wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士专业学位论文论文题目______wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心_____________肌样细胞分化的实验研究研究生姓名_______________沈晗___________指导教师姓名________________沈振亚教授__________专业名称______________胸心血管外科学研究方向干细胞移植治疗缺血性心脏疾病论文提交日期________2015年5月Wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究中文摘要Wnt5b诱导大鼠骨髓

2、间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究中文摘要目的：心肌梗死的致残致死率极高，已成为危及生命的重大疾病，现有的治疗手段难以从根本上解决问题；干细胞治疗心肌梗死的前景相当广阔，但仍存在诸多问题，例如：移植后干细胞分化率较低、存活率低等。本研究拟通过调节wnt5b基因的表达，探讨BMSCs向心肌样细胞分化率的改变，旨在为临床心肌梗死的治疗提供更有效的方法。方法：选取4周龄SD大鼠胫骨提取骨髓间充质干细胞，利用贴壁法培养，传代生长到P3代，以流式细胞仪检测细胞表面抗原，主要选用CD29、CD44、CD34、CD45

3、鉴定骨髓间充质干细胞。选取生长良好的P3代骨髓间充质干细胞分为四个实验组，分别转染siRNA-空白对照（siRNA-NC）、wnt5b基因沉默组（siRNA-wnt5b）、PEX1-空白对照（PEX1-NC）、wnt5b基因高表达组（PEX1-wnt5b），从而实现对wnt5b基因沉默及高表达，24h后向每组细胞内加入心肌细胞裂解液诱导分化。在体外，于3天、7天、14天收取细胞，以qPCR检测各组细胞心肌特异性因子Nkx2.5、GATA-4、CX43、MyoD的mRNA量；以免疫荧光检测各组细胞中的特异性

4、CX43、Desmin表达，比较各组荧光亮度；以蛋白印迹法(westernblot,WB)检测各组细胞Desmin、cTnT蛋白表达量,比较各组特异蛋白表达的变化。在体内，建立大鼠心梗模型，48h后注射四组处理后的细胞，分别于术后第1、28天心超检测大鼠心功能指标，28天后取出心脏行HE染色，Masson染色，免疫荧光等检测心肌分化指标。结果：贴壁法分离得到P3代BMSCs，镜下观察细胞长条状，呈极性生长，流式鉴定细胞表面抗原CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性。处理后3天qPCR检测心肌特异性

5、因子，siRNA-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4表达量升高，而PEX1-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4表达受到抑制，与对应的阴性对照组相比有统计学差异；siRNA-wnt5b组CX43、MyoD表达量下降，而PEX1-wnt5b组CX43、MyoD表达略升高，与对应的阴性对照组相比无统计学差异。处理后7天、14天qPCR检测心肌I中文摘要Wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究特异性因子，siRNA-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4、CX43、MyoD表达量升高，而P

6、EX1-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4、CX43、MyoD表达受到抑制，与对应的阴性对照组相比有统计学差异。体外免疫荧光检测心肌特异性蛋白CX43、Desmin，westernblot检测Desmin、cTnT蛋白表达，siRNA-wnt5b组表达增高，PEX1-wnt5b组表达降低。建立心梗模型，向梗死心肌表面注射处理后的BMSCs，转染siRNA-wnt5b组大鼠心功能较转染PEX1-wnt5b组明显修复；Masson染色分析心梗面积发现：siRNA-wnt5b组梗死纤维组织面积最小，而PEX

7、1-wnt5b组梗死纤维组织面积最大，与相应的阴性对照组比较有统计学差异；HE染色可见siRNA-wnt5b组较PEX1-wnt5b组心肌细胞排列整齐，炎症细胞浸润减少；最后对注射BMSCS的心脏组织进行免疫荧光检测，CX43在siRNA-wnt5b组表达增高，而PEX1-wnt5b组表达降低。结论：wnt5b在BMSCs向心肌样细胞分化中有重要的调控作用，上调wnt5b抑制BMSCs向心肌样细胞分化，下调wnt5b则促进其分化；wnt5b可能是通过改变GSK-3β的表达，调控BMSCs向心肌样细胞分化。

8、关键词：骨髓间充质干细胞；分化；心肌样细胞；wnt5b。作者：沈晗指导老师：沈振亚教授IIResearchOnWnt5binducedBMSCsdifferentiationintocardiomyocyte-likecellsAbstractResearchOnWnt5binducedBMSCsdifferentiationintocardiomyocyte-likecellsAbstractObjective:Withth