhizospheresoilofGinkgobiloba对镰刀菌数量取对数进行方差分析（如表4-2），7月份施药一个月后，各处理组镰刀菌的数量极显著低于对照组；对照组的镰刀菌数量分别是苯醚甲环唑2.67倍、噻霉酮1.87倍、枯草芽孢杆菌9.46倍、多菌灵2.07倍、恶霉灵3.84倍；枯草芽孢杆菌的镰刀菌数量显著的低于噻霉酮、多菌灵、苯醚甲环唑，与恶霉灵之间差异不明显。综合以上分析可知，枯草芽孢杆菌在施药30d后对镰刀菌的抑制效果最好。8月份，镰刀菌数量有所回升，但对照组呈下降的趋势。枯草芽孢杆菌处理组的镰刀菌数量依旧极显著低于其他处理；噻霉酮与对照相比差异不明显；苯醚甲环唑、多菌灵、恶霉灵显著低于对照，处理间差异不显著。9月份，随着药效的减弱，镰刀菌数量继续回升，噻霉酮与对照组之间相比差异不明显；枯草芽孢杆菌的镰刀菌数与苯醚甲环唑之间无显著差异，显著低于多菌灵、恶霉灵；恶霉灵、多菌灵、苯醚25 河北农业大学硕士学位（毕业）论文甲环唑之间差异不显著。综合以上分析可知枯草芽孢杆菌在抑制镰刀菌数量方面有很强的作用。表4-2根际土壤中镰刀菌数量方差分析Table4-2ThevarianceanalysisoffusariumquantityofrhizospheresoilofGinkgobiloba4药剂名称镰刀菌数量/10Fungicides6.17.18.19.1CK29.41631a22.69632a19.44852a27.76153a苯醚甲环唑20.61625bc8.51161cd9.74943cd12.99825cd噻霉酮16.52581c12.08185b15.90772ab21.88586ab枯草芽孢杆菌27.50197ab2.39967e5.08219d6.78261d多菌灵24.12235ab10.94623bc11.05355c13.61382c恶霉灵27.08614ab5.91389de13.82523bc18.02248bc4.3.1.2根围土壤中镰刀菌数量变化规律银杏根围土壤中可分离镰刀菌数量变化规律如图4-2，由图可知，根围镰刀菌数量的变化规律与根际土壤中镰刀菌数量变化规律比较一致。喷洒药剂之后，土壤中的镰刀菌数量急剧减少，后缓慢上升。对施药后同一月份不同处理之间镰刀菌数量进行p检验可知，各处理之间差异极显著（p<0.01）。3530CK3/g)25苯醚甲环唑10噻霉酮20枯草芽孢杆菌15多菌灵镰刀菌数量（Quantityoffusarium10恶霉灵506.1（施药前）7.18.19.15日期（Date）图4-2银杏根围土壤中镰刀菌数量动态变化Fig.4-2FusariumquantitativedynamicofrhizospheresoilofGinkgobiloba取对数经方差分析可知（表4-3），7月份，经苯醚甲环唑处理过的土壤中镰刀菌的数量与对照相比差异不显著，其他处理与对照相比差异显著；噻霉酮与苯醚甲环唑之间差异不显著；多菌灵、恶霉灵、枯草芽孢杆菌处理之间差异不显著，但都显著的低于对照和苯醚甲环唑。8月份，各处理组的镰刀菌含量均显著低于对照；枯草芽孢杆菌与苯醚甲环唑之间无显著差异，显著低于噻霉酮、多菌灵、恶霉灵；苯醚甲环唑、噻霉酮、多菌灵、恶霉灵这四者之间差异不显著。9月份，噻霉酮、26 银杏根腐病病原菌分离及防治药剂筛选恶霉灵的镰刀菌数量与对照相比差异不显著；多菌灵、苯醚甲环唑显著低于对照，处理间差异不显著；枯草芽孢杆菌显著低于多菌灵，与苯醚甲环唑之间差异不显著。由此可见，枯草芽孢杆菌在抑制镰刀菌数量方面效果显著。表4-3根围土壤中镰刀菌数量方差分析Table4-3ThevarianceanalysisoffusariumquantityofrhizospheresoilofGinkgobiloba3药剂名称镰刀菌数量/10Fungicides6.17.18.19.1CK21.02299a27.53851a24.37156a31.40265a苯醚甲环唑27.80612a20.26573ab12.86411bc16.07670cd噻霉酮18.72844a13.42427bc15.01081b24.33071abc枯草芽孢杆菌24.38401a7.01203c6.06828c9.51388d多菌灵19.27585a11.43807c14.42427b20.63903bc恶霉灵21.17353a8.90981c16.11071b27.75783ab4.3.2土壤中真菌数量的变化规律4.3.2.1根际土壤中真菌数量变化规律银杏根际土壤中可分离真菌数量变化详见图4-3，由图可知6月份真菌含量最高，7、8月份真菌含量降低，9月份数量呈现回升的趋势。喷施药剂之后，各处理组的真菌数量均低于对照，由此可知施药之后抑制了真菌数量的增长。对施药后同一月份不同处理间银杏根际土壤真菌数量进行p检验可知，各个处理间差异极显著（p<0.01）。3025CK4/g)苯醚甲环唑20(10噻霉酮15枯草芽孢杆菌真菌数量Quantityoffungi10多菌灵恶霉灵506.1（施药前）7.18.19.15日期（Date）图4-3银杏根际土壤中真菌数量动态变化Fig.4-3FungiquantitativedynamicofrhizospheresoilofGinkgobiloba取对数经方差分析可知（表4-4），7月份，对照组真菌数量显著高于处理组；噻霉酮与枯草芽孢杆菌之间无显著差异，显著高于苯醚甲环唑、多菌灵、恶霉灵的27 河北农业大学硕士学位（毕业）论文真菌数量；枯草芽孢杆菌与苯醚甲环唑之间无显著差异，显著高于多菌灵、恶霉灵真菌数量；苯醚甲环唑、多菌灵处理之间差异不显著，但都显著高于恶霉灵；由此可知在施药30d后，恶霉灵的抑菌效果最好。8月份，噻霉酮真菌数量与对照相比差异不明显，其他处理显著低于对照；恶霉灵、枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑之间差异不显著，都显著高于多菌灵。由此可知多菌灵此时抑制真菌的效果比较持久。9月份，对照组真菌数量最多，除噻霉酮外显著高于其他处理，高于苯醚甲环唑1.65倍、噻霉酮1.24倍、枯草芽孢杆菌1.46倍、多菌灵1.84倍、恶霉灵1.34倍。表4-4银杏根际土壤中真菌数量方差分析Table4-4ThevarianceanalysisoffungiquantityofrhizospheresoilofGinkgobiloba4药剂名称真菌数量/10Fungicides6.17.18.19.1CK21.70524a17.01268a13.60683a18.60309a苯醚甲环唑17.27951ab9.61496cd8.67742cd11.27399cd噻霉酮14.77918b12.70831b11.80224ab14.99872ab枯草芽孢杆菌18.22005ab11.56985bc9.78511bc12.76049bcd多菌灵19.82659ab8.05246d6.90088d10.11312d恶霉灵20.85393ab4.91153e9.83128bc13.90305bc4.3.2.2根围土壤中真菌数量变化规律银杏在生长季内喷洒药剂之后，根围土壤中可分离真菌数量变化详见图4-4。根围真菌数量变化趋势与根际土壤真菌变化规律一致。对施药后各个月份不同处理间真菌数量进行p检验可知，同一月份不同处理之间除9月份处理间差异显著外（0.05
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