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Ｓ４３２学校代码：１０７５８分类号；：１巧１０２００５０密级；公开学号《寺乂＃硕壬学位论文新疆结奏果实两种真菌病害病原鉴定及关键防治技术研究ＲｅｓｅａｒｃｈｂｅｔｗｅｃＨＰａｔｈｏｇｅｎｓＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＫｅｙＣｏｎｔｒｏｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆＴｗｏＪｕ油ｅＦｒｕｉｔＦｕｎｇａｌＤｉｓｅａｓｅｓｉｎＸｉｎｊｉａｎｇｊ研究生巧名刘艳祥＾导师姓名及职称郭庆元教授合作导师姓名及职称学位口类级别农学硕±专业名称植物病理学研究方向作物病害所在学院农学院新疆？乌鲁木齐二〇—六年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究＾作及取得，论的研究成果，除了文中特别加标注和致谢的地方外文中。尽我所知不包含其他人己经发衣或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业火－？学或其他教肯单位的学位或证书而使用过的材料。与我同１［作的同志对本研充所做的任何贡献巧已在论文中作了明确的说明化农不了谢意。研究生签名时间；年Ｈ：争１＾关于学位论文使用授权的说明日］：、，新本人亢全了解新疆农业大学有关保留使用学位论义的规化１聽农业大学有权保留并向固家有关部口或机构送交论义的复印件和电子义巧，可采用影印、缩印或扫描等复制乎段保存、汇编学位论文，允许论入义被窓阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论义的全部或部分内容编巧关数踞库进巧检索，可公布（包括刊嘗）论文的全部或部分内巧。＇（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：元）倫时间：如／／年＾月／口７导师簽名：表克时间：年月曰違采 新疆红枣果实两种真菌病害病原鉴定及关键防治技术研究摘要红枣黑斑病及软腐病是新疆普遍发生且较为严重的两种主要果实病害，严重影响了红枣的品质及产量。本研究对病害发生情况进行了调查及病样采集，对两病的致病菌进行分离与鉴定；在此基础上，对病原菌田间越冬场所进行调查，并利用抑菌圈比较、毒力测定与田间药效试验相结合的方法进行防治药剂的筛选。以期准确查明两病病原、筛选出高效防治两病药剂，建立关键防控技术，为新疆红枣黑斑病和软腐病的防治提供理论支持和技术指导。主要研究结果如下：（1）对采集的黑斑病样品进行分离，共得到7种分离物，其中，链格孢属分离频率最高，占所有分离物的76.1%，其余6种分离物的分离频率均处于10%以下；红枣软腐病样品所获得6种分离物中，根霉属分离频率最高，占分离总数的66.7%，其次是链格孢属38个，占分离总数的19.2%，其余4种分离物的分离频率均小于10%。经回接证病试验，接种链格孢菌的健康枣果发病率为84%；接种根霉菌的健康枣果发病率为82.3%。初步判定当前新疆枣果实黑斑病的病原菌为链格孢属，软腐病病原是根霉属。（2）参照《真菌鉴定手册》及相关文献、专著，对枣黑斑病及枣软腐病代表菌株进行鉴定，同时，分别结合EF-1α延伸因子基因序列，rDNA-ITS基因序列进行分析，把枣黑斑病病原菌鉴定为链格孢属的链格孢(Alternaria.Alternata)；枣软腐病病原菌鉴定为根霉属米根霉(Rhizopusoryzae)。（3）对采集的根土、落叶、落果、枯枝和树皮五类样品中病原菌检出率进行统计，明确A.alternata的田间主要越冬场所为落叶和落果；R.oryzae的田间主要越冬场所为落叶、落果及根土。（4）筛选出有效防治新疆红枣黑斑病的杀菌剂，分别为80%乙蒜素及5%己唑醇，防治效果为65.3%及61.7%；50%氯溴异氰尿酸和5%己唑醇可作为防治新疆枣软腐病的药剂，防治效果分别为73.6%和67.2%。关键词：红枣；黑斑病；软腐病；链格孢；米根霉；药剂筛选I ResearchbetweenPathogensIdentificationandKeyControlTechniquesofTwoJujubeFruitFungalDiseasesinXinjiangAbstractBlackspotandsoftrotonjujube,astwomajorfruitdiseaseseliminatingthequalityandproductionofjujube,areincreasinglyseriousinXinjiang.Inthisstudy,investigatethesituationoftheoccurrenceofdiseaseandcollectsamples,isolateandidentifythepathogensthatcausingthistwodiseases;onthebasisofthese,detecttheoverwinterplacesofpathogensinthefield，theinhibitioncomparing,toxicitytestandfieldcontrolefficacytrialsetalmethodsareallusedforscreeningfungicides.Inordertofindoutthepathogensofthetwodiseases,screenouteffectivefungicidestocontrolthem,establishthekeycontroltechniques,therefor,providingtheoreticalguidanceandtechnologicalsupportforthepreventionofZizyphusjujubablackspotandsoftrot.Themainfindingsareasfollows:(1)Atotalof7kindsofisolateswereobtainedfromthediseasedfruitsamplesthatofblackspot.TheisolationfrequencyofAlternariasppwasthehighest,occupied76.1%ofthetotalisolates,theisolationfrequencyoftheotherswaslessthan10%;Amongtheisolateswhichwereobtainedfromthesamplesofsoftrot,TheisolationfrequencyofRhizopussppwasthehighest,occupied66.7%ofall,Alternariasppoccupied19.2%,theotherswaslessthan10%.Throughthepathogenicitytests,84%healthyjujubefruitswhichwereinoculatedAlternariasppgotdiseasedand82.3%healthyjujubefruitswhichwereinoculatedRhizopussppgotdiseased.AlternariasppwaspreliminarilyconsideredtobethepathogenofjujubefruitblackspotinXinjiangandsowasRhizopusspp,itwasthepathogenofjujubefruitsoftrot.(2)Referto“FungiidentificationHandbook”,relatedliteratureandmonograph,thestrainsofjujubeblackspotandsoftrotwereidentified,meanwhile,accordingtotheEF-1αgenesequenceandITSsequencerespectively,thejujubefruitblackspotpathogenwasidentifiedasAlternaria.alternataandthesoftrotwasRhizopusoryzae.(3)Countingforthepathogendetectionrateofthe45collectedsamplesfromthe5positionsincludingroot-soil,deciduous,fruitdrop,deadwood,andbark.DeciduousandfruitdropwereconsideredtobethemainoverwinteringplacesofA.alternataandR.oryzaesubsistedindeciduous,fruitdropandroot-soilinwinter.(4)ScreeningouteffectivefungicidestocontroljujubefruitblackspotinXinjiang,theywere80%Ecilincyand5%Hexaconazole,thecontroleffectswere65.3%and61.7%respectively;50%C·B·isocyanurateand5%HexaconazolecouldbeusedasthepesticidescontrollingjujubefruitsoftrotinXinjiang,thecontroleffectswere73.6%and67.2%,respectively.Keywords:Zizyphusjujube；blackspot；softrot；A.alternata；R.oryzae；fungicidescreeningII 目录第1章绪论........................................................................................................11.1红枣的分布及价值........................................................................................................11.2红枣病害的研究现状....................................................................................................31.2.1病害种类及其病原.......................................................................................................................31.2.2病害侵染循环途径.......................................................................................................................51.2.3病害防治技术研究.......................................................................................................................51.3本项目研究意义............................................................................................................61.4研究内容........................................................................................................................61.5技术路线........................................................................................................................7第2章枣黑斑病及软腐病病原鉴定................................................................82.1材料与方法....................................................................................................................82.1.1供试材料.......................................................................................................................................82.1.2供试培养基...................................................................................................................................82.1.3供试仪器及试剂...........................................................................................................................82.1.4病害症状及发病动态观察...........................................................................................................92.1.5病原菌的分离和纯化...................................................................................................................92.1.6致病性测定.................................................................................................................................102.1.7病原菌形态学鉴定.....................................................................................................................102.1.8病原菌分子生物学鉴定.............................................................................................................112.2结果与分析..................................................................................................................122.2.1枣黑斑病的病原鉴定.................................................................................................................122.2.2枣软腐病的病原鉴定.................................................................................................................162.3小结与讨论..................................................................................................................20第3章两种果实病害病原越冬场所调查研究.............................................223.1材料与方法..................................................................................................................223.1.1供试材料.....................................................................................................................................223.1.2供试培养基.................................................................................................................................223.1.3仪器及试剂.................................................................................................................................223.1.4菌丝体的培养与收集.................................................................................................................233.1.5基因组DNA提取与PCR扩增................................................................................................23III 3.1.6特异性引物设计与验证.............................................................................................................233.1.7退火温度的优化.........................................................................................................................233.1.8特异性引物灵敏度检测.............................................................................................................233.1.9病原越冬场所检测.....................................................................................................................243.2结果与分析..................................................................................................................243.2.1引物筛选与特异性验证.............................................................................................................243.2.2退火温度的优化.........................................................................................................................253.2.3特异性引物的灵敏度检测.........................................................................................................263.2.4病原越冬场所检测.....................................................................................................................263.3小结与讨论....................................................................................................................29第4章两种果实病害的防治药剂筛选..........................................................304.1材料与方法..................................................................................................................304.1.1供试地点与试验田概况.............................................................................................................304.1.2供试菌株.....................................................................................................................................304.1.3供试培养基.................................................................................................................................304.1.4供试药剂.....................................................................................................................................314.1.5抑菌圈实验法.............................................................................................................................314.1.6毒力测定试验.............................................................................................................................324.1.7田间药剂筛选.............................................................................................................................324.2结果与分析..................................................................................................................334.2.1枣黑斑病的防治药剂筛选.........................................................................................................334.2.2枣软腐病的防治药剂筛选.........................................................................................................374.3小结与讨论..................................................................................................................41第5章结论......................................................................................................43参考文献..............................................................................................................44附图...................................................................................................................49致谢...................................................................................................................51作者简历..............................................................................................................52IV 新疆农业大学硕士学位论文第1章绪论红枣(Zizyphusjujuba)，起源于中国，鼠李科(Rhamnaceae)，枣属植物，在中国已栽培了4000年左右[1]。红枣是中国特色果品之一，海外的枣树基本从我国引进[2]，因此红枣在我国具有广阔的发展前景。新疆是我国的农业大省，其具有土地多，光热足，温差大，气候干燥等特点，这为培育优良品质的红枣提供了必要条件，同时，枣树适应环境能力强，尤以耐盐碱、抗干旱和易管理等特点而著称，是发展南疆节水型林果业的首选树种[3-5]。目前新疆红枣的栽培不但能改良生态环境又能调整农业产业经济布局，具有社会及生态双重效益。近年来，随着新疆红枣栽培面积的急剧增加及栽培模式的转变，病害发生越来越多，一些新的病害也相继发生。枣果实病害尤为突出，黑斑病、软腐病、缩果病、裂果病等发生非常普遍，不仅导致红枣产量下降，而且严重影响了红枣品质，大大降低了新疆红枣的商品价值和市场竞争力，给当地枣农带来了巨大的经济损失[6]。在几种果实病害中又以枣黑斑病和软腐病为甚，枣黑斑病及软腐病在新疆平均发病率一般为在10%~20%，严重发病枣园发病率达50%以上，综合侵染病果率甚至达到60%以上[7-8]。而新疆目前对这两种果实病害致病菌的种类、越冬场所及其防治药剂的研究报道很少，使得枣农在防治这两种病害时存在一定的盲目性。新疆因其独特的自然资源和广阔的耕地面积，红枣产业在新疆有着很好的发展前景。因此，对新疆红枣严重发生的果实病害的研究已迫在眉睫，对病害种类的调查，对病原菌进行准确鉴定，摸清病原菌的越冬场所等病害规律，选择高效、低毒、低污染的药剂，建立关键防病技术及综合防治技术体系，从而有效提高新疆红枣品质和产量，已成为我区红枣病害防治研究的迫切需要，并对我区红枣产业的健康可持续发展具有深远意义。1.1红枣的分布及价值枣树是我国栽培历史最为悠久且最具代表性的民族特色果树之一[9]，远在周代的黄河流域已有大片的枣树种植，距今已有4000多年的历史[1]。我国古代许多书籍都有关于1 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究枣的记载，古代两大著名农书《齐民要术》及《农政全书》中，都把枣、桃、李、杏、栗并称为“五果”，且红枣被列为“五果之首”[10-11]。《日华子本草》及《本草纲目》等众多古代书籍都有关于红枣食用及药用的记载。这表明红枣的食药价值在中国得到开发利用的历史已相当久远。全世界几乎所有的枣树种质资源都集中于中国[12]。枣树在中国分布较为广泛，尤以黄河流域地区为甚。大约在3000年前左右，枣树自我国通过不同路线先后传至亚洲西部，欧洲，美洲等地，亚洲国家的枣树，例如：朝鲜、日本、泰国等，也是由中国引进。虽然世界许多国家都有种植枣树，但唯独韩国形成一定规模栽培，其他国家因为饮食文化等原因，基本为庭院种植[13-15]。2015年，中国目前枣树种植面积约为298万hm2，果实总产量可达913.5万多吨[16]，而新疆产区已经逐渐超越传统的红枣主产区，例如山西、河北、陕西与辽宁等地，成为国内红枣最重要产区，其栽培面积和果实产量位居全国首位。枣的营养价值极其丰富，是我国历来推崇的滋补佳品。民间素有“天天吃大枣，青春永不老”、“五谷加大枣，胜过灵芝草”、“若要皮肤好，粥里加大枣”、“每日吃三枣，永生不显老”，甚至还有“吃枣能成仙”等说法，即便略显夸张，但从这些古风民俗中可以看出，红枣的营养价值和滋补功效在我国人民心中的地位。不同品种枣之间，营养价值差别很小，但其它干鲜果与之相比，均无法与之媲美。红枣皮薄肉厚，香甜脆郁、营养丰富，其富含人体所需的蛋白质、糖类、维生素、矿质元素、生物碱等[17]。枣中维生素C含量极高，是橘子的13倍，苹果和香蕉的60~80倍，以维生素C含量高而著称的猕猴桃都无法与之相比，是目前维生素C含量最多的栽培果实[18-19]。再者，枣果中的碳水化合物几乎全部是蔗糖、果糖、葡萄糖等糖类，极易为人体吸收利用。红枣中的维生素P含量也是百果之冠，可保护血管，降血压及预防心脑血管疾病发生[20]。枣果中还含有较为丰富的硒、钼、锶等微量元素。硒的含量远远高于梨、山楂、草莓等果品。微量元素对维持人体正常生理功能有重要意义。红枣不仅营养价值高，同时也有较高的医学价值，具有“药食同源”之功效[21]。公元三世纪《名医别录》即有大枣药用功效的记载：“补中益气，坚志强力，除烦闷，除肠澼。”《中药大辞典》记载大枣具有补脾和胃，益气生津的功能。国外有些国家也将大2 新疆农业大学硕士学位论文枣用于民间医药。如俄罗斯的《药品商店》一书中提到，大枣是较好的止咳和治疗溃疡性口疮的药物，对肝脏、肾脏和膀胱等器官的疼痛也有治疗作用。红枣味甜气香、温性，不仅具有生津益气、养心安神的作用，还可健脾养胃、消炎止痛，尤其可用于辅助治疗血气不足、倦怠乏力等症状。药理学研究表明，红枣具有提高血清中蛋白含量、降低胆固醇、增加免疫力、抗过敏和抗癌等医药价值。大枣富含芦丁，能降低毛细血管脆性，常食可有效的降血脂、血糖、保护毛细血管，是作为治疗心脑血管及动脉硬化方面的极佳药引[22-24]。由于其具较高的经济价值和良好的生态效益，生长适应能力强、便于管理等特点，发展红枣产业增加了当地枣农收入，成为当地农民致富的一个新的支柱产业。自2001年中国加WTO以来，苹果、梨、柑橘和香蕉这四大传统水果业均面临着外国进口水果的威胁[25]，同时还受国内种植面积、气候变化、农业技术水平等多方面因素制约。因此，红枣作为中国特有的果品资源，具有丰富的品种资源及熟练的栽培技术，使其具有明显的优势，是当前大力发展红枣产业来应对全球化冲击的最佳时机。1.2红枣病害的研究现状1.2.1病害种类及其病原红枣为中国特色果树之一，海外对其鲜有研究。据外文文献报道，枣果实在生长过程中可被以下真菌侵染引起果实病害：Alternariachartarum,Aspergillusnanus,A.Parasiticus,Helminthospariumatroolivaceum,Phomahessarensis和Stemphyliommavalparadisiacum；在果实储藏期,可被Alternariabrassicicola,Phomasp,Curvalarialunat,Cladosporiumherbarum侵染；Fusariumsp,Nigrosporaoryzae,Epicoccumnigrum和Glomerellacingulata可引起枣果实腐烂；Entypellazizyphi,Hypoxylonhypomiltum,Patellariaatrata可侵染枣枝，引起病害[26-29]。国内，自1979年，韩金声[30]报道了红枣缩果病以来，又陆续报道了枣果炭疽病[31]、枣铁皮病[32]、枣黑斑病[33]、冬枣烂果病[34]、金丝小枣浆烂果病[35]、金丝小枣黑疔病[36]、金丝小枣褐皮病[36]和枣轮纹病[37]共九大类果实病害；在枣叶片上主要有枣锈病[38]、枣疯3 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究病[39]、枣叶斑病[40]。赵燕[8]报道了新疆红枣上的10种病害，其中果实病害包括黑斑病、软腐病、缩果病和裂果病四种。在众多植保工作者的努力下，虽然对红枣病原菌的鉴定和诊断上已取得了一些成绩，但对于枣果病害症状描述和病原菌的准确鉴定，仍具有较大的争议，不同的专家，在不同地区、不同时期及不同类型的果园中，最终确定的病原菌不尽相同，甚至差别很大，有的病害是由单一病原菌还是多种病原菌共同侵染引起的复合病害，迄今未形成统一的结论。红枣缩果病的病原目前认识各异。一说可能是由于生理缺素或病毒侵染引起。陈谟林[41]经过分离鉴定认为引起红枣缩果病的病原是一种细菌，命名为噬枣欧文氏菌，否定了缺素可导致缩果病。郑晓莲[42]的试验表明枣缩果病的病原菌有橄榄色盾壳霉菌(Coniothyriumsp.)、细交链孢菌(Alterzturiutenuis)，1种半知菌亚门真菌和1种细菌，并且单独接种或混合接种4种菌均可产生典型症状；康绍兰[43]鉴定出3种真菌，分别为细链孢菌(A.alteruata(Fr.)Keissler.)、毁灭茎点霉(PhomadestructivePlowr)和壳梭孢菌(Fusicoccumsp.)；徐祥彬[44]报道细链格孢菌(A.alteruata(Fr.)Keissler)、青霉菌(Peuicilliumexpausum)及芽枝孢菌(Cladosporiumteuuissimum)是山西枣缩果病的主要致病菌。赵燕[8]实验证明枣缩果病的病原菌包括短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、沙福芽孢杆菌（Bacillussafensis）。张萍[45]报道新疆巴州地区枣缩果病病原菌为链格孢菌（Alternariasp.）。二十一世纪初，林忠敏[33]研究发现了山西枣果实上出现的新病害，由细交链孢菌和茎点属真菌侵染所致，将其定名为枣果实黑斑病。李晓军[46]认为冬枣黑斑病是由黄单孢杆菌属细菌(Xanthomonassp.)和假单孢杆菌属(Pseudomonassp.)两种细菌侵染引起的。但季延平[47]分离到冬枣黑斑病病原菌为细极链格孢，这与林忠敏研究结果一致。宗淑萍[48]认为桑壳小圆孢菌(Coniothyriumfucsidulum)、仁果茎点霉(Phomapomirum)是冬枣黑点病的主要病原，向征[49]认为枣花和枣果黑斑病有相同的病原物，均为链格孢菌（A.alternata）。郭东起、刘晓琳[50,51]认为新疆红枣黑斑病的病原为链格孢菌（A.alternata）。常聚普[37]研究认为半知菌类的Macrophomakuwatsukai是枣软腐病病原。张立震[52]研究发现烂果病的主要病原菌为仁果囊孢壳菌(Physalosporaobtuse)。牛晓科[53]将河南灰4 新疆农业大学硕士学位论文枣的红点软腐病的病原鉴定为葡萄座腔菌属葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea(Moug.exFr.)Ces.etdeNot.）刘春琴[35]研究金丝小枣浆烂果病时，鉴定其病原菌为囊孢壳菌Physalosporaobtuse(Schw.)Cke.)，与张立震[52]的研究结果一致。1.2.2病害侵染循环途径针对红枣果实病害的病原分布、发生和侵染循环，郑晓莲、曲俭绪[54,55]对红枣缩果病和枣果黑腐病病原的越冬场所进行了研究，认为以链格孢菌为主的枣缩果病病原在枣树的枣吊、枣叶上越冬，树皮、枣枝和枣头以橄榄色盾壳菌为主，但在越冬部位不表现任何症状。李志清[56]认为落果、落叶等组织也是其主要越冬场所，而枣黑腐病病原在落果和枯枝上越冬。吴玉柱[57]对山东的冬枣黑斑病进行调查研究认为该病原菌一般越冬场位于枣树的芽鳞和皮痕中，以菌丝体形式越冬，次年春天产生分生孢子进行初侵染，康绍兰[58]对红枣果实病害的传播介体以及侵染途径进行了研究，认为田间害虫刺吸可加剧病害的发生，同时病原菌通过枣果面上的伤口(刺伤、机械伤)、皮孔和表皮侵入而使枣果染病。白剑宇[59]认为枣园的栽培管理和枣园的间作方式以及间作作物类型和品种类型也是影响发病程度的重要因素。1.2.3病害防治技术研究由于枣果实病原菌的侵染潜伏期长达2~3个月，8~9月中旬达发病盛期。试验研究和生产实践结果表明，在绿幼果期喷布杀菌剂，对预防和降低病果率具有极显著作用。苏安仁[60]研究发现，6月底~7月初，喷布1次1:2:200波尔多液，7月上旬以后，每隔半月喷1次200倍30%复方多菌灵、400~800倍50%轮纹宁或400倍80%大生M-45可湿性粉剂、600倍50%多菌灵、1500倍50%扑海因对防治枣僵烂果病有较好的作用，其中轮纹宁对冬枣烂果病和黑斑病均有显著的作用。王军[61]用生物农药抗菌新星(200亿孢子/g)500倍液于盛花期、花后10天和20天各喷一次，可将冬枣黑斑病病果率控制在4%以下，而同浓度的多菌灵处理的病果率却高达17%~25%。宋宏伟[62]试验结果表明，85%枣病克星是防治红枣缩果病的首选药剂，其次为大生M-45等。陈贻金[63]认为在7月份枣幼果期喷1次1500倍68.75%易保颗粒剂和波尔多液，8月份再喷2次2500~3000倍20.76%的万兴乳油，能将病果率控制在5%以下。用链霉素70~140单位/mL、卡那霉素140单位/mL、土霉素210单5 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究位/mL在8月上、中、下旬各喷以次，好果率会在90%以上。常聚普[37]研究发现，6月底~7月初，喷布1次70%甲基托布津(800~1000倍)等内吸杀菌剂，以后每隔半月与波尔多液交替喷布，再于8月雨季加入40%大生M-45600~800倍液，有显著保护和治疗枣轮纹病的作用。任秋萍[64]认为在幼果期至果实膨大期，喷施50%甲基托布津800倍液，共3次，对枣烂果病有较好效果。1.3本项目研究意义新疆因其独特的自然资源和广阔的耕地面积，使得新疆红枣产业蓬勃发展。随着新疆枣树栽培面积的扩大及种植模式的转变，病害发生情况不容乐观，尤以红枣果实病害为甚，其中红枣果实黑斑病是危害最为严重的病害，软腐病情也愈演愈烈，在雨水多的年份，病果率可达20%~30%，严重果园健果率不及40%。病害的发生不仅导致红枣产量下降，而且严重影响了红枣品质，大大降低了新疆红枣的商品价值和市场竞争力，而目前针对新疆枣果实黑斑病确有一些报道，但众议纷纷，对于枣软腐病尚未见相关报道，致使当前资料不能作为病害防治的权威参考，造成果农不能掌握病原菌的发生侵染规律，针对特定的靶标病原菌等因素进行适时防控，而盲目使用或超量使用农药的现象，这不但不能有效防治病害，还会造成农药的残留和环境的污染，若是不能及时有效地控制病害的发生和传播，新疆红枣产业的可持续发展将受到严重的影响。本研究通过对南疆红枣产区两种果实病害症状调查、病样采集、致病菌分离、回接证病及形态鉴定和分子验证，以明确两种病害的病原种类，在此基础上，通过病原菌的田间越冬场所调查，了解其侵染来源，同时采用抑菌圈比较、毒力测定和田间药效试验相结合的方法进行药剂筛选，以期筛选出针对两病的高效防病药剂。最终为有效防治当前新疆红枣黑斑病及软腐病提供理论指导及技术支持。1.4研究内容(1)对田间果实上的病害症状发展变化情况进行观察、记录；采用形态学鉴定、致病性测定及分子生物学测定相结合的方法对两种病害病原精准鉴定；6 新疆农业大学硕士学位论文(2)采用传统形态检测及分子检测两种方法，分别统计两种病原菌的分离频率，确定其主要越冬场所；(3)采用抑菌圈比较、毒力测定与田间药效试验相结合的方法，筛选高效防治两病药剂。1.5技术路线病害样品采集、分离与纯化形态学鉴定致病性测定分子生物学鉴定病原菌的确认病原菌分子检测技术体系建立病原菌越冬场所调查与检测室内药剂毒力测定田间药剂筛选试验高效防病药剂的确定7 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究第2章枣黑斑病及软腐病病原鉴定枣果实黑斑病和软腐病是新疆枣园中发生较为普遍且严重的两种果实病害，这两种病害的发生，致使新疆红枣产量下降且品质降低。当前针对这两种病害的相关报道较少，致病菌有什么，有几种，单一侵染还是复合侵染等问题，还没有明确的答案，造成枣农对枣黑斑病及软腐病的防治存在盲目性。明确两种果实病害的主要致病菌类别，确定防治靶标，解决生产中对病害及其病原模糊不清的认识，以便对症下药，有针对性地进行防治，对两病的高效防控及果农增收具有重要意义。2.1材料与方法2.1.1供试材料2014年9月于阿克苏地区依杆旗乡，阿克苏地区农业科技示范园，阿瓦提县多浪乡，阿瓦提县乌鲁却勒镇，温宿县红旗坡农场，农一师10团，农一师12团，皮山县固玛镇，皮山县农场，巴州且末县等红枣种植区17个果园进行红枣黑斑病及软腐病新鲜病果采集。2.1.2供试培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基[65](PSA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH=7.2；马铃薯蔗糖培养液[66](PSL)：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH=7.2；水琼脂培养基[67](WA)：琼脂20g，水1000mL，pH=7.2；营养琼脂培养基[68](NA)：牛肉浸膏粉3g、蛋白胨10g，氯化钠4g、琼脂粉13g，蒸馏水1000mL，pH=7.2。2.1.3供试仪器及试剂光学显微镜，电子分析天平，pHS-3C数字酸度计，超净工作台，微波炉，恒温培养箱，温度计，电磁炉，灭菌锅，无菌烘箱，冰箱，恒压恒流电泳仪，PCR仪，凝胶成8 新疆农业大学硕士学位论文像系统，离心机，无菌滤纸，解剖刀，接种环，三角瓶，培养皿（Φ=90mm），打孔器，移液器。无菌水，75%乙醇溶液，2%NaClO溶液，液氮（基因组DNA提取）。2.1.4病害症状及发病动态观察2014-2015年，对农一师阿克苏地区农业科技示范园，阿瓦提县多浪乡，阿瓦提县乌鲁却勒镇，和田皮山县等地的多个枣园枣黑斑病及枣软腐病的发生及危害情况进行了调查，对田间果实上的病害症状发展变化情况进行观察、记录和拍照。2.1.5病原菌的分离和纯化2.1.5.1病原菌的分离采用组织分离法[69]。用无菌水将采集的新鲜且具有典型病症的病果表面洗净，75%酒精擦拭2~3次，在超净工作台中晾干，去除病部表面果皮，在病健交界处挑取27mm3见方组织块，用2%NaClO溶液处理1min，再用无菌水彻底冲洗3遍，用灭菌滤纸将组织块吸干，置于无菌PSA平板上，放置在25℃恒温培养箱中进行培养，每24h观察培养基上的分离物菌落变化，并记录其种类及形状。2.1.5.2病原菌的纯化单孢分离法[70]。对部分孢子较大的真菌进行分离，在超净工作台中取一小块培养5d且带有充分产孢分离物的培养基，放置在无菌空试管中，加入适量无菌水，轻摇，将孢子菌悬液在4×10倍镜下镜检，将浓度调为每视野1个孢子左右。取100μL菌悬液，在WA平板上涂布，25℃环境下恒温培养12h，将涂布的WA平板放置于4×10倍镜下，找见并确保已经萌发孢子位于视野中央，调整光圈至最小，用解剖刀沿光圈切下琼脂块，接至PSA斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱中继续培养，保存备用。尖端菌丝挑取法[71]。对孢子较小的真菌分离物进行纯化，挑取不同形态的菌丝移至新鲜PSA平板上，重复3~4次以保证所得菌落为纯培养。平板划线法[72]。对细菌分离物进行纯化，用无菌接种环挑取细菌分离物，在NA平板培养基表面，通过分区划线的方法对其进行逐级稀释，每24h观察一次，待平板的划线区长出单一菌落，挑取，重复划线步骤3~4次。9 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究将纯化好的菌株转接至斜面培养基上，待长满整个斜面后放于4℃环境中保存备用。2.1.6致病性测定2.1.6.1孢子悬浮液的制备真菌孢子悬浮液的配置：将无菌水加入长满纯化后的真菌分离物平板上，轻摇，液体转至无菌空试管中，制成一定浓度的孢子悬浮液。细菌悬浮液的配置[73]：将无菌水加入在营养琼脂培养基中培养48h的细菌分离物平板上，用无菌接种环轻轻刮下菌苔，混匀，通过比浊管对比后，制成理想浓度菌液。2.1.6.2室内离体接种选取健康且大小均匀的枣果，75%酒精擦拭2~3次，无菌水洗涤干净后，在超净工作台内，无菌风吹干。用灭菌且蘸有真菌孢子液/细菌悬浮液的刀片划伤刺伤枣果，以蘸有无菌水的处理作为对照，每处理3重复，每重复8~10个果。25℃条件下培养，7d后统计发病率。2.1.6.3田间活体接种田间选取发病较轻的果园，随机选取健康枣果，用针刺法[74]和喷雾法[75]进行回接，接种后，用灭菌纱布覆盖，保湿，每处理设3重复，每重复8~10个果，7d后观察处理枣果果发病情况并记录发病果树。若所接枣果出现和田间自然发病一致或类似的症状，应用柯赫式法则，对发病后的枣果再次分离，方法同2.1.5.1，确定病原物。2.1.7病原菌形态学鉴定将所纯化的代表菌株接种至PSA平板上，5d后观察菌落形态。在显微镜下，仔细观察孢子形态，对其大小、横纵隔数、喙的长宽进行描述，并记录。根据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》相关分册及相关文献、专著等进行形态鉴定[76]。10 新疆农业大学硕士学位论文2.1.8病原菌分子生物学鉴定2.1.8.1菌丝体收集与培养将完成形态鉴定的菌株分别用接种环挑取少量菌丝，接到200mL蔗糖培养液中，放置25℃恒温摇床振荡培养72h，将菌丝组织用纱布过滤后，无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干，40℃烘干，-20℃保存备用。2.1.8.2基因组DNA的提取用植物基因组快速提取试剂盒提取已收集菌丝的基因组DNA[77]。提取步骤：取适量菌丝，加液氮充分研磨30mg粉末，装入1.5mL离心管65℃预热GP1加入0.1%巯基乙醇加入700μL65℃预热缓冲液GP1混匀65℃，水浴30min加入700μL氯仿，充分混匀12000r离心5min取上清，加入700μLGP2缓冲液，混匀12000r离心5min混匀液体转入吸附柱CB312000r离心30s向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD12000r离心30s向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW12000r离心30s向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW12000r离心30s倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中12000r离心2min吸附柱CB3置于室温放置15分钟，晾干向吸附柱CB3吸附膜中央加70μL洗脱缓冲液TE12000r离心2min离心得到的溶液加入吸附柱CB3中12000r离心2min收集DNA11 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究2.1.8.3PCR反应及扩增根据David[78]的报道，本试验对枣黑斑病利用O'Donnell[79-80]所设计引物EF1-728F(5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')和EF1-986R(5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3')对转录延长因子EF-1α[81-83]进行扩增；对枣软腐病用真菌通用引物ITS1(3'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5')和ITS4(3'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5')[84-85]进行扩增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。EF1-α和rDNA-ITS两个基因的PCR反应体系相同，均为：反应总体积为25.0μL，含MgCl2的10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs1.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，10.0μmol/L上游引物1.0μL，10.0μmol/L下游引物1.0μL，加ddH2O补至25.0μL。PCR扩增条件：EF-1α基因扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，设置35个循环，最后72℃延伸10min；ITS基因扩增程序均为ITS基因PCR扩增反应程序为94℃预变性3min，94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸l0min。2.1.8.4序列分析及数据处理将PCR产物与溴酚蓝上样缓冲液混合充分，琼脂糖凝胶电泳27min后，染色，置于凝胶成像仪中进行检测，观察条带情况。将确认出现条带的PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序后的核酸序列在数据库GenBank中BLAST搜索相关序列，用MEGA5.0软件进行比对并用邻接法构建系统发育树。2.2结果与分析2.2.1枣黑斑病的病原鉴定2.2.1.1病害症状及病情动态观察枣黑斑病分为大斑和小斑两种。在枣果白熟期，田间树势较弱的植株上极易感染小斑点黑斑病，斑点圆形，多且分布不均，后期斑点边缘易开裂。大斑点黑斑病一般在枣果着色期开始发生，病害侵染初期一般于果实顶端或尾部出现深褐色的小圆点，后期扩12 新疆农业大学硕士学位论文展为圆形或不规则黑褐色大斑点，病斑平滑或皱缩且稍有凸起，病斑表皮坚硬，皮下果肉组织完整呈黄褐色，部分组织有墨绿色菌丝分布。枣果易脱落，味苦，甚至不堪食用。该病一般在幼果期基本不发病，枣果白熟期至着色期(8月下旬)部分植株枣果病情加重，在成熟期及采收前期(9、10月份)，降雨增多，病情因空气湿度变化等原因而急剧增大。2.2.1.2病原菌分离结果在17个枣园采集枣黑斑病果实样品51份，经分离得到180个分离物，依其培养特征及菌落形态，初步认定为7种不同分离物，包括真菌6种，细菌1种（表2-1）。其中，链格孢属137个，靑霉属12个，根霉属13个，黑曲霉菌8个，黄曲霉菌6个，镰刀菌菌2个，细菌2个。分离频率最高的是链格孢属为76.11%，其余五种真菌及一种细菌的分离频率均处于10%以下，可以看出引起枣黑斑病的主要病原微生物为链格孢属真菌。表2-1红枣果实黑斑病样品采集与分离结果Tab.2-1TheresultofcollectionandseparationpathogensfromfruitblackspotofZizvphusjujuba采样地点枣园数样品数分离块数链格孢属其它NumberofSamplesSeperrationAlternariaTheSiteorchardsnumbernumbersppothers阿克苏市依杆旗乡1374阿克苏地区农业科技示范园1391阿瓦提县多浪乡392511阿瓦提县乌鲁却勒镇412328温宿县红旗坡农场1391农一师10团26155农一师12团26174皮山县固玛镇1383皮山县农场1375巴州且末县1381总数175115313743分离频率---76.1%23.9%2.2.1.3分离物回接证病（1）室内离体接种：将所分离的7种分离物代表菌株接至田间所采的健康红枣上，经试验发现：链格孢属真菌的致病力较强，所接种的枣果发病率为82.2%；根霉也可致病，发病率为79%，但链格孢菌所接枣果发病症状与田间黑斑病症状相同而根霉所接枣果则不同；其余5种菌株均未表现出症状。对链格孢菌接种发病后的病斑进行再分离，经形态鉴定，与原来所接菌株一致，再次证实接种的链格孢菌为枣果实黑斑病的致病菌。13 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究（2）田间活体接种：通过针刺和喷雾两种方法将7种分离物代表菌株在田间枣果上进行回接，可以看到，链格孢菌采用两种方法都可以致病，且与自然发病枣果症状相同，但针刺回接法的发病率远高于喷雾法，针刺法为84%，喷雾法为22.6%。由于田间接种环境条件与自然发病环境相同，应用柯赫氏法则，对接种发病的枣果发病部位组织分离，分离物与所接链格孢菌一致，同样认为链格孢菌是新疆枣果实黑斑病的病原菌。aabbbc图2-1红枣黑斑病菌室内离体接种与田间接种发病症状Fig.2-1Smptomsofindoorandoutsideinoculationwithblackspotpathogenofjujuba注：a：室内离体接种发病症状；b、c：田间活体接种发病症状Note:a:Symptomsofindoorvitroinoculation;b.c:Symptomsofoutsidevitroinoculation2.2.1.4病原菌的形态鉴定根据不同时间，不同地点选取三个不同链格孢菌株（AGH1409，WGH1410，HGH1410），PSA培养基上三菌株菌落形态基本相同，初期为灰白色，呈放射状发散扩展，后期呈黑褐色至黑色，呈圆形，边缘较为整齐，中间具有墨绿色至深灰色轮纹；菌落背面呈黄褐色至深褐色。气生菌丝发达，前期菌丝颜色为白色，后期逐渐变深至灰黑色。通过镜检产孢表型，孢子链主链不明显，分支丰富，有多个侧链，侧链短，含5~8个孢子，分生孢子呈倒棒状或倒梨形，孢身15.8~29.4×4.0~11.3μm，平均23.1×7.7μm，14 新疆农业大学硕士学位论文具有短柱状喙，1.2~4.7×1.1~3.4μm，平均2.4×1.9μm，主横膈膜2~6个，纵隔膜0~3个。根据病原菌的菌落形态特征和产孢表型，根据《真菌鉴定手册》进行检索，初步鉴定后认为引起枣果实黑斑病的病原为A.alternata。abcd图2-2链格孢菌（A.alternata）形态学特征Fig.2-2ThemorphologicalcharacteristicsofA.alternata注：a：分生孢子；b：产孢结构；c：菌落正面形态；d：菌落背面形态Note:a:Conidia;b:Sporestructure;c:Colonyobversemorphology;d:ColonyTergalmorphology2.2.1.5分子生物学鉴定以提取的AGH1409，WGH1410，HGH1410的DNA为模板，利用设计合成的EF-1α引物对进行PCR扩增，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，均获得254bp大小的预期片段（图2-3）。MⅠⅡⅢIV254bp图2-3链格孢3个菌株EF-1α序列PCR扩增结果Fig.2-3ThePCRamplificationproductsofEF-1αsequenceof3Alternaria.sppstrains注：I代表AGH1409，II代表WGH1410，III代表HGH1410，IV代表CK，M代表MakerNote:IrepresentAGH1409,IIrepresentWGH1410,IIIrepresentHGH1410,IVrepresentCK,MrepresentMaker15 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，并将所测序列利用NCBI中Blast检测程序进行相似性检索，运用软件MEGA5.0，采用邻接法将菌株AGH1409基因序列（GenBank中的登录号：KP763645）进行同源性分析，构建系统发育树。AGH1409与Alternariaalternata(EU139384、KJ008710、KJ638247、KJ830919、KP763645、KF889267、KJ008708)序列的相似性极高，同源性为99%以上。基于EF-1α序列构建的系统发育树可知，供试链格孢菌株被分为8组，AGH1409（KP763645）与A.alternata亲缘关系较近，而与A.brassicae,A.ellipsoidea,A.juxtiseptata,A.obclavata,A.intercepta,A.soliaridae,A.alternantherae亲缘关系较远（图2-4），进一步确切证明新疆枣果实黑斑病的致病菌是链格孢菌（A.alternata）。图2-4代表菌株基于EF-1α序列构建的系统发育树Fig.2-4PhylogenetictreebasedonEF-1αsequencesofrepresentativeisolate2.2.2枣软腐病的病原鉴定2.2.2.1病害症状及病情动态观察病原于8月上、中旬开始侵染枣果，8月下旬处于侵染高发期，9月中、下旬达到田间发病盛期。病害发病初期果面出现1至多个浅黄色斑点，随着时间的变化，降雨量的增多，田间病情迅速加剧，一般3~4d病斑扩至整个果面，无轮纹，染病组织一般呈土黄色至橙色，病果整体变软，皮下组织腐烂并散发出酒糟味，采收贮藏后，病果继续腐烂，直至果肉组织消失（图2-5）。16 新疆农业大学硕士学位论文ab图2-5枣软腐病症状Fig.2-5SoftrotSymptomsofofjujubafruits2.2.2.2病原菌分离结果在17个枣园采集枣软腐病51个病果分离获得198个分离物，依其培养特征及菌落形态，初步认定为6种不同分离物，包括5种真菌，1种细菌（表2-2）。其中根霉属132个，链格孢属38个，靑霉属8个，黑曲霉菌6个，黄曲霉菌2个，细菌12个。分离频率最高的是根霉属为66.67%，链格孢分离频率为19.19%，其余三种真菌和一种细菌的分离频率亦均在10%以下，共计14.14%。表2-2红枣果实软腐病样品采集与分离结果Tab.2-2TheresultofcollectionandseparationpathogensfromfruitsoftrotofZizvphusjujuba采样地点枣园数样品数分离块数根霉菌链格孢菌其它OrchardsSamplesSeperationRhizopusAlternariaTheSitenumbernumbernumbersppsppothers阿克苏市依杆旗乡139832阿克苏地区农业科技示范园139631阿瓦提县多浪乡39272387阿瓦提县乌鲁却勒镇4123630124温宿县红旗坡农场139923农一师10团26181564农一师12团26181722皮山县固玛镇139901皮山县农场139811巴州且末县139713总数17511531323828分离频率---66.67%19.19%14.14%17 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究2.2.2.3分离物致病性回接测定结果⑴室内离体接种：将6种分离物代表菌株接种于田间所采的健康且新鲜枣果上，经试验发现：接种根霉菌的枣果发病率为63.3%；接种链格孢菌的枣果也发病，但症状明显与接种根霉菌的不同，其余4种菌株均未表现出症状。对根霉菌接种发病后的病斑进行再分离，经形态学鉴定，与原接种菌一致，证实接种的根霉菌为枣软腐病的致病菌。⑵田间活体接种：通过针刺(有伤)和喷雾(无伤)两种方法将6种分离物代表菌株在田间枣果上进行回接，可以看到，根霉菌采用两种方法都可以致病，且与自然发病枣果症状相同，但针刺回接法的发病率远高于喷雾法，针刺法为82.3%，喷雾法为7.8%。与黑斑病方法一样，采用柯赫氏法则进行再分离，再次证实接种的根霉菌为新疆红枣果实软腐病的致病菌。ab图2-6红枣软腐病菌室内离体接种与田间活体接种发病症状Fig.2-6Smptomsofindoorandoutsideinoculationwithsoftrotpathogenofjujuba注：a:室内离体接种发病症状；b:田间活体接种发病症状Note:a:Symptomsofindoorvitroinoculation;b.c:Symptomsofoutsidevitroinoculation2.2.2.4病原菌形态学鉴定菌丝生长速度较快，在PDA培养基上培养5d后，菌落可长满整个培养皿，初期呈白色，后转变成灰白色，两周后呈灰黑色；菌丝上产生孢囊梗,孢囊梗束基部形成假根,假根发达，较多分枝，形成匍匐丝，每束2~4株，长达490~2000×11~18μm，顶部膨大形成囊轴和孢子囊；囊轴球形，淡褐色，直径(20)50~160(200)μm；孢囊孢子椭圆形，黄灰色，直径5~10μm。孢子囊形大小为(60)170~230(250)μm，初期呈白色，成熟后黑色，壁光滑，多于成熟时自行溶解。18 新疆农业大学硕士学位论文abc图2-7米根霉菌（Rhizopusoryzae）菌形态学特征Fig.2-7ThemorphologicalcharacteristicsofRhizopusoryzae注：a：菌丝体；b：孢子囊及孢囊梗；c：菌落形态Note:a:Mycelium;b:SporangiumandSporangiophore;c:Colonymorphology2.2.2.5分子生物学鉴定以提取的ARF1409、HRF1410、NYT2-1的DNA为模板，利用ITS通用引物(ITS1、ITS4)进行PCR扩增，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，均获得580bp大小的预期片段。对PCR产物进行测序，结果得到3条大小均为582bp的序列片段。MIIIIIIIV580bp图2-8根霉3菌株ITS序列PCR扩增结果Fig.2-8ThePCRamplificationproductsofITSsequenceof3Alternaria.sppstrains注：I代表ARF1409，II代表HRF1410，III代表NYT2-1，IV代表CK，M代表MakerNote:IrepresentARF1409,IIrepresentHRF1410,IIIrepresentNYT2-1,IVrepresentCK,MrepresentMaker将测序得到的基因序列在GenBank中进行同源性比较(图2-8)，结果显示与其同源性较高的序列菌株均为根霉属真菌，同源率达到90%-100%。其中同源性最高的5个菌株均为根霉属米根霉。运用软件MEGA5.0，采用邻接法将菌株ARF1409的基因序列进行同源性分析，构建系统发育树。结果所测定的菌株序列与米根霉Rhizopusoryzae(KT152017、KR085968、KP881427、KP784372、KP764906)遗传距离最近，同源19 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究性达100%，与Rhizopuspusillus亲缘关系较远，证明引起新疆枣软腐病致病菌为米根霉。RhizopusoryzaeKT152017ARF1409RhizopusoryzaeKR085968RhizopusoryzaeKP881427100RhizopusoryzaeKP784372RhizopusoryzaeKP764906RhizopuspusillusAF113433RhizopuspusillusAF1134340.2图2-9代表菌株基于EF-1α序列构建的系统发育树Fig.2-9PhylogenetictreebasedonEF-1αsequencesofrepresentativeisolates2.3小结与讨论在黑斑病研究中，不同地区，不同研究者所鉴定的病原也不尽相同。李晓军[46]研究认为冬枣黑斑病由黄单胞杆菌属（Xanthomonassp.）和假单孢杆菌属（Pseudomonassp.）共同侵染引起的细菌病害；王军[61]研究发现山东冬枣黑斑病的病原为细链格孢（A.alternata(Fr)keissler）；王兰[86]将新疆红枣黑斑病病原鉴定为链格孢（A.alternata）；吴玉柱、李夏鸣[57,87]报道冬枣黑斑病的致病菌为细极链格孢（A.tenuissima）。本研究通过形态学观察、致病性回接及分子生物学鉴定三种方法相结合认为，新疆红枣黑斑病的病原为链格孢属链格孢（A.alternata），这与王兰的鉴定结果一致。在枣软腐病的病原研究中，红枣软腐病原菌鉴定为根霉属米根霉（Rhizopusoryzae），这在国内外尚未见报道，属首次发现。牛小科[54]认为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea(Moug.exFr.)Ces.etdeNot）是引起灰枣红点软腐病的病原，况红玲[88]认为除葡萄座腔菌外，尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）也可以侵染，引起红枣软腐病，这与本文研究结果存在一定出入。在真菌研究中，致病菌种类的鉴定大多依据菌落形态、分生孢子形态及子实体的类别等来进行鉴定，但是真菌的种类很多、形态特征也极为复杂、分布较广，而且其形态20 新疆农业大学硕士学位论文特征比较容易受到其培养条件和其它因素影响而不稳定，因此给鉴定工作带来了很多困难。真菌的DNA碱基组成遗传稳定性较高，并且一般与环境因素无关，在它的任何生长阶段，利用极少量基因组DNA就可以完成鉴定工作。所以，分子生物学鉴定与形态学鉴定相结合的方法将会大大增加病原菌鉴定结果的可靠性。例如，通过对链格孢EF-1α转录延长因子基因序列及米根霉rDNA-ITS序列分析和比对，枣黑斑病分离物菌株与链格孢属链格孢，枣软腐病的分离物菌株与根霉属米根霉具有极高的同源性，所以可以确定新疆红枣黑斑病病原鉴定为链格孢属链格孢（A.alternata），枣软腐病病原鉴定为根霉属米根霉（R.oryzae）。本试验不仅通过形态学和分子生物学相结合的方法确定新疆红枣黑斑病致病菌为链格孢属链格孢菌，枣软腐病的致病菌为根霉属米根霉，并且在致病性试验中，两种病原菌在室内离体接种和田间活体接种，均可使健康枣果染病，且症状与田间自然发病表现一致，此外，针刺法接种的发病率远远大于喷雾法接种，田间树势较弱的枣果实上，两病发病程度远大于健康植株，说明枣果在亚健康或枣果表面有伤口时极易感病,也可看出田间环境是病害发生流行的关键因素，所以应选择田间活体有伤接种的发病率作为致病性测定的可靠数据。通过对新疆红枣果实两种病害致病菌的分离与鉴定，明晰了引起这两种病害的致病菌，为新疆两种枣果实病害的防治提供理论指导，但若在田间进行防治时，还需要对病原菌的越冬场所、侵染时机、影响发病因素等病害规律，以及高效防病药剂等方面进行系统的研究。21 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究第3章两种果实病害病原越冬场所调查研究枣黑斑病及软腐病是新疆红枣近年来普遍发生的严重病害，病害的发生严重影响枣果的产量及品质等级，在明确两种病害的病原菌基础上，对两种枣果实病害的病原越冬场所进行调查，为后续病害规律及防治研究提供理论依据。3.1材料与方法3.1.1供试材料供试样品：2014年12月于阿瓦提县多浪乡，皮山县农场，温宿县红旗坡农场三点取根土、落叶、落果、枯枝和树皮五个部分样本。供试菌株：试验所用菌株为新疆农业大学植物病理实验室分离保存菌株。黑斑病菌株为链格孢（A.alternata）AGH1409，WGH1410和HGH1410，枣软腐病菌株为米根霉（R.oryzae）ARF1409、HRF1410和NYT2-1。3.1.2供试培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH=7.2，121℃高压灭菌30min。马铃薯蔗糖培养液（PSL）：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL，pH=7.2，121℃高压灭菌30min。3.1.3仪器及试剂光学显微镜，电子分析天平，pHS-3C数字酸度计，无菌操作台，微波炉，恒温光照振荡培养箱，温度计，电磁炉，灭菌锅，无菌烘箱，冰箱，恒压恒流电泳仪，PCR仪，凝胶成像系统，12000rpm离心机，无菌滤纸，解剖剪，解剖刀，接种针，三角瓶，培养皿（Φ=90mm），打孔器，移液器。75%乙醇溶液，2%次氯酸钠溶液，液氮（基因组提取）。22 新疆农业大学硕士学位论文3.1.4菌丝体的培养与收集将纯化保存鉴定后的菌株转接至PSA平板上培养72h后，用打孔器（Φ=5mm）取直径为0.5cm的菌饼放入装有100mL灭菌PSL培养液的三角瓶中，25℃，黑白交替振荡培养72h，菌丝体灭菌纱布过滤，收集后分装，-20℃保存备用。3.1.5基因组DNA提取与PCR扩增利用植物基因组提取试剂盒提取，具体步骤同2.1.8.2(根土总DNA提取用残渣法)。扩增体系及扩增程序同2.1.8.3（引物不同，反应退火温度不同）。3.1.6特异性引物设计与验证引物设计一般原则及注意事项如下：①引物一般长度为18~24bp；②引物序列中GC含量范围以40%~60%为宜，上下引物序列中GC含量差异越小越好；③引物在模板中无错配，避免多于4个碱基互补错配；④避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构。设计引物时需根据以上原则，合成合适的引物[89-92]。通过分子鉴定所得菌株序列，运用软件Primer5分别设计了两种果实病害的特异性引物。用特异性引物对红枣黑斑病病原真菌基因组DNA进行PCR扩增，结果只在以枣黑斑病原菌基因组DNA为模板的体系有特异性条带，其余阳性对照菌株未显示特异性条带；用特异性引物对红枣软腐病病原真菌基因组DNA进行PCR扩增，结果只在以枣软腐病病原菌基因组DNA为模板的体系有特异性条带，其余阳性对照菌株未显示特异性条带。3.1.7退火温度的优化对两种病害的致病菌，使用各自的特异性引物，对供试病原菌菌株的基因组DNA模板（10ng/μL）进行PCR扩增，电泳检测。梯度PCR优化退火温度，确定最佳退火温度。3.1.8特异性引物灵敏度检测利用核酸定量仪测定所提病原菌DNA的浓度及OD值，用无菌水将模板逐级稀释到5ng/μL、3ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL，用特异性引物进行PCR扩增，琼23 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究脂糖凝胶电泳，根据出现特异性条带最低模板浓度确定检测的灵敏度。3.1.9病原越冬场所检测3.1.9.1传统分离鉴定法采用传统组织分离法[69]，对在3地点所采集的根土、落叶、落果、枯枝和树皮五部位样品，进行分离培养，待菌落形成以后，根据菌落形态特征予以鉴定，并根据鉴定结果来统计所采集各部位样品的致病菌带菌频率，进而了解枣树两种果实病害致病菌在田间主要的越冬场所。3.1.9.1分子检测法将冬季采集的根土、落叶、落果、枯枝和树皮五部位样品分别进行总DNA提取，利用所设计的两种病害病原菌各自的特异性引物对各部位总DNA模板进行特异性PCR扩增，反应完成后，对其进行电泳检测。依照分子检测结果来分析各部位样品中的致病菌检出频率，从而确定枣树两种果实病害致病菌田间主要越冬场所。3.2结果与分析3.2.1引物筛选与特异性验证经验证表明，设计的引物对均具有良好的特异性。枣黑斑病的扩增产物片段长度为194bp，枣软腐病的扩增产物片段长度为439bp。链格孢特异性引物对：Alt1R：5'-CTGTGGCCAGAATGGGGAAA-3'Alt1F：5'-CATCTATCTTCGCGGCCTGT-3'米根霉特异性引物对：Rh1R：5'-TCAGACTGGTCATGGGTAGA-3'Rh1F：5'-TACTTTACTTCCTGGGCGAAC-3'分别应用各自特异性引物对两种病原菌基因组DNA进行PCR扩增（图3-1），结果显示：枣黑斑病只在黑斑病菌基因组DNA为模板的反应体系有194bp的特异性条带，而靑霉菌，黄曲霉菌，镰刀菌，米根霉菌，细极链格孢菌均未显示特异性条带；枣软腐病只在软腐病菌基因组DNA为模板的反应体系有439bp特异性条带，其余菌株DNA模板扩增产物中均未检测到特异性条带，从而更加精准的验证了引物的特异性。24 新疆农业大学硕士学位论文MⅠⅡⅢⅣⅤⅥMⅠⅡⅢⅣⅤⅥ2000bp439bp194bpab图3-1两种病原菌的引物特异性验证结果Fig.3-1Theverificationresultofspecificprimersoftwokindsofpathogens注：a:枣黑斑病特异性引物PCR扩增图，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别为链格孢菌、镰刀菌、靑霉菌、细极链格孢、黑曲霉菌和根霉菌的PCR扩增产物，M代表Maker（2000bp）；b：枣软腐病特异性引物PCR扩增图，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别为根霉菌、镰刀菌、靑霉菌、细极链格孢、黑曲霉菌和链格孢菌的PCR扩增产物，M代表Maker（100bp）3.2.2退火温度的优化ⅫⅪⅩⅨⅧⅦMⅥⅤⅣⅢⅡⅠM2000bp194bpaⅫⅪⅩⅨⅧⅦMⅥⅤⅣⅢⅡⅠM2000bp439bpb图3-2PCR扩增反应中退火温度优化结果Fig.3-2TheresultofannealingtemperatureoptimizationinPCRamplifiedreaction注：a:黑斑病原菌特异性引物退火温度优化；b:软腐病原菌特异性引物退火温度优化。Ⅰ～Ⅻ分别为52℃，52.2℃，52.8℃，53.7℃，54.8℃，56.1℃，57.4℃，58.7℃，59.9℃，60.8℃，61.5℃，62℃，M代表Maker25 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究设计退火温度梯度进行PCR扩增。结果表明：枣黑斑病菌优化后的退火温度在56℃；而软腐病菌优化后的退火温度在58℃时的条带显示最为清晰且稳定性好（图3-2）。其最优PCR反应体系为：总体积为25μL，含MgCl2的10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs2.0μL，10μmol/L上游引物1.0μL，10μmol/L下游引物1.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O补至25μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度52℃~62℃（特异性引物不同，Tm值不同）,退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。3.2.3特异性引物的灵敏度检测将两种病原菌的模板DNA分别稀释至5ng/μL、3ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL五种终浓度。对不同浓度病样组织总DNA进行PCR扩增，结果表明，黑斑病菌在总DNA浓度为0.5ng/uL以上时，模板可扩增出特异性条带；枣软腐病菌在0.1ng/uL以上时，模板也可扩增出特异性条带（图3-3）。特异性引物灵敏度较高，因此，可将其用来精准检测两种果实病害致病菌田间越冬场所。ⅠⅡⅢⅣⅤMⅠⅡⅢⅣⅤM2000bp2000bp194bp439bpab图3-3两种特异性引物的灵敏度检测结果Fig.3-3Thedetectionresultofsensitivityoftwokindsofspecificprimers注：a:黑斑病原菌特异性引物灵敏度检测，b：软腐病原菌特异性引物灵敏度检测；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别代表模板DNA浓度为5ng/μL、3ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL，M代表Maker(2000bp)3.2.4病原越冬场所检测3.2.4.1传统分离鉴定法检测结果针对两种果实病害，采用传统分离与形态学鉴定对所采集各部位样品带菌率进行检测，结果表明，不同地点，不同部位，病原菌分离频率有差异。由表3-1可知：落叶中的枣黑斑病病原菌分离频率最高，为77.8%，落果次之，为66.7%，树皮部位的病原菌分离频率最低，为22.2%，土壤及枯枝中病原菌分离频率均为44.4%，初步认为落叶及26 新疆农业大学硕士学位论文落果为枣黑斑病病原菌的主要越冬场所。表3-1传统分离鉴定法对红枣黑斑病病原菌在田间五部位中带菌率检测Tab.3-1Detectingblackspotpathogeninfectionrateoffivepositionsinfieldbytraditionalmethodofisolationandidentification部位阿瓦提多浪乡红旗坡农场皮山县农场分离频率PositionⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢIsolationfrequency根土root-soil+---+--++44.40%落叶deciduous+++-+++-+77.80%残果fruitdrop--+-+++++66.70%枯枝deadwood++-+-+---44.40%树皮bark--+---+--22.20%注：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别表示各地点的三个重复；“+”代表“有”，“-”代表“无”。Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲrepresent3repeatsofeachpointrespectively;“+”represent“Exist”,“–”represent“nix”对于枣软腐病，各部位均能分离出米根霉菌，但落叶中病原菌分离频率最高，为77.8%，其次为落果，病原菌分离频率为44.4%，其余三部位病原菌分离频率均为33.3%（表3-2）。枣软腐病原菌在五个部位均可越冬，但落叶为其主要越冬场所。表3-2传统分离鉴定法对红枣软腐病病原菌在田间五部位中带菌率检测Tab.3-2Detectingsoftrotpathogeninfectionratebytraditionalmethodofisolationandidentification部位阿瓦提多浪乡红旗坡农场皮山县农场分离频率PositionⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢIsolationfrequency根土root-soil--+--++--33.30%落叶deciduous++-+++++-77.80%落果fruitdrop+++-+----44.40%枯枝deadwood-++-+----33.30%树皮bark--+--+--+33.30%注：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别代表各地点的三个重复；“+”代表“有”，“-”代表“无”。Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲrepresent3repeatsofeachpointrespectively.“+”represent“Exist”,“–”represent“nix”3.2.4.2分子检测结果将所采集的根土、落叶、落果、枯枝及树皮五部份样品分别进行总DNA提取，利用上述各自的特异性引物对各部位总DNA模板进行特异性PCR扩增，反应完成后，对其进行电泳检测。检测结果表明：落叶中的枣黑斑病病原菌检出频率最高，为88.9%，其次为落果及根土，同为77.8%，枯枝及树上枝中也存在致病菌，检出频率为66.7%，落叶、落果及根土为其主要越冬场所。27 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究表3-3分子检测法对红枣黑斑病病原菌在田间五部位中带菌率检测Table3-3Detectingblackspotpathogeninfectionrateoffivepositionsinfieldbythemethodofmoleculerbiolog部位阿瓦提多浪乡红旗坡农场皮山县农场检出频率PositionⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢDetectionfrequency根土root-soil+++-+-+++77.80%落叶deciduous+++++++-+88.90%残果fruitdrop+--++++++77.80%枯枝deadwood++++-+--+66.70%树皮bark-++--++--44.40%注：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别代表各地点的三个重复；“+”代表“有”，“-”代表“无”。Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲrepresent3repeatsofeachpointrespectively.“+”represent“Exist”,“–”represent“nix”M12345678M9101112131415162000bp194bp图3-4多浪乡枣黑斑病病原菌在田间五部位中带菌率检测结果Fig.3-4TheresultofdetectionforjujubeblackspotpathogeninfectionrateoffivepositionsinfieldofDuolangtownship注：1代表阴性对照（CK），2、3、4、5、6分别为地点一的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，7、8、9、10、11分别为地点二的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，12、13、14、15、16分别为地点三的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，M代表Maker(2000bp)对于枣软腐病，落叶中病原菌分离频率最高，约为100%，其次为根土，病原菌分离频率约为88.9%，枯枝中的致病菌带菌率最小，约为55.6%，落叶为其主要越冬场所。表3-4分子检测法对红枣软腐病病原菌在田间五部位中带菌率检测Tab.3-4Detectingjujubesoftrotpathogeninfectionrateoffivepositionsinfieldbythemethodofmoleculerbiology部位阿瓦提多浪乡红旗坡农场皮山县农场检出频率PositionⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢDetectionfrequency根土root-soil++++-++++88.90%落叶deciduous+++++++++100.00%残果fruitdrop+++++--++77.80%枯枝deadwood+++-+---+55.60%树皮bark+++--++-+66.70%注：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别代表各地点的三个重复；“+”代表“有”，“-”代表“无”。Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲrepresent3repeatsofeachpointrespectively.“+”represent“Exist”,“–”represent“nix”28 新疆农业大学硕士学位论文M12345678M9101112131415162000bp439bp图3-5多浪乡枣软腐病病原菌在田间五部位中带菌率检测结果Fig.3-5TheresultofdetectionforjujubesoftrotpathogeninfectionrateoffivepositionsinfieldofDuolangtownship注：1代表阳性对照（Rhizopusoryzae），2、3、4、5、6分别为地点一的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，7、8、9、10、11分别为地点二的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，12、13、14、15、16分别为地点三的根土、落叶、残果、枯枝和树皮的总DNA，M代表Maker(2000bp)3.3小结与讨论对于两种枣果实病害，致病菌在田间根土、落叶、落果、枯枝及树皮五个场所均可越冬，但落叶中两种病害的致病菌检出率均为最高，说明落叶为两种果实病害的致病菌田间主要越冬场所。传统分离鉴定检测方法与分子检测方法均可检出各部位病原菌，从而确定其越冬场所，但分子检测方法与传统分离鉴定检测法相比，其检测速度快，检出率较高，通过试验可以看出，当植物组织内带菌量极少时，都可以检测出来，可以精确检测，而传统分离鉴定检测法，却不能实现精确检测，且存在操作复杂，人为因素影响较大，培养周期长，易污染等问题。在病害侵染循环方面，虽已调查了两种病害病原菌越冬场所，但还需开展病原菌的传播途径和侵染循环途径等方面的研究。29 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究第4章两种果实病害的防治药剂筛选枣黑斑病及枣软腐病直接危害枣果实，造成果实苦涩，腐烂，严重降低产量及品质，是新疆近年来普遍发生且日趋严重的两种果实病害，为了有效防治这两种枣果实病害，本试验以枣黑斑病的主要致病菌A.alternata的3个菌株AGH1409，WGH1410，HGH1410及枣软腐病致病菌R.oryzae的3个菌株ARF1409，HRF1410，NYT2-1为研究对象，采用抑菌圈试验法及毒力测定进行了室内防治药剂的初步筛选，在此基础上，选择杀菌效果较好的药剂在田间进行药剂防控试验，最终筛选出在大田生产中有效防治新疆红枣两种主要果实病害的杀菌剂，从而为有效防控新疆红枣果实病害提供技术支持。4.1材料与方法4.1.1供试地点与试验田概况新疆农业大学植物病理实验室、新疆阿克苏阿瓦提县多浪乡小拜什艾日克村枣黑斑病、枣软腐病重病区；试验田位于新疆阿克苏阿瓦提县多浪乡小拜什艾日克村，果园面积约为4hm2，海拔1077m，80°29.45'E，40°31.41'N，枣树品种为骏枣，树龄为8a，平均冠幅2.4m，枣树株行距1.5×2m。该园枣黑斑病及软腐病病情较为严重，发病高峰期两种病害的综合发病率超过50%。4.1.2供试菌株自阿克苏地区、和田地区采样，经新疆农业大学植物病理实验室分离，鉴定后保存的枣黑斑病菌株：AGH1409、HGH1410和WGH1410；枣软腐病菌株ARF1409、HRF1410、NYT2-1，各个菌株用于供试药剂的抑菌圈实验和毒力测定。4.1.3供试培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g；水1000mL。30 新疆农业大学硕士学位论文4.1.4供试药剂通过查阅文献，选择主要针对真菌病害的20种各类杀菌剂作为供试药剂，具体剂型，有效成分及生产厂家见表4-1。表4-1供试药剂、剂型及生产厂家Tab.4-1Suppliedtestfungicides,dosageformsandmanufacturers药剂剂型生产厂家FungicidesDosageformsManufacturers50%乙嘧酚乳油(EC)山东旭日化工有限公司40%氟硅唑乳油(EC)美国杜邦有限责任公司30%苯甲丙环唑乳油(EC)瑞士先正达公司10%氟嘧·氨基水剂(AS)郑州方正化工有限公司20%苯醚有机硅水剂(AS)郑州方正化工有限公司80%乙蒜素水剂(AS)河南科邦化工有限公司94%霜脲氰原药(TC)甘肃华实农业科技有限公司23.4%双炔酰菌胺悬浮剂(SC)瑞士先正达公司5%己唑醇微乳剂(ME)盐城利民农化有限公司50%氯溴异氰尿酸可溶性粉剂（SP）河南银田精细化工有限公司72%农用链霉素可溶性粉剂（SP）郑州方正化工有限公司40%多·福可湿性粉剂(WP)河北润达农药化工有限公司50%腐霉利可湿性粉剂(WP)陕西亿农高科药业有限公司3%中生菌素可湿性粉剂(WP)陕西标正作物科学有限公司72%霜脲锰锌可湿性粉剂(WP)甘肃华实农业科技有限公司80%多·福·福锌可湿性粉剂(WP)上海沪联生物药业股份有限公司15%多·福·辛菌胺可湿性粉剂(WP)郑州方正化工有限公司46%氢氧化铜水分散粒剂（WG）美国杜邦有限责任公司32.5%嘧菌酯水分散粒剂（WG）郑州方正化工有限公司37%苯醚甲环唑水分散粒剂（WG）山西绿洲农业科技有限责任公司4.1.5抑菌圈实验法将供试菌株在PSA平板培养基上活化，然后接种于PSA斜面培养基上培养72h后，在试管中加入3mL无菌水，轻摇，制成真菌孢子悬浮液备用。在超净工作台内，将PSA培养基分装至培养皿中(Φ=9cm，每皿10mL)制成平板培养基。取100μL上述病原孢子菌悬液，加入每培养皿，再用灭菌玻璃涂布器把所加菌液涂匀。待干燥后，在培养皿中央重叠放置2片灭菌圆形滤纸片(Φ=10mm)[93]。滤纸片中央加50μL药液(推荐使用浓度倍数中间值的200倍浓缩液)，每个处理重复3次，以加入无菌水的处理作为对照(CK)，置于25℃环境中培养，当对照处理菌落长满每个培养皿后，采用十字交叉法测量各药剂31 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究处理抑菌圈直径，统计抑菌半径，计算各药剂的抑菌率，运用SPSS20.0进行数据处理分析。4.1.6毒力测定试验采用菌丝生长速率法[94]将抑菌圈试验中抑菌效果较好的农药作为供试药剂，参考农药推荐使用浓度中间值及抑菌圈实验中的抑菌效果，对每种药剂设置从高到低7个药剂有效成份浓度。将各不同浓度药剂与熔化并冷却至45℃的PSA培养基按1:9比例配制成含药培养基，在超净工作台上分装至培养皿中(Φ=9cm，每培养皿9mL)；待冷凝且平板表面干燥后，用直径相同的打孔器打菌饼(Φ=0.5cm)，分别放置于每个处理培养基中间位置，菌丝面向下。按每种药剂每个浓度处理3培养皿(3次重复)，以不加农药处理作为对照(CK)，25℃恒温培养，当对照处理菌落长满每个培养皿后，采用十字交叉法测量各重复菌落直径，统计抑菌半径以及对照菌落半径与每一处理的菌落半径差值，据此计算各药剂对各菌株的抑菌率，根据抑菌率保留5个适当浓度；以药剂浓度(mg/L)的对数值为自变量，抑制率的机率值为因变量，运用SPSS20.0建立毒力回归方程，求出各药剂的抑菌中浓度(EC50)，比较抑菌效果。4.1.7田间药剂筛选将毒力测定所筛选出的杀菌剂作为田间药效试验供试药剂。在田间每种药剂喷施50米，随机选择连续3株枣树为一个重复，每种药剂设置3个重复，随机区组排列，每个处理共计九株，以无药清水处理作为对照，每种药剂处理之间设置保护行。每处理病情调查采用定株定数随机抽样调查法调查，记录每一株病果数以及病果病斑面积。统计各处理的病果率、病情指数，计算防治效果。枣果实病害危害程度分级标准见表4-2。试验于2015年8月下旬进行第一次喷药，选择无雨，风速小的天气，用背负手动喷雾器全株喷雾，确保上下均匀，喷药量以叶面聚集成滴为宜，共施药3次，每次间隔10d，且每次喷药后10d调查病情，共3次，统计防效。32 新疆农业大学硕士学位论文表4-2枣果实病害分级标准[62]Tab.4-2GradeconditionstandardsofJujubeblackspotandsoftrot危害等级级值分级依据GradeValueGradebasisⅠ0枣果无病斑；Ⅱ1枣果病斑面积占枣果总面积1/4以下；Ⅲ2枣果病斑面积占枣果总面积1/4～1/2；Ⅳ3枣果病斑面积占枣果总面积1/2～3/4；Ⅴ4枣果病斑面积占枣果总面积3/4以上4.2结果与分析4.2.1枣黑斑病的防治药剂筛选4.2.1.1杀菌剂的抑菌力比较20种杀菌剂对枣黑斑病3个菌株的抑菌圈大小比较表明：20种药剂对红枣黑斑病菌的抑菌力有显著差异。80%乙蒜素和50%氯溴异氰尿酸的抑菌力最强，平均抑菌半径在2.50cm以上，尤其80%乙蒜素，平均抑菌半径达3.80cm，接近培养皿半径；其次为40%多福、40%氟硅唑、50%乙嘧酚、72%霜脲锰锌、37%苯醚甲环唑、5%己唑醇6种药剂，平均抑菌半径在1.80cm~2.50cm之间；其余12种药剂也具有一定的抑菌作用，但抑菌力较低，平均抑菌半径均小于1.80cm(表4-3)。由此，筛选出80%乙蒜素、50%氯溴异氰尿酸、40%多福、40%氟硅唑、50%乙嘧酚、72%霜脲锰锌、37%苯醚甲环唑、5%己唑醇共8种杀菌剂进行后续试验。33 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究表4-320种杀菌剂对红枣黑斑病原的抑菌半径比较Tab.4-3Comparisonoftheantibacterialradiusforthe20kindsoffungicidesagainstjujubeblackspotpathogen药剂名称药剂浓度抑菌半径(cm)平均抑菌半径(cm)差异显著性(g/L)/(ml/L)AntibacterialradiusSignificanceFungicidesnameFungicidesAverageantibacterialofdifferenceI*IIIIIconcentrationradiusP=0.01/P=0.0580%乙蒜素1.603.933.783.683.80A/a**50%氯溴异氰尿酸1.353.053.731.232.67AB/b40%多·福0.221.622.672.482.26BC/bc40%氟硅唑0.702.072.272.032.12BCD/bcd50%乙嘧酚1.051.852.122.082.02BCD/bcd72%霜脲锰锌1.101.732.471.631.94BCD/bcd37%苯醚甲环唑2.202.101.302.321.91BCD/bcd5%己唑醇1.151.071.832.581.83BCD/bcde15%多·福·辛菌胺1.202.131.851.381.79BCDE/bcde32.5%嘧菌酯1.601.271.431.431.38BCDEF/bcdef30%苯甲丙环唑1.601.101.301.231.21BCDEF/bcdef3%中生菌素0.670.931.150.730.94CDEF/def20%苯醚有机硅2.940.120.121.630.62DEF/ef94%霜脲氰1.190.420.330.180.31F/f50%腐霉利1.150.420.200.200.27F/f46%氢氧化铜2.500.270.130.100.17F/f72%农用链霉素0.580.230.080.130.15F/f23.4%双炔酰菌胺1.500.150.080.130.12F/f10%氟嘧·氨基1.450.100.080.070.08F/f80%多·福·福锌1.600.070.120.050.08F/f注*：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为菌株AGH1409，HGH1410，WGH1410，下同Note*:Ⅰ,Ⅱ,ⅢrespectivelyrepresentsAGH1409，HGH1410，WGH1410，Thesamebelow.4.2.1.2杀菌剂室内毒力测定与药剂的复选以药剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，用SPSS20.0求得8种药剂对枣黑斑病原毒力回归方程、EC50值和相关系数R。通过8种药剂对3个枣黑斑病菌株所得的EC50值比较表明：8种杀菌剂对A.alternata的毒力有显著差异，其中，40%氟硅唑对A.alternata的毒力最大，EC50值为35.89mg/L；其次为5%己唑醇，EC50值分别为58.24mg/L；40%多福的毒力最小，EC50值为517.13mg/L。其余5种药剂的毒力大小为：50%氯溴异氰尿酸、50%乙嘧酚、80%乙蒜素、72%霜脲锰锌37%苯醚甲环唑，EC50为113.11mg/L、220.04mg/L、226.20mg/L、398.11mg/L、489.78mg/L(表4-4)。34 新疆农业大学硕士学位论文表4-48种杀菌剂对枣黑斑病病原菌毒力测定结果Tab.4-4Thevirulencedeterminationresultsofeightkindsoffungicidesagainstjujubefruitblackspotpathogen菌落抑制率平均抑制率相关系数（R）供试药剂浓度（mg/L）毒力回归方程ToxicityEC50Inhabitedpercent(%)AveragerateofCorrelationFungicidesConcentrationregressiveequations(mg/L)I*IIIIIantimicrobial(%)coefficient160097.590.092.593.3±2.280068.861.382.567.9±6.250%乙嘧酚40057.552.568.862.5±4.8y=1.5550x+1.3573220.040.979320056.348.833.846.3±6.6Dd**10037.540.027.535.0±3.8160086.393.886.388.8±2.580070.082.567.573.3±4.680%乙蒜素40062.573.852.562.9±6.1y=1.3986x+1.7113226.200.999120057.552.535.048.3±6.8Ee10027.538.826.330.8±3.9160086.396.386.389.6±3.380042.552.552.549.2±3.337%苯醚甲环唑40026.337.547.537.1±6.1y=1.7461x+0.3022489.780.966220026.323.828.826.3±1.4Gg10010.017.516.314.6±2.3160070.068.885.074.6±5.280057.558.855.057.1±1.172%霜脲锰锌40041.337.546.341.7±2.5y=1.1585x=1.9868398.110.985820020.023.823.822.5±1.3Ff10020.02.516.312.9±5.3160073.886.390.083.3±4.980047.561.352.553.8±4.040%多福40033.846.338.839.6±3.6y=1.4202x+1.1462517.130.970120030.030.032.530.8±0.8Hh10020.025.022.522.5±1.440083.872.568.875.0±4.520071.365.061.365.8±2.950%氯溴异氰尿酸10051.351.355.052.5±1.2y=1.3236x+2.2820113.110.96025036.323.831.330.4±3.6Cc106.36.310.07.5±1.216067.562.575.068.3±3.68060.048.862.557.1±4.25%己唑醇4040.033.851.341.7±5.1y=1.2110x+2.864058.240.99452032.523.848.835.0±7.3Bb1013.818.816.316.3±1.416080.081.365.075.4±5.28072.578.867.572.9±3.340%氟硅唑4065.055.051.357.1±4.1y=1.4202x+1.146235.890.98982038.825.030.031.3±4.0Aa1028.818.822.523.3±2.94.2.1.3药剂田间防效测定（1）八种药剂处理的病果率和病情指数比较35 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究各药剂处理在三次施药后的病情动态调查显示，虽在有零星病果时期(病情忽略不计)开始施药，但平均病果率均呈现递增趋势，说明仍有新增病情，但与对照相比，各药剂处理的新增病情明显较小，说明各药剂对枣黑斑病均有一定抑制作用。通过最终调查结果可见，CK平均病果率达到31.6%，各施药处理平均病果率均小于CK；其中80%乙蒜素效果最好，平均病果率仅为16.0%，相比对照，病果率降低近15个百分点；其次为5%己唑醇和50%氯溴异氰尿酸，其平均病果率均低于20%，分别为17.1%、19.5%；40%氟硅唑效果最差，但仍优于CK，达到21.3%。病情指数是反应病害发病率与严重度的综合指标。三次调查结果可见，随着生长期的延长，病果病斑面积随之增大，则各处理病情指数也相应增加。在9月15日前后，新增病情指数、新增病果率均大于9月5日和9月25日，说明此时黑斑病情最为严重，达到峰值。最终调查结果显示，各药剂处理之间有差异，病情指数依序为CK＞40%氟硅唑＞50%氯溴异氰尿酸＞5%己唑醇＞80%乙蒜素(表4-5)。表4-5红枣黑斑病病情调查Tab.4-5TheinvestigationofdiseasedstationforJujubeblackspot9月5日9月15日9月25日药剂名称病果率病情指数病果率病情指数病果率病情指数FungicidesDiseasedDiseaseiDiseasedDiseaseDiseasedDiseasefruitsfruitsfruitsnameindexindexindexrate(%)rate(%)rate(%)50%氯溴异氰尿酸61.8134.919.57.380%乙蒜素71.4114.1165.840%氟硅唑9.62.918.36.921.37.95%己唑醇8.52.6124.517.16.4CK16.47.428.914.131.616.7（2）四种药剂处理的防治效果比较按病情指数统计的各处理防治效果表明：各药剂处理在三次施药后均有一定的防效，初始防效在60%以上，最终防效也在50%以上，但均不能完全控制病情的增加，各药剂的防效有明显差异；从第三次施药后10d的综合防效来看，各药剂防治效果依序为，80%乙蒜素(65.3%)、50%己唑醇(61.7%)、50%氯溴异氰尿酸(56.3%)、40%氟硅唑(52.7%)；其中，作为植物源农药的80%乙蒜素防病效果较为理想，5%己唑醇次之。5%己唑醇处理第二次施药的防治效果高于第一次及第三次施药，是由于此阶段为病害高发期，CK36 新疆农业大学硕士学位论文处理在此时期的新增病情指数远大于其余两阶段(图4-1)。在当前以链格孢为病原的枣黑斑病的防治研究较少，生产中有效控制该病发生较难的情况下，本研究筛选出的80%乙蒜素和5%己唑醇宜作为当前防治新疆红枣黑斑病的备选药剂。图4-1四种药剂对枣黑斑病的田间防治效果Fig.4-1Controleffectsof4kindsoffungicidesforthejujubefruitblackspotinfield4.2.2枣软腐病的防治药剂筛选4.2.2.1杀菌剂的抑菌力比较20种不同类型杀菌剂针对枣软腐病的3个菌株的抑菌圈大小比较表明(表4-6)：所有供试药剂对枣软腐病菌的抑菌力有显著差异。其中，50%有氯溴异氰尿酸的抑菌力最强，平均抑菌半径为3.82cm；其余药剂抑菌半径均未达到3cm，80%乙蒜素次之，平均抑菌半径为2.03cm；5%己唑醇、50%乙嘧酚、30%苯甲丙环唑40%多·福、40%氟硅唑、72%霜脲锰锌平均抑菌半径在1.00~1.50cm之间；其余12种药剂抑菌力较低，平均抑菌半径均在1.00cm以下。由此，筛选出50%氯溴异氰尿酸、80%乙蒜素、5%己唑醇、50%乙嘧酚、30%苯甲丙环唑、40%多福、40%氟硅唑、72%霜脲锰锌8种杀菌剂进行后续试验。37 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究表4-620种杀菌剂对红枣软腐病原的抑菌半径比较Tab.4-6Comparisonoftheantibacterialradiusforthe20kindsoffungicidesagainstjujubesoftrotpathogen药剂浓度抑菌半径(㎝)差异显著性平均抑菌半径(cm)药剂名称(g·L-1)/(ml·L-1)SignificanceofAntibacterialradiusAverageantibacterialFungicidesnameFungicidesdifferenceradiusI*IIIIIconcentrationP=0.01/P=0.0550%氯溴异氰尿酸1.353.923.673.883.82A/a80%乙蒜素1.601.652.052.382.03B/b5%己唑醇1.151.51.431.381.44C/c50%乙嘧酚1.051.381.121.351.28CD/cd30%苯甲丙环唑2.201.221.481.031.24CD/cd40%多·福0.221.021.331.201.18CD/cde40%氟硅唑0.701.181.131.051.12CDE/cde72%霜脲锰锌1.101.220.931.081.08DE/de94%霜脲氰1.190.880.800.830.84E/e72%农用链霉素0.580.250.720.380.45F/f37%苯醚甲环唑1.600.320.570.370.42F/f32.5%嘧菌酯1.600.450.350.300.37F/f50%腐霉利1.150.330.080.400.27F/f46%氢氧化铜2.500.180.230.130.18F/f20%苯醚有机硅2.940.170.130.170.16F/f23.4%双炔酰菌胺1.500.170.120.100.13F/f10%氟嘧·氨基1.450.080.120.170.12F/f15%多·福·辛菌胺1.200.10.220.050.12F/f80%多·福·福锌1.600.070.070.120.08F/f3%中生菌素0.670.10.050.080.08F/f注*：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为菌株HRF-1308-1，ARF1406-10-1，NYT2-1，下同。Note*:Ⅰ,Ⅱ,ⅢrespectivelyrepresentsHRF-1308-1，ARF1406-10-1，NYT2-1，Thesamebelow.4.2.2.2杀菌剂室内毒力测定与药剂的复选以药剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，用SPSS20.0软件求得8种杀菌剂对枣软腐病原毒力回归方程、EC50值和相关系数R(表4-7)。通过8种药剂对3个枣软腐病菌株的EC50值比较表明：8种药剂对枣软腐病原菌的毒力大小有显著差异，其中，40%氟硅唑对枣软腐病原的毒力最大，EC50值为35.05mg/L；其次为50%氯溴异氰尿酸，EC50值分别为45.28mg/L；50%乙嘧酚EC50值最大，为1161.44mg/L，毒力最弱；其余5种药剂的毒力大小依序为：5%己唑醇、80%乙蒜素、30%苯甲丙环唑、40%多福、72%霜脲锰锌，EC50分别为72.59mg/L、175.43mg/L、295.32mg/L、514.04mg/L、611.78mg/L。50%乙嘧酚、72%霜脲锰锌、40%多福、30%苯甲丙环唑对病原菌毒力与其余四种杀菌剂相比较低，不作为进一步田间试验的药剂。38 新疆农业大学硕士学位论文表4-7八种杀菌剂对枣软腐病病原菌毒力测定结果Tab.4-7ThevirulencedeterminationresultsofeightkindsofFungicidesagainstjujubefruitsoftrotpathogen菌落抑制率平均抑制率毒力回归方程EC50相关系数（R）供试药剂浓度（mg/L）Inhabitedpercent(%)AveragerateofToxicityregressiveCorrelationFungicidesConcentrationIIIIIIantimicrobial(%)equations(mg/L)coefficient80082.576.372.577.140060.070.068.866.350%氯溴异氰尿酸20061.361.348.857.1y=1.552x+2.414545.280.990710040.052.546.346.3Bb5028.813.820.020.8120070.067.576.371.380063.860.060.061.380%乙蒜素60036.340.027.534.6y=0.884x+3.0162175.430.992740036.330.025.030.4Dd20016.326.312.518.332068.880.077.575.416053.851.380.061.75%己唑醇8046.343.865.051.7y=1.1305x+2.896272.590.98694036.335.057.542.9Cc2038.832.525.032.1120068.847.566.360.880037.528.843.836.750%乙嘧酚60030.026.350.035.4y=1.4016x+0.70411161.440.977340012.528.827.522.9Hh20010.013.837.520.4120075.092.588.885.480070.076.373.873.330%苯甲丙环唑40032.551.373.852.5y=1.6414x+0.9452295.320.969820023.847.533.835.0Ee10015.035.038.829.680065.063.867.565.440062.536.353.850.840%多·福20047.535.037.540.0y=1.257x+1.5168514.040.985310033.823.833.830.4Ff5021.318.825.021.716083.883.893.887.18068.868.881.372.940%氟硅唑4050.053.863.855.8y=1.8103x+2.203735.050.98152045.037.561.347.9Aa1015.016.327.519.680053.863.866.361.340046.343.867.552.572%霜脲锰锌20036.333.843.837.9y=1.3053x+1.3627611.780.991510038.822.527.529.6Gg5017.515.015.015.84.2.2.3药剂田间防效测定（1）八种药剂处理的病果率和病情指数比较39 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究在有零星病果时期(病情忽略不计)开始施药，但平均病果率仍呈现递增趋势，但与对照相比，各药剂处理的新增病情明显较小，说明各供试杀菌剂对枣软腐病均具有一定抑制作用。CK处理的最终平均病果率达到38.0%，各施药处理平均病果率均小于CK；其中50%氯溴异氰尿酸效果最好，平均病果率仅为11.0%，相比对照，病果率降低近27个百分点；其次为5%己唑醇和40%氟硅唑，其平均病果率均低于20%(分别为14.0%、19.5%)；80%乙蒜素效果最差，但仍优于CK，病果率达到23.5%，较对照处理降低14.5个百分点。三次调查结果可见，随着生长期的延长，病果病斑面积随之增大，则各处理病情指数也相应增加。在9月20日前后，新增病情指数、新增病果率均大于9月10日和9月30日，说明此时软腐病情发生发展最为严重，达到峰值（表4-8）。表4-8红枣软腐病病情调查Tab.4-8TheinvestigationofdiseasedstationforJujubesoftrot9月10日9月20日9月30日药剂名称病果率病情指数病果率病情指数病果率病情指数FungicidesDiseasedDiseaseiDiseasedDiseaseDiseasedDiseasefruitsfruitsfruitsnameindexindexindexrate(%)rate(%)rate(%)50%氯溴异氰尿酸3.01.58.57.611.09.580%乙蒜素6.53.318.014.323.520.540%氟硅唑8.04.013.012.319.516.65%己唑醇6.03.09.08.014.011.8CK9.04.534.031.638.036.0（2）四种药剂处理的防治效果比较按病情指数统计的各处理防病效果表明：各药剂处理在三次施药后均有一定的防效，但均不能完全控制病情的增加，各药剂的防效有明显差异；第三次施药后10d后的综合防效可以得出，各药剂防治效果依序为：50%氯溴异氰尿酸(73.6%)、50%己唑醇(67.2%)、40%氟硅唑(53.9%)、80%乙蒜素(43.1%)；其中，50%氯溴异氰尿酸防病效果较为理想，5%己唑醇次之。各药剂处理的第二次施药的防治效果高于第一次及第三次施药，是由于此阶段为病害高发期，CK处理在此时期的新增病情指数远大于其余两阶段（图4-2）。筛选出50%氯溴异氰尿酸和5%己唑醇作为当前防治枣软腐病的优选药剂。40 新疆农业大学硕士学位论文图4-2四种药剂对枣软腐病的田间防治效果Fig.4-2Controleffectsof4kindsoffungicidesforthejujubefruitsoftrotinfield4.3小结与讨论红枣在南疆四地州和东疆哈密等地种植规模较较大，截止到2015新疆红枣种植面积目前已达到47.37万hm2，占全国总面积的近三分之一，盛果期产量将占到全国总产量的50%以上。红枣产业的迅猛发展，有效带动了当地农业经济发展。然而，由于新疆枣树栽培面积的增加及种植模式的转变，红枣黑斑病及软腐病的病情越来越严重，一般发病率在10%~20%，严重地块可达50%以上，两种病害综合发病甚至达到60%左右，黑斑病发生，造成枣果味苦，不堪食用，降低红枣品质等级，枣软腐病的发生则造成枣果实腐烂，在着色及贮藏期均可发生，严重影响红枣产量，造成大幅的经济损失。由于枣农对枣果实病害的盲目防治以及对病害病原菌的研究较少，导致新疆红枣黑斑病及枣软腐病的发生愈发严重，因此，有效防治新疆两种果实病害已是当务之急。目前，从已有的报道来看，对于两种果实病害，尽管因地区和红枣品种的不同，鉴定的病原和采用防治方法也不同，但药剂防治仍是目前预防及控制红枣黑斑病及枣软腐病爆发与流行的主要措施之一。本研究使用20种针对真菌的杀菌剂，通过抑菌圈筛选及毒力测定试验对两种果实病害病原菌进行室内药剂筛选。80%乙蒜素、50%氯溴异氰尿酸、40%多·福、40%氟硅唑四种杀菌剂对两种果实病害病原菌均具有较好效果。50%氯溴异氰尿酸是一种速效，持效期长，广谱型杀菌剂，喷施在作物表面能慢慢地释放次溴酸(HOBr)和次氯酸(HOCL)，次溴酸的活性是次氯酸的四倍，有强烈的杀灭细菌、真菌的能力，通过内吸传导释放次溴酸后的母体形成三嗪二酮(DHT)和三嗪(ADHL)，具有强烈的杀病毒作用，另外，因起始原料富含钾盐及微量元素群，因此，氯溴异氰尿酸不41 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究仅有强烈的预防和杀灭细菌、真菌及病毒的能力，而且有促进作物营养生长等作用，独特的作用机制使得其具有降解快，污染小的优点[95]；80%乙蒜素是仿生植物源杀菌剂，不同于传统杀菌剂，具有低残留，污染小，防治效果极佳的优点，同时可强力排出体内毒素基因，提高作物免疫力，避免二次感染。红枣是一种食药兼用果品，既可做中药也可用于食用，新疆产区在其种植过程中，枣黑斑病及软腐病发生极为普遍且病情严重，本研究筛选出50%乙蒜素和80%氯溴异氰尿酸可作为当前防治新疆这两种果实病害的最佳药剂，在病害发生早期使用，既可有效抑制病原菌生长，又可有效抑制病原菌孢子的萌发和传播，还具有环保、低残留的优点，同时，两种药剂还具有一定兼防作用，建议在大田中推广使用。在田间防治方面，筛选出了几种有效防治两种枣果实病害的杀菌剂，但所有药剂的防治效果未达到其它报道中所述水平(90%以上)，因此，需进一步研究田间防治的最佳时间以及施药次数。同时本试验所用药剂均为单一药剂，供试枣树品种均为骏枣，农药复配及品种抗性对防治效果的影响也需进一步研究。为有效防治新疆红枣两种果实主要病害，本研究只采用了化学防治措施，尚未研究其综合防治措施，为有效控制这两种病害的发生及影响，应研究农业防治，物理防治，生物防治等措施，创建最佳的综合防治措施。42 新疆农业大学硕士学位论文第5章结论新疆红枣在中国乃至世界红枣市场的比重逐年加大，但近年来，由于种植面积的急剧增加和种植模式的转变，一些新的红枣果实病害也相继发生且病情愈演愈烈，尤以枣黑斑病和软腐病为甚。病害的发生不仅导致红枣产量下降，而且严重影响了红枣品质，大大降低了新疆红枣的商品价值和市场竞争力，给当地农民带来巨大的经济损失。化学防治因其具有快速、直接、高效、广谱、使用方便等优点，仍是新疆针对枣果实病害的最主要，最普遍的防治措施。由于新疆对枣黑斑病及枣软腐病两种果实病害的病原尚不明晰，且相关报道较少，致使田间防治这两种果实病害存在一定的盲目性。本研究以枣果实黑斑病及枣果实软腐病为研究对象，通过病原菌形态学鉴定、致病性试验及分子生物学鉴定，明确新疆枣果实两种主要病害的致病菌；采用传统形态学和分子检测两种方法，查明了两病病原的田间主要越冬场所；最终，将抑菌圈比较、毒力测定及田间药效试验相结合，筛选出高效防病药剂。结论如下：（1）新疆红枣黑斑病的病原菌为链格孢属链格孢(A.alternata)；软腐病的病原菌为根霉属米根霉(Rhizopusoryzae)。（2）新疆枣黑斑病原的田间主要越冬场所为落叶和落果；枣软腐病致病菌的田间主要越冬场所为落叶、落果及根土。（3）80%乙蒜素和5%己唑醇防治新疆红枣黑斑病的防效分别为65.3%和61.7%，可作为当前防治枣黑斑病的优选药剂；50%氯溴异氰尿酸和5%己唑醇防治新疆红枣软腐病的防效分别为73.6%和67.2%，可作为当前防治枣软腐病的优选药剂。43 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新疆农业大学硕士学位论文附图乙蒜素氯溴异氰尿酸多福氟硅唑已嘧酚霜脲锰锌苯醚甲环唑己唑醇多·福·辛菌胺嘧菌酯苯甲丙环唑中生菌素苯醚有机硅霜脲氰对照（CK）附图1黑斑病原菌抑菌圈比较结果Fig.1Theresultsofinhibitioncomparisonforblackspotpathogens49 新疆红枣两种果实病害的病原鉴定及关键防治技术研究氯溴异氰尿酸乙蒜素己唑醇已嘧酚苯甲丙环唑多·福氟硅唑霜脲锰锌霜脲氰农用链霉素嘧菌酯苯醚甲环唑腐霉利氢氧化铜对照（CK）附图2软腐病原菌抑菌圈试验效果图Fig.2Theresultsofinhibitioncomparisonforsoftrotpathogens50 新盛农业大爷顿丄学化论义致谢本论文息在导师郭庆兀教授的悉如指导下完成的。从论文的选题，实验设计，实验进程到论文的撰写，巧师都给予了关键性的巧巧和巧助。化论义完成之际，又巧到丫甘师耐也而又细必的审阅和修化字化巧问尤不蕴含着巧师的巧慧和也血。巧师洲博的巧识、严谨的治巧态度，半巧的实践经验，义循循善巧的教学方化，使我终身受益。化论义完成和毕业么际，向恩师吉年来化节习、巧验和生巧等方而给予的教梅、指诗、鼓励、宽奔衷示衷也的感谢！－在柳？．＋：课巧学习和巧爆论义硏殆工作期间，得到农学院的各位领导和老帅对化恶也关样，使巧巧所进步，受益匪浅。巧此，我向化们表示山巧的感谢。感谢円剑宇帅兄这年来在实验及生活中所给予的巧诗和巧助，少走许多巧路，内必感激之情－！，，尤＾吉表巧时感谢Ｎ４０８全体同学，本论义研究能够顺利地完成离不开实验南令体同ｎ及实习牛．在实验和斗：活中给予的帮贴和支持！感谢我的父巧、家人、朋友这么多年米对我的支持和理解，为我解除了生活上的粗一？－必、忧，使我能意进巧硏充工作，是他们无私的爱屯巧无限的期巧伴巧走到了今天，我向他们致Ｌ：ｒ史也的感谢！本论文硏充。由新髓维百尔鬥治Ｋ科技计划项鬥新賴特色果树商效女全中产义键＂－（２０技术硏究集成勺示１！３日１日２），。化资助化此丧小感谢抗最向参加本论文评、的全Ｗ閒答辩体心宗致玻诚帶的谢！意５１
