黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选

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河北农业大学硕士学位论文黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选姓名：王惠哲申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：董金皋2003.5.1 摘要针对近年来各地黄瓜根腐病普遍发生并逐年加重的现状，本文以黄瓜根腐病为研究对象，进行了致病病原菌的分离、鉴定、生物学特性研究以及室内药剂筛选等试验。为明确黄瓜根腐病致病病原菌的种类，作者于1999～2002年从天津市及周边地区共采集、分离88个菌株。从黄瓜病株根部及茎基部分离到3类病原分离物。经对其培养性状调杏、形态观察及其接种鉴定表明，这儿种分离物分别为甜瓜疫霉(Phytophthoramelonis)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病镰刀菌(凡Ⅱariumsolani)。致病性测定结果表明，甜瓜疫霉是引致天津市区及郊区黄瓜根腐病的致病菌，而后两种镰刀曲可能加重该病的发生。试验还表明，目前的黄瓜主栽品种大都不抗甜瓜疫霉，而有抗镰刀菌的品种。因此，当前黄瓜生产所面I临的亟待解决的问题就是抗甜瓜疫霉菌品种的选育。本文对分离出的每类病菌随机选取菌株进行了生物学特性研究。结果表明，甜瓜疫霉生艮发育最适温度介于25～35。C，最佳温度为32。C，致死温度为45℃，10分钟；尖孢镰刀菌生长适温为20～32℃，最佳温度为28℃左右，37。C条件下停止生长：茄病镰刀曲生I丈适温为25～35。C，最佳温度为30。C左右，37℃仍可以生长。根据变温培养试验可知，供试2种镰刀菌在28～30℃时生长较为合适，茄病镰刀菌比尖孢镰刀曲生长适温偏高。两种镰刀菌的生长最适pH值为6～8；不同含萤氮、磷、钾营养元素对镰刀菌菌丝生长影响不大。通过室}勺平板法测定了甜瓜疫霉23个菌株对甲霜灵的敏感性，结果表明，天沣及周边地区的黄瓜根腐病致病菌——甜瓜疫霉对甲霜灵的敏感性差异不人，未发现高度抗性菌株。同时测定了其他9种杀菌剂对甜瓜疫霉的毒力，结果表明，甲霜灵、甲霜灵一锰锌和氟吗啉对甜瓜疫霉的毒力最强，其Ecm分别为O．115ug·mL。，0．905“g·mL’和2．202ug·mLl；阿米西达、一恶霜锰锌、代森锰锌和霜脲氰锰锌对甜瓜疫霉毒力次之，其对P025一l的EcⅥ分别为18．952ug,mL。，22．761ug’11L。，2916lugwL。利49．552ug·mL‘；a恶霉灵和霜霉威对甜瓜疫霉毒力最差，其对P025—1的ECm分别为133．785ug·mLl和3814549ug·mLl。关键词：黄瓜根腐病；瘸原鉴定；生物学特性；致病性测定：药荆筛选 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特_5jlJDn以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得至日￡弦丝盔嚷或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：刁熏霭签字日划：如。；年}爿巧钼学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全r解羽互￡么蔓业叁坐有关保留、使Ⅲ学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被杏阅和借阅。本人授权ii3a碰整业叁生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后使用本授权钔)学位论文作者签名：1翼踅导师签名签字日期：加哆年r月垆日签字日期学位论文作者毕业去向一[作单位：通讯地址：L岜话邮编日 黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选文献综述黄瓜根腐病(rootrot)是一种重要的土传病害，自有报道以来，已知该病广泛分布于美国、丹麦、德国、加拿人、印度、希腊、日本和比利时等””1。我国于1978年在西安报道了该病的发生．近年来随着黄瓜栽培面积尤其是重茬面积的扩大，黄瓜根部病害日趋严重。目前，在天津市及周边地区黄瓜根腐病发生非常普遍，发病率轻者30％～40％，重者70％--80％，甚至全部死秧，造成巨大的经济损失。以往国内外有关黄瓜根腐病的文献报道认为，引致黄瓜根腐病的主要病原菌有镰刀菌“⋯“、腐霉菌“。”‘”和丝核菌“⋯，近年来又在天津地区发病的黄瓜植株根部分离到疫霉菌。现推广‘的黄瓜品种中基本上没有抗病的品种，且高抗品种和资源缺乏，加之致病病原菌不明确．严重阻碍着黄瓜抗病育种的进科。1黄瓜根腐病的研究现状1．1黄瓜根腐病田间症状西安市农业科学研究所报道，由瓜果腐霉(毋thiumaphanidermatum)引起的黄瓜根腐病在黄瓜定植至结瓜期间发病。主要病状是叶片白天萎蔫，晚上恢复，近地面的根茎色深似水烫状，病部缢缩，根毛死亡，最后腐烂，全株枯萎。蔓。仃或节间受害处为水烫状坏死，后缢缩，造成前半部枯萎。叶片受病菌侵染后，初为灰绿色水烫斑，后扩展为近圆形，中部淡褐色，外缘水烫M：死斑。瓜果受害后，形成灰绿色下陷斑块．长出淡灰色菌丝，最后腐烂。其他如叶柄、卷须、雌雄花都可被感染”“。前苏联报道，塔什干地区保护地里的黄瓜在秋、冬期间苗期普遍感染根腐病。痫株发黄、凋萎、茎基部和根部的皮层变褐⋯1。黄瓜根腐病的田间症状表现为：初期地上部症状不明显，后期上部nl片中午萎蔫，早晚恢复，此时拔起病株根部某些部位变黄，儿天后病株地上部呈青枯状萎蔫，发病速度受土壤湿度影响较人，茎基部有时有缢缩症状，类似黄瓜疫病(Phytophthoramelonix)，根部壁黄褐色湿腐，最后只剩F丝状维管束⋯l。天津地区春大棚黄瓜6月下旬结瓜期发病较严重。各国和地区所报道黄瓜根腐病田间症状基本相似。1．2黄瓜根腐病致病病原及防治方法研究据报道，在前苏联的阿塞拜疆(1982)”01用杀菌剂处理黄瓜种子防治黄瓜根腐病．在播种前用50％苯菌灵可湿性粉剂，70％甲基托布津可湿性粉剂或25％开拉 散(KapaTaH)粉剂拌种．川量是每69／kg种子．对照不处理。结果表明药剂不降低种子发芽率，防治黄瓜真菌病害最有效的约剂是苯凶灵，能将根腐病的发病率降低剑4％～6％(对照为17％～21％)，托布律同样有效．但不及苯菌灵。美国的Goldverg(1992)报道了用过滤法防治水培黄瓜腐霉根腐病(乃thiumaphanidermarum)⋯。丹麦的Green和Jensen(1992)报道了哈茨小霉抑制Pythiumspp．增殖，从而减轻黄瓜根腐病的发病程度“1。德国的Grote等(1992)报道了_L}』PreyicurN(propamocarb)抑制黄瓜根腐病菌瓜粟腐霉(Paphanidermatum)菌丝体的生长”’。法国报道荧光假单孢杆凿(Pseudomonas，1uorescent)CH3l可以有效减轻黄瓜根部瓜果腐霉(Paphanidermatum)的危害⋯。Christensen和Thinggaard(1997)报道，土壤日晒可以抑制有机生长的黄瓜腐霉根腐病”。。希腊Bourbos等报道用氰化钙和日晒防治温室黄瓜根腐病菌Fsolani”’。日本有报道土壤为酸性时可以抑制菜豆根腐病菌∽solani)孢子的萌发，pH值为4tj十JL乎可以完全抑制菜豆根腐病菌⋯。黄瓜根部内生水杨酸的累积可以诱导黄瓜对瓜果腐霉引起的根腐病的系统抗病性”1。2000年比利时报道，假单孢杆菌菌株BTPI和它的突变体sid-mutantM3可以保护黄瓜不受瓜果腐霉根腐病的危害，这一保护作用主要与受过处理的根部抗菌酚类的累积有关”1：同年，日本报道了种子银包农(SCC))可以有效防治水培黄瓜植株的瓜果腐霉根腐病⋯。。最早中国报道““黄瓜根腐病是由瓜果腐霉所致，至于天津地区近来发生的黄瓜根腐病病原菌则未见相关报道。有关黄瓜根腐病的病原菌各国报道不一，说明黄瓜根腐病的病原菌具有一定的地域性分布。不周地区对其防治方法不尽相同，效果迥异。因此，鉴定某一地区主要致病菌对黄瓜生产有很大作用。2其他作物根腐病的致病病原及寄主能够引起作物根腐病的病原菌很多，已报道的有瓜果腐霉、疫霉、镰刀凶、丝核菌、蠕孢菌、链格孢等，蔬菜作物上主要是疫霉菌和镰刀菌，现将有关报道记述如一F：2．1疫霉菌研究较多的疫霉根腐病主要集中在大豆上。1948年大豆疫霉根腐病首次发现于美国的印第安纳州““，最初被认为是由Fusarium或Diaporthe引起。1955年，Suhovecky和Schmitthenner首次将该病与Phytophthora联系起来。之后，日本、澳大利亚、新西兰、印度、加拿大、巴两、阿根廷、俄罗斯、匈牙利、英国、瑞士、埃及、尼日利亚等国家相继报道了该病的发生。1958年，Kaufmann2 黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选和Gerdemann首次对大豆疫霉根腐病进行了病原研究，发现该病菌与另两个非常相似的疫霉种尸cactorum和尸megasperma不同，因而将其确定为户sojae。Hildebrand(1959)根据对引起火豆根腐病的疫霉凶菌株系统研究的结果，认为引起火豆根腐病的疫霉凶应属于人雄疫霉(Pmegasperma)，但由r病凶对人显具有高度的专化性，建议作为人雄疫霉的一个变种一一人雄疫霉人豆变种(尸megaspermavar．sojae)。1980年．Kuan和Erwin对来白丁不同寄土的人雄疫霉菌株进行了比较研究，发现来自不同寄主的菌株的卵孢子形态没有明显差异，因此认为在大雄疫霉种内基于藏卵器大小划分变种是不适宜的；由丁来自人豆的PmeKasperma菌株和苜蓿菌株分别仅对其各自的寄主具有致病性，建议将它们划分为两个专化型种一一大雄疫霉大豆专化型(尸megaspermaf．sp．glycinea)和大雄疫霉苜蓿专化型(尸megaspermaf．sp．medicaginis)，以区别从其他寄主上分离的大雄疫霉分离物”⋯。1991年，Hansen和Maxwell综合前人对来自于不同寄主的大雄疫霉分离物各方面的研究结果，将人雄疫霉复合群体划分为4个种，即大豆疫霉(户sojae)、苜蓿疫霉(尸medJcaginis)、二叶草疫霉(尸trifolii)和大雄疫霉(尸megasperma)。至此，经过30多年的研究，引起大豆根腐病的疫霉菌的分类地位最终回到由Kaufmann和Gerdemann在1958年建议的种，即为大豆疫霉菌(Psojae)(171。至1998年，美国已报道了39个生理小种。我国的大豆疫霉病菌首次发现_丁东北大豆产区，目前已在北京、山尔、占林、内蒙古等地相继发现。王就光”“在武汉进行黄瓜疫病的研究时曾经讲述剑该病茎基部被害后，可向地F根部蔓延，引起根腐。可惜的是，在整笳文章中他都没涉及剑该病病原的拉r学名。此外，据报道疫霉还可侵染番茄、南瓜、辣椒、鳄梨、菠萝、柑桔、苜蓿、菊花、美人蕉、鸡冠花、杜鹃、九里香、一串红、山茶花、香石竹等多种植物，引起根腐病“4“。2．2镰刀菌镰刀菌(FusarJumLinkexFr．)是真菌中的～个重要类群，无性态属半知菌弧门，有性态属子囊菌亚门“”。白发现镰刀菌引起的根腐、茎腐病以来，先后发现井报道了多种镰刀凶可导致多种作物出现根腐病症状。20世纪70年代初，一种导致温室、田间番茄攀基腐、根腐的病原菌——尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)先后在加拿人、美国的加利福尼亚”“、佛罗里达””和俄亥俄””以及日本“””发现。经研究证实，该病菌引起的症状明显区别于由尖孢镰刀菌番茄专化型(Foxysporumf．sp．1ycopersicD引起的枯萎病，后由Jarvis等定名为尖孢镰刀菌番茄根腐专化型 ⋯1。此后，在澳大利亚”71和美国的加利福尼皿又发现了由Fsolani引起的番茄根腐病。同时，FsoJani也能引起烟草根腐”⋯、鹰嘴豆根腐”1、人参根腐””平¨辣椒根腐病””。1981年，在美国的德克萨斯州，甜菜根腐病发生严重，造成巨人产量损失。Martyn等”“研究发现，该病由土壤习居菌——镰刀菌引起，3或4年轮作不足以减轻其为害：后经Harveson‘⋯证实，尖孢镰刀菌为导致甜菜根腐病的重要病原。南非的renter””等研究发现，尖孢镰刀菌可导致马铃薯产生不同症状(茎基腐、千腐、枯萎)，通过病害症状类型可以划分为不同营养亲合型(VCG)。1986年在澳大利亚，有人报道尼加马镰刀菌””造成高粱、粟、人豆和棉花等的根腐病。印度的Padaganur和Kachapur等人(1988)经鉴定得出茄病镰刀菌可造成芙蓉属植物严重的根腐病”⋯。Roy等”711989年研究发现茄病镰刀菌与人豆孢囊线虫复合侵染造成大豆猝死综合症的严重发生⋯’⋯。加拿大的Hwang等人1“⋯(1994)调查得出结论，造成Alberta北部地区扁豆犬面积暴发的镰刀菌根腐病是由尖镰刀菌(Foxysporum)、锐顶镰孢菌(Facuminatam)、黄色镰孢菌(Fculmorum)、燕麦镰孢菌(FagOllaCOUlll)引起。1991年春季意火利首次发生铁树根腐病。后来经鉴定病菌为茄病镰刀菌”⋯。意大利Belisario等人经研究鉴定(1999)首次报道了茄病镰刀菌引起胡桃树颈腐和根腐⋯。。印度Rathnamma等(1999)也第一次报道了芸香根腐病(Fsolani)”“。我国对镰刀菌根腐病的研究目前土要针对豆科作物研究较多””。综合国山外研究现状，现将已报道的镰刀菌根腐病主要致病病原记叙于表1。3土传病原菌的分离及纯化方法研究土壤传染性病原菌的分离一般有以一F)L种方法““：一是从植物体分离，包括单菌丝分离法和单孢予分离法。二是从土壤分离，包括直接接种法、稀释平板法、土壤平板法、埋没试管法、植物残渣法、菌丝分离法，漂浮法和捕捉法等。其中2种方法较为常用：(1)直接接种法。将极少量的土壤粉末直接撒在培养基上，长出菌丝后用单菌丝分离法得到纯菌株．所得到的分离菌的属数和分离频率与基础琼脂培养基、马铃薯葡萄糖培养基和查氏培养基分离的效果大致相符。(2)稀释平板法。将土壤稀释液加入选择培养基平扳上，放置数日长出菌落后．挑出代表性菌株，统计菌落数，算出土壤中的含菌量。本法配合相应的培养基可使特定的目标菌以高频率分离并定量．纯化方法应用最多的是单孢分离法⋯’，即将少量孢子悬浮液放在灭菌载玻片上的水滴中，在显微镜下观察其中孢子数，水滴中孢子调节到适当的数量，再J【}j划线法加在琼脂平板表面上。先在培养皿的背面用蜡笔标出点和划线的位置，以便以后找到孢子。琼脂平板表面的孢子．刚金属计在显微镜下观察和挑取。这种4 黄瓜根腐病病原菌的分离签定及室内药剂筛选直喙镰孢菌(F．orthoceras)禾秆镰孢菌(，．culmorum)锐顶镰孢菌(Eacuminatum)木贼镰孢菌(Eequiseti)乐谷镰孢菌(Fgraminearum)串珠镰孢菌(fmoniliforme)柑桔、盘豆、渣菜、柑刁柏等(0I起根瞄炳1：黄瓜(根麟{1j；和果腐病)；洋葱(茎腐病)．燕麦、大麦小米、高粱(根腐病和种子上的赤霉病)：45刁柏、剐菜、石竹、黄瓜、南瓜。玉米(茎基腐病)：豆科植物(根腐病)；茸蓿(冠腐病)。玉米(茎基腐瘸)；小麦(根腐病)；瓜类等(根腐病)。禾谷类、咖啡属、番茄属、豌豆腐、枳屈、茄屈等多种植物(苗枯、穗腐、根腐、茎腐、穗轴腐烂和冠腐)。采本科植物、苋科、茄科、萌芦科、I‘字花科植物等(种了的腐烂、苗枯、穗腐、报腐、茎腐和项腐，如造成稻根腐病、办霉病，棉花苗枯、根腐或红腐病等)．尖孢镰刀菌引起多种作物枯萎病，主要为害根部，引起蒌蔫或基腐：也可0I(foxysporum)起番茄果腐或马铃薯块茎腐烂．茄痫镰孢菌豌豆、盘豆、法困菜豆(系统性根J搿病)：辣椒、茄了、番舶等和(Esolani)瓜类．茄病镰孢菌蓝色变种马铃薯(腐烂、干|晷i病)；絮花日蓿(冠腐和茎腐炳)；托生、菜(E5vaFcocruleum)豆属和云杉属的苗术。燕麦镰孢菌蔬菜(苗期猝倒jlIi)；紫托酋蓿等豆类(根部病害)；玉米(茎基(favenaceum)腐病等)。接骨木镰刀菌柑桔(果腐病)：禾谷类植物、森林树术、羽扇豆、番茄、黄瓜和(Esambucinum)草莓等(根腐、苗枯及储藏期腐烂、溃疡)。黄色镰孢菌小麦、燕麦等(根腐病)；玉米(穗腐病、茎基J扫i病)；{+字仡科、(Fculmorum)豆科、茄科等20多种植物。尼加马镰孢菌高粱、大麦、大豆、棉花；水稻(根腐病)。(Fnygalnai) 塑些垒些查兰堡兰兰堡堡兰——方法虽然简便，但不准确；比较精确的是用微量移液器吸取合适浓度的孢子悬浮液，滴一滴于灭菌载玻片上，镜检，直到该滴悬浮液仅含有1个孢子为止，再转移这滴悬浮液于合适的培养基平扳上，待&出单个曲落“⋯，这种方法操作比较团难．操作过程中容易污染。人工接种苗期致病性测定方法4．1国内外一直沿用的苗期致病性测定方法菌土法：将孢子悬浮液与灭菌的砂子混合，使得砂子中含有合适比例的孢子，再将消毒的黄瓜种子播于装有接菌砂子的育苗盘内，置温度28"C温室中培养。或将病菌接种于1：4的玉米、砂子培养基上，1周后按2％的接菌量与灭菌的蛭石营养土混合均匀，分装于育苗钵内，然后再将已催芽的黄瓜种子播于上述育苗钵中。置温度25～z8℃温室中培养⋯1。灌根法：以灭菌细砂为基质，温室育苗钵育苗，一片真叶期接种。接种时Hj～硬板片插入植株四周的砂子中数次，以达到伤根的目的。然后在育茸钵内砂子的插孔中倒入合适浓度的接种液50mL。5～7d后，再用相同的方法浇灌第2次a温室温度保持在25～28℃”““’。沾根法：以灭菌细砂或珍珠岩为基质．温室育苗盘育苗，第一片真叶期将苗拔起，剪掉：／3的须根，然后将其根部浸于一定浓度的接菌液中，再将黄瓜曲定植于盛有细砂或蛭石营养土的育苗钵内。置于温度25～28’C温室中培养”+”1。菌土法操作复杂，用菌量大且难以控制，发病周期故。沾根接种法使病菌和植物根部直接接触，病菌容易侵入，受各种因素影响小；而且操作简便，菌鼙容易控制，发病周期短。灌根接种法用菌量大，发病周期长，效果最差。4．2胚根接种法胚根接种法的具体操作是，先埘0．1％升汞水浸种lOmin，清水冲洗后置于培养皿内，于28"C恒温箱内催芽。当胚根长至0．5～1．Ocm时，注入浓度为1×10“孢子／mL的菌液，浸泡20～30min后倒去菌液，将已催芽的种子插于盛有灭菌蛭石营养土(蛭石：土=1：4)育苗钵内。置温度25～28"C温室中培养。这种方法JLfJ菌液量少．操作简便，鉴定周期短(15～20d)，准确性较高。适用于大批量抗病材料的筛选⋯’。5杀菌剂室内药效测定方法杀菌剂室内药效测定方法主要有：(1)抑菌圈试验”””’。将孢子悬浮液与合6 黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选适的培养基混匀以后，倒入培养皿中，凝固以后t_【}J打洞机将吸水纸打成巾=5mm的纸碟，消毒，蘸取不同浓度的约剂．放在培养基表面，然后放入恒温箱内，培养，测量抑菌圈直径。同一处理重复3次。(2)菌落生长抑制法”⋯。在无菌操作条件下，将供试药剂用无菌水稀释成试验所需浓度的母液，取定量的母液加入经高压灭菌后温度降至45"C的PDA培养基中制成药剂培养基，将培养基迅速倒入培养皿(巾=90mm)中，每皿15mL，冷却后备用，以无药剂的培养基为对_|{{{。在每一平板中央移接一(巾=5mm)菌饼，置26"C恒温箱中培养4～5d，用圣宵十字交叉法测量菌落直径，与不含药剂的PDA培养基上生长的菌落比较，计算各药荆的抑菌率。同一处理重复3次”⋯。(3)孢子萌发法。将供试农药稀释到一定倍数．将孢子悬浮液和药剂等鼍滴加在沽净载玻片上，在28"C下培养。每个处理重复4次，并以无菌水与孢子悬浮液混合的处理为对照。5h后计测分生孢子萌发率，并计算孢子萌发抑制率(％)=(对照孢子萌发率一处理孢子萌发率)／对照孢子萌发率×100”“。(4)其他方法。疫霉菌对甲霜灵抗药性研究甲霜灵(metalaxyl)是瑞士Ciba-Geigy公司推出的苯基酰胺类杀菌剂，是一类具有很强保护与治疗作_【lj的内吸性杀菌剂”⋯1。在实验室条仲F，lug／mL印可抑制大多数疫霉菌的凶丝生艮””’。此类杀菌剂还包括恶唑烷酮、Ef；f呋酰胺和bena[axyl等，由于甲霜灵在内吸性、生物活性莆I持效期等方面均优丁同类化合物，因而在苯基酰胺类杀凶荆中，该约刑在生产上使Hj最为广泛，对其抗性研究也最多””，在自然界已经发现存在对甲霜灵敏感性不同的疫霉菌菌株”⋯。苯基酰胺类杀菌剂刚投入生产应川于防治腐霉科病菌引起的病害时，具有良好的保护、治疗和持效期长等优点。然而应刚不久病菌就对其产生了抗性。1980年．在芬兰首次检测到马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗性，随后在爱尔兰、以色列、丹麦、挪威””、美国“”等地均发现抗甲霜灵菌株。疫霉菌对甲霜灵产生抗性后，可能对其它苯基酰胺类杀菌荆也具有交互抗性。在荷兰．从喷施甲霜灵的马铃薯田间获得的抗甲霜灵菌株，同时对Furalaxyl和Milfuram具抗性。而且抗性菌株一旦出现，其群体数量在甲霜灵的选择压力下迅速上升。因此，及时检测备地疫霉菌株对甲霜灵的抗性，对当地疫霉病害的防治药荆筛选和轮换、防治策略的制定等具有重要的指导意义。研究表明，卵菌对甲霜灵的抗药性由单基因或寡基因控制，一旦作用位点发生突变，药剂即不能在其位点发挥作t}}J．因而导致病茁产生抗药性，抗约菌株遗传稳定，竞争力强”“。疫霉菌容易对甲霜灵产生抗性。除因为甲霜灵对病菌的作用位点单一。其毒性容易因病菌的个别基因发生突变被克服外””．己注意到一些7 }町北农业人学坝’l二学位论文其他因素与病菌的抗药性产生有关。(1)抗性多出现在寄主植物感病，疫病发生严重的叶部病害中。为了防治病害，一方面需要增加施药量和增加用药次数，另一方面由于病菌在感病作物上形成较大的群体，因而增加了病菌产生抗药性突变的几率。(2)在单一长期使用甲霜灵的地区病菌出现抗性的几率最大。(3)甲霜灵通常被用作治疗剂，即在病害大发生、病菌群体数量火的情况下才用药，或未能按要求定期施药．施药时间间隔过人，增加了病菌抗性产生的机会。同时．在生产中发现．在甲霜灵与其他农药混合使Ⅲ或交替使用的地区，很少山现抗约性现象。刚甲霜灵处理土壤，土传瘦霉曲山现抗性的频率根低，可能由于十壤中疫霉菌的群体数量较叶部病害的小．因此发生突变的儿率小或即便发生突变也不易检测到：也可能与土壤施药药剂的选择压相对较小有关：此外还可能与十壤理、化因素的影响有关。但是．长期单一使用甲霜灵处理土壤，土壤中的疫霉菌仍然可能对甲霜灵产生抗性并形成较大数量的抗性群体。7疫霉所致病害的防治疫霉引起的病害通常发病速度快，毁灭性强，一旦发病极难控制。疫霉病菌以卵孢子在病残体上越冬，通过灌溉水或雨水传播蔓延。疫霉病害的发生、流行与温度、湿度密切相关．如果灌水量大，气温高，易暴发流行成火，多年连作发病重。由疫霉引起的病害在防治上难度很大，任何单一的防治措施都难以达到理想的防治效果。目前仍采取以药荆防治为主，以农业预防等为辅的综合防治策略。7．1药剂防治疫霉病害在药剂防治中存在很多问题⋯。，主要是：(1)药剂晶种单一，缺少效果优持效期长的品种，对于土传疫霉病害的化学防治，多年来使用的主要是以甲霜灵、u恶霜灵等为代表的苯基酰胺类杀菌剂，以后虽然相继开发了霜脲氰、霜霉威等杀菌剂，但均因其持效期短不能有效控制土壤中病菌对植株的艮期侵染，致使长期、大面积、重复使用甲霜灵而使得抗药性菌株出现，进而导致药效下降。(2)加工剂型单一，现有的甲霜灵、-恶霜灵等杀菌剂一般被加工成可湿性粉剂或粉剂剂型较单一，不适宜进行土壤处理，使用也不方便，因而不能有效地控制土壤中的病菌。另外可湿性粉剂的加工剂型不能使药剂缓慢释放，因而延长了对病菌的作用时间。(3)使用方法不合理，疫霉根腐病属土壤传播病害，采用常规喷雾的方法是不起作用的，或者作用极小，对土壤中病菌侵染导致的茎和根的腐烂基本无效。未来药剂防治的发展趋势是：(1)开发具有高杀菌活性、且持效期K的新型杀菌剂。防治土传疫霉根腐病除苯基酰胺类的甲霜灵和a恶霜灵外，近年义开发8 黄瓜根腐病病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选了霜脲氰、霜霉威和烯酰吗琳、甲呋酰胺等杀菌剂，但它们的刚量无法与甲霜灵相比，而且效果也不理想，致使长期、人面积、重复使_LlJ同一药剂或同一作_L}J机制的杀菌剂，导致药效下降．抗性菌株山现。因此生产上急需开发新型、持效删长、杀菌活性高的杀菌剂用于土传疫霉根腐病的防治。(2)改变加]：剂删，适麻土传病害防治的需要。(3)了解病害发生的规律，适时喷药防治。(4)科学Hj约，避免抗药性产生。甲霜灵及其它苯基酰胺类杀菌剂在使用过程中的主要问题是疫霉菌容易对其产生抗药性，因此对这类药剂不能长期人面积重复使川。解决抗药性的产生可以通过两个途径，一是根据病害预测预报的结果减少用药的盲目性或交替使用药剂品种；二是将此类杀凶剂与保护性杀菌剂加工成复配剂，既可延缓抗约性的产生又能延长药剂的持效期。7．2农业预防控制措施清洁田园，消灭中心病株，减少病菌传播与积累。实行合理轮作倒茬，增施有机肥，恶化病原菌的生存环境。提倡高垄栽培，可使黄瓜根系处于较高位置，不被水直接浸泡，减少病菌借水流传播的机会：同时又可提高地温，降低湿度，调节土壤肥力．增加透性，壮大根系，增强植株抗病能力。科学灌水控水，以小水勤浇为宜，灌水时间以早、晚为佳。7．3其他方法7．3．1生物防治生物防治是解决黄瓜疫霉根腐病的可能途径之一，对环境更好、更安全。但这方面进展较慢，近期在生产上使用不太现实。木霉菌作为一类理想的生防益凶，已日益受到国内外普遍关注，作为商品注册的生防制剂已达十儿种”⋯。绿色小霉(Gliocladiumvirens)和哈茨小霉(Trichodermaharzianum)对Phytophthora有一定生防能力，有些真菌对Pmelonis也有一定抑制作_I_|j。哈茨术霉抑制疫霉菌生长的主要拮抗机制是哈茨术霉生K速度快，具备较强的竞争作_Hj，同时分泌抗生素和B～I、3-葡聚糖酶参与抑菌作_【}j[641o薛宝娣等””报道术霉TR一5菌株对寄生疫霉具有极强的拮抗作用，主要表现为缠绕、附着在病菌苗丝上，同时产生吸器侵入病原菌的菌丝，使菌丝断裂，还能分泌有毒或抗生物质抑制其生长。温室条件下，对寄生疫霉防治效果可达94．4596，而且具有持续防效和刺激作物生K=的作用。7．3．2嫁接防病利用嫁接方法防治植物土传病害，在集约化种植程度高的日本、欧洲等地较9 河北农业大学坝L学位论文为普遍““。嫁接技术可有效防治疫霉病害，黄仲生“”报道用云南黑籽南瓜作砧木，黄瓜作接穗进行嫁接，防治黄瓜疫病效果选90％左右，每亩增产20％以上。但当前以黑籽南瓜为砧木的嫁接黄瓜容易发生由拟茎点霉引起的根腐病⋯】。因此，还有待于筛选优良、抗病的嫁接砧木。0 黄瓜根腐病病原菌的分离箍定搜室内药刺筛选引言我国是世界上黄瓜(CucumissativusL)生产丽积最大、总产量最高的国家。近年来，随着我国农业种植结构的调整，黄瓜的栽培面积逐渐扩大，现已一1i蔬菜总面积的15％以上，其中保护地黄瓜栽培面积发展更快⋯⋯。20世纪60～70年代威胁我国黄瓜生产的病害主要为霜霉病、白粉病等叶部病害。以后由丁黄瓜多年连作，致使枯萎病、疫病、根腐病等黄瓜_十传病害普遍发生，并上升为黄瓜土要病害。最早西安市农业科学研究所报道黄瓜根腐病由瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)引起”“；20世纪80～90年代开始迅速蔓延⋯1。黄瓜根腐病以蔓延快、为害重、损失大(发病率轻者30％～40％，重者70％～80％，)，定植后大面积死秧等特点给生产造成很大损失。黄瓜根腐病是一种世界性病害，日本“4。、前苏联”⋯、美国““、丹麦”1、德国”1、加拿大”⋯、印度”“701在20世纪70～80年代均有黄瓜根腐病发生的报道；我国在近年来发生也逐渐严重。因此，如何控制黄瓜根腐病的危害就成为当前黄瓜生产中的一个重人问题。国外黄瓜根部病害在欧洲、亚洲均有发生，研究报道也较多，认为引起根部病害的主要病原菌是尖孢镰刀凶(Fusariumoxysporum)和疫霉凶(册tophtholl口spp．)。我国在近20多年来对黄瓜根部病害的研究主要集中在由疫霉菌引起的疫病和由尖孢镰刀菌引起的萎蔫病。对于在天津市及周边地区发生的黄瓜根腐病，病株表现为叶片萎缩，根部发生黄褐色湿腐，茎基部有时有缢缩症状，最后只剩r丝状维管束，严重的整株萎蔫枯死的类型则米见文献报道。黄瓜根腐病是继黄瓜疫病、枯萎病之后的又一毁灭性土传病害，此病的发生是由丁二黄瓜根部受剑了病菌的侵染，引致根部腐烂，最后导致死秧。大大制约了黄瓜产耸和质龄的提高，给我国的黄瓜生产造成了相当严重的损失。黄瓜根腐病可以在不同季1，、不同栽培条件下发生。除国外报道引起黄瓜根腐病的病原菌主要是瓜果腐霉外，其他有关黄瓜根腐病的病因、致病机制至今米见详细报道。天泮市科润公司黄瓜研究所同时分离到两类病原菌，经初步的生物学特性鉴定表明，从黄瓜根腐病病株分离的主要病原菌为甜瓜疫霉(Phytophthoramelonis)和镰刀菌((尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病镰刀菌(FusariumsD砌f(Man．)Sacc．))。经接种试验，认为尸melonis是天津地区黄瓜根腐病的主要致病菌。甲霜灵是一种防治由卵菌纲真菌引起的病害效果较好的一种高效、内吸性杀菌剂．20世纪70年代末被川丁防治各种作物上疫霉菌(Phytophthora)引起的病害。应_LlJ2年后，首先在黄瓜霜霉曲上产生了抗药性，之后生产厂家为延缓病原菌对甲霜灵抗性出现，将广谱性杀菌剂代森锰锌与之混合制成了甲霜灵锰锌川丁 防治马铃薯晚疫病，但是出人意料的是在应用后不久，1980年夏季首次在荷兰和爱尔兰发现了致病瘦霉(Pinfes胁ns)对甲霜灵的抗性凶株。随后，住英国年11I甾欧等国家相继发现了抗甲霜灵菌株”“r11．针对疫霉菌容易对甲霜灵产生抗约性的现状，我们采用室内平扳测定法测定了黄瓜根腐病菌——Pmelon括不同凶株对甲霜灵的敏感性。目前生产中还缺乏抗或耐尸Ⅲ幽栅7根腐病的黄瓜品种，主要是应用化学防治方法控制该病害的发生。因此，筛选井应用杀菌剂是目前有效防治黄瓜根腐病的方法之一，为此．我们做了初步的室内药剂筛选试验。基于国内外对黄瓜根腐病的研究较少且目前尚未有一致结论的现状，本试验以黄瓜根腐病为研究对象，首先从黄瓜根腐病菌的病原鉴定入手，明确危害黄瓜生产的黄瓜根腐病的主要致病病原菌，进而对其生物学特性进行研究。这样一方面可以进一步明确其生活习性及致病机制，为今后防治方法的提山和抗病育种提供理论依据。同时，基于目前国内外报道的大都是对黄瓜瓜果腐霉根腐病防治的现状．有必要彻底弄清此病的病因、致病机制、品种抗病性等问题。而明确黄瓜根腐病的致病病原菌种类成为解决此问题的关键。本试验以田间观察和室内试验相结合，确定了黄瓜根腐病的主要致病菌种类；研究了主要致病菌的生物学特性；对黄瓜主要品种及自交系进行人工接种致病性测定；并进行了杀菌剂的室内药效测定，筛选出对黄瓜根腐病有效的药荆，为制定黄瓜根腐病的综合防治措施提供依据。2 黄瓜根腐痫痫原菌的分离鉴定及室内药剂筛选1试验材料材料和方法1．1供试病菌采集于天津市及周边地区，经分离纯化后共得到88个分离物，保存备_L|J。1．2供试黄瓜材料黄瓜主要栽培品种及自交系由天津科润公司黄瓜研究所提供。1．3供试培养基PDA培养基；PSA培养基；米饭培养基；Bilay’s培养基；Czapek’sAgar培养基和PL培养液(见表2)“’“’7“。表2供试培养基种类Table2Typcsoftestedmedia培养基名称Nameofmedia成份IngredientPDA培养基PSA培养摹米饭培养基BilayS培养基Czapek培养基PL培养液马铃薯200．09、葡萄糖17．Og、琼脂15．09、蒸馏水1000．0mL，pH5．6。马铃薯200．Og、葡萄糖17．09、琼脂15．09、蒸馏水1000．OmL，pH5．6。新鲜火米5．Og、水10．OmL．磷酸二氟钾1．Og、硝酸钾1．Og、氯化钾O．59、硫酸镁o．59、淀粉O．29、葡萄糖0．29．蔗糖02．g、琼脂2009，蒸馏水1000．0肌L．NAN,,2．Og、KzHPO．I．Og、KCl0．59、MgS0．·7Hz00．59、FeSO。0019、蔗糖30．Og、琼脂15．09、蒸馏水1000．OmL。马铃薯200．Og、乳糖20．09、蒸馏水1000．OmL。1．4供试药剂25％甲霜灵(Mctalaxyl)可湿性粉剂(浙江禾本农药化学有限公司)95％a恶霉灵(Hymexaz01)可湿性粉剂(吉林边绿洲化工有限责任公司)72．2％霜霉威(PrompamocarbHydrochloride)水荆(青岛农药厂)72％霜脲氰锰锌(CymoxanilMancozeb)可湿性粉剂(上海农乐生物制品有限3 公司)58％甲霜灵一锰锌(MetalaxylMancozeb)可湿性粉剂(浙江不本农药化学有限64％u恶霜锰锌(OxadixylMancozeb)可湿性粉剂(诺华农化(江苏)有限公司)70％代森锰锌(Mancozeb)可湿性粉剂(西安近代农药有限责任公司)25％阿米西达(Amistar)悬浮剂(英国先正达有限公司(苏州))60％氟吗啉(Flumorph)可湿性粉剂(沈阳化T研究院试验厂)2试验方法2．1病原菌的分离、纯化1999～2002年期间从天津市及周边地区采集黄瓜根腐病病株，自显症后不同时间的病株根及根茎部各切取5mm2病健交界处组织一块。在无菌条件下州常规方法进行组织分离、单孢纯化，分离获得的分离物按不同类型编号、转管，共分离到88个分离物，初步可归为两类，即疫霉属(Phytophthora)和镰刀凶属(Fusarium)。保存于4℃冰箱待鉴定。2．2黄瓜根腐病病原菌的鉴定纯化后分离物在PDA平板上培养，观察培养性状，经初步鉴定全部分离分离物可归为两类，即疫霉属(Phytophthora)和镰刀菌属(Fusarium)。分别参照郑小波⋯1、任光地⋯1、陆家云⋯1、成家壮”””和王拱辰⋯1、Booth⋯1的方法作进一步形态鉴定。2．2．1疫霉菌采用Newhook等的检索表，参照郊小波，任光地等的方法进行疫霉菌的培养，并参考余永年””的分类系统进行疫霉菌的鉴定。2．2．1．1培养特性和形态特征研究用巾5mm的打孔器在已培养的菌落边缘打取菌块，置于PDA、CA、OMA”⋯平板上在(26±1)℃下培养，试验设4次重复，第3d和第5d测量菌落扩展直径及日平均菌丝生长速度；并在第5d观察、测量菌丝宽度，描述菌落形态。将在PDA上培养后的病菌打菌块，置于灭菌的培养皿中加无菌水，再在其中加入几块黄瓜叶诱导孢子囊的产生，室温培养，观察孢子囊的形态⋯’。另外在PDA平板上，25℃条件下培养5d后观察有无厚垣孢子和膨大菌丝体的产生。2．2．1．2生物学特性研究分别对疫霉菌生长温度”⋯平¨致死温度进行测定。4 黄瓜根腐病病原苗的分离箍定及室内药剂筛选生长温度测定随机选取分离物P025一l、P032一l，先在PDA平板上于25。C、黑暗条件下预培养2～3d，刚打孔器在菌落边缘取直径4mm的菌块，置于直径为9cm的PDA平板中央。分别在O'C、5"C、IO'C、15"C、20"C、25"C、28"C、30。C、35"C、40"C各温度一F培养。每个处理3次重复，72h后测量菌落直径。依菌落直径的火小来确定该温度F的生K=速率。致死温度测定将供试尸melon括在37℃、40"C、45℃、48"C、50。C、55"C‘卜水浴锅内处理lOmin，再移到PDA平板上，28"CF培养．3d后检查结果。2．2．1．3寄主范围的测定分别在瓜类蔬菜和茄科蔬菜上测定了病菌的致病性。瓜类蔬菜：将在PDA培养基上培养的Pmelonis菌丝体，楚基刺伤贴菌块法接种到西葫芦、菜瓜、南瓜、丝瓜、苦瓜、甜瓜的幼苗上，接种部位为茎基部及叶片。每种瓜苗分伤茎接种和不接种两个处理，每个处理瓜苗5～8株。瓜曲栽种于灭菌营养钵中。接种后在20～25"C温度下保湿24h，5d后进行调查。茄科蔬菜：番茄、茄子、辣椒种植于含灭菌的有机质营养钵中，待一定苗龄时，接种方法同上，接种5d后进行病害调查。2．2．2镰刀菌2．2．2．1培养特性和形态特征研究_L}j由5mm的打孔器在已培养的菌落边缘打取菌块，置于pH5．6的PSA平板上25℃条件r培养，96h后检测菌落直径，并观察菌落形态及气生菌丝形状。将培养物培养4d后，取出置于室内散射光F两周后记载色泽，试管斜面表层的颜色为PSA基物表面色泽，观察培养基有无变色记为基物色泽；观察在米饭培养基和Bilay’s培养基上色泽记载综合的颜色“”。参照王拱辰的方法”“，随机选取儿个分离物，在PSA平板上，25℃F培养，观察小型分生孢子的数量、形状、着生方式及孢子大小、有无分隔，每分离物测量30个孢子：大型分生孢于及其顶胞、基胞形状，孢子分隔数及其人小；厚垣孢予形状及其着生方式。在培养初期，用Bilay’s等透明度火的培养基培养，后用头部扁平的解剖针挑取一薄片基物连同菌丝体平放在载玻片上，加盖玻片，将水从盖玻片边缘加入，让菌丝慢慢伸展开，观察产孢细胞。2．2．2．2生物学特性研究分别测定了温度、pH值和某些营养元素对镰刀菌菌丝生长的影响。温度的的影响随机选取分离物F000-2-1、F025—2—1、F043—2、F027—2—1，从菌落边缘用打孔器打出直径9mm菌丝块，移入PDA平板培养基上(定量为12m1)，分别在15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃各温度F培养。分别在48h和96h测量菌落直径，比较不同温度下菌丝生跃差异⋯“。15 pH值的影响将灭菌的PDA培养基，无菌条件下用HCl和NaOH调节其pH值分别为2、4、6、7、8，10、11，在不同pH值培养基上接种菌块，26"C恒温培养，分别于48h和96h测量菌落直径。营养元素的影响以Czapek’sAgar培养基为基础，对其中的氮、磷、钾源进行增减，配制成氨素含量分别为0、1．5％0、3．0％o、4．5％0，磷索含量为0、0．5‰、1．0％0、1．5％o，钾素含量为0、0．75％0、1．5‰、2．25％0的培养基，将菌块置于培养基上26"C恒温培养，分脚于72h和96h调查菌落的生长情况””。2．2．3黄瓜根腐病病原菌的致病性检测和回接试验根据柯赫氏法则．选用致病力强的分离物进行回接。将孢子悬浮液接种到健康无病的黄瓜植株上，调查分离物的致病力及所致症状特点；从接种后发病的植株上再进行病原菌分离，进一步确定分离物是否为致病菌。2．2．3．1病原菌和接种源制备将PDA上培养5～7d的Pmelonis曲接种到黄瓜叶片上，待发病后，将发病叶片剪下放置于无菌水中浸泡，使其产生游动孢子。待游动孢子大部分形成休止孢后，用血球计数板计数，将休止孢悬浮液浓度稀释至300个／mL左右，备用””。将纯化的PDA平板培养基上的镰刀菌，切成0．2cm见方的菌块，在无曲条件下少量移入装有PL培养液的500raL长颈瓶或三角瓶中，在25～28℃，120次／rain的振荡培养器或摇床中培养7～lOd，菌液用双层纱布过滤，滤去菌丝后，用3000～4500r／min的离心机离心5～15min后，弃上清液。沉淀部分即为镰刀菌孢子，把一定量的无菌水加入其内稀释菌液，充分搅拌后，用血球计数板计数，然后制成所需浓度(I×10“孢子／mL)的孢子悬浮液。以备接种。或将镰刀菌在PDA平板上，25℃恒温培养6d，用灭菌毛笔刷下菌落上的孢子，经双层纱布过滤，用血球计数板计数，然后制成所需浓度的孢子悬浮液。2．2．3．2疫霉属分离物回接试验选用天津科润黄瓜研究所提供的l乏春密刺、Q22黄瓜材料(以下同)，采用休止孢悬浮液蘸根接种法接种。置于25～30"CF，3～5d后观察发病情况。2．2．3．3镰刀菌回接试验采用胚根接种法⋯”和蘸根接种法。2．2．3．4两类菌致病关系试验参照任光地的方法，供试植株蘸根接种法，先接疫霉菌，待24h后，再接镰刀菌，对照只接疫霉菌。观察记载发病情况。埘同样方法先接镰刀菌，待24h后张接疫霉菌，对照为镰刀菌，观察记载发病情况。2．3室内Pmelon&不同菌株对甲霜灵的敏感性采用平板测定法，在无菌操作条件下。将甲霜灵制剂J【|J无菌水稀释成试验所 黄瓜根僻躺病原菌的分离鉴定及室内药剂筛选需浓度的母液，取定量的母液加入经高压灭菌后温度降至459C的PDA培养基中制成约剂培养基，使含药培养基浓度为0．025，0．05，0．1，0．2，0．4ug·mL‘，将培养基迅速倒入培养皿(巾=90mm)中，每皿15mL，冷却后备用。以无药刑的培养基为对照。用巾5mm的打孔器沿平板培养好的尸meloni凶落前端打取菌饼，移入上述培养基中央，每皿放1片，每个处理3次重复。置于26"C恒温箱中培养，6d后待对照菌落直径至少为50mm时检查结果⋯“。按抑制率几率值和浓度对数值求出毒力回归方程，进而求出每种曲剂的Ec一比较甲霜灵对不同菌株的毒力人小。敏感性测定标准，根据0．1：0ug·mL‘，0．2：0ug·mL‘和0．4：0ug·mL’的菌落直径比值确定Pmelonis对甲霜灵的敏感性”””‘。主要根据(0．2：0)ug·mLl的比值划分Pmelonis病菌对甲霜灵的抗性，比值小于0．2为高度敏感菌株(Hs)，比值大于等于0．2而小于0．4的菌株为敏感菌株(s)，火-丁等丁0．4而小于0．8菌株为中抗菌株(MR)，比值大于等于0．8的为高抗菌株(HR)””。敏感菌株以0．1：0ug·mLl的比值作为参考，抗性菌株以0．4：0ug·mL。的比值作为参考。若0．4：0ug·mL。的比值人于0．1：0ug·mL2的比值或二者著异不显著并且二者的比值都大于0．4而小于0．8，则该菌株为高抗菌株。2．4几种杀菌剂对P．melonis菌丝生长的影响采用平板测定法，无菌条件卜，将a恶霉灵、霜霉威、霜脲氰锰锌、甲霜灵一锰锌、n恶霜锰锌、代森锰锌、阿米西达和氟吗啉，分别稀释于经高压灭菌后温度降至45℃的PDA培养基中，混匀，配成不同浓度的待测含药培养基，倒入mlOcm培养皿中，每皿15mL，冷却后备用，以无药剂的PDA培养基为对照。随机选取菌株P025一l和P032—1，在生长7d的菌落边缘用打孔器打取直径5mm的菌饼，移入上述含药培养基中央．每个处理重复4次，置于(26±1)℃恒温箱中培养5d，待对照菌落直径至少为50mm以上但不K满整个培养皿时测鼙结果，测龄两个乖直菌落直径取平均值，按。F别公式计算抑制率，按抑制率儿率值平¨浓皮对数值求山毒力回归方程，进而求出每种曲荆的Ec*，值，以此比较各药剂的毒力人小。。。．(对照菌落直径一菌饼直径)一(处理苗落直径一菌饼直径)对照菌落直径一菌饼直径17 结果与分析1病原菌分离结果1999～2002年期间，从天津及周边黄瓜根腐病严重地区(大津郊区、南河、武清等地)共采集发病症状明显的病株48株，43株分离到88个分离物，分离率为89．6％；其中34株分离到疫霉，分离率为79．07％；32株分离到镰刀菌，共分离到2属5种菌，有51．16％病株同时分离到两属病菌，分别为疫霉和镰刀菌，并分别选取典型分离物进行种的鉴定，各地区分离的病原菌人致相同，详见表3。2病原菌鉴定2．1疫霉菌鉴定2．1．I培养特性和彤态特征观察培养了22个疫霉分离物，以POOO-I为例(其培养特性见表4)，在PDA上菌落灰白色，生长较疏松，边缘较平滑，不整齐，菌落花瓣型(P型)。镜检可见菌丝无隔，宽3．5～7．5¨m，菌丝分枝处稍缢缩，分枝角度较大。在PDA培养基上培养一段时间后．划断菌丝可产生孢子囊，或PDA上培养后的蘸块置于灭菌三角瓶中，加无菌水，并在其中加入小块的黄瓜州片，在22～25℃温度条件下培养5～8h，也可诱导孢子囊的产生。黄瓜叶片上产生的孢子囊卵形或长椭圆形．项生式，单生，不易脱落，有内层出现象，孢子囊有乳头状突起，但突起较低，较扁平，黄褐色，大小为45～55um×27．5～37．5um，长宽比为1．467～I．636：1。而无菌水中产生的孢子囊顶端平没有乳突，大小为22．5～55um×15～35um。菌丝易产生瘤状或节状膨大菌丝体，为姜瓣状或不规则的圆形或近圆形，有时形成结节状菌丝。菌丝间还可形成厚垣孢子，圆形或近圆形，顶生或间生。2，】．2有性器官的产生尸melon船在cA培养基上培养6d后有藏卵器和雄器产生．也有卵孢子产生。藏卵器球形，表面光滑，微黄色，直径为22．5～37．5¨m，卵孢子几乎充满器内：雄器较小，直径为15--20um，为穿雄生。18 球搿搿E芒。牙套。芒#i6譬山￡Eo厶r斗誉芒=￡or茁o§冒E￡。#芏d。r莹m基=k04r岔苎s≮o∞#=王繁≈{or芷叠La童甚SoH《暑§q毒∞鼍o≮甚。童罩厶。_莹山r量。一￡2。点{“。r童“￡gn釜E≈tg芒芒芒。舟夸。E{f4譬=l息tor∞￡薏。匹ti40l奎山譬d{o"E毒§§山鼍Dlor拦曼每譬也rlu。≮譬b邕告Il厶暑堂山i皇oqEl＆h迂隹nlorSHl＆譬mr{or∞￡口Sl社{do一量mE芒ods蛩。基nt每r芒E￡o舟岔￡§≈r#‰薯tor*芒口k宴童4。r童乱脚蜊卷趟∞I；苯{E5蝴骊霉甜蚰昔善燃脚蚩喜《口蜊嚣蜒印《嚣嬲印营晷餐脚昔晷燃脚皆唇燃脚蚓嚣螺叫I；卷嬲皿舞划槛．篓蒜皿弈划讴．葵繇皿舞划姐．嚣蒜．韫刊宣．蜷嚣州Ⅲ．葵嚣糖。韫一唇+挂骶酬皿．葵繁童}皿窭端袒．嚣餐皿舞剁粗．等鬟。枢刊量．蒜蜒剐皿．粒叫尽．《蜒州皿．葵繇鱼}．篓繇童{．糨刊匠．《蹬洲皿．葵髫童1．枢州垦．撼燃州Ⅲ．葵嚣曩；皿豁剁粗．纂繇皿豁Ⅻ粗．嚣蒜脚皿蜷．窿帐刹襁．葵岬鬈回Ⅲ拭．窿抿划耀．葵岬餐印皿《．窿帐划粗．葵钾搽唧皿撼．竖限划粗．葵W繇叫皿撼．窿帐封粗．嚣州蒜脚皿毯．鞋咐划粗．并忡誉蝴Ⅲ撼．嗟峡剐粗．葵岬螺删．掣蜂制悯．划掣州删．划璀州球．韫警聚．槛掣聚．骠翊．韫掣聪．姆曩；．粗璀聚．嫌翊辩．极蜂聚群．槭蜂嚼搿．般哗聚搿．收掣暴辑．枉掣鞲僻．粗掣暴搿．枢《曝搿．椒掣嚓搿．韫掣《壬#．粗踞骤恻．刿曜州删．毅孵州蚓．刿啐州N．N．卜oo‘I-叶卜oo山I_卜oo山I|．心oo‰qN^oo‰1．qnoo山I．80‰I-寸oo山N曲-cg■I|^．cookI-coo山qN^8‰I-N^oo山I．Noo乱一曲-【oo山忑．100kI_loo山N^．ooo‰I|^．ooo‰I．善‘婚-L裂枯∞叫蛙*■《∞山叫《o“圣{脚赵韵刁f犍妞巡舌j}崾辎越葵悄蜷懊S锻求_窨芍o：uDE8n3-o盟In∞2∞口。一苗一昌一nu一上届I．霉锻求堠龌喏星枢n懈划按幕§差长槲《心静髓隶g祖隧慑馔筵《_丑『粗 葛|匕督睁汁舴旁降慊亩黟Hqoosl『l勺019-I叫019“_I10一口．2-2叼oNu．1，o¨．4-l勺o¨认-l勺o¨¨．2．110¨认b-2勺o¨．7-l10NJ7b-l唧o¨∞-1qo¨∞b-l10¨∞12．2勺o¨心-l10N啦_2．1叫o¨口．2-2勺ouo-1呵03l-l10u1|．2-l吲ou『l-2_2，ouH-l唧ou¨-2-1q032-2-2斌茄瓣．前忖丰艮沫．忡时丰艮济．懈卅茄阼．畔时茄溶，忡邋薤球．j至薛苗．淌茄肆，j|至薛按，进茄冲．车至薛赫．淌茄球．j至鼗赫．渤茄肆．车至菲赫．溢茄球．j至薛藩，润{侵球。敞薛藩，溢茄徘．葭皇盏赫．满茄球．j釜薛港，忖茄孙．露脚塞盏撼．卅丰艮珊．蝣脚妻釜赫．忖菏肆。辫牌酿挤。时茄球．辫脚薛赫．卅茄辩．辫牌垒盏藩，忖茄冲．露牌曼盐嚣．忖茄冲．蜉岬薛旃．忖{幔肆．辜吏牌薛赫，时丰艮群．辫呻妾蓝赫，卅茄琳．辫脚辩卅弗。卧膝孙嗣．辩Ⅲ暗落水茹．酣晦冲萄．封口晴鹭水弗，群滕孙爵．衬皿嘧嚣水弗，醋陋孙蕊．：炙心嘧媾m落．科膝M嗣，时D时媾水露．瞬膝孙蕊．射Ⅲ嘧辩抖茹．瞬膝冲酾。射Ⅲ时落水茹．薛憾冲窬，衬皿嘧辩水落．雕膝冲嗣．时心嘧端海。融僻章Ⅲ游嚣肾晴媾弗．卧膝嚣Ⅲ辩露。噼膝章Ⅲ媾落．雕悔霉Ⅲ{荨辩霈．瓣簿筇．ⅢM潞对。西卜冲．ⅢM辩衬，苴卜球．赫辩海．D吼潞衬．亩卜球．搿嚣弗．Ⅱ蛳藩射．面卜琳．簿海．落劳。噼滕举Ⅲ雠博棼心炼舅．斟滕棼心潞霈．噼膝露Ⅲ饕露．噼膝棼皿嚣菇．噼障掌皿游嚣肾嘧iji藩龄嘧潞篓禽嘧藩署幂晴jj黾署幂嘧潜署暴睁辫署幂嘧潞婆瞥嘧}ji婆觜睁iji窦{工嘧潞嚣肾嘧潞辫l工时潞簿{工时州#r毽iui墨肯。壬暮，誊一0p，^h。rd器一。j甜呷、lr毫iu摹暹¨q。王摹，盎☆rf#童垒o、崩可。壬汪叫嚣口ri#罩o《qo苫嚣，誊且勺哥净9畦暑nj0≈耳，善苔邙，争穹§iel。#is哪磊Q0#嚣rolQ#r|Eul‘Ⅵ口、h#iko夸jh，善10p季ordif{sq嚣o：#暑rr暑～胃n一#器，善一0p，th。；iI。蚤、￡“Q3≈Ihop萎『}一¨—譬～#iro一口；一飞》yfop毒手鑫蒹fo=井节#r鼋手罩殳{Do壬暑呐嚣毽Fi。趋Sps暑，hyt。phlho；i季is，罩苕薯乎蚤暑10蚤州基鼋若摹要{曰霉ti叩fr。ri#量9qr口}章，百【oPrlho；i手；创嚣Q0#}。莒p0王器、§3≈目9鼋毽。1￡器 搿球勰球掰珥蝉球删辩球群殚釜旦orS最kor=t警皇o¨￡苎kBrj=lr葺。面若口k里n{厶。r堂山￡j5磬≈gEnt＆n#=l芒jk。4∞斧。S暑‘4r#‰r{。r#一2墨¨{A。r童“￡芒。磬斗蓉E#譬ar#‰芒jqo冀毛#u》基主§声～E88名Jlc笋g竹l邕譬‰r譬。一薹a每吾t{乱2莹(1r{or∞基2。《甚。一叠m嚣t。r∞蕞口专毒工厶or堂山￡j；磬≈§Enlbr亡￡j‘。4r斧。芒#≮口r盂r{。{釜q器点告。一莹m暮童oh￡基毛h迂警卫or￡≈tq譬k盘专la甚08善盖or童‰壬旦or芒蔓各譬‰甚皇obE星q星盟￡o≮蔗a鲁{ll“宴童“l乱皇or芒曼§兰‰譬010r芒蔓各譬=lr鼍or_s口占告蕞。一堂乱叫蚩罨爆脚昔罨《蝴蜊嚣蟋脚I}嚣蜒叫蜊嚣蜒脚I}嚣趟锄蚓嚣瘿。昔唇燃脚蚩番赘脚昔番避印管唇燃．椒刊叵．繇懋洲Ⅲ．椒刊厘．越趟州皿皿杂划悃Ⅲ豁剁粗．葵鬈蕈{．葵《牲．葵餐．嚣蒜Ⅲ豁划粗．葵繇Ⅲ豁刈粗．葵搽皿弈洲襁．篓蒜．韫州匿．蒜嚣州Ⅲ．椒刊厘．越燃洲皿．椒刊庭．越蜒Ⅻ皿．收刊厘．繇蜒洲皿．葵鬈毫}．葵蒜鼬．嚣蒜奎}．葵繇曩f脚皿蒜．匪限划粗．嚣岬餐脚Ⅲ撼．窿限刈粗．葵岬餐锄皿拭．匿限划粗．嚣州螺脚皿蜷．匿懈剐粗．葵岬鬈脚皿撼．匪帐划龌．葵岬餐叫皿蒜．竖怅划粗．葵W繇。皿蜷．巨愀到粗．葵蝉搭脚皿《．窿怅划襁．葵噼搭叫皿蒜．匿帐划粗．嚣岬餐辑辞群辞搿郦群铎群蛘群群僻．枢攥《州．粗蜒蜂州．枢蜒罂州．枢越难州．极蜒掣州．框撼《州．粗留蝶州弭壬#繇蝉．槭骅染．韫掣嘹．枢罂聚．般掣慕．瓤罂聚．收蜂曝．韫难鬃．粗蜂聚．概鞋暴．粗啐聚．枢骧鞯．枢蜂鞲．椒骚《N．N．∞寸。山一．N．∞寸。山I-∞寸。山I|一甘okI|．9寸o‰I-”寸。山I．寸寸。山呷N-c寸ok一．N．n寸。山一-c寸o“I．N甘。山I-；o山N^-6nokI-N_6no‰1-乱no山qN-9鲁山●N．9no山I|-99山N．N^no‰I-N^昌‰一矗no山qN寸8‰I-q寸g山I|{nok蝌壕幂蠕昱删赵似蜊髓求g粗睡惺幄龌硭臣概 苫吾善夏苫事警嚣嚣事鹫等好导冲舴岛+慊{立黪Hq049．II，o¨o_1百o¨一-l，o¨¨-l10u¨．2_lqo蚺¨．2-N勺。认u-1哪。认u．2-1qou3-¨-2勺o¨#．I10协．4．2-l啊。认扛-2．2吲ou”-l10u饥．I勺o¨J7．1懈啦鼗赫，忖茄球阱擀薛游．时茄琳眦嫩墨益旃．卅茄赇M嫩翁i旃，时茄球蚺嫩翁i龄．时茄肆懈噼璺益豁。忖茄徘M晰|益游，时茄肆阱啉酥器，时茄琳阱晰薛游．忖盎孙懈辫皇盏，缩。卅茄冲懈懈薛旃。忖茄徘M啦酥游，卅茄冲叶茄球．卅阼时茄球。*阵时茄肆。晰瘗斟Ⅲ嘧撼落藩爿薛旃．卅盎冲．潞敲爿薛暂苦．卅茄砧．辫葺至剖薛希．时}艮孙．辫敞剖薛游，忖茄冲．辜受敲爿菲旃，H茄冲．落故辩水弗．酣悻M嗣，辩抖落．雕僻M萄．辩水弗。噼膝M面，婶卅第．瞬降H蕊．衬D时*Ⅲ晴时D嘧衬皿嘧薄卅弗．卧障孙嗣．时Ⅲ嘧婶m露．卧隐M嗣．衬皿时饕水舞．卧膝孙嗣，辩Ⅲ时媾水弗．噼障M嗣．辩Ⅲ嘧鹫抖落．卧膝冲蕊．漪Ⅲ睁站海。鞋僻举Ⅲ落弗．鞋博掌心辑辩舞．辑辩藩．叮㈣潞辩．国卜球．ⅢMj戋对．亘卜球．媾劳．鞋陋掌心辩弗．噼憾津Ⅲ辩舞。雕膝举Ⅲ辩劳，雕障章心落劳．隧障游Ⅲ珊簿弗．心M游蚶．画h肆．媾茹．鞋晦棼心潞嚣龄渖ijl萋随时藩署导晴辫署幂睁薜睾肾时潞窦龄嘧薷喜裔晴潞嚣觜时薜熏膂时港署幂嘧潞嚣肾时，可惜op}I—ho若熹103胃，尊苔qhlhoS鼍lo；芽，}|景。口hir。若摹盟。未r唧要oq芝h0盂鼍一。；甜Ⅲgggi8ys苫；imSar手i2莒Poii智善一op著}l。若摹eIojis—¨嚣q1Fj*口一口未，．Ⅳ§、jf≈§hoF≈jf，罩孑日若，。暑罨lo未r节#rQl菩摹o《r≈or#掌咀#∞雩若罩9qrq。叠暑_S￡r§皇皂oli≯∞口ri#哥譬莒口。罩j，F苔q若yo，口；葛Io；is，誊一0phl，。，o；葛lo；；乍旨雩}蓍oxysp鸳#罩喇蓦Q未#iro—Q；一啷#r自j#ioxyr寸or#i智善一oq}1lr。暑≈臣。未r浒。“．：姗叭雪斟h肆晴串峙子包哺阱 黄瓜根腐病病埭菌的分离浆定及室内药剂筛选2．1．3生物学特性研究生长温度将Pmelonis分离物P034—1、P053—1分别置于5～40。C_卜培养．结果可以看出(图1)，病菌菌丝体在5"C、40"C均不能生长，生跃的最适温介于25～35℃，最佳温度为32。C。茁落直径(nun)510152025283032353740图lP034-l菌丝生长!』温度的关系—暑-414h—--P72h—{}12iIh—{-l44h温度(℃)致死温度将供试户口elonis不同分离物分别在37℃，40℃，45℃，48℃，50℃。55℃下水浴锅内处理lOmin，28℃F培养，3d后检查结果可知，JPmelonis的致死温度为45℃，lOmin。不同分离物在不同培养基上的培养特性供试病分离物在不同培养基上的培养特性明显不同(见表5)。在PDA平板上菌落灰白色，花瓣型，生长较慢：在燕麦培养基(OMA)平板上菌落为绒毛状，气生菌丝较多，菌丝较厚、色白，生长很快：在CA培养基平板上则介于以上两种培养基之间。温度为26℃时供试菌在不同培养基上的生长速率著异较大，其中在OMA培养基上生长最快．培养5d后菌落直径可达72．60mm以上．生K速率为14．52mm／d，快TPDA培养基上的10．43mm／d；CA培养基上的生长速率也较快，5d后菌落直径可达61．15mm，生长速率为12．23mm／d，仅次于OMA培养基上的生长速率，快于PDA培养基上的生长速率。∞∞阳∞∞∞∞∞m0 河北农业人学倾I：学位论义表5尸melon／s确：刁iI川培养基上的培养特点Table5Culturingcharacteristicofpaytophthoramelonisindifferentmedia培养基菌落形态5d的菌落直径生|支速率PDA化瓣型52．16mm10．43cA绒毛状61．15mm12．230MA绒毛状72．60mm14．522．1．4黄瓜材料抗病性鉴定疫霉菌致病性测定于2002年10月丁在天津黄瓜所温室内进行，通过颦基曲期(2叶1新期)菌块接菌法对32份黄瓜材料进行试验，结果表明(见表6)．多数黄瓜材料不抗甜瓜疫霉菌，有极少数材料具有轻微抗性，如19，4，3，26，28。表6黄瓜材料对甜瓜痰霉抗病性鉴定Table6ResistanceidentificationofcucumbermaterialstoPmelon坫黄瓜材料编号总株数死亡数死亡率(％)黄瓜材料编号总株数死亡数死亡率(％)l875．00196233．3327457．14207—37100．002l6—46350．00228675．0058100．002364666768787．5024757I．437100．00256466．678562．502B7457．1497100．00277100．00106i00．00287457．14118100．00298787．50126100．00308675．00133100．003t8100．00148100．00327100．00153100．00337100．OO167100．00348100．00 黄瓜根腐jI；；病原菌的分离攀定及室内药剂筛选2．1．5寄主范围通过茎基刺伤苗期菌块接种法测定Pmelonis的寄土范围。结果表明，供试葫芦科6种瓜苗均在接种部位出现水浸状的病斑，以后茎基部出现缢缩，最后全株枯萎。对照组的瓜苗生长均止常。根据接种的结果看来，阿葫芦、菜瓜、甜瓜、南瓜易感病，苦瓜、丝瓜的抗性较强。对茄子、辣椒和番茄3种茄科幼苗椒幼苗在接种后初期出现淡褐色坏步匕斑其上枝叶生长均正常。2．2镰刀菌鉴定接种Pmelonis后15d生长均止常。辣但没有进一步扩展，以后病斑逐渐愈合，2．2．1培养特性和形态特征不同分离物的培养特性和形态特征(结果见表7、表8)。可以看山，供试镰刀菌的4个不同分离物均可产生人、小两种类型分生孢子，F000—2—1小型分生孢子数量多：大型分生孢子数量很少，镰刀形，顶胞较均匀的逐渐变尖，基胞略成二角形，多数三隔；产孢细胞短，单瓶梗；厚垣孢子很容易产生，球形，单生或对生，偶有串生。F025—2-1小型分生孢子非串生；人型分生孢子较宽，马特掣，两端稍钝，顶胞尖，基胞圆形，具有2～5个分隔；产孢细胞为K=筒形单瓶梗，少分枝；厚垣孢子球形，单生或对生”‘”’。2．2．2镰刀菌生物学特性研究温度与菌丝生长的关系将以F03卜2—1分离物为代表的尖孢镰刀菌和以F005—2-2分离物为代表的茄病镰刀菌分别置于15～37"Cr培养，其结果见图2。可以看出，尖孢镰刀菌的适宜生长的温度范围为20～32"C，最适生长温度为28℃左右，37"C条件下停止生K；茄病镰刀菌适宜生K的温度范闱为25～35。C，最适生长温度为30℃左右，37。C仍可以生长。根据变温培养试验可知，供试_二种病原菌在28～30℃时生长较为合适，茄病镰刀菌比尖孢镰刀菌生长适温偏高。 塑!!坐些叁兰堡：!兰竺堡兰一——曲60蓍50耗40m4jo20lO0图2镰刀菌菌丝生艮与温度的关系a：F03l一2—1．b：F005—2—2bpH值与菌丝生长的关系经不同pH值条件下菌体培养试验可知(见图3)，中性条件下菌落生长最快，最适pH值为6～8，pH值过低或过高皆会影响菌落生长，pH值低于2，菌落停止生长；pH值为12时，菌落生长缓慢。t蓁甜50一×一帅hF∞s＼温度(℃)港8lO12PH值图3p}l值对两种镰刀菌菌丝生长的影响 p奇∞g越蝰蛙8*琵删露*惦擗lJ。燃刊特讯鞋矮斟半．葵酬求川车I求龟．鄹娶井鼙挺半划册锰划井，刊厘．蛰酱赠f蝌牛∞由铽．州斟．蛰酱刊茛锰砷．釜酱州状匿n州氓鹾n饕R蜡丑f鼎蠕鞲ooo，o∞寸×o曲岫00∞．Nxoo。∞00鼍NN州状匿竹副蜷胛罱。N，oo．岍oo∞0∞一N×oo．∞00岬N×一锰。丑f器匿H铽。蛰凰半州器『【懵。碘塑徭＆‰下N占g：l璐婴廿．嫂州册怔陛．州靛懈斟．繁莆。吧『In0。曲．∞_I州状龌竹醴R器o∞．NN0∞一甘_【舔。丑f墅锰呆_【山占oo也薹k童娶k堆”洋下障h小乳讯飞卜鞑口dsE基亳q芒％岩量b一篇％号一8苟。一o‘dJo吕coco甚高厶Eou∞uIq盘掰丑出蜷搀丑fS粗【(嚣∞僻髅曝*惦懈11．倒m鼎州求脚槭州忙匣惦群*。州荟惮非司葵脯葵餐羹{葵鬈蛐妪耀衄血印皿脚皿．氐到粗刊圹．氐刈粗划r．枢刊垦鲁怔．龟删粗州r．黾划粗划矿础昔晷螺脚昔唇爆脚婚嚣趟脚韫刊印韫摆蛐槭悟∞斟恃脚翟口程田霍叫皿脚Ⅲ糕．槭州垦邮蒜{；}州皿皿弈削皿69．乌1∞∞叫n一．o'【0寸6．∞∞∞．譬0譬6．∞一．N．曲No山H．N．ooo也划粗州矿一《∽‘器蜥恒僻霉郴划担击}脚霉滁磐叫蝴栋辩匣恃一p／g一世嘲半州∞u苗Io∞一S镩!求口鲁E基§芒-o。l苗仨3lq。毗c—k皇lnu口oEo一篇高A昌ou卜uIq用I．群丑担非滁磐g粗[(错卜懈制嫉幂§垂最删《删鲋艇求S翘睡螵馔龌喏《韫 ■落直桎塑韭坐些查兰堡主堂丝堡兰——营养元素与菌丝生长的关系通过在Czapek培养基上对尖孢镰刀茁和茄病镰刀菌在不同含量N、P、K源环境下生长能力的研究(见图4)可知，3种营养元素的缺失和过量对这两种镰刀菌的生j王=影响著异不显著，随着营养元索含龋的增加，菌落生长直径略有下降。试验结果表明，少蜮的N、P、K营养元素即可满足病原苗的生长需要，同时过量的N、P、K营养元素对病原菌生长也无显著影响。b*60$H50n(_)●0Ⅲ)aI“}‰10o—叫-—o—-o凸_叼—口’．口图4营养元素对镰刀菌菌丝生长的影响a；N素；b：P素；c：K素2．2．3镰刀菌致病性测定镰刀菌致病性测定于2002年6月住大津焚瓜所温室内进行，通过胚根接种法，采用黄瓜枯萎病鉴别寄主啦2进行试验，结果表明(见表9)，黄瓜材料Q22对多数镰刀菌均有不同程度的抗性，发病株均表现为典型的枯萎症状。2．3病原菌回接试验通过病原菌接种试验。发现尸melonis蘸根接种不同黄瓜材料可使黄瓜茁不同程度发病，呈典型根腐状，从病株可再分离获得和接种菌相同的病原菌；贴接不同黄瓜材料茎基部、叶片、叶腋处也都发病。尖孢镰刀菌胚根接种不同黄瓜材料，有高抗材料出现，并且接种后星现典型枯萎病症状，感病材料友病前或发病后也可分离到原病菌：茄病镰刀茵胚根接种无根腐病株出现，但再分离也可分离到原病菌；尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌蘸根接种也无根腐病株出现。清水对照均朱发病也未检出病原菌。疫霉和镰刀菌致病关系试验表明，先接疫霉届接镰刀凿的植株和先接镰刀菌后接疫霉的植株均表现出典型的根腐症状．再分离均可得到两种病原菌：只接疫霉的植株也表现出典型的根腐症状．再分离得到原病菌；而只接镰刀菌的未表现根腐症状，再分离也得到原病菌。说明疫霉是引致黄瓜根腐病{}：z墓一 苎墨堡堕丛堑堕堕竺坌塑鉴塞丝皇塑堑型堑垄一一——的主要致病菌(弛表10)。表9镰刀菌致病性测定Table9PathogenicitytestofFusarium发jIii牢(％)分离物茄病镰刀菌F025—2—110半裸镰川菌F027一l艄IIjj镰川菌F028—21尖他镰川菌F03卜21尖子乜镰刀菌F044—1尖孢镰刀菌F047—1尖孢镰刀菌F0522一l尖孢镰刀菌F054—2一I尖抱镰刀菌F056一l0102010表10黄瓜根腐嫡病原茁致病性测定TablelOPathogenicitytestofcucumberrootrotpathogens黄瓜材料疫霉尖孢镰刀菌崩病镰川Ij!i先接疫霉后接2种镰川菌先接2种镰刀凿后接疫霉不披阐长春密刺+一～+一022+一+一注：“+”表示呈现根腐状。“一’’表求不出现_lIi腐状，“·”表小出现枯莲状3Pmelo行is不同菌株对甲霜灵的敏感性应用平板法测定了来自天沣市及周边地区的23个Pmelonis菌株对甲霜灵的敏感性(结果见表1l、12)。结果表明，菌株间对甲霜灵敏感性存在著异，其Ec”值范围在0．034～0．160ug·mL’，平均值为0．088pg·mLl。P007—1菌株Ec”值最高，与P054一l最低值相比仅相差3．7倍，根据毕朝位⋯1的方法，以抗性凶株与敏感菌株的Ec。比值计算各菌株的抗性水平，比值达到1×106以上时他认为存在很高抗药性，因此，本试验结果认为各菌株对甲霜灵不存在抗药性；另外，根据致病疫霉对甲霜灵的抗性测定标准⋯“⋯，以含药5和100pg／mE平板上菌落生长量与40％对照生长量进行比较米确定。本试验住0．41．tg／mL对甜瓜疫霉的抑制率就可达到90％以上，说明所测定的凶株均为甲霜灵敏感性菌株-不存在盯∞盯∞∞∞O矗置撕坶m船．0o加m0∞曲o0∞∞加00加m舯m加加m 河北农业大学颁士学位论文抗药性。有些菌株在低浓度甲霜灵含药培养基上菌落生故真径比不含甲霜灵的对照的菌落直径还大，这说明甲霜灵可能在低浓度下刺激Pmelon缸的菌丝生妖。以(o．2：o)ug·m一的比值大小作为确定离体条件下只melon如对甲霜灵敏感性，结果表明，多数曲株为高度敏感凶株，敏感菌株数蛙较少，说明天津及周边地区不存在对甲霜灵的自然抗性菌株：同时也说明以(0．2：0)¨g·mL。的比值人小作为确定离体条件下尸melon括对甲霜灵敏感性的标准是可行的。 半州划掣惦僻__燃No_【o，嚣ooo∞o．o，=o．ooN_【o，∞曲oo兮1_【．o，譬o．o∞=o，『INooN∞o．o0∞g．oNooo，∞∞o．oo∞∞．o0高o．oo∞oo0器o．o雩_Io000_【o譬『I009『Io∞∞一o，∞Noog'【．00000_oo∞o．o00no．o兮￡_【．o0∞oooN∞『I000N『I．o∞oNo0n譬．ooo_【．o，『I∞o．oo西o．o0；o．o导_【．o，∞_【_【．oN11．o0∞∞o．oNo『I．o，竹弓ooN∞『I．00n苫oo∞No∞o．oHoN卜o∞．o91甘N甘∞．o∞o三曲西．o∞卜∞∞n∞oonooo∞．o离∞～o∞．o'【o_【oN∞．o∞n卜ono．o岢∞oN卜o．o∞N∞卜∞∞．o_【曲卜∞曲∞．o∞o叫寸∞中．o∞09Ioo．oNoo∞oo．oo∞=卜o．o∞o『I∞No．o∞∞oo卜o．o∞NoNN西．o19∞_I卜o．ooNoo∞ooo卜。高o．oo∞ooNo．o×寸T|¨+甘寸卜i砷×卜∞．『I+『In．卜i斗)(卜o．N+_【N．∞i}×∞_【n十∞n．∞i})(甘NN+一卜．卜i})('【卜N+卜『I．∞i})('【oN+o甘．卜i卜](卜o∞+呻'【．∞i})(甘oN+o∞．卜i})(∞西．N+N卜．卜i}×∞∞N+oN．卜i})(o卜一+no．oi}一卜oN+口。卜i}x卜NN+岢∞．卜i扣)(o甘．∞+∞N．∞i扣)(∞∞．N+N呻．卜i})(∞o．n+n∞．卜i})(口『I．∞志一∞i}州no．『I+n∞卜i扣)cn∞．罕∞曲．寸，R∞叫．N+∞|．卜i}HoH．N+∞寸卜i扣)(甘N．甘+廿∞．∞i}oo．ooo甘∞吲_【∞卜。寸∞∞一．∞旧。山∞n．o卜∞∞．o∞寸∞吲oH．叫∞oI卜n．o卜N_【oooo曲o『I．n曲o．|o卜．o口∞∞．卜∞岫寸吣∞_【∞o山oo∞啦n∞．∞∞卜『I叫o．【I∞甘o．|No．卜心∞砷．o∞oo∞∞_【．∞寸o．|o吖．o心oN．卜∞o叫．叫o_【．n呻。乱oo∞卜n∞o∞甘叫．n∞『I，∞∞o乱『I∞oo卜∞oo∞N∞o『I，∞∞o山∞|，N叫甘∞．吣卜呻N叫o『I甘∞o山oo．o甘o∞H卜o∞．∞∞_【．N∞okN口．N口ooo卜N∞．譬1-1colo一．一。卜曲啦∞一o．卜∞一．∞No山n甘_【卜o∞m∞∞N卜∞『I，卜No山∞t∞no∞．_【∞o∞．高_【占No山∞∞．『I∞oH．一o∞寸No_【．∞一。山∞曲．N『Io∞．oo叫。叫o_【．卜oo乱∞卜．呻∞o∞．『Io∞n．o∞『I．心oo．|呻甘．呻∞o『I．∞∞nn．n西叫oo‘|No．o帕高．『I卜o∞．no_【．noo乱∞∞．∞吣No．呻卜∞∞．n西『I．Noo乱∞叫．o∞一时．呻∞N∞．竹西'【．'【oo山∞n．o∞∞岬16oo．∞o'【．ooo山p一目州一『1日州uj刁州¨辞∞西鹾呈}叫冰∞∞^J)赫幡水翼co—u日j口∞pco_【：-一>哗恹Efi囤R坩∞Nooo∞o．ooo_【．ooo■ooo畔．o褂辜晕蜷粗靠接^．1Ⅲ．呻j＼v∞等昌凸删幂匣恃∞∞_∞_【o∞『I蜷粗兽￡o，～E口苦毛《鲁X《钆-o∞Q≈lo∞11c2m譬≈o=h蒿一蛊ogho葛u_u兽卫已lA=uIq盘恻嚣R懈窖蜷粗匣悻盘}D，；q靛嘣姆}_【_【懈蝴嫉幂§主长删《似洲艇求g粗隧慑蟮遥踞《粗 ii；l；；ii；；i；；；§；i∽吞吞磊磊磊吞景景∽∽∽景吞景∽∽吞吞∽∽景景卅_阳～鲁mfoj哥爿司瞬莽遗珂稿舢3薄谌薛望础．r旷叮一n一¨，IIe∞一of_∞o，∽itiv～tvof-未薯莹≥o、☆童m_『q=哥iSo一兽n∽『co暑n冒一∞x《一噼桑一∞oH∞一o∞噼；喜时{空＼虽净涵打茸强画}匕癖o．．4¨oE∞．mL鼍坷斟_灵薄谗十生∞nj∞¨一柚《¨一《一。目m一∞H∞H{一7_】_．时明o∞∞．7_明o∞∽．oooo∽．饥ooo7_．∞oo们∞．时∽oq∽．∽oo西o．∽ooq_．ooo叫∞．忉oooq．ooo们∞．朗ooom．o7_oo∞．们oo∞∞．ooo西一．oooo时．∞oo∽时们oooo．ooo曲o．ooo∞o．q∞o∽∞．uoo∞o．∽ooo．一o．时o．．4o．_¨oo时一oE噼．目r_乍响．mL．#昀．目r—E∞．日r．一；∞．目广．一l_‘耋．ooooooo一．oooo．_o西o．o∞．4№o．ooo—o．时们o‘4．oooo．∞心们o．_∽o№心．oooPo．∞oo^．oooo．．4J4西o．时∞．耋．耋们．怕∽o一∞．u们o4．oooo．西∞Po．时∞m¨Aooo—o．oooA．∞ooo．∞∞oo．H48N∽oooA．∞oo时oooo．A∞吣o．o∞P西∞ooo～∽．oooA．饥ooo．∞7_Ao．33PA∞500N乒．∞oo∞．o口oo．o∞乒o．∞o∞．耋∞饥ooP∞．oooP．∞ooo．oPuo．_∞∞¨_．oooq．∽oo～．oooo．¨∞oo_o∞时o．ooo心．ooo吣．oooo．∞∞∞o．1|∽‘4¨o．ooo_西．ooo‘|．oooo．∞q^o．∞ooAo．ooo_o．oooq．oooo．西ooo．～∞∞．40．oooH7_．ooo‘耋．oooo．∽7_oo．吣^∞H西．ooo讲．ooo时．∞ooo．∞o时o．o心A_∞．oooHN．80^．08o．H1_∞o．p97N_．ooo∞．ooo∞．∞ooo．∞∞oo．_吣∞H7_．ooo∞．oooH．oooo．∞¨‘|o．095时一．ooo山．ooo∽．∽ooo．∞∽oo．oo7_时o．ooo∞．oooo．uo∞o．一吣P_∞．ooo西．ooo∞．oooo．时∞oo．o∞∞l|．耋．oooo．ooo∞．oooo．时∞oo．1|oP时oooo一∞．ooo时．oooo．∞明^o．∞P∞oo一．4o．oo卜o．o西№o．oo_o．oo吣o．o∞西o．o西oo．oq∞o．o时一o．o¨7_o．o∞oo．oq∽o．一。仇o．o∽∞o．oA7_o．o曲∞o．o们oo．o卜∞o．o∞∞o．o舡∽o．o山啦o．o∽_o．o∞叽 堕墨堡堕堕塑堕堕塑坌曼鳖室丝皇塑垫型堕垄4几种杀菌剂对Pmean&的毒力测定利用平板法测定了10种杀凶剂对户melonis的毒力(随机选取菌株P025—1P032一1)，确定了各药剂的毒力方程平¨ECso值(见表13和表14)。表13几种杀菌剂对尸melonis菌株P025—1的毒力比较Table13ComparisonOnvirulenceofseveralfungicidestoPhytophthoramelonisP025-I浓度0．4000．2000．10000500．025抑菌率97．89816938．735．63423呵1霜炙I哪归方程Y-825十3．46xEc。。和95％置信限01150．1000～0．1400 河北农业人学硕士学位论文锰锌回归方程Y=3．42+0．93xEc。和95％置信限49．55232．4262～75．7215浓度784．00392．00196．0098．oo49．00抑苗率u恶霉炙I壁I归方程660759．8253．57—一Y-3．86+0．54x!!：塑!竺兰堕竖!!!：!!!!：竺竺二!!!：!!!!浓度3610．00180500902．50451．252256011280抑菌率霜霉威回归方程48．2l446441．0732．593I．2523．2lY=3．41+O．44XEc“和95％置信限3814．551475．2590～9863．2220注：浓度单位为(ug·m∥)，抻菌率为(％)．表14几种杀菌剂对尸melonisP032一I的毒力比较Table14ComparisononvirulenceofseveralfungicidesloPhytophthoramelonisP032-I浓度0．400．200．100050．025抑菌率89．507i5040．00一～甲霜炙回归方程Y=7．29+2．53XEc。和95％置信限0．1240104～0．147 苎巫堡堕塑堑堕堕堕坌堕鉴塞丝窒盎垫型堕垄一Ec。和95％置信限1008082888～12．2576注：浓度单位为(ug·mL‘)．抑菌率为(％)。从表13和表14可见，10种药剂在PDA培养基上对Pmelonis菌丝生艮均有不同程度地抑制作用。与其他几种杀菌剂相比，甲霜灵、甲霜灵一锰锌和氟吗啉在离体条件下对Pmelonis表现出很高活性，对P025一l的分别为0．115，0．905，2．202ug·mL一，对P032-1的Ec”分别为0．120，1．084，2．249ug·mL。，其Ecw明显小于其他几种杀凶剂。多凿灵在800ug·mL。时仍对F025—1抑制率很小，仅为5．357％，而此浓度已经使培养基浑浊，因此未做进一步试验、分析。从测定结果来看，n恶霉灵在49．00，98．ooug·mLl浓度下甚至促进菌丝生长。其余9种药剂对P025一l菌株的抑菌率大小顺序依次为：甲霜灵>甲霜灵一锰锌>氟吗啉>阿米西达>a恶霜锰锌>代森锰锌>霜脲氰锰锌>。恶霉灵>霜霉威；对P032一l的抑制率大小顺序依次为：甲霜灵>甲霜灵一锰锌>氟吗啉>阿米西达>代森锰锌>a恶霜锰锌>霜脲氰锰锌>u恶霉灵>霜霉威。 }【lJ北农业大学碳L学位论文讨论1关于PhytophthorameIonis与Pdrechs彪“户mPlonis这一新种是日本的桂墒一(1968)在以黄瓜基腐病菌为研究对象时建立的。当初他认为该菌为孢子囊项部’卜乳状突起、无层山现象，井可产生厚垣孢子””。他认为该菌在培养基上很少形成穿雄生的有性器官，是与掘氏疫霉的主要区别。我国的翁祖信⋯“1报道，20世纪70年代初在北京郊区夏、秋黄瓜上发生的疫病菌鉴定为PmPf。"括，并指出二者的区别是PⅢPf0H括属于同宗配合，而尸drechsleri为异宗配合。1980～1981年陆家云””对南京地区黄瓜疫病菌进行了调查和鉴定，其性状与桂琦一命名的种Phytophthoramelonis相同。1984年，他义对南京黄瓜疫病菌生物学及分类进行了研究，他指出二者之间的差异极小，并明确了当时Pmelonis的异宗配合性，通过观察发现其根本不形成厚垣孢子，这一性状与Pdrechsleri完全一致，只是Pmelonis的致病性仅限于葫芦科植物，在国内首次报道应将原来被鉴定为户melonis的菌株重新定名为Pdrechsleri⋯’。另外，桂琦一，陆家云等在对其进行报道时均未提到菌丝分枝处缢缩的情况。余永年⋯在1998年将Pmelonis列为Pdrechsleri的异名，并明确指出疫霉科在分枝处常有缢缩。至此，侵染黄瓜的疫霉菌的分类地位与陆家云当时的结论一致，二者为同一种菌，互为异名的关系。近年来多数作者发表的论文均沿用Pmelonis这一学名””。，鉴于此，本研究也仍采j；fj这一学名。2关于黄瓜根腐病2．1关于黄瓜根腐病的致病菌从黄瓜根腐病主要致病菌Phytophthora的培养特性以及形态特征上进行鉴定．与陆家云，桂琦一，余永年等报道的黄瓜疫病菌——Pmelonis基本相同，寄主范围与引起黄瓜疫病的甜瓜疫霉也人致相同。本试验认为天津及周边地区黄瓜上的根腐病菌为甜瓜疫霉(Pmelonis)，与以前报道的引起黄瓜疫病的病原菌为同一种菌．在天津地区以前束发现它能够引起黄瓜根腐病，其原因可能是近年来由于多年连作，重茬栽培致使十壤环境发生变化。寄主抗病性减弱，加上病菌本身致病力的增强所致，总之这还有待于进一步研究。在实际生产中，尚未发现抗根腐病的黄瓜品种，而本试验通过人J：接种发现有高抗尖孢镰刀菌的品种出现，且此高抗品种不抗甜瓜疫霉菌，接种后表现典型36 黄瓜根腐病痫原菌的分离鉴定及室内药剂筛选的枯萎症状，茄病镰刀菌接种后也不发病，因此说明甜瓜疫霉是导致天沣及周边地区黄瓜根腐病大发生的主要致病曲。但所分离的病株有人部分都能同时分离剑两类病原菌，关于镰刀菌在黄瓜根腐病中的作刚本试验没有定论，因此有关镰刀菌与黄瓜根腐病发生的关系还需做深入研究。甜瓜疫霉引起黄瓜根腐病以及从朴l部侵染方面的研究尚未见有相关的报道，通过本试验明确了Pme，0nk能引起黄瓜的根腐病，且能够从黄瓜根部侵染。但其致病机制还不清楚，这也有待于进一步研究。2．2关于甜瓜疫霉菌文献报道，侵染黄瓜可引起病害的疫霉属有很多种，如甜瓜疫霉(Phytophthoramelonis)、辣椒疫霉∽capsici)、寄生疫霉∽parasitica)和隐地疫霉怛cryptogea)等。我国的黄瓜疫霉菌究竟是哪个种或以哪个种为主，许多地区都曾进行过病原菌种的鉴定]：作。最早吉林省曾报道为寄生疫霉∽parasitica)；后来杭州、南京、上海、武汉、北京、J“州⋯7。“”1等地鉴定为甜瓜痰霉(Pmefon担)：南京、武汉曾报道过为Pdreschleri；北京(1982)曾报道为一新种——中国痰霉∽sinensis)。目前多数意见认为，我国各地发生的侵染黄瓜的疫霉菌主要是甜瓜疫霉(JPⅢP如H括)。本研究通过大茧的试验证明，甜瓜疫霉是引致黄瓜根腐病的致病菌，该病菌与以前报道的黄瓜疫病菌为同一种菌，应对其近年来导致黄瓜根腐病大发生的原因做进一步的试验、研究。2．3关于抗源筛选方法和黄瓜抗病材料黄瓜根腐病作为～种根部病害和新发病害，对其研究较少：关_丁致病性测定方法和抗源筛选方法也只是对有关疫病的研究。对于典型的_卜传病害可选择的方法有菌液蘸根法、灌根法和茎基刺伤苗期接菌法。本试验采坩孢子悬浮液蘸根接种法进行致病性测定，虽能使黄瓜植株发生典型的根腐病，但能否用于抗源的筛选未做有关试验。对于一种新病害，合适的抗源筛选方法需要做人量试验进行反复验证，因此，合适的接菌液浓度，适宜的发病温、湿度，进行调查的时问，以及评价抗性的标准等等。都有待1二以后的反复试验进行摸索，以制定山一种简单，有效的抗源筛选方法。本试验采用茎基刺伤卣划接菌法作为抗源筛选方法，经过初步的筛选(温室条什’F)，有轻微抗性黄瓜材料出现(如19，4，3，26．28)，可以认为这一结果与生产上实际无抗病品种相一致。由于客观条件的限制本筛选试验只在秋季进行了一次，结果是否可靠还有待于进行反复接种试验。37 河北农业大学硕士学位论文3关于疫霉根腐病的防治策略疫霉病菌以卵孢子在病残体上越冬，通过灌溉水或雨水传播蔓延。疫霉病害的发生、流行与温度、湿度密切相关，如果灌水量火。气温高，易暴发流行成灾，多年连作发病重。由甜瓜疫霉引起的黄瓜根腐病是典型的士传病害，在防治上难度很大，任何单一的防治措施都难以达到理想的防治效果。本研究通过室内人量的约剂筛选试验．认为25％甲霜灵可湿性粉剂、58％甲霜灵一锰锌可湿性粉剂和60％氟吗啉可湿性粉剂是目前防治由甜瓜疫霉引起的黄瓜根腐病的首选约剂。从试验结果来看，甲霜灵仍然是对疫霉菌毒力最盘『的药剂，但许多研究者发现，疫霉菌易对甲霜灵产生抗药性，晟好能和其他与甲霜灵不产生交互抗性的杀菌剂如霜霉威轮换使用，以减缓抗性的产生；也可与近年来新推广的防治卵【封病害的新型杀菌剂氟吗啉、烯酰吗啉等交替使_Hj“⋯，但他们之间是否存在交互抗性问题尚需深入研究。根据本试验研究结果，建议在生产上对黄瓜疫霉根腐病应采取以药剂防治为主，其他措施(如：农业预防措施、生物防治和嫁接等)为辅的综合防治措施。 黄瓜根腐躺病原菌的分离搽定及室内药剂筛选结论1从黄瓜病株根部及茎基部分离山3种主要病原菌，经鉴定表明，分别为甜瓜疫霉(肪rtophthoramelonis)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病镰刀曲(Fusariumsolani)。2致病性测定结果表明，在天津及周边地区，户melon&是引致黄瓜根腐病的致病菌。户melon&休止孢蘸根接种法进行致病性测定简便、可行。试验明确了尸melonis能从根部侵染。3通过对甲霜灵的室内敏感性测定，没有发现自然界对甲霜灵的抗性凶株。初步制定出了室内评价Phytophthoramelon&对甲霜灵的敏感性标准。4通过对杀菌剂的室内毒力测定，实验室条件下筛选山了3种对尸melon&毒力较高的药剂——甲霜灵、甲霜灵一锰锌和氟吗啉。39 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