microrna-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及在脓毒症患者外周血白细胞的表达

《microrna-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及在脓毒症患者外周血白细胞的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号R614密级公开学号1002012092学校代码90031净j孚贊大•杳博士学位办又MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及在脓毒症患者外周血白细胞的表达邬明指导教师陶国才教授、主任医师导师组成员鲁开智易斌顾健腾甯交琳培养单位第三军医大学第一附属医院手术麻醉科申请学位类别博士专业学位专业名称麻醉学论文提交日期2015年4月论文答辩日期2015年5月答辩委员会主席王国林评阅人侯立朝徐世元袁红斌邹全明彭代智二〇一五年五月 第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 目录缩略语表..............................................................................................................................1英文摘要..............................................................................................................................4中文摘要.............................................................................................................................10论文正文MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及其在脓毒症患者外周血白细胞的表达研究..........................................................................15第一章前言......................................................................................................15第二章MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达....................172.1材料和方法.................................................................................................172.2结果....................................................................................................252.3讨论....................................................................................................28第三章microRNA-23b在脓毒症病人的外周血的白细胞中的表达及意义.........323.1对象、材料与方法.....................................................................................333.2结果....................................................................................................413.3讨论....................................................................................................44全文总结.............................................................................................................................50参考文献.............................................................................................................................52文献综述一.........................................................................................................................60文献综述二.........................................................................................................................81博士研究生期间发表的论文............................................................................................102致谢...........................................................................................................................103 第三军医大学博士学位论文缩略语表英文缩写英文全称中文译名bpbasepair碱基对cmcentimeter厘米DEABDiethylaminobenzaldehyde对二乙氨基苯甲醛DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜mRNAmessengerRNA信使RNAEDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸hhour小时HEhematoxylin-eosinstaining苏木精-伊红染色minminute分钟miRNAmicroRNA微小核糖核酸mlmillilitre毫升mmmillimeter毫米pgpicogram皮克μgmicrogram微克μlmicrolitre微升nMnanomol纳摩尔PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应rpmrevolutionsperminute每分钟转动次数Uunit单位EPEppendorf离心管DEPCdiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯secsecond秒SIRSsystemicinflammatoryresponsesyndrome全身炎症反应综合征quantificationalreal-timepolymerasechainqRT-PCR定量反转录聚合酶连锁反应reaction1 第三军医大学博士学位论文mmHgmillimeterhydrargyrum毫米汞柱SCCMSocietyofCriticalCareMedicine美国重症医学会EuropeanSocietyofIntensiveCareESICM欧洲危重病医学会MedicineSOFAsequentialorganfailureassessment序贯器官衰竭估计TNF-αTumorNecrosisFactorα肿瘤坏死因子-αIL-10Interleukin-10白细胞介素-10EICUEmergencyIntensiveCareUnit急诊重症监护病房CTcyclethreshold循环阈值transforminggrowthfactor-βactivated转化生长因子-β活性激酶1靶蛋TAB2kinase1bindingprotein2白2transforminggrowthfactor-βactivated转化生长因子-β活性激酶1靶蛋TAB3kinase1bindingprotein3白3G试验1,3-beta-Dglucanasedetection1.3-β-D葡聚糖检测GM试验galactomannandetermination半乳甘露聚糖检测WHOworldhealthorganization世界卫生组织FBSfetalbovineserum胎牛血清IRAK1interleukin-1receptorassociatedkinase1激活IL-1受体相关激酶1IRAK磷酸化肿瘤坏死因子受体TRAF6TNFR-associatedfactors6激活因子6TAK1TGF-β-activatedkinase1转化生长因子激酶1acutephysiologyandchronichealth急性生理和慢性健康评估ⅡAPACHE-IIevaluationIIareasunderreceiveroperatingAUC-ROC可接受特征曲线下面积characteristiccurvesBPbloodpressure血压CDclusterofdifferentiation白细胞分化抗原CRPC-reactiveproteinC反应蛋白C3acomplement3a人补体片断3aHRheartrate心率IL-1rainterleukin-1receptorantagonist白介素-1受体拮抗剂2 第三军医大学博士学位论文MCPmonocytechemoattractantprotein单核细胞趋化蛋白MIFmacrophagemigrationinhibitoryfactor巨噬细胞移动游走抑制因子NGALneutrophilgelatinase-associatedlipocalin中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白PCTprocalcitonin原降钙素solubletriggeringreceptorexpressedonsTREM-1可溶性髓系细胞触发受体-1myeloidcell-1solubleformofurokinase-type可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物suPARplasminogenactivatorreceptor受体WBCwhitebloodcell白细胞ATCCamericantypeculturecollection美国典型培养物集存库pri-miRNAprimarymiRNA初级miRNApre-miRNAPrecursormiRNA前体miRNAmyeloiddifferentiationprimaryresponseMyD88髓样分化因子88gene88LBPLPS-bindingprotein脂多糖结合蛋白MD-2Myeloiddifferentiationprotein-2髓样分化蛋白-2AP-1activatorprotein-1激活蛋白1PAMPspathogenassociatedmoleculespatterns病原体相关分子模式TLR4Toll-likereceptor4Toll样受体4loadingbuffer上样缓冲液Denaturingsolution变性溶液3 第三军医大学博士学位论文AstudyonmicroRNA-23bregulatesinflammatoryfactorexpressiononvascularendothelialcellsofsepsisandperipheralbloodmicroRNA-23bassepsis-molecularmarker.AbstractSepsisisaheterogeneoussyndromewithvariablephysiologicalmanifestationsinpatients.Oneofthebiggestchallengesinsepsisistodevelopamoredetailedunderstandingoftheunderlyingpathophysiologicalmechanism.Numerousstudieshavefoundanassociationbetweenendothelialcellactivationandsepsisanditisbecomingevidentthattheendotheliumplaysakeyroleinsepsis.Theendothelialactivationinsepsisisassociatedwithchangesinhemostaticbalance,leukocytetrafficking,vascularpermeability,inflammationandmicrocirculatoryflow.Althoughthesechangesisapartoftheadaptivehostresponsetoinfection,theymaybecomeexcessiveresultinginthedysfunctionalphenotypethatahallmarkofsepsis.Inaprevioussingle-centerstudy,wefoundcompellingevidencethatsepsisinhumansisassociatedwithactivationoftheendotheliumasevidencedbyincreasedlevelsofcirculatingendothelialbiomarkers.Wealsofoundanassociationbetweenthesemarkersandseverityofillnessandorgandysfunctioninsepsis.Giventhecentralroleoftheendotheliuminsepsispathophysiology，suchfindingsmaynotonlyimproveourunderstandingofacomponentofthepathophysiologyinsepsisbutmayalsosuggesttargetsfordiagnosticplatformsandspecifictherapeuticinterventions.EmergingofmiRNAprovidesusanewwayinsightintothemechanismunderliningendothelium’sroleinsepsis.Thisarticleincludedtwopartsasfollows:PartⅠ:MicroRNA-23bregulatesinflammatoryfactorexpressiononvascularendothelialcellsofsepsisMiR-23bisamulti-functionalmiRNAwhichcontributestoregulatemultiplesignalpathways.ItwasreportedthatmiR-23bpreventsmanyautoimmunediseasesthrough4 第三军医大学博士学位论文regulatinginflammatorycytokinepathways.However,itsmechanismkeptunkown.Inthepresentstudy,themir-23binhibitorandmimicsweretransfectedintohumanvascularendothelialcells(HUVECs)tochangetheexpressionofmir-23bindividually.Thenegativecontrols(NC)wasused,too.Results1TransfectionofmiR23bInhibitorinhibitedmiR23bexpressionandtransfectionofmiR23bmimicsincreasedmiR23bexpressionbyHUVECsHUVECstransfectedwithmiR23bemittedgreenfluorescenceunderfluorescencemicroscopy.QuantitativePCRresultsindicatedthatmiR23bexpressiondecreasedsignificantlyinthegrouptransfectedwithmiR23binhibitorsequencewhencomparedtotheblankcontrolgroupandthegrouptransfectedwithinhibitorNCsequence,demonstratingthattransfectionofmiR23binhibitorinhibitedmiR23bexpressioneffectively.Incontrast,miR23bexpressionincreasedsignificantlyinthegrouptransfectedwithmiR23bmimicswhencomparedtotheblankgroupandthemimicNCgroup,demonstratingthattransfectionofmiR23bmimicpromotedmiR23bexpression.2LPSdownregulatedmir-23bexpressionbyHUVECsVECsinsepsisweresimulatedbyLPSstimulatedHUVECs.Theresultsshowedthatmir-23bexpressiondecreasedsignificantlyincellstransfectedwithmimicNCorinhibitorNCat4hor8hafterLPSstimulationwhencomparedtocellsnotstimulatedwithLPS(P<0.01).Theresultsdemonstratethatmir-23bexpressiondecreasedinLPSstimulatedHUVECs,thatis,VECsactivationinsepsiswasaccompaniedbyinhibitionofmir-23bexpression.Incontrast,mir-23bexpressiondecreasedslightlyincellstransfectedwithmimicsequenceat4hor8hafterLPSstimulationwhencomparedtocellsnotstimulatedwithLPS,butremainedstillathighlevels.mir-23bexpressionremainedlowincellstransfectedwithInhibitorsequenceafterLPSstimulation.3LPSpromotedinflammatorycytokineexpressionbyHUVECsInflammatorycytokinesNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,andVCAM-1increasedsignificantlyat4hand8hafterLPSstimulationinHUVECs(P<0.05),demonstratingthatLPSstimulatedHUVECstoexpressinflammatorycytokinesandthuscontributedtoinflammatoryreactionsinsepsis.4Mimicmir-23binhibitedLPSstimulatedexpressionofinflammatoryfactors5 第三军医大学博士学位论文NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,andVCAM-1mRNAincreasedsignificantlyat4hand8hafterLPSstimulationinHUVECstransfectedwithmimicNC(P<0.05),butdecreasedsignificantlyincellstransfectedwithmimic(P<0.05)(Fig.4a).Western-blotassayshowedthatthelevelofNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,andselectinEproteinswassignificantlylowerinthemimicgroupthanthemimicNCgroupafter4hofLPSaction(P<0.05),andthelevelofVCAM-1proteinwassignificantlylowerinthemimicgroupthanthemimicNCgroupafter8hofLPSaction(P<0.05).5Effectofinhibitormir-23boninflammatoryfactorsexpressioninLPSstimulatedcellsNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,VCAM-1mRNAsincreasedsignificantlyinHUVECstransfectedwithinhibitorNCafter4hand8hLPSstimulation,whencomparedtothepre-stimulationlevels(P<0.05).ThelevelsoftheseinflammatoryfactorsincreasedsignificantlyincellstransfectedwithinhibitorafterLPSstimulationwhencomparedtothepre-stimulationlevels(P<0.05).Moreover,thelevelsoftheinflammatoryfactorsincreasedsignificantlyafter4hor8hLPSstimulationwhencomparedtothelevelsincellstransfectedwithinhibitorNC.Western-blotassayshowedthatNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinEandVCAM-1proteinsincreasedsignificantlyincellstransfectedwithinhibitorwhencomparedtocellstransfectedwithinhibitorNCafter4hor8hofLPSaction(P<0.05).Conclusion:TheresultsshowedthatLPSdownregulatedmir-23bexpressionbyHUVECs。TheresultsdemonstratedthatLPSpromotedHUVECstoexpressinflammatoryfactorssuchasNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,andVCAM-1.Upregulatingmir-23binhibitedNF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinEandVCAM-1expression,whiledownregulatingmir-23bpromotedinflammatoryfactorexpression.IthasbeendemonstratedpreviouslythatNF-κBisactivatedinsepsisandregulatesapoptosis,cellgrowth,stressreaction,immunereactionandsepticshock.ThelevelsofTNF-αandIL-6reachapeakasearlyas3haftertheonsetofsepsis,andthedegreeofincreasemayreflecttheseverityofsepsis.ICAM-1,VCAM-1andselectinEareimportantcelladhesionfactors,andregulatetheactivityofinflammatoryandvascularendothelialcells,pro-andanti-inflammatoryfactors,aswellasinflammatorycellmigrationtotissues6 第三军医大学博士学位论文andorgans;hence,theyplayanimportantroleinsepsis.Insummary,mir-23bregulatessepsisthroughinhibitinginflammatoryfactorexpressionbyVECs.KeywordsMicroRNA-23b,vascularendothelialcell,sepsis,NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,VCAM-1PartⅡ:TheresearchofperipheralbloodmicroRNA-23bassepsismolecularmarker.Objective:ToevaluatethevalueofperipheralbloodmicroRNA-23b(miRNA-23b)astheidentificationmolecularmarkerofsepsisandSIRS,trytofigureoutthepotentialroleofmiRNA-23basanewsepsismolecularmarkerappliedforclinicaltreatment.Methods:FromDecember2012toNovember2014,40subjectsinGuangzhoumilitarycommandwuhangeneralhospitalEICUwereenrolledforourstudyperipheralbloodspecimensandclinicdataofthesubjectsweregathered.Theydividedintosepsisgroup(n=20)、SIRSgroup(n=10)andcontrolgroup(n=10)accordingtotheirdiagnosis.WeusedthemirVanaPARISKittoextracttheserummiRNAandAll-in-OnemiRNAqRT-PCRtodetecttheexpressionlevelofmiRNA-23bintheserumofperipheralbloodspecimens.ThelevelsofTNF-αandIL-10inplasmawasdetected.WeanalyzedthecorrelationbetweenthetheexpressionlevelofperipheralbloodmiRNA-23bwithclinicaldataofthesepsispatients.SensitivityandspecificitywerecomparedbetweentheexpressionsofmiRNAwithSOFA.Results:1)40studiedcasesincluded20sepsispatients,10SIRSpatients,24casesofnormal(healthycontrols),meanage(49.9±15.7)years,25casesofmaleand15casesoffemale.2)detectionsensitivityandlinearrangeofMiR-23bThelowdetectionlimitofRNAinwhichMiR-23bandU6couldbedetectedwas6.974pg/L.Inthe6.97-6.97*10pg/LRNArange,therewasagoodlinearrelationshipbetweenthemiR-23bandU6’scyclethresholdandtheconcentrationofRNA(R=0.999).3)ThetemperaturestabilityofmiR-23bintheperipheralbloodAfterperipheralbloodpreservedin4℃forfivedays,it’stotalRNAquantitativeresultsdownfrom51.32ng/μLto18.3ng/μL.Thus,withtheprolongedstoragetime,the7 第三军医大学博士学位论文degradationofthetotalRNAinsamplesincreasedsignificantly.ButtheexpressionleveldataofmiR-23bandU6,intheperipheralbloodleukocytes,hadnoobviouschange.4）theanalysisofillnessinsepsispatients20sepsissubjectsincluded12casesofpulmonaryinfection,4casesofperitonitis,2casesofbiliarytractinfectionand2casesofbacterialendocarditis.The28daymortalityratewas20%(4/20).ThemeanSOFAscoreswas5.8+2.52(2-11).5)TheaverageexpressionlevelofmiRNA-23binsepsisgroup(4.1427±2.0836)(Log2ΔCt)wassignificantlylowerthanthatinhealthycontrolgroup(1.6884±2.1499)，andtherewasnosignificantdifferencebetweeninsepsisgroupandSIRSgroup(3.5159±2.0554)(p>0.05).AndtheaverageexpressionlevelofmiRNA-23binSIRSgroupwasnosignificantlylowerthanthatinhealthycontrolgroup(p>0.05).Thewhitecellcounts,tumornecrosisfactoralpha,interleukin-10andtheratioofinterleukin-10totumornecrosisfactoralphaweresignificantlyhigherintheperipheralbloodleukocytesinsepsisgroupthanthoseinheathlygroup(P＜0.01).Therewasnosignificantdiffenrenceintumornecrosisfactoralpha,interleukin-10,theratioofinterleukin-10totumornecrosisfactoralphaorwhitebloodcountsbetweensepsisgroupandinflammatoryresponsesyndromegroup(P＞0.05).6)TheexpressionlevelofmiRNA-23bwassignificantlylower(P＜0.01，P=0.003),andserumIL-10wassignificanthigher(P＜0.01,P=0.037)indeadpatientsthanthoseinsurvivedpatientsinsepsisgroup.Therewasnosignificantdiffenrenceinwhitecellcounts（P=0.584）,tumornecrosisfactoralpha（P=0.324）,ratioofinterleukin-10totumornecrosisfactoralpha（P=0.263)indeadpatientsandthoseinsurvivedpatientsinsepsisgroup.7)Forpatientsinsepsisgroup,theexpressionlevelofperipheralbloodmiRNA-23bwascorrelatedwithsequentialorganfailureassessment(SOFA)scores(r=0.473),tumornecrosisfactoralpha(r=0.485)andinterleukin-10(r=0.470)(P＜0.05).AndtheexpressionlevelofperipheralbloodmiRNA-23bwasnotcorrelatedwithwhitecellcounts(r=0.301)andtheratioofinterleukin-10totumornecrosisfactoralpha(r=0.039)(P>0.05).8 第三军医大学博士学位论文8)Forpatientsinsepsisgroup,thesequentialorganfailureassessmentscoreswasnotcorrelatedwithtumornecrosisfactoralpha(r=0.410),interleukin-10(r=0.369)andtheratioofinterleukin-10totumornecrosisfactoralpha(r=0.124)(P>0.05).LimitationsThisstudyhasanumberoflimitations.First,wedidnotuseaconsecutivepatientpopulationsothestudymaybesubjecttoselectionbias.Second,weonlyanalyzedbloodfromtheinitialdrawandwedidnotfollowthebiomarkerdynamicsovertime.Third,Theremayhavebeenunmeasuredconfoundersorconfoundingthatwasnotaccountedforintheanalysis.Fourth,,somepatientsenrolledwithsepsismayhavebeenmisclassifiedandultimatelyhadotheretiologiesofdisease,butincludedinourcohorts.Lastly,oursamplesizeisnotlarge.Alargerstudymayhaveaffordedtheopportunityformorecompletesubsetanalysis.Conclusion:TheexpressionlevelofmiRNA-23binsepsisgroupwassignificantlylowerthanthatinhealthycontrolgroup，andtherewasnosignificantdifferencebetweeninsepsisgroupandSIRSgroup.TheexpressionlevelofmiRNA-23breflectsthesituationofimmuneresponse,anditmaybeusedasamolecularmarkerforjudgingtheseverityandprognosisofsepsis.Butitstillneedsfurtherstudytoexpandthesamplesizebeforeusedforclinicalscreening.ThemechanismoftheactionofmiRNA-23binthedevelopmentofsepsisneedstobeexplored.KeyWords:miRNA-23b,sepsis,peripheralblood,molecularmarkers9 第三军医大学博士学位论文MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及其在脓毒症患者外周血白细胞的表达研究摘要脓毒症是患者异常生理变化表现综合征。脓毒症的最大挑战之一的是对其发生发展的潜在病理生理机制的更详细的了解。大量的研究已经发现内皮细胞活化和脓毒症间的联系，而且日益显现出，内皮细胞在脓毒症起着关键作用。脓毒症中内皮细胞激活的变化包括凝血功能、白细胞趋化粘附、血管通透性的变化，与炎症发生发展以及和微循环障碍息息相关。尽管这些变化是宿主对感染的正常反应的一部分，但在脓毒症中它们可能过度表达从而成为脓毒症异常的表型的标志。相关研究表明，循环内皮生物标志物的水平增加证明人类脓毒症与内皮细胞的活化相关。这些生物标记物和脓毒症病情的严重程度和器官功能障碍之间的存在关联。基于内皮细胞在脓毒症病理生理学中的核心作用，这些发现不仅可以提高我们在脓毒症病理生理过程中的内皮细胞部分的理解，但也可能会提示建议相应目标诊断指标和特定的治疗性干预的可能。新近的miRNA-23b给我们提供了观察脓毒症内皮细胞变化发生和发展的新途径。本文包括两部分：第一部分microRNA-23b调节脓毒症脐静脉血管内皮细胞炎症因子的表达Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿瘤中呈现低表达，被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用。据报道，mir-23b防止多种自身免疫性疾病通过调节炎症细胞因子的途径，它调节炎症因子如NF-κB，TNF-α，IL-1β和IL-17。因此，我们推测脓毒症中mir-23b可能通过NF-κB通路和IL-17，从而调节NF-κB介导的血管内皮细胞的活化。在这项研究中，通过细菌脂多糖（LPS）刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs），然后转染mir-23b的模仿剂或者抑制剂进入细胞，并观察转染对mir-23b表达的上调和抑制作用，对脓毒症血管内皮细胞表达的炎症调节因子的影响。进而探讨mir-23b作为脓毒症的靶点以及生物标志物的可能性。方法：mir-23b抑制剂和模拟剂分别被转染到人血管内皮细胞（HUVEC）从而分别抑制10 第三军医大学博士学位论文和上调mir-23b表达。抑制剂和模拟剂的阴性对照（NC）同样进行转染以便对照。观察LPS刺激后4h和8h后各组细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达和mRNA的表达，以及miR-23b表达的荧光图片，进行分析和比较。组间行χ2检验或t检验，SPSS16.0统计软件进行统计分析，P<0.05为有显著差异。结果：1转染mir-23b抑制剂抑制了人脐静脉的内皮细胞中的mir-23b的表达；转染模拟剂则可促进mir-23b的表达使用荧光显微镜可见人脐静脉的内皮细胞中，mir-23b发出绿色荧光。而定量PCR的结果则表明，mir-23b抑制剂的转染组与空白对照组及NC组相比较，其mir-23b的表达可见显著的降低，表明mir-23b抑制剂的转染抑制mir-23b的表达有效。与此相反，mir-23b模拟剂的转染组与空白组和NC组的模拟剂组相比，则发现mir-23b的表达增高，表明mir-23b模拟剂的转染可促进mir-23b表达。2LPS下调人脐静脉的内皮细胞中mir-23b的表达LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞模拟脓毒症中血管内皮细胞。结果显示，相比没有用LPS刺激细胞表达的miR-23b，转染显著模拟剂对照和拮抗剂对照的细胞LPS刺激4h或8h后的miR-23b表达明显下降（P＜0.01）。结果表明，在LPS刺激导致人脐静脉的内皮细胞的mir-23b表达减少，在脓毒症中血管内皮细胞活化伴有mir-23b表达的抑制。相反，在模拟剂转染组与没有LPS刺激的细胞相比较，LPS刺激后4h、8h检测发现，mir-23b表达轻微下降，但仍处于高水平。在抑制剂的转染组中，LPS刺激后内皮细胞所表达的mir-23b则仍然很低。3LPS促进炎性细胞因子表达的影响LPS刺激人脐静脉内皮细后4h、8h检测发现，炎性因子NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素E均显著增加（P＜0.05），表明LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞表达炎性细胞因子，进而导致脓毒症中的炎症反应。4mir-23b模拟剂抑制LPS刺激后炎症因子的表达LPS刺激人脐静脉的内皮细胞4h、8h在转染模拟NC组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素mRNA表达明显增加（P＜0.05），与转染模拟剂组有明显差异（P＜0.05）。Westernblot分析结果表明，LPS刺激后4h检测发现，模拟剂转染组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1和E-选择素的蛋白水平，明显低于模拟剂NC组4h（P＜0.05）。LPS刺激后8h检测发现，VCAM-1的蛋白水平在模拟剂的转染组显著的低于模仿剂NC的转染组（P＜0.05）。11 第三军医大学博士学位论文5mir-23b抑制剂的转染对LPS刺激以后细胞的炎症因子的表达产生影响抑制剂NC转染组LPS刺激4h、8h后检测发现，其NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和选择素E的表达，比其刺激以前的水平有显著的增加（P＜0.05）。这些炎性因子的表达水平在抑制剂转染组LPS刺激后与刺激前比较，也明显升高（P＜0.05）。此外，抑制剂转染组与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平显著升高。Westernblot分析表明，与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h抑制剂转染组细胞的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，E选择素和VCAM-1蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）。结论：LPS刺激后内皮细胞的miR-23b表达下降，而转染miR-23b模拟剂后，LPS刺激内皮细胞后NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，选择素E的表达下降，而转染miR-23b抑制剂后，LPS刺激内皮细胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、选择素E的表达上调。以往研究表明，这些炎性因子均是脓毒症炎症网络系统(inflammatorynetwork)的重要组成因子，在脓毒症的发生、发展过程中起关键作用。因而我们认为，miR-23b可以通过抑制血管内皮细胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的释放，进而对脓毒症进行调节。12 第三军医大学博士学位论文第二部分microRNA-23b在脓毒症患者外周血的表达收集样本外周血取自20例脓毒症患者、10例SIRS患者及10例正常对照组人群，记录相关的临床资料,并采用mirVanaPARISKit方法进行样本外周血的血清中RNA抽提,然后使用AllinOne的miRNAqRT-PCR法对miRNA-23b在血清中的相对定量进行检测,同时测定血中WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的变化，并结合患者的临床资料测定SOFA评分,比较脓毒症、SIRS及正常对照组血清中miRNA-23b表达的差异,分析血清miRNA-23b的表达与脓毒症患者SOFA评分、WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的关系，并分析脓毒症死亡组与存活组之间的差异，从而判定其与临床指标及预后的相关性。结果1、miR-23b的检测灵敏度以及线性范围miR-23b和U6检测的最低检出界限为6.97pg/μLRNA，在6.97～6.97×104pg/μL的RNA范围内miR-23b和U6测定的Ct值与RNA浓度之间存在良好的线性相关关系(r>0.999)。2、外周血中miR-23b的温度稳定性在4℃保存外周血循环血，1、3及5d后，其总定量RNA从51.32ng/μL下降至18.3ng/μL，由此可见总RNA的降解随保存时间的延长同步增多。而外周循环血的白细胞中miR-23b和U6的表达水平则没有明显变化。3、脓毒症患者病情分析20例脓毒症患者中病情分布为：心内膜炎患者2例，胆道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28d病死率为20%(4/20)；SOFA评分2～11分，平均(5.8±2.52)分。4、外周血中miR-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值变化与对照组相比较，脓毒症组对象的miR-23b表达显著降低(P＜0.01)，同时其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均显著升高(P＜0.01)；而脓毒症组与SIRS组之间比较，各项指标均没有统计学差异(P＞0.05)。5、预后不同，脓毒症病患组内miR-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之间的差异脓毒症患者组中死亡患者与存活患者相比较，miR-23b表达量明显降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平则明显升高(P=0.037,P＜0.01)。两组患者的组间白细13 第三军医大学博士学位论文胞数（P=0.584），血清中TNF-α水平（P=0.324）以及IL-10和TNF-α的比值（P=0.263)均没有显著的统计学差异(P＞0.05)。6、脓毒症患者的miR-23b水平与其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA评分之间的关系脓毒症患者外周血miR-23b表达所需的循环数与其自身的SOFA评分、血清中的TNF-α和IL-10呈显著相关(其r值分别为0.473、0.485和0.470，P＜0.05)；其与WBC计数（r值分别为0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均无明显相关(r值为0.039，P＞0.05)。7、IL-10、TNF-α在脓毒症组病患的表达水平及两者的比值和SOFA评分之间的关系脓毒症患者的SOFA评分与血清中的IL-10(r值为0.369)、TNF-α(r值为0.410)和IL-10与TNF-α的比值(r值分别为0.124)均无明显的相关性（P＞0.05)。限制此研究有许多限制。首先，我们没有使用一个连续的患者人群因此这项研究可能会受到选择偏倚。其次，我们只分析了从最初循环血的相关指标，而并没有随着时间的推移动态观察相应生物标志物的变化。第三，有可能有未测量的干扰因素或混杂。第四，部分纳入脓毒症或SIRS组患者可能有其他疾病的原因，可能是误诊，而最终对其结果形成了干扰。最后，我们的样本规模太小。更大规模的研究可能提供更完整的分析。结论:miRNA-23b的表达水平在脓毒症组患者较正常对照组明显下降，但与SIRS组患者相比较则无明显差异。miRNA-23b的表达水平反应了机体的免疫水平，可能作为脓毒症的严重程度和判断预后的生物学分子标志物,而其能否能在脓毒症的临床辅助诊断以及预后判断中进行应用,则需要大样本量临床研究对其进一步判断,miRNA-23b在脓毒症发生和发展中的相关作用以及机制,任然有待对其进行深入的研究。关键词:脓毒症,miRNA-23b,外周血,分子标志物14 第三军医大学博士学位论文MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及其在脓毒症患者外周血白细胞的表达研究第一章前言脓毒症是一种感染导致的严重全身性炎症反应为特征的医学状况，在严重的创伤、冲烧伤、各种休克、大型手术术后等情况下多见,进一步的发展就可能导致感染[1]性休克和MODS,脓毒症是目前重症监护病房（ICU）患者的主要死亡原因。约28.3[2]％至41％脓毒症患者因多器官功能衰竭进而死亡。脓毒症的相关病理机制被认为错综复杂，免疫促进和抑制在脓毒症中矛盾存在，并与病情发展同步，呈现出相应的变化。机体为病源微生物入侵后，出现炎症性因子的瀑布式释放，免疫能力亢进，机体内由于相关炎症性反应过于强大进而引发免疫源性伤害；而同时机体的相关免疫源性的病例伤害也被过于强大的相关炎症性反应所引发；而同期，脓毒症病例的机体内环境发生变化，以淋巴细胞为代表的大量免疫细胞出现凋亡，机体免疫能力的抑制逐渐发展。免疫的相关调控在脓毒症的病理过程中起着关键的作用。脓毒症的临床表现以全身性的炎症性反应（SIRS）初始，随后进展为伴随有MODS的严重脓毒症，进而导[3]致伴有持续性低血压的脓毒性休克。此外，由于最初的炎症反应也可以由非感染性[4]因素，如烧伤、创伤和急性胰腺炎等，脓毒症可能被误诊为SIRS。因此，迫切需要开发出用于诊断脓毒症更精准的生物标志物。血管内皮细胞（VEC）作为血液和组织之间的重要联系，大量的研究已经发现内皮细胞活化和脓毒症间的联系，而且日益显现出，内皮细胞在脓毒症起着关键作用。脓毒症中内皮细胞激活的变化包括凝血功能、白细胞趋化粘附、血管通透性的变化，与炎症发生发展以及和微循环障碍息息相关。在炎症刺激下，被激活并表达粘附分子，而粘附因子在白细胞聚集起关键作用。内毒素和其他细菌成分作用于内皮细胞，减少血管张力，增加血管内皮细胞之间的空间，增加血管通透性，促进炎症介质的释放，加重血小板聚集。出现凝血功能异常等，进而出现炎症反应综合征（SIRS）和多器官[5，6]功能障碍综合征。尽管这些变化是宿主对感染的正常反应的一部分，但在脓毒症中它们可能过度表达从而成为脓毒症异常的表型的标志。相关研究表明，循环内皮生物标志物的水平增加证明人类脓毒症与内皮细胞的活化相关。这些生物标记物和脓毒症病情的严重程度和器官功能障碍之间的存在关联。15 第三军医大学博士学位论文基于内皮细胞在脓毒症病理生理学中的核心作用，这些发现不仅可以提高我们在脓毒症病理生理过程中的内皮细胞部分的理解，但也可能会提示建议相应目标诊断指标和特定的治疗性干预的可能。microRNA（miRNA）是非编码RNA，可以通过抑制翻译或降解mRNA来调控目标基因的表达，从而对mRNA以及其蛋白表达进行调控，参与调控分泌代谢、炎症性反应、心脏相关疾病、器官的移植和癌症以及其他各种病理性过程。重要的是，miRNA能够被释放到细胞外，从而容易在体液中（血液，汗液，尿液和母乳等）被检测出。分析脓毒症患者体液中miRNA的失调，把细胞外miRNA作为生物标记物的研究正大量进行。miRNA也许能在基因转录调节的水平对脓毒症进行早期诊断，并可能进而评估预后以及治疗提供指导。同时，通过进一步研究脓毒症中相关miRNA的作用，一条脓毒症的蛋白表达的上游调控的治疗方案将被开辟，miRNA可能成为新的靶点或者标记物对治疗脓毒症和预后的预判起到相应的作用。近年来脓毒症方面，重点研究的miRNA主要有miR-125b、miR-150、miR-155、miR-223、miR-132、miR-146等，主要［4-6］关注于其在脓毒症的病理过程中相关的作用以及其相应的调控机制等方面。Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿瘤中呈现低表达，被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用，其功能和作用机制仍在研究中。据报道，mir-23b通过调节炎症细胞因子的途径防止多种自身免疫性疾病，它调节炎症因子如NF-κB，TNF-α，IL-1β和IL-17。NF-κB信号通路在脓毒症中起着重要的调节[7，8][9，10]作用，阻断NF-κB通路是治疗脓毒症的重要方式。因此，我们推测脓毒症中mir-23b可能通过NF-κB通路，从而调节NF-κB介导的炎性通路。而脓毒症患者的外周血液中的miR-23b表达情况及其临床意义尚不清楚。16 第三军医大学博士学位论文第二章MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达脓毒症被认为是一种由感染引起的全身性的炎症反应性综合征，据报道是导致重症监护病房的危重病患者的最主要的死亡原因。目前认为，脓毒症导致机体失调导致[1-4]炎症失控，大量炎症介质的释放，炎性级联反应的发展，最终损害组织和器官。血管内皮细胞（VEC）作为血液和组织之间的重要联系。内皮细胞在炎症的刺激下，被激活并进而表达出粘附因子，而表达的粘附因子被认为在白细胞的聚集过程中有关键性的作用。最近的研究表明，血管内皮细胞是脓毒症病原体及其毒素的主要受害者。例如，内毒素和其他细菌成分作用于内皮细胞，减少血管张力，增加血管内皮细胞之间的空间，增加血管通透性，促进炎症介质的释放，加重血小板聚集。凝血功能进而出现异常，并由此可能出现炎症性反应综合征（SIRS）以及多器官的功能障碍综合征[5，6]。NF-κB信号通路在脓毒症中起着重要的调节作用[7，8]，阻断NF-κB通路是治[9，10]疗脓毒症的重要方式。MicroRNA是单链微小分子的RNA，被认为广泛地存在于各种真核生物机体中，并具有高度保守性以及组织的特异性。其绑定到特定的目的基因mRNA的表达或降解其mRNA，从而促进细胞的增殖、分化、发育、代谢、细胞凋[11-13]亡等生理活动。因而，对真核生物基因有重要的调节作用。Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿瘤中呈现低表达，[14-22]被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用。其功能和作用机制仍在研究中。据报道，mir-23b防止多种自身免疫性疾病通过调节炎症细胞因子的途径，它调[23，24]节炎症因子如NF-κB，TNF-α，IL-1β和IL-17。因此，我们推测脓毒症中mir-23b可能通过NF-κB通路和IL-17，从而调节NF-κB介导的血管内皮细胞的活化。在这项研究中，通过细菌脂多糖（LPS）刺激人类内皮细胞（HUVECs）模拟脓毒症状态，然后转染mir-23b的模仿剂或者抑制剂进入细胞，并观察转染对mir-23b表达的上调和抑制作用，对脓毒症血管内皮细胞表达的炎症调节因子的影响。进而探讨mir-23b作为脓毒症的靶点以及生物标志物的可能性。17 第三军医大学博士学位论文2.1材料和方法2.1.1材料方法2.1.1.1实验仪器及材料(1)主要设备和产地设备名称生产商(产地)光学显微镜Leica公司(德国)恒温水浴箱重庆市医疗仪器公司(中国)台式TGL-16G型离心机Sigma公司(美国)YS-131-U超净工作台苏州安泰公司(中国)AA-200电子天秤DenverInstrument公司(美国)-80℃超低温冰箱青岛海尔（中国）医用眼科剪重庆市医疗仪器公司(中国)医用眼科镊重庆市医疗仪器公司(中国)LDX-40BI压力蒸汽灭菌器上海市中安医疗器械公司(中国)磁力搅拌器，上海市沪西仪器厂(中国)微量移液器Eppendof公司(德国)CO2孵育箱Thermo公司(美国)超纯水仪Millipore公司(美国)液氮罐Thermo公司(美国)(2)药品及试剂药品及试剂名称生产商(产地)胰蛋白酶北京索来宝公司(中国)二甲基亚砜(DMSO)Sigma公司(美国)氯化钾川东化工(中国)二甲苯川东化工(中国)枸橼酸钠川东化工(中国)氢氧化钠川东化工(中国)乙二胺四乙酸(EDTA)北京索来宝公司(中国)磷酸盐缓冲液(PBS)北京中杉金桥公司(中国)胎牛血清(FBS)Gibco公司(巴西)DMEM培养基基干粉Gibco公司(美国)18 第三军医大学博士学位论文青霉素和链霉素的混合液Gibco公司(美国)胎牛血清（Gibco®，澳洲）Thermo公司(美国)Lipofectamine®2000Thermo公司(美国)改良RPMI-1640培养基Hyclone公司(美国)抗体稀释液武汉博士德公司(中国)重组人TNFaSigma公司(美国)细菌LPSSigma公司(美国)mRNA定量PCR试剂盒THUNDERBIRDTOYOBO（日本）SYBR®qPCRMixTRIzol®ReagentThermo公司(美国)Mir-23b抑制物的对照Mir-23b上海吉玛制药InhibitorNCMir-23b的抑制物Mir-23bInhibitor上海吉玛制药Mir-23b模拟物的对照Mir-23bMimicsNC上海吉玛制药Mir-23b的抑制物Mir-23bMimics上海吉玛制药Mir-23b反转录及定量PCR试剂盒常州楚天生物RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitThermo公司(美国)附：Mir-23bInhibitorNC序列：5`CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3`（合成时进行了FAM标记以观察荧光）Mir-23bInhibitor序列：5`GGUAAUCCCUGGCAAUGUGAU3`MimicsNC序列：sense链5`UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3`;anti-sense链5`ACGUGACACGUUCGGAGAATT3`（合成时进行了FAM标记以观察荧光）Mimics序列：sense链5`AUCACAUUGCCAGGGAUUACC3`;anti-sense链5`UAAUCCCUGGCAAUGUGAUUU3`2.1.2主要使用试剂以及溶液的配制方法19 第三军医大学博士学位论文（1）细胞冻存液：15ml的离心管中加入小牛血清9ml，再加入DMSO溶液1ml并进行混匀，放置于4℃冰箱中保存以备使用。（2）磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4，含有0.01mol/LPBS)：取2L装的PBS粉剂，然后使用用1.5L的超纯化水进行溶解，使用磁力搅拌器进行充分搅拌直到其完全的溶解，然后进行定容达到2L后充分地混匀，分装为每瓶250ml，标记并贴标签后，进行高压灭菌，然后放置于4℃冰箱中保存以备使用。（3）完全DMEM培养基：取DMEM的培养基粉1L，在超纯水800ml中溶解，然后加入HEPES2.38g以及NaHCO33.5g，随后加入青霉素-链霉素的混合液10ml，定容达到900ml容量，磁力搅拌器对其搅拌至溶解完全，最后pH值调整到7.2～7.4，这样就得到DMEM的基础的培养液。接着加入FBS100ml，充分的搅拌混匀，再进行真空抽滤，然后再使用0.22µm的溶剂微孔过滤膜对其进行过滤以及除菌，就得到了含有10%血清的完全DMEM培养基，然后250ml分装，并密封，贴上标签，再放置在4℃冰箱中保存以备使用。（4）CCK8试剂：CCK8试剂在-20℃冰箱中被取出，室温放置30min；然后进行融化复温后，使用移液器，将试剂加入1.5ml的EP管中，然后按每管1ml进行分装，贴上标签后，放置于-20℃冰箱中避光保存以备使用。（5）胰酶消化液(含有0.02%的EDTA溶液和0.25%的胰酶)：将胰酶0.25g，EDTA0.02g，共溶于0.01M的PBS溶液内，使用磁力搅拌器进行充分搅拌直到其完全的溶解，然后进行定容达到100ml，使用0.22µm的微孔滤膜进行过滤及除菌，然后进行分装，放置于4℃冰箱中保存以备使用。（6）枸橼酸抗原修复溶液：准备A液(去离子水500ml溶解14.7g枸橼酸钠)以及B液(去离子水500ml溶解10.5g枸橼酸钠)；取A液41ml+B液9ml，定容操作达到500ml，使pH值达到6.0，溶液配置完成。2.1.2实验操作2.1.2.1细胞的培养及传代（1）冻于液氮的人脐静脉的内皮细胞于37℃水浴中快速解冻后常温下1000rpm离心5min，将细胞在加入了生长因子的补充物以及相应抗生素的M200型培养液中重悬，放置在含有5％CO2的培养箱中37℃温度条件下进行培养，按要求隔天进行换液。（2）等待细胞长满后，弃除培养液，然后在加入0.25%的胰酶共0.5ml进行细胞消化，等待细胞已经悬浮以后在以10%的胎牛血清进行终止其消化，然后进行细胞的5计数。常温下，于1000rpm条件下离心细胞悬液5min，然后后按照1×10/ml的密度20 第三军医大学博士学位论文在10cm的培养皿中进行接种，最后放入于含5％CO2的培养箱中37℃条件下培养，按要求隔天进行换液。2.1.2.2转染条件摸索44（1）转染的前一天，在24孔板上分别取1×10到3×10个样本细胞进行接种，随后加入含有10%FBS改良的RPMI-1640型培养基共500μL。（2）放置在5%CO2浓度培养箱中，在37℃温度条件下培养知道细胞汇合已经达到了70-90%。（3）在50μl的无血清Opti-MEM培养基加入Aμl（见下文）mimicsNC或inhibitorNC，柔和混匀。（4）混匀Lipofectamin2000，取Bμ（见下文）l，加到已混匀的50μl无血清Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5分钟。（5）将步骤3、4所得溶液混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便MiR与Lipofectamin2000形成复合物。（6）在复合物形成期间，将含血清改良RPMI-1640培养基更换为500μL无血清改良RPMI-1640培养基。（7）将共100μl的复合物小心加入含有细胞以及500μL的无血清的培养基培养板孔洞中，来回摇晃该细胞培养板，注意轻柔。（8）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了5h以后，将含新鲜血清的改良的RPMI-1640型培养基500μL更换为其培养基，摇晃其培养板进行混匀。（9）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了24h以后，使用荧光显微镜进行观察并拍照。NCFAM(mimicsNC)或InhibitorNCFAM(inhibiotrNC)Lipo20000.3μL（总量6pmol，终浓度10nM）0.3μL0.75μL（总量15pmol，终浓度25nM）0.3μL1.5μL（总量30pmol，终浓度50nM）0.3μL1μL（总量20pmol，终浓度33nM）1μL2.5μL（总量50pmol，终浓度83nM）1μL5μL（总量100pmol，终浓度166nM）1μL21 第三军医大学博士学位论文2.1.2.3LPS和TNF-α筛选44（1）转染的前一天，于12孔板上接种2×10到5×10个样本细胞，然后在加入含10%的FBS改良的RPMI-1640型培养基共500μL。（2）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了24h以后，直至细胞汇合达到了70-90%。（3）向其中4孔中（LPS和TNF-α各两孔，实验设置的复孔）中加入LPS至终浓度为1μg/mL或TNF-α至浓度为10ng/mL。（4）继续培养4h，向其中两孔（实验设置的复孔）加入LPS和TNF-α。（5）继续培养3h，向其中两孔（实验设置的复孔）加入LPS和TNF-α。（6）继续培养1h，向其中两孔（实验设置的复孔）加入LPS和TNF-α。（7）收集细胞，提总RNA，定量PCR。2.1.2.4四种小RNA效果检测和正式转染操作步骤（1）转染前一天，取细胞接种在24孔（定量PCR用）或6孔板（western用）上，加入含10%FBS的改良RPMI-1640培养基。（2）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了24h以后，直至细胞汇合达到了70-90%。（3）在200μl的无血清Opti-MEM培养基加入mimics或inhibitor或各自相应的NC（与各自相应的mimics或inhibitor体积相同），柔和混匀。（4）取混匀的Lipofectamin2000，加到已混匀的无血清Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5分钟。（5）将步骤3、4所得溶液混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便MiR与Lipofectamin2000形成复合物。（6）在复合物形成期间，将含血清改良RPMI-1640培养基更换为无血清改良RPMI-1640培养基（37℃预热）。（7）将复合物加入到培养板孔洞中，其中含有细胞以及无血清的培养基，来回摇晃该细胞培养板，注意轻柔。（8）细胞在CO2培养箱中37℃温育5h后，更换新鲜的含有血清的改良的RPMI-1640型培养基中，摇晃培养板使其混匀。（9）（仅限于四种小RNA效果检测实验）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了24h以后，使用荧光显微镜进行观察并拍照。收集好细胞，进行定量PCR的检测。22 第三军医大学博士学位论文（10）（仅限于正式转染实验）细胞在37℃条件下于CO2的培养箱中温育了24h以后，加入LPS使其达到终浓度为1μg/mL，然后按前面所述方法收集处理4h和8h的细胞，进行定量PCR及westernblotting的检测。根据转染条件摸索的实验结果，从图片来看，不论是Inhibitor类还是Mimics类，小RNA的终浓度为83nM和166nM，lipo2000的使用量为1μL时，转染效果好。但考虑到166nM浓度偏大，且83nM已可获得良好的转染效果，最终确定转染条件为小RNA的终浓度为83nM，lipo2000的使用量为1μL。对于培养基用量为500μL的24板而言，MiRNA的加入量为2.5μL，Lipofectamin2000使用量为1μL；对于12孔或6孔板，按比例增加。2.1.2.5定量PCR（1）细胞总RNA提取（按TRIZOL试剂的操作步骤进行）。第一将培养瓶或者板中的培养液尽量吸除干净后，再加入预冷的4P℃BS溶液1ml，进行轻摇从而洗涤，然后在用微量移液器把PBS溶液尽量吸除干净。第二然后在加入TrizolReagent共1ml，进行轻缓的振荡或者使用枪头进行吹打，从而使细胞破碎。然后把液体转移到1.5ml的EP管中去。第三然后在加入三氯甲烷共250μl，离心管反复地颠倒共15s，以便充分地混匀，随后再静置3min。第四4℃下13000g离心8min。第五随后在把上清液进行转移到新的离心管中去，随后加入0.8倍体量的异丙醇溶液，反复地颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中过夜或者15min。第六4℃下13000rmp条件下离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。第七吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。第八4℃下13000g离心5min或20min。第九将液体吸除干净，将离心管置于超净台上3min。第十加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。（2）反转录第一取一PCR管，加入含2μgRNA的溶液。第二加入1μloligo(dT)18。第三用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。第四于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。第五依次加入4μl5×buffer，2μl10mMdNTPs，1μlRNAinhibitor和1μl反转23 第三军医大学博士学位论文录酶，用枪抽吸混匀。第六在PCR仪器上于42℃条件下保存60min，结束后，再在70℃条件下保存5min以便对反转录酶进行灭活。（3）定量PCR第一取0.2ml规格的PCR用管，按照如下的反应体系进行配制，每一个反转录的产物要求配制3管。试剂量2×qPCRMix12.5μl2.5μM基因引物（或内标引物）2.0μl反转录产物2.0μlddH2O8.5μl说明：对于mRNA，内标引物为actin；对于MiR，内标引物为U6。第二PCR扩增95℃，3min→95℃，15s→59℃，30s→72℃，25s（循环40次）附：定量PCR引物基因引物序列（5`→3`）扩增长度（bp）NF-κB(NM_003998、正义：TGAGTCCTGCTCCTTCCAA150NM_001165412)反义：GAGAGGTGGTCTTCACTGGGIL-6(NM_000600)正义：AAGCAGCAAAGAGGCACTG106反义：TTTCACCAGGCAAGTCTCCTTNF-α(NM_000594)正义：GTGCTGGCAACCACTAAGAAT170反义：GCCTAAGGTCCACTTGTGTCAVCAM-1(NM_001078)正义：GCTGCTCAGATTGGAGACTCA100反义：CGCTCAGAGGGCTGTCTATCE-selectin(NM_000450)正义：AATCCAGCCAATGGGTTCG104反义：GCTCCCATTAGTTCAAATCCTTCTICAM-1(NM_000201)正义：GCTCAAGTGTCTAAAGGATGGC196反义：CATTATGACTGCGGCTGCTAACTB(NM_001101)正义：GCACTCTTCCAGCCTTCCTT112反义：TGTTGGCGTACAGGTCTTTG24 第三军医大学博士学位论文2.1.3统计分析所有的实验都进行三次。数据表示为均数±标准差表示，SPSS16.0行χ检验或t检验。P值<0.05则被认为有统计学上的意义。2.2结果2.2.1转染mir-23b抑制剂抑制了人脐静脉的内皮细胞中的mir-23b的表达；转染模拟剂则可促进mir-23b的表达使用荧光显微镜可见人脐静脉的内皮细胞中，mir-23b发出绿色荧光（图1A）。而定量PCR的结果则表明，mir-23b抑制剂的转染组与空白对照组及NC组相比较，其mir-23b的表达可见显著的降低，表明mir-23b抑制剂的转染抑制mir-23b的表达有效。与此相反，mir-23b模拟剂的转染组与空白组和NC组的模拟剂组相比，则发现mir-23b的表达增高，表明mir-23b模拟剂的转染可促进mir-23b表达（图1B，C）。图12.2.2LPS下调人脐静脉的内皮细胞中mir-23b的表达LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞模拟脓毒症中血管内皮细胞。结果显示，相比没有用LPS刺激细胞表达的miR-23b，转染显著模拟剂对照和拮抗剂对照的细胞LPS刺激4h或8h后的miR-23b25 第三军医大学博士学位论文表达明显下降（P＜0.01）。结果表明，在LPS刺激导致人脐静脉的内皮细胞的mir-23b表达减少，在脓毒症中血管内皮细胞活化伴有mir-23b表达的抑制。相反，在模拟剂转染组与没有LPS刺激的细胞相比较，LPS刺激后4h、8h检测发现，mir-23b表达轻微下降，但仍处于高水平。在抑制剂的转染组中，LPS刺激后内皮细胞所表达的mir-23b则仍然很低。（图2）图22.2.3LPS促进炎性细胞因子表达的影响LPS刺激人脐静脉内皮细后4h、8h检测发现，炎性因子NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素E均显著增加（P＜0.05），表明LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞表达炎性细胞因子，进而导致脓毒症中的炎症反应(图3).图326 第三军医大学博士学位论文2.2.4mir-23b模拟剂抑制LPS刺激后炎症因子的表达LPS刺激人脐静脉的内皮细胞4h、8h在转染模拟NC组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素mRNA表达明显增加（P＜0.05），与转染模拟剂组有明显差异（P＜0.05）（图4A）。图4aWesternblot分析结果表明，LPS刺激后4h检测发现，模拟剂转染组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1和E-选择素的蛋白水平，明显低于模拟剂NC组4h（P＜0.05）。LPS刺激后8h检测发现，VCAM-1的蛋白水平在模拟剂的转染组显著的低于模仿剂NC的转染组（P＜0.05）(图4b)图5a27 第三军医大学博士学位论文图4b图5b2.2.5mir-23b抑制剂的转染对LPS刺激以后细胞的炎症因子的表达产生影响抑制剂NC转染组LPS刺激4h、8h后检测发现，其NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和选择素E的表达，比其刺激以前的水平有显著的增加（P＜0.05）。这些炎性因子的表达水平在抑制剂转染组LPS刺激后与刺激前比较，也明显升高（P＜0.05）。此外，抑制剂转染组与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平显著升高（图5a）。Westernblot分析表明，与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h抑制剂转染组细胞的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，E选择素和VCAM-1蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）（图5b）2.3讨论脓毒症是由感染所引起的全身性的炎性反应性的综合征，被认识是由于病原体对机体的侵袭从而触发了炎症因子的大量释放，从而出现全身性的炎症反应的后果，在严重的创伤、冲烧伤、各种休克、大型手术术后等情况下多见,进一步的发展就可能导28 第三军医大学博士学位论文致感染性休克和MODS,是临床ICU危重病患者死亡中最常见的原因。脓毒症的发病机制是极其复杂的，其病理生理学机制仍未得到界定,研究表明在临床研究方面也并没有有效的治疗措施。脓毒症的病理生理过程中,死亡率与脓毒症患者的免疫应答相关这一观点被广泛认同，其涉及到一系列的复杂反应,包括大量的细胞因子以及各种炎性递质，以及凝血相关系统的激活等等,而血管的内皮细胞的功能变化可能是这一系列病理过程中的中心环节。目前，脓毒症的病理生理方面的研究的重点主要在:对感染的宿主反应、细胞免疫（单核细胞）以及血管内皮细胞的在脓毒症中的作用，其与脓毒症的炎症因子的激活以及凝血系统的级联反应之间密切相关。VEC位于血液循环和血管的平滑肌之间，是两者间的物理屏障，作为血管内层的多功能性细胞,是机体旁分泌的器官，暴露于血液循环中的病原体,对损伤高度敏感,同时并具有自体保护的能力。内皮细胞可以通过调控血管的舒张性、血管渗透压的变化以及可以提供凝血面积等，从而有助于保持器官组织和内环境的稳定。同时,在感染的病理生理过程中,发现VEC功能出现紊乱,并进而导致脓毒症所致的器官、系统的组织和功能的障碍。因而内皮细胞被认为在脓毒症患者病情的进展演化过程中都起了重要的作用。研究认为VEC作为参与脓毒症炎症性免疫应答的主要靶向细胞,同时也是炎症性反应中的效应细胞之一,在机体渗出、趋化、微循环的障碍以及脓毒症休克以及MODS等病理变化中发挥着重要的作用。LPS可以增加VEC的应激，并可激活NF-κB。众所周知，NF-κB是对细胞基因调控的关键分子，许多基因表达的调控与之相关，其中大量与炎症性反应相关。NF-κB活化后，其P65和P50的表达相应上升，使相关炎症性因子的转录提高，促进了炎症性蛋白质的表达，炎性细胞的趋性性提高，并提高了循环白细胞的粘附能力，促进细胞的分化，促使降解基质，并进而促进血管性炎症。VCAM-1、E选择素和ICAM-1作为NF-κB活化后的下游因子，在LPS的刺激下出现高表达，可以促进免疫细胞和VEC的粘附作用，对血管炎症的形成起到关键作用。因此，抑制NF-κB的活性，可能是控制血管炎症的重要途径。目前，microRNA的相关研究已成为一个热点。microRNA是一种内源性非编码单链RNA，大约22个核苷酸长度，它可以降解mRNA或抑制其翻译，从而调节基因[25][26，转录后的表达水平。microRNA的目标基因数可达到人类基因总数的30%以上27]。主要与靶向基因的3'末端的非编码区进行不完全的配对,通过对靶向基因的mRNA翻译的抑制了或者直接降解,从而参与真核生物细胞的分化、增殖和凋亡，进而发育等的生命活动产生影响。29 第三军医大学博士学位论文已有研究证实，miRNA的表达显示出组织来源特异、疾病相关以及显著稳定性，和RNA的表达比较，其稳定性则更显著。循环外周血中的miRNA可作为备选的生物标记分子，外周血相关miRNA的检测抗体预期可被应用于早期诊断疾病、治疗的检测指标治疗和预后的提前预判。研究表明证明病原微生物的入侵，宿主细胞快速产生miRNA，从而可促进相关的炎症性因子诱导免疫释放，同时诱导免疫细胞的凋亡或者使炎性细胞因子降低从而抑[28-33][34]制免疫。因此，miRNA在脓毒症调节炎症反应中的起重要作用。血管内皮细胞是覆盖血管内膜的单层鳞状上皮细胞，作为血管和组织之间的屏障，涉及物质交换、血管张力调节、凝血和炎症反应。血管内皮细胞损伤是脓毒症密切相关。病原微生物[5]和它们的产品可能会损害血管内皮细胞并导致微循环障碍，并导致炎症反应放大效[6，35]应。LPS是革兰阴性杆菌细胞壁主要组成部分，是主要的致病物质，可以引起细胞毒[36]性反应，LPS常用于脓毒症模型的制备。在本研究中，LPS刺激HUVECs以模拟脓毒症中血管内皮细胞。结果表明，LPS促使HUVECs表达炎症因子NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,selectinE,和VCAM-1。Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿瘤中呈现低表达，[37-42]被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用，与肿瘤的发生、转移、耐[23]药等病理进程密切相关，被认为可以调控细胞骨架重建、细胞侵袭和转移，其各项作用及其作用的机制仍在研究之中。miＲ-23b通过靶定TGF-β活性激酶1靶蛋白2(transforminggrowthfactor-βactivatedkinase1bindingprotein2，TAB2)，在自身的免［24，43］疫疾病中可以起到抑制炎症反应的作用，从而对自身免疫疾病起到保护性作用，TAB2/3是NF-κB信号通路的重要调控因素，该信号通路在脓毒症状态下被激活，将胞外信号传导到胞内，并进而参与了细胞的应激、炎症性反应和细胞凋亡等，并被认为在脓毒症的病理过程中起到了核心作用。Mir-23b在脓毒症中的作用未见报道，miＲ-23b是否能通过对NF-κB信号通路的调控作用，达到抑制脓毒症炎性因子释放的作用，未见有文献报道。本实验探讨miＲ-23b通过NF-κB信号通路抑制脓毒症血管内皮细胞炎性因子的释放，为脓毒症的临床治疗提供新的思路。本研究显示LPS刺激HUVECs后miR-23b表达降低。为了探讨miR-23b在脓毒症对血管内皮细胞炎症因子表达的抑制作用，通过转染miR-23b模仿剂和抑制剂，从而上调或下调miR-23b的表达，阴性组作为对照。结果表明，上调miR-23b抑制NF-κ30 第三军医大学博士学位论文B，NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和E选择素的表达，而降低miR-23b则促进以上炎症因子的表达。目前已知大量炎症因子，形成一个彼此交互的复杂网络，对脓毒症的发生发展产[44，45]生重要的作用。众所周知，NF-κB在脓毒症被可激活，并可调节细胞凋亡、细[46-48]胞生长、应激反应、免疫反应和感染性休克。脓毒症发病后3小时，TNF-α和[49、50]IL-6水平峰值，其增加的程度可能反映脓毒症的严重程度。VCAM-1、ICAM-1以及选择素E是重要的粘附因子，可以调节VEC和炎症因子的活性，并可以调节炎[51-53]性细胞向周围组织和器官的迁移移行；从而在脓毒症起着重要的作用。综上所述，LPS的刺激可以激活VEC的NF-κB，进而显著增加黏附因子以及多种炎性因子的表达，miR-23b抑制NF-κB的活性，进而可能通过降低IL-6、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1和E选择素的高表达，从而对抗了LPS的刺激对VEC的致炎作用，进而可以对VEC产生保护作用。由此可能为脓毒症提供新的治疗策略。31 第三军医大学博士学位论文第三章microRNA-23b在脓毒症病人的外周血的白细胞中的表达及意义脓毒症是一种感染导致的严重全身性炎症反应为特征的医学状况，在严重的创伤、冲烧伤、各种休克、大型手术术后等情况下多见,进一步的发展就可能导致感染[54-56]性休克和MODS,是临床ICU危重病患者死亡中最常见的原因。脓毒症诊断明确的越早，对病情程度和预后的判断提前，相应的治疗和干预措施更加及时，脓毒症由早[57]期转为严重的机率就会减少，并进而可以减少脓毒症的死亡率。[56]脓毒症的最大挑战之一的是对其发生发展的病理生理机制的更详细的了解。目前认为，脓毒症导致机体失调导致炎症失控，大量炎症介质的释放，炎性级联反应的[57,58]发展，最终损害组织和器官。相关研究表明，循环中内皮细胞的生物标志物水平的变化，说明人类脓毒症与内皮细胞的活化相关。这些生物标记物和脓毒症病人病情的严重程度，及其与病患的器官组织的功能障碍的存在关联。基于内皮细胞在脓毒症病理生理学中的核心作用，这些发现不仅可以提高我们在脓毒症病理生理过程中的内皮细胞部分的理解，但也可能会提示建议相应目标诊断指标和特定的治疗性干预的可能。MicroRNAs（miRNA，miR）由19-22核苷酸组成，为单链非编码内源性RNA，通过5′末端的2～8个碱基种子区域与靶向mRNA的3′末端完全匹配或者匹配不完全，从而降解靶向mRNA或者抑制其进行翻译，从而在mRNA水平对目标基因的蛋白表[59]达进行调控。通过抑制翻译或通过降解mRNA从而在翻译后基因沉默，发挥作用。miR的靶向基因非常广泛，据信人类基因中30%以上都可以被miR所调控。重要的是，miRNA能够被释放到细胞外，从而容易在体液中（血液，汗液，尿液和母乳等）被检测出。分析脓毒症患者体液中miRNA的失调，把细胞外miRNA作为生物标记物的研究正大量进行。基因的转录和翻译水平研究miRNA，可能作为脓毒症的早期诊断和病情预后判断的新途径。并且，随着脓毒症中miRNA的相关作用的研究进一步深入，对脓毒症的相关蛋白表达的更早期上游的治疗可能将成为将来医学治疗的新进途径，miRNA可能成为新的靶点或者标记物，对治疗脓毒症和预后的预判起到相应的作用。近年来脓毒症方面，重点研究的miRNA主要有miR-125b、miR-150、miR-155、miR-223、miR-132、miR-146等，主要关注于其在脓毒症的病理过程中相关的作用以及其相应［60-63］的调控机制等方面。32 第三军医大学博士学位论文Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿瘤中呈现低表达，被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用，其功能和作用机制仍在研究中[19,64,65］。Zhu等研究表明，mir-23b通过调节炎症细胞因子的途径防止多种自身免疫性[23]疾病，它调节炎症因子如NF-κB，IL-17，IL-1β和TNF-α。因此，我们推测在脓毒症中mir-23b可能通过调控NF-κB的信号通路，从而调节脓毒症中NF-κB所介导的炎性通路。而miR-23b在脓毒症患者的外周血液中的表达以及临床中的意义目前未见报道。本项研究为前瞻性脓毒症临床研究，第一，测试miR-23b相关检测的稳定性，同时进行了线性关系的检测，第二，测试miR-23B的表达，并对照SIRS患者和正常对照组患者，对外周血白细胞中的miR-23b水平与患者的预后、以及血清中相关的炎症性因子（如IL-10、TNF-α）以及SOFA评分[66]之间的相关性进行评价，从而探讨外周血白细胞中miR-23b的表达与脓毒症诊断、预后评价以及病情判断的关系。3.1对象、材料与方法3.1.1研究对象3.1.1.1脓毒症组:2012年12月至2014年11月于武汉华中医院急诊科的重症监护室(EICU)所收住院治疗脓毒症病患20例，要求其符合美国重症医学会(SCCM,SocietyofCriticalCareMedicine)联合欧洲危重病医学会(ESICM,EuropeanSocietyofIntensiveCareMedicine)于2012年提出的诊断标准。其中男性为13例，女性为7例；年龄分布为25～74岁，平均为(50.75±15.6)岁。3.1.1.2SIRS组:10例同期医院EICU收治的非脓毒症SIRS患者，要求符合以下条件:(1)患者体温＞38.0℃或者体温＜36.0℃；(2)患者心率＞90次/分钟；(3)患者的呼吸频率＞20次/分钟或二氧化碳分压＜32mmHg(1mmHg=0.133kPa)；(4)99患者的外周血的计数白细胞＞12×10/L或者＜4×10/L或者其中含有的不成熟细胞＞10%。要求至少符合相关标准的2条以上。其中男性6例，女性4例；年龄为26～75岁，平均为(48.2±17.1)岁。3.1.1.3正常对照组:10例同期的门诊健康体检者，其中男性6例，女性4例;年龄分布为26～72岁，平均为(50±14.3)岁。3组受试者中其性别以及年龄的构成等因素比较发现，均没有统计学上的差异(P＞0.05)，认为其具有可比性。33 第三军医大学博士学位论文3.1.1.4患者签字同意及伦理委员会批准本研究已经通过了当地和医院的医学伦理性委员会的正式批准，同时已经征求了所有受试者或者其家属同意的意愿后，并签署了相关的知情同意书。3.1.1.5临床试验入选标准(1)符合诊断标准，积极配合治疗者；(2)阅读并充分理解患者须知，签署知情同意书。3.1.1.6排除标准：具有下列之一者不可纳入临床试验(1)不符合入选标准者；(2)临床医生认为不适合的病例；(3)无法取得知情同意书；(4)怀孕或哺乳期妇女；(5)长期使用抗凝药物；(6)严重心律失常患者；(7)长期免疫抑制状态,如：器官移植者、长期大剂量的皮质类固醇药物（如>20mg的强的松（或其他等同物）/天）、过去14天内使用了化疗药物治疗、HIV阳性患者。3.1.1.7剔除标准(1)入组后发现不符合诊断者；(2)依从性差的患者；(3)有其他干扰因素者；(4)因其他原因可能影响数据真实性者；3.1.2研究试剂与设备：3.1.2.1主要设备和产地设备生产商（产地）超低温度冰箱Thermo公司（美国）荧光定量PCR仪(ABI7500)ABI公司（美国）超纯水系统Mili-QMILIPORE公司（美国）紫外分光光度计Biorad公司（美国）DENLEYDRAGONWellscanMK3酶标仪Thermo公司（美国）核酸定量检测仪Thermo公司（美国）DK-8A型电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司34 第三军医大学博士学位论文3.1.2.2主要试剂及产地药品及试剂名称生产商(产地)RNA提取试剂盒mirVanaTMPARISTMKitABI公司（美国）PCR试剂盒All-in-OneTMmiRNAGeneCopoeia公司（美国）qRT-PCRDetectionKitmirVanamiRNA提取试剂盒Ambio公司（美国）miRNA检测试剂盒mirVanaqRT-PCRAmbio公司（美国）IL-10和TNF-α检测试剂盒上海市西唐科技公司其他同前实验。3.1.3研究内容及方法3.1.3.1临床资料收集(1)一般情况：住院登记号码、民族、姓名、性别、年龄、受教育程度、饮酒史，吸烟史，用药史等；(2)体格检查：身高、体重、体温、血压、心率；(3)既往病史：高血压病史、高脂血症史，中风史，心脏病史、糖尿病病史等；(4)血生化检查：血脂、血糖等；(5)临床评估：详细询问每位患者的病史及查体。临床各观察指标的记录:按照制式的病例资料登记表，对各组患者情况进行登记记录，包括患者达到脓毒症诊断标准或SIRS诊断标准后24h以内采集的静脉血样本，以及患者目前吸入的氧浓度、尿量、GCS评分、动脉血血气分析结果、患者血小板的计数、外周血的白细胞计数(WBC)、当时的平均动脉压、血乳酸、各种肝脏酶的指标、血总胆红素、血肌酐、血尿素氮等指标，并且取所涉及的各项检测参数以及最差各种化验结果的数据来进行SOFA评分。最后记录各组患者的28d后转归(死亡或者存活)。收集全部研究对象的临床资料,所有患者的诊断均有相关依据。35 第三军医大学博士学位论文SOFA评分：指标指标分值01234PaO2/FiO2>400≤400≤300≤200≤100300–440;urineCr≤110110–170171–299>440;urineoutput<200ml/dayoutput≤500ml/dayBIL≤2020–3233–101102–204>204Dopamine>5orDopamine≤5,Dopamine>15orMAP<70epinephrine≤0.1orhypotensionNohypotensiondobutamine(anyepinephrine>0.1ormmHgnorepinephrinedose)norepinephrine>0.1≤0.1PLT>150≤150≤100≤50≤20GCS1513–1410–126–9<6总分格拉斯哥昏迷评分(GCS)睁眼反应得分言语反应得分运动反应得分正常睁眼4回答正确5按吩咐动作6呼唤睁眼3回答错误4对疼痛刺激能定位5刺痛睁眼2言语错乱3对刺痛有躲避反应4刺痛时肢体屈曲无睁眼1含糊不清23(去皮层状态)刺痛时肢体过伸(去无反应12大脑状态)无反应1备注：将三类所得分数相加，即可得到其GCS的评分（最低为3分，最高为15分）36 第三军医大学博士学位论文3.1.3.2Sepsis组样本采集注意：（1）应该在应用抗生素之前，提前采集细菌学样本，要求尽可能的在45分钟范围内完成此操作；至少留取两份血培养，分别要求来自经皮穿刺所抽取的外周静脉血，和通过置入血管的相应导管抽取的静脉血（留置导管的时间<48h则排除）；（2）其他细菌样本来源有以下途径：脑脊液、尿、伤口或者呼吸道的分泌物或这其他各种体液，采集标本要求不影响应用抗生素的始发时间；（3）常规使用GM实验以及G实验诊断真菌性的感染；（4）为了明确感染的可能部位，尽早进行各种影像检查，如果病患不适宜外出做检查或者对侵入性的操作不能耐受，可以进行床边超声等检查以便明确相关诊断。3.1.3.3血清/血浆标本收集及处理所用血液样品由武汉华中医院EICU提供，所有的试管均已经进行了去RNA酶的处理。SIRS组和脓毒症组患者在达到相应的诊断标准的24h以内，正常组体检是行外周循环静脉血的采集，并进行以下处理:（1）EDTA抗凝管中置入采集到的全血3ml。（2）常温1500rpm条件下离心l5分钟。（3）离心后的上层血清被转移到1.5ml规格EP管中,注意样品使用4℃的冰盒进行运送，并在-80℃冰箱中保存以备使用。3.1.3.4外周血的总RNA的提取所有RNA实验操作物品均经过无酶处理。具体步骤如下：（1）匀浆化：使用EP管提取400µl的血清或者血浆，然后加入Trizol溶液共1ml，充分颠倒混匀后，室温下静置达5分钟；（2）分离：在每1ml的Trizol中分别加入0.2ml的氯仿。确实盖紧管盖后，再使劲摇晃试管持续约15秒，使之充分的混匀后，于室温下静置5分钟，然后以12000rmp条件进行离心处理持续15分钟；（3）沉淀RNA：将离心后的上层水相物质转入准备好的1.5ml型号的EP管中（共约400-500µl）去，随后加入0.5ml的异丙醇溶液，反复地颠倒混匀之后，再放置于-20℃冰箱中保存1小时，然后在4℃下12000rmp条件下离心10min（这里要注意在取上层的水相时，不能够取尽，防治接触到了下层的油相而造成了污染；假如不小心情况下取到了下层的液体，则可以再次行离心重复以上操作，但是尽量注意避免）；37 第三军医大学博士学位论文（4）洗脱RNA：小心去除掉上清，留取离心的沉淀物。然后在加入预冷的现配75%乙醇溶液1ml，行RNA的振荡洗涤并行一次沉淀，最后在4℃温度条件下于7500rmp下进行5分钟的离心；（5）再溶解RNA：小心去除掉上清，然后进行充分的风干（约持续30分钟，这时RNA由于沉淀而变透明）。这里要注意，如果RNA沉淀呈现完全干燥其可溶性就会明显降低，应尽量避免。随后再在离心管中加入0.1%的DEPC处理水20µl进行溶解，在55-60℃条件的恒温水浴温箱中把样品进行10-15min的孵育。（6）保存：RNA完全溶解后，在-80℃的超低温条件下进行保存，或者立即进行逆转录实验。（7）检测样品RNA的纯度：取5µl的RNA样本，将0.1%DEPC处理水按照1：9的比例进行添加，达到50µl，然后在紫外线的分光光度计里面检测样本260/280的吸光值。3.1.3.5检测样品RNA的完整性：将5×TBE的溶液进行稀释，直到形成1×TBE的溶液。然后使用1×TBE的溶液来配制20ml2%的琼脂糖胶，在微波炉中加热溶解约50s，随后加入10mg/ml的EB溶液直到5μg/ml的终浓度，充分混匀后进行灌胶，等待25min使其凝固，然后将其放入准备好的电泳槽里面，加入1×TBE溶液直到比胶面高出大约5mm左右。取样品RNA共5μl，加入1μl的6×loadingbuffer，补足后达到6μl，将其加入RNA的凝胶孔洞中，在100V的稳压下行电泳15-25min。3.1.3.6抽提并富集血清中的循环miRNA（1)将标本血清样本转移到3个1.5ml规格的EP管中，注意EP管要求无RNA酶存在,并使3管的血清含量均为300μ1。（2)在每个EP管中分别加入300μ1的2×Denaturingsolution的溶液,反复吹打使其混匀之后，于冰上放置共5分钟(注意Denaturingsolution的溶液配置时要按要求适量加入硫基乙醇溶液)。（3)把酸性酚加入每个EP管中:将600μl的氯仿,行30-60S的充分振荡,13000rpm条件下进行5min的离心。随后将上清液提取出来,再将其转移到准备好的EP管中。（4)按照上清液在此EP管中含量,加入其1/3体积的无水酒精溶液,反复吹打使其混匀之后，再将其转移到收集管中，此收集管需含有滤筒,于13400rpm条件下进行30S离心。再将滤出液收集后，转入到准备好的EP管中去。38 第三军医大学博士学位论文（5)按照滤出液在此EP管中的含量,加入其1.25倍体积的无水酒精溶液,反复吹打使其混匀之后，在将其转移到收集管中，此收集管需含有滤筒,于13000rpm条件下进行30S离心。将滤出液去除。（6)将1700µl冲洗液加入滤筒中,13000rpm条件下15S离心。将滤出液去除。（7)再将3500u1冲洗液加入滤筒中,13000rpm条件下15S离心，将滤出液去除。再将此环节重复。然后再进行1分钟离心。（8)然后在准备好的收集管里放置滤筒。在此收集管中加入10µl已经95℃预热的洗涤液,13000rpm条件下30S离心。（9)将此次的洗出液收集完毕后,将其在-80℃的环境中保存。以上步骤要求全部在冰盒冰上搡作,并要求所用的枪头和EP管均没有RNA酶污染。操作者口罩及手套防护齐全。3.1.3.7血清中miRNA-23b表达的检测(qRT-PCR法)逆转录反应:使用25µl的逆转录体系,使用1ng的总RNA。冰上融化试剂,RTmastermix准备:试剂量RNA1ng2.5U/µlPolyAPolymerase1µlRTaseMix1µl5XReactionBuffer5µlddH20(RNase-/DNase--free)Tofinal25µl混匀液体,循环条件设置为37℃条件下保温60min；在85℃条件下保温5min。miRNA-23b表达的检测:采用20µl的qRT-PCR体系，反应体系如下:所加试剂容量最终浓度2XAll-in-OneqPCRMix10µl1XAll-in-OnemiRNAqPCRPrimer(2µM)2µl0.2µMUniversalAdaptorPCRPrimer(2µM)2µl0.2µMFirst-strandcDNA(diluted1:5)2µl39 第三军医大学博士学位论文50XROXReferenceDye0.4µl1XNotusingROXReferenceDye4µlUsingROXReferenceDye3.6µlFinalvolume20µl扩增反应在qRT-PCR仪中进行,设置循环条件如下:95℃下10min,然后95℃下10sec,然后60℃下20sec,然后72℃下10sec,完成60个扩增循环之后，进行结果的观察和分析。本研究内参照为U6,标准化CT值如下:ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（U6）。为了便于ΔCt统计处理,以2法计算外周循环血液中的miRNA-23b表达值,并用Log2ΔCt值表示表达改变的倍数。注:荧光信号从开始进行直到所设定的域值过程中所需要的循环数量即为Ct(Cycclethreshold)值,miRNA-23b的表达越高则表示ΔCt值越低。3.1.3.8检测miR-23b方法的灵敏度及测量的线性范围:提取5份正常对照者的外周血的白细胞中的RNA，充分混匀，使用核酸定亮检测仪对总RNA进行定量检测，然后再使用DEPC处理水对其进行10倍逐级稀释，控制RNA浓度范围在6.97～6.97×104tpg/μL，并将每个数量级样本中的miR-23b逐一检测，同时测出其U6内对照的表达。从而了解此定量检测miR-23b方法的灵敏度并因此确定其线性范围。3.1.3.9外周血中的miR-23b的检测稳定性:通过随机选择，将5人份的外周血血样，每份外周血样本被分别装成4管，第一管立刻进行RNA的提取，其余3管则分别在4℃条件下于Ep管中被保存1d、3d和5d，然后进行RNA的提取。提取上述这些样本中RNA并定量检测，同时将上述外周血液样本中的miR-23b和内参照U6的表达进行检测。3.1.3.10血清中的IL-10和TNF-α的表达水平采用ELISA法进行测定，IL-10以及TNF-α的检测灵敏度被设置为15pg/mL。3.1.3.11统计处理:所用数据均需要计算机录入处理,使用SPSS19.0软件对产生的数据统一进行统计学的分析,计量型资料均用(均数±标准差)来进行表示,组间的差异则采用了独立样本的t检验以及卡方检验观察其是否有显著性。以Ｐ＜0.05作为差异有统计学上的意义。40 第三军医大学博士学位论文3.2结果3.2.1miR-23b的检测灵敏度以及线性范围miR-23b和U6检测的最低检出界限为6.97pg/μLRNA，在6.97～6.97×104pg/μL的RNA范围内miR-23b和U6测定的Ct值与RNA浓度之间存在良好的线性相关关系(r>0.999)。结果见图表1。3.2.2外周血中miR-23b的温度稳定性在4℃保存外周血，1、3及5d后，其总定量RNA从51.32ng/μL下降至18.3ng/μL，可见随着保存时间的延长，总RNA的降解增加明显。而miR-23b和U6的表达则没有相应的改变。41 第三军医大学博士学位论文3.2.3关于脓毒症患者的病情分析合计20例脓毒症患者中病情分布为：心内膜炎患者2例，胆道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28d病死率为20%(4/20);SOFA评分2～11分，平均(5.8±2.52)分。正常对照组SIRS组42 第三军医大学博士学位论文Sepsis组注:釆用独立样本的t检验:(1)P<0.05,正常对照组VSsepsis组；（2）P>0.05，正常对照组VSSIRS组；（3）P>0.05，sepsis组VSSIRS组。3.2.4外周血中miR-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值变化与对照组相比较，脓毒症组对象的miR-23b表达显著降低(P＜0.01)，同时其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均显著升高(P＜0.01)；而脓毒症组与SIRS组之间比较，各项指标均没有统计学差异(P＞0.05)。43 第三军医大学博士学位论文3.2.5预后不同，脓毒症病患组内miR-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之间的差异脓毒症患者组中死亡患者与存活患者相比较，miR-23b表达量明显降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平则明显升高(P=0.037,P＜0.01)。两组患者的组间白细胞数（P=0.584），血清中TNF-α水平（P=0.324）以及IL-10和TNF-α的比值（P=0.263)均没有显著的统计学差异(P＞0.05)。3.2.6脓毒症患者的miR-23b水平与其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA评分之间的关系脓毒症患者外周血miR-23b表达所需的循环数与其自身的SOFA评分、血清中的TNF-α和IL-10呈显著相关(其r值分别为0.473、0.485和0.470，P＜0.05)；其与WBC计数（r值分别为0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均无明显相关(r值为0.039，P＞0.05)。3.2.7IL-10、TNF-α在脓毒症组病患的表达水平及两者的比值和SOFA评分之间的关系脓毒症患者的SOFA评分与血清中的IL-10(r值为0.369)、TNF-α(r值为0.410)和IL-10与TNF-α的比值(r值为0.124)P＞0.05，均无明显相关。3.3讨论众所周知，脓毒症是一种感染所导致的医学状况，在严重的创伤、冲烧伤、各种休克、大型手术术后等情况下多见,进一步的发展就可能导致感染性休克和MODS,[55]是临床ICU危重病患者死亡中最常见的原因。约28.3％至41％的脓毒症患者都因[56]为MOF的进展最终死亡。脓毒症的相关病理机制被认为错综复杂，免疫促进和抑44 第三军医大学博士学位论文制在脓毒症中矛盾存在，并与病情发展同步，呈现出相应的变化。机体为病源微生物入侵后，出现炎症性因子的瀑布式释放，免疫能力亢进，机体内由于相关炎症性反应过于强大进而引发免疫源性伤害；而同期，脓毒症病例的机体内环境发生变化，以淋巴细胞为代表的大量免疫细胞出现凋亡，机体免疫能力的抑制趋势逐渐发展。免疫的相关调控在脓毒症的病理过程中起着关键的作用。脓毒症的临床表现以全身性的炎症性反应（SIRS）初始，随后进展为伴随有MODS的严重脓毒症，进而导致伴有持续性[67]低血压的脓毒性休克。此外，由于最初的炎症反应也可以由非感染性因素，如烧伤、创伤和急性胰腺炎等，脓毒症可能被误诊为SIRS。因此，迫切需要开发出用于脓毒症[68]的诊断和治疗预测的更加精准的生物性标志物。MicroRNAs（miRNA，miR）由19-22碱基组成，为单链非编码内源性RNA，通过5′末端的2～8个碱基种子区域与靶向mRNA的3′末端完全匹配或者匹配不完全，从而降解靶向mRNA或者抑制其进行翻译，从而在mRNA水平对目标基因的蛋白表[69]达进行调控。通过抑制翻译或通过降解mRNA从而在翻译后基因沉默，发挥作用。人们普遍认识到，单一的miRNA可以调节数百个基因的转录，从而组织基因表达的[70]复杂程序，进而影响细胞的整体运行。生物信息学预测发现，miR的靶向基因非常广泛，据信人类基因中30%以上都可以被miR所调控。与蛋白分子的调节方式不同，miR通过数个碱基的互补联系，便可以发挥相当精确的调节和控制效能，以定量的精准方式进行靶控基因的调节表达。目前对在不同疾病miRNA的表达谱进行分析，结果发现在不同疾病中,miRNA的表达谱的变化有显著特征,这使miRNA可能成为疾病诊断的生物学标记和治疗的靶[71]标。其在脓毒症的研究中的地位日益突出。而外周血中miRNA的稳定性，可测性和与疾病的相关性成为相关研究的关注点。[72][81]已有研究证实，绝大多数在血浆中的RNA均被确认为小分子RNA。Mitchell等从健康者血浆的进行RNA提后,然后用电泳检测，发现约22个碱基大小的RNA小分子包含其中，随后对18-24碱基大小的RNA小分子片段进行反式转录,并建立了小分子RNAcDNA库,发现已知miRNA占93%，说明了外周循环血中miRNA的真实存在。在临床存在于血液、汗液、尿液和母乳的miRNA可迅速快速测量，较微生物培养快速简便。由于RNA易被降解,循环中RNA的含量较低,因而对体液中RNA作为疾病生物标记物的产生了限制。而外周循环中的miRNA则由于通常处于和蛋白质相结合的[73][74]状态,因而稳定性相对良好。Mitchell等和Chen等的研究都发现，内源性miRNA可以抗核酸酶。另外chen等发现(如在过酸或过碱状态、室温下静置过夜、加热煮沸45 第三军医大学博士学位论文以及反复冰冻和解冻复苏等条件下),miRNA在外周循环血中的表达水平仍然能够维持相对稳定。而且,外周循环血的miRNA表达水平没有显著个体性差异,性别差异也不明显，就能在临床治疗或科学研究中对其设定相应统一的参照值，进而对其进行相关监测以及各种对比。miRNA在循环外周血的血浆和血清之间，其表达也没有差异。由此可见,外周血的循环miRNA有比较好的稳定性,通过常规的RNA提取方法就可以提[75]取，这些为临床和科研上大规模检测外周循环血的miRNA提供了极大的便利。脓毒症被认为是一种由感染引起的全身性的炎症反应性综合征，据报道是导致重症监护病房的危重病患者的最主要的死亡原因。目前认为，脓毒症导致机体失调导致[1-4]炎症失控，大量炎症介质的释放，炎性级联反应的发展，最终损害组织和器官。感染因素和严重的组织损伤诱导免疫活化，导致炎症性因子的过量产生和释放。其中，脓毒症的特征主要是补体系统的活化以及细胞免疫被过度地激活。嗜中性粒细胞和巨噬细胞对相关的补体激活产物、趋化因子、炎症性细胞因子和其他的相应介质产生响应，并进而大量产生氧自由基等次级炎症性介质，从而使炎症性反应的范围被进一步扩大、强度增加，并可增加毛细血管通透性，进而出现组织和器官的损害，导致感染性休克，甚至最终死亡。因此，现代医学认为脓毒症病程中，人体的调节机能障碍是导致不可控的炎症并最终损伤器官组织的关键环节。近来的研究表明，先天免疫通过PRRs识别PAMP，如革蓝阴性细菌的细胞膜中的脂质多糖（LPS），革蓝阳性细菌的肽聚糖（PGN）以及两种细菌共同的DNA基因组（CpGDNA），产生和释放了大量的炎症性介质，从而诱发产生炎症性风暴（cytookinestorm），随后免疫系统表现出免疫抑制，如嗜中性粒细胞麻痹，增加淋巴细胞和树突细胞的细胞凋亡，Th1细胞向Th2[59]细胞的转化。同时机体的多个系统，例如血液凝固系统、自主神经等都参与了脓毒症病程。因而可见，脓毒症是炎性网络共同作用的结果。研究表明病原微生物入侵机体后，宿主细胞快速地产生miRNA，从而促使炎症性细胞因子的大量释放，进而引起了免疫应激，也可以通过促使细胞的凋亡或者可以降低晚期炎症性细胞因子的表达，从而导致免疫抑制。miRNA通过调节转录各因子表达的水平，进而下调了炎症性因子以及炎症性因子的相关信号通路上的受体，从而对炎症中炎症性反应的失衡进行调控，其中包括有抗原的呈递、经典的TLR的信号通路途［76］径、细胞的炎症性因子和淋巴细胞的受体信号通路等。由此可见，在脓毒症的炎症反应调节中miRNA发挥着重要作用。在相关的模型动物中，研究者发现，LPS的刺［77］激促使miR-155的表达水平上调，同时miR-125b的表达水平则出现下调。而在人46 第三军医大学博士学位论文体试验中，有研究报道，脓毒症患者的miR-146b、miR-342、miR-150的表达出现下[78-88]调，而miR-486、miR-182以及miR-143的表达则上调。尽管被认为是TLR-NF-κB途径的关键调节剂，MiRNA还并没有在脓毒症模型研究中被广泛地应用。Mir-23b是新近发现的miR，可以调节多种的信号通路，在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用，并在数种肿[37-42]瘤中呈现低表达，被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用，与肿瘤的发生、转移、耐药等病理进程密切相关，被认为可以调控细胞骨架重建、细胞侵袭[23]和转移，其各项作用及其作用的机制仍在研究之中。miＲ-23b通过靶定TGF-β活性激酶1靶蛋白2(transforminggrowthfactor-βactivatedkinase1bindingprotein2，[65]TAB2)，在自身免疫性疾病中抑制炎症反应，从而对自身免疫性疾病起保护作用，TAB2/3是NF-κB信号通路的重要调控因子，该信号通路在脓毒症状态下被激活，将胞外信号传导到胞内，主要参与细胞应激、炎症反应和凋亡，在脓毒症的发生发展过程中发挥重要作用。在脓毒症领域，已经进行了大量的研究，来分析脓毒症病例的血浆中的miRNA。目前在临床中血液样本的采集被认为最为方便，因而应用最广，从循环中寻找生物标记物比较容易得到标本，因此疾病相关循环miRNA的研究就成为生物标记物研究的热点。但miRNA的检测性能和相应指标达到临床要求，是循环中miRNA在临床应用的前提之一。在本项研究中我们发现，总RNA的降解随着外周循环血样本的保存时间的延长而明显增加，同时4℃下miR-23b的表达水平和内参照U6的表达水平则可以稳定5d以上。通过RT-PCR的结果，可以发现miR-23b和U6之间的线性关系良好，6.97pg/μLRNA为最低的检出限，灵敏度较高。同时本研究还观察到脓毒症组的患者miR-23b的表达量与正常对照组相比较降低显著，同时脓毒症组的患者与SIRS组患者间比较，其miR-23b表达的差异则并没有统计学上的意义。由此可见，外周血miR-23b的表达变化与相应的炎症反应的发生发展相关，而与感染与否无关，因而，miR-23b并不能鉴别SIRS和脓毒症。SOFA评分通过客观而相对简单的方法，连续描述器官衰竭或者功能障碍,同时又能对严重程度进行评价,并能在临床研究中对单个或者多个器官的功能进行反复计量,由此可以较确切的描述机体的器官和组织的功能障碍亦或衰竭。具有能够相对客观、简便，能够动态观察病情变化，同时相关的指标也较易于收集等优点。其对器官衰竭或者功能不全的发生发展过程的描述，对病情判断以及预后的估计均有良好价值。47 第三军医大学博士学位论文相关的研究表明SOFA评分的最高值以及ΔSOFA被认为与病情变化和转归呈正[89]相关，并能较好评价预后，可以协助评价相应生物标记物指标的有效性。我们发现在本研究中脓毒症组病人的miR-23b的表达与患者的SOFA评分呈现出显著的负相关。由此可见，miR-23b的表达与脓毒症的病情轻重密切相关；脓毒症病患的病情越重，SOFA评分就越高，其miR-23b的表达水平越低。此外，脓毒症组中死亡患者与存活者比较，其miR-23b的表达水平显著降低。由此可见，miR-23b的表达与脓毒症的预后相关，即外周血中miR-23b的水平越低，则脓毒症患者的预后越差。TNF-α属于脓毒症的炎症性反应中释放最早的炎性因子之一，也被认为是衡量免疫炎症性反应强弱的一个指标。而IL-10则是抗炎性因子，主要由Th2细胞（CD4+）在体内分泌产生。在脓毒症的病程后期，在Th2细胞主导下，机体的免疫功能处于抑制免疫的状态，而外周血中IL-10则始终保持高表达水平。IL-10与TNF-α之间的比值就可能代表机体处于免疫抑制或者亢进阶段的指标。本研究还发现脓毒症患者的外周血miR-23b表达与血清中TNF-α和IL-10的表达水平呈现出显著的负相关，而与外周血的WBC则没有显著性相关。由此可见，miR-23b的表达水平可以反映患者体内炎症性反应的情况，并且能不受WBC数值的影响，因而可能避免，由于抗生素的使用降低WBC，而对病情的误判。此外，本研究还发现，脓毒症患者组与SIRS组比较，其血清IL-10、TNF-α的水平、外周血WBC以及IL-10和TNF-α的比值之间差异没有统计学的意义。由此可见，以上这些指标只能反映机体中是否存在炎症反应，而对鉴别诊断脓毒症和SIRS没有价值。脓毒症患者组中死亡者与存活者比较，其IL-10和TNF-α的比值和以及血清的IL-10水平均显著升高，而血清的TNF-α表达水平的差异没有统计学的意义。可能提示脓毒症组的死亡患者免疫抑制的状态较重，其预后较差。在本研究中，循环血清中的IL-10、TNF-α以及IL-10和TNF-α之间的比值与SOFA评分之间均没有表现出显著的相关性。本研究有很多局限。首先，我们没有使用一个连续的患者人群，因此这项研究可能会受到选择偏倚。其次，我们只分析了从最初循环血的相关指标，而并没有随着时间的推移动态观察相应生物标志物的变化。第三，有可能有未测量的干扰因素或混杂。第四，部分纳入脓毒症或SIRS组患者可能有其他疾病的原因，可能是误诊，而最终对其结果形成了干扰。最后，我们的样本规模太小。更大规模的研究可能提供更完整的分析。48 第三军医大学博士学位论文综上所述，本研究表明脓毒症组患者的外周血miR-23b的表达显著降低，与外周血的WBC无关。miR-23b不能鉴别SIRS和脓毒症。miR-23b的表达水平不但能反映出机体所处的炎症反应的状态，而且还可能作为判断疾病病情的严重程度以及判别预后的生物学指标。49 第三军医大学博士学位论文全文总结本论文主要包括两部分内容，首先研究了microRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达；另外对外周血microRNA-23b在脓毒症中的表达及意义进行了探讨。第一部分研究了microNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达，主要结论如下：1、转染mir-23b抑制剂抑制了人脐静脉的内皮细胞中的mir-23b的表达；转染模拟剂则可促进mir-23b的表达2、在LPS刺激导致人脐静脉内皮细胞的mir-23b表达减少，在脓毒症中血管内皮细胞活化伴有mir-23b表达的抑制；3、LPS刺激的人脐静脉内皮细胞表达炎性细胞因子，进而导致脓毒症中的炎症反应；4、转染mir-23b模拟剂抑制LPS刺激后细胞NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素的mRNA和蛋白表达；5、转染mir-23b抑制剂增加LPS刺激后细胞NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，E选择素的mRNA和蛋白的表达。结论：miR-23b可以通过抑制血管内皮细胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的释放，进而对脓毒症进行调节。第二部分对外周血microRNA-23b在脓毒症中的表达及意义进行了探讨。主要结论如下：1、miR-23b和U6检测的最低检出界限为6.97pg/μLRNA，在6.97～6.97×104pg/μL的RNA范围内miR-23b和U6测定的Ct值与RNA浓度之间存在良好的线性相关关系。2、在4℃保存外周血循环血，1、3及5d后，其总定量RNA从51.32ng/μL下降至18.3ng/μL，由此可见总RNA的降解随保存时间的延长同步增多。而外周循环血的白细胞中miR-23b和U6的表达水平则没有明显变化。50 第三军医大学博士学位论文3、20例脓毒症患者中病情分布为：心内膜炎患者2例，胆道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28d病死率为20%(4/20)；SOFA评分2～11分，平均(5.8±2.52)分。4、与对照组相比较，脓毒症组对象的miR-23b表达显著降低(P＜0.01)，同时其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均显著升高(P＜0.01)；而脓毒症组与SIRS组之间比较，各项指标均没有统计学差异(P＞0.05)。5、脓毒症患者组中死亡患者与存活患者相比较，miR-23b表达量明显降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平则明显升高(P=0.037,P＜0.01)。两组患者的组间白细胞数（P=0.584），血清中TNF-α水平（P=0.324）以及IL-10和TNF-α的比值（P=0.263)均没有显著的统计学差异(P＞0.05)。6、脓毒症患者外周血miR-23b表达所需的循环数与其自身的SOFA评分、血清中的TNF-α和IL-10呈显著相关(其r值分别为0.473、0.485和0.470，P＜0.05)；其与WBC计数（r值分别为0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均无明显相关(r值为0.039，P＞0.05)。7、脓毒症患者的SOFA评分与血清中的IL-10(r值为0.369)、TNF-α(r值为0.410)和IL-10与TNF-α的比值(r值分别为0.124)均无明显的相关性（P＞0.05)。结论:miRNA-23b的表达水平在脓毒症组患者较正常对照组明显下降，但与SIRS组患者相比较则无明显差异。miRNA-23b的表达水平反应了机体的免疫水平，可能作为脓毒症的严重程度和判断预后的生物学分子标志物,而其能否能在脓毒症的临床辅助诊断以及预后判断中进行应用,则需要大样本量临床研究对其进一步判断,miRNA-23b在脓毒症发生和发展中的相关作用以及机制,任然有待对其进行深入的研究。51 第三军医大学博士学位论文参考文献1.周红，刘鑫，郑江.脓毒症治疗—挑战与机遇并存[J].第三军医大学学报，2013（1）；91-94.2.GomezH,InceC,DeBackerD,etal:Sepsisandinflammation:sepsis-inducedacutekidneyinjury:inflammation,microcirculatorydysfunction,bioenergetics,andthetubularcelladaptationtoinjury.Shock41:3-11,2014.3.PinheiroDSF,MachadoMCandVelascoIT:Neuropeptidesinsepsis:frombrainpathologytosystemicinflammation.Peptides44:135-138,2013.4.王志富，贺福初，周钢桥.MicroRNA对脓毒症调控机制的研究进展[J].中国医学前沿杂志，2012（9）；37-43.5.ZhangZDandMaXC:Injuryofvascularendothelialcellandmicrocirculationdisturbanceinsepsis.ZhongguoWeiZhongBingJiJiuYiXue23:125-128,2011.6.LiMandYuYH:Vascularendothelialcelldysfunctionanditsclinicalstrategyinseveresepsis.ZhonghuaErKeZaZhi49:603-606,2011.7.AdamzikM,SchaferS,FreyUH,etal:TheNF-κB1promoterpolymorphism(-94ins/delattg)altersnucleartranslocationofNF-κB1inmonocytesafterlipopolysaccharidestimulationandisassociatedwithincreasedmortalityinsepsis.Anesthesiology118:123-133,2013.8.RaspeC,HocherlK,RathS,SauvantCandBucherM:NF-κB-mediatedinverseregulationoffractalkineandcx3cr1duringclp-inducedsepsis.Cytokine61:97-103,2013.9.KaplanJ,NowellM,ChimaRandZingarelliB:PioglitazonereducesinflammationthroughinhibitionofNF-κBinpolymicrobialsepsis.InnateImmun2013[Epubaheadofprint]10.LiH,HanW,PolosukhinV,etal:NF-κBinhibitionaftercecalligationandpuncturereducessepsis-associatedlunginjurywithoutalteringbacterialhostdefense.MediatorsInflamm2013:1-9,2013.11.LenkalaD,LacroixB,GamazonER,GeeleherP,ImHKandHuangRS:TheimpactofmicroRNAexpressiononcellularproliferation.HumGenet2014[Epubaheadofprint]52 第三军医大学博士学位论文12.DvingeH,GitA,GrafS,etal:Theshapingandfunctionalconsequencesofthemicrornalandscapeinbreastcancer.Nature497:378-382,2013.13.MeltonC,JudsonRLandBlellochR:Opposingmicrornafamiliesregulateself-renewalinmouseembryonicstemcells.Nature463:621-626,2010.14.冯菲菲.外周血microRNA-23b作为胃癌筛查分子标志物的价值和应用研究[D].浙江：浙江大学，2012：18-3915.LoredanaP,KrellJ,Roca-AlonsoL,StebbingJandCastellanoL:MicroRNA-23bregulatescellulararchitectureandimpairsmotogenicandinvasivephenotypesduringcancerprogression.Bioarchitecture2013[Epubaheadofprint].16.DonadelliMandPalmieriM:RolesformicroRNA23binregulatingautophagyanddevelopmentofpancreaticadenocarcinoma.Gastroenterology145:936-938,2013.17.IshteiwyRA,WardTM,DykxhoornDMandBurnsteinKL:ThemicroRNA-23b/-27bclustersuppressesthemetastaticphenotypeofcastration-resistantprostatecancercells.PLoSOne7:e52106,2012.18.AuYC,TsangTY,YauPLandKwokTT:Humanpapillomavirustype16e6inducescervicalcancercellmigrationthroughthep53/microRNA-23b/urokinase-typeplasminogenactivatorpathway.Oncogene30:2401-2410,2011.19.WangKC,GarmireLX,YoungA,etal:RoleofmicroRNA-23binflow-regulationofRbphosphorylationandendothelialcellgrowth.ProcNatlAcadSciUSA107:3234-3239,2010.20.PellegrinoL,StebbingJ,BragaVM,etal:Mir-23bregulatescytoskeletalremodeling,motilityandmetastasisbydirectlytargetingmultipletranscripts.NucleicAcidsRes41:5400-5412,2013.21.LoftusJC,RossJT,PaquetteKM,etal:MiRNAexpressionprofilinginmigratingglioblastomacells:regulationofcellmigrationandinvasionbymiR-23bviatargetingofPYK2.PLoSOne7:e39818,2012.22.ChenL,HanL,ZhangK,etal:VHlregulatestheeffectsofmir-23bongliomasurvivalandinvasionviasuppressionofhif-1alpha/vegfandbeta-catenin/tcf-4signaling.NeuroOncol14:1026-1036,2012.53 第三军医大学博士学位论文23.ZhuS,PanW,SongX,etal:Themicrornamir-23bsuppressesil-17-associatedautoimmuneinflammationbytargetingtab2,tab3andikk-alpha.NatMed18:1077-1086,2012.24.HuRandO'ConnellRM:Mir-23bisasafeguardagainstautoimmunity.NatMed18:1009-1010,2012.25.BrummerAandHausserJ:Micrornabindingsitesinthecodingregionofmrnas:extendingtherepertoireofpost-transcriptionalgeneregulation.Bioessays2014[Epubaheadofprint]26.TarangSandWestonMD:MacrosinmicroRNAtargetidentification:acomparativeanalysisofinsilico,invitro,andinvivoapproachestomicroRNAtargetidentification.RNABiol2014[Epubaheadofprint]27.BartelDP:MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell116:281-297,2004.28.JernasM,MalmestromC,AxelssonM,etal:MicroRNAregulateimmunepathwaysinT-cellsinmultiplesclerosis(ms).BMCImmunol14:32-42,2013.29.LiYC,ChenY,LiuWandThadhaniR:MicroRNA-mediatedmechanismofvitaminDregulationofinnateimmuneresponse.JSteroidBiochemMolBiol2013[Epubaheadofprint]30.ChenCZ,SchaffertS,FragosoRandLohC:Regulationofimmuneresponsesandtolerance:themicrornaperspective.ImmunolRev253:112-128,2013.31.LourencoAP,Guidugli-LazzariniKR,FreitasFC,BitondiMMandSimoesZL:BacterialinfectionactivatestheimmunesystemresponseanddysregulatesmicroRNAexpressioninhoneybees.InsectBiochemMolBiol43:474-482,2013.32.JernasM,NookaewI,WadenvikHandOlssonB:MicroRNAregulateimmunologicalpathwaysinT-cellsinimmunethrombocytopenia(ITP).Blood121:2095-2098,2013.33.ZhouR,O'HaraSPandChenXM:Micrornaregulationofinnateimmuneresponsesinepithelialcells.CellMolImmunol;8:371-379,2011.34.DuLLandMaZF:MicroRNAandimmuneresponse,andsepsis.ZhongguoWeiZhongBingJiJiuYiXue21:501-503,2009.35.HerwigMC,TsokosM,HermannsMI,KirkpatrickCJandMullerAM:Vascularendothelialcadherinexpressioninlungspecimensofpatientswithsepsis-inducedacute54 第三军医大学博士学位论文respiratorydistresssyndromeandendothelialcellcultures.Pathobiology80:245-251,2013.36.AnandAR,BradleyRandGanjuRK:Lps-inducedMCP-1expressioninhumanmicrovascularendothelialcellsismediatedbythetyrosinekinase,PYK2viathep38mapk/nf-kappab-dependentpathway.MolImmunol46:962-968,2009.37.ChenL,ZhangK,ShiZ,etal:Alentivirus-mediatedmiR-23bspongediminishesthemalignantphenotypeofgliomacellsinvitroandinvivo.OncolRep31:1573-1580,2014.38.ZamanMS,ThamminanaS,ShahryariV,etal:InhibitionofptengeneexpressionbyoncogenicmiR-23b-3pinrenalcancer.PLoSOne7:e50203,2012.39.GengJ,LuoH,PuY,etal:MethylationmediatedsilencingofmiR-23bexpressionanditsroleingliomastemcells.NeurosciLett528:185-189,2012.40.LeoneV,LangellaC,D'AngeloD,etal:MiR-23bandmiR-130bexpressionisdownregulatedinpituitaryadenomas.MolCellEndocrinol390:1-7,2014.41.MajidS,DarAA,SainiS,etal:Mir-23brepressesproto-oncogenesrckinaseandfunctionsasmethylation-silencedtumorsuppressorwithdiagnosticandprognosticsignificanceinprostatecancer.CancerRes72:6435-6446,2012.42.JinL,WesselyO,MarcussonEG,etal:ProoncogenicfactorsmiR-23bandmiR-27bareregulatedbyher2/neu,EGF,andTNF-alphainbreastcancer.CancerRes73:2884-2896,2013.43.OudaR,OnomotoK,TakahasiK,etal:Retinoicacid-induciblegenei-induciblemir-23binhibitsinfectionsbyminorgrouprhinovirusesthroughdown-regulationoftheverylowdensitylipoproteinreceptor.JBiolChem286:26210-26219,2011.44.WuY,LiC,HeY,etal:Relationshipbetweenexpressionofmicrornaandinflammatorycytokinesplasmalevelinpediatricpatientswithsepsis].ZhonghuaErKeZaZhi52:28-33,2014.45.ChenW,ZhaoL,NiuS,etal:Thediagnosticvalueofdifferentpro-inflammatoryfactorinearlydiagnosisofsepsisinpatientswithbloodstreaminfection.ZhonghuaWeiZhongBingJiJiuYiXue26:165-170,2014.46.BrownMAandJonesWK:NF-κbactioninsepsis:theinnateimmunesystemandtheheart.FrontBiosci9:1201-1217,2004.55 第三军医大学博士学位论文47.ThairSandRussellJA:Noncanonicalnuclearfactorkappab(NF-κb)signalingandpotentialfortherapeuticsinsepsis.CurrInfectDisRep15:364-371,2013.48.LiangY,LiX,ZhangX,etal:Elevatedlevelsofplasmatnf-alphaareassociatedwithmicrovascularendothelialdysfunctioninpatientswithsepsisthroughactivatingthenf-kappabandp38mitogen-activatedproteinkinaseinendothelialcells.Shock41:275-281,2014.49.SongR,KimJ,YuD,ParkCandParkJ:KineticsofIL-6andTNF-alphachangesinacaninemodelofsepsisinducedbyendotoxin.VetImmunolImmunopathol146:143-149,2012.50.ShahkarL,KeshtkarA,MirfazeliA,AhaniAandRoshandelG:TheroleofIL-6forpredictingneonatalsepsis:asystematicreviewandmeta-analysis.IranJPediatr21:411-417,2011.51.HildebrandF,PapeHC,HarwoodP,etal:Roleofadhesionmoleculeicaminthepathogenesisofpolymicrobialsepsis.ExpToxicolPathol56:281-290,2005.52.Figueras-AloyJ,Gomez-LopezL,Rodriguez-MiguelezJM,etal:Serumsolubleicam-1,vcam-1,l-selectin,andp-selectinlevelsasmarkersofinfectionandtheirrelationtoclinicalseverityinneonatalsepsis.AmJPerinatol24:331-338,2007.53.ZakiMandEl-SayedH:Evaluationofmicrobiologicandhematologicparametersande-selectinasearlypredictorsforoutcomeofneonatalsepsis.ArchPatholLabMed133:1291-1296,2009.54.DellingerRP1,LevyMM,RhodesA，etal.Survivingsepsiscampaign:internationalguidelinesformanagementofseveresepsisandsepticshock:2012.CritCareMed.2013Feb;41(2):580-637.55.D.C.Angus,W.T.Linde-Zwirble,J.Lidicker,G.Clermont,J.Carcillo,M.R.Pinsky,EpidemiologyofseveresepsisintheUnitedStates:analysisofincidence,outcome,andassociatedcostsofcare,Crit.CareMed.29(7)(2001)1303–1310.56.M.M.Levy,A.Artigas,G.S.Phillips,A.Rhodes,R.Beale,T.Osborn,R.P.Dellinger,OutcomesoftheSurvivingSepsisCampaigninintensivecareunitsintheUSAandEurope:aprospectivecohortstudy,LancetInfect.Dis.12(12)(2012)919–924.57.TheLancet．Newhopeforsepsis［J］．Lancet，2012，379(9825):1462．56 第三军医大学博士学位论文58.RittirschD，FlierlMA，WardPA．Harmfulmolecularmechanismsinsepsis［J］．NatRevImmunol，2008，8(10):776－787．59.HotchkissRS，CoopersmithCM，McDunnJE，etal．Thesepsisseesaw:tiltingtowardimmunosuppression［J］．NatMed，2009，15(5):496－497．60.AmbrosV．ThefunctionsofanimalmicroRNAs．Nature，2004，431:350-35561.O’ConnellRM，TaganovKD，BoldinMP，etal．MicroRNA-155isinducedduringthemacrophageinflammatoryresponse．ProcNatlAcadSciUSA，2007，104:1604-1609．62.TaganovKD，BoldinMP，ChangKJ，etal．NF-κB-dependentinductionofmicroRNAmiR-146，aninhibitortargetedtosignalingproteinofinnateimmuneresponses．ProcNatlAcadSciUSA，2006，103:12481-12486.63.DaiR，PhillipsRA，ZhangY，etal．SuppressionofLPS-inducedinterferongammaandnitricoxideinspleniclymphocytesbyselectestrogen-regulatedmicroRNAs:anovelmechanismofimmunemodulation．Blood，2008，112:4591-4597．64.PellegrinoL，StebbingJ，BragaVM，etal．miＲ-23bregulatescytoskeletalremodeling，motilityandmetastasisbydirectlytargetingmultipletranscripts［J］．NucleicAcidsＲes，2013，41(10):5400-541265.GaoP，TchernyshyovI，ChangTC，etal．c-MycsuppressionofmiR-23a/benhancesmitochondrialglutaminaseexpressionandglutaminemetabolism［J］．Nature，2009，458(7239):762-76566.MarshallJC,BernardGR,LeGallJI,etal.Themeasurementoforgandysfunction/failureasanICUoutcome〔J〕.Sepsis,1997,1:41-58.67.R.C.Bone,W.J.Sibbald,C.L.Sprung,TheACCP-SCCMconsensusconferenceonsepsisandorganfailure,Chest101(6)(1992)1481–1483.68.V.Sankar,N.R.Webster,Clinicalapplicationofsepsisbiomarkers,J.Anesth.27(2)(2013)269–283.69.J.Krol,I.Loedige,W.Filipowicz,ThewidespreadregulationofmicroRNAbiogenesis,functionanddecay,Nat.Rev.Genet.11(9)(2010)597–610.70.D.Baek,J.Villén,C.Shin,F.D.Camargo,S.P.Gygi,D.P.Bartel,TheimpactofmicroRNAsonproteinoutput,Nature455(7209)(2008)64–71.57 第三军医大学博士学位论文71.SchmidtWM，SpielAO，JilmaB，etal．InvivoprofileofthehumanleukocytemicroRNAresponsetoendotoxemia．BiochemBiophysResCommun，2009，380:437-441．72.El-Hefnawy,Tetal.Characterizationofamplifiable,circulatingRNAinplasmaanditspotentialasatoolforcancerdiagnostics.Clinicalchemistry,2004.50(3):564.73.Mitchell,P.S.,etal.,CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.ProcNatlAcadSciUSA,2008.105(30):10513-8.74.Chen,X.,etal.,CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellResearch,2008.18(10):997-1006.75.CortezMA，CalinGA．MicroRNAidentificationinplasmaandserum:anoveltooltodiagnoseandmonitordiseases．ExpertOpinBiolTher，2009，9:703-711．76.PedersenI，DavidM．MicroRNAsintheimmuneresponse．Cytokine，2008，43:391-39477.TiliE，MichailleJJ，CiminoA，etal．ModulationofmiR-155andmiR-125blevelsfollowinglipopolysaccharide/TNF-alphastimulationandtheirpossiblerolesinregulatingtheresponsetoendotoxinshock．JImmunol，2007，179:5082-5089．78.C.Vasilescu,S.Rossi,M.Shimizu,S.Tudor,A.Veronese,M.Ferracin,G.A.Calin,MicroRNAfingerprintsidentifymiR-150asaplasmaprognosticmarkerinpatientswithsepsis,PLoSOne4(10)(2009)e7405.79.C.Roderburg,M.Luedde,D.VargasCardenas,M.Vucur,D.Scholten,N.Frey,T.Luedde,CirculatingmicroRNA-150serumlevelspredictsurvivalinpatientswithcriticalillnessandsepsis,PLoSOne8(1)(2013)e54612.80.J.Wang,M.Yu,G.Yu,J.Bian,X.Deng,X.Wan,K.Zhu,SerummiR-146aandmiR-223aspotentialnewbiomarkersforsepsis,Biochem.Biophys.Res.Commun.394(1)(2010)184–188.81.L.Wang,H.-C.Wang,C.Chen,J.Zeng,Q.Wang,L.Zheng,H.-D.Yu,DifferentialexpressionofplasmamiR-146ainsepsispatientscomparedwithnon-sepsis-SIRSpatients,Exp.Ther.Med.5(4)(2013)1101–1104.82.X.Wang,W.Huang,Y.Yang,Y.Wang,T.Peng,J.Chang,G.-C.Fan,LossofduplexmiR-223(5pand3p)aggravatesmyocardialdepressionandmortalityinolymicrobialsepsis,Biochim.Biophys.Acta1842(5)(2014)701–711.58 第三军医大学博士学位论文83.Y.Ma,D.Vilanova,K.Atalar,O.Delfour,J.Edgeworth,M.Ostermann,G.M.Lord,Genome-widesequencingofcellularmicroRNAsidentifiesacombinatorialexpressionsignaturediagnosticofsepsis,PLoSOne8(10)(2013)e75918.84.H.Wang,K.Meng,W.J.Chen,D.Feng,Y.Jia,L.Xie,SerummiR-574-5p:aprognosticpredictorofsepsispatients,Shock37(3)(2012)263–267.85.X.Sun,B.Icli,A.K.Wara,N.Belkin,S.He,L.Kobzik,M.W.Feinberg,MicroRNA-181bregulatesNF-κB–mediatedvascularinflammation,J.Clin.Investig.122(6)(2012)1973–1990.86.曾小莉，张韶岩，张京岚，李凤梅，马雪莲，米玉红.微小RNA-150在脓毒症患者外周血白细胞的表达及其临床意义[J].中国呼吸与危重监护杂志，2011（4）；360-364.87.F.Tacke,C.Roderburg,F.Benz,D.V.Cardenas,M.Luedde,H.J.Hippe,T.Luedde,LevelsofCirculatingmiR-133aAreElevatedinSepsisandPredictMortalityinCriticallyIllPatients,Crit.CareMed.42(5)(2014)1096–1104.88.WuSC1,YangJC,RauCS,ChenYC,LuTH,LinMW,TzengSL,WuYC,WuCJ,HsiehCH.ProfilingcirculatingmicroRNAexpressioninexperimentalsepsisusingcecalligationandpuncture.PLoSOne.2013Oct30;8(10):e77936.89.ÖzkanDevran,ZuhalKarakurt,NalanAdıgüzel,GökayGüngör,ÖzlemYazıcıoğluMoçin,MerihKalamanoğluBalcı,EceÇelik,CüneytSaltürk,HuriyeBerkTakır,FeyzaKargın,AdnanYılmaz。C-reactiveproteinasapredictorofmortalityinpatientsaffectedwithseveresepsisinintensivecareunit。MultidiscipRespirMed.2012;7(1):47.59 第三军医大学博士学位论文文献综述一脓毒症生物标记物进展[摘要]:目前，即使进行了有效治疗，脓毒症仍然是重症病人死亡的主要原因。目前为止，严重脓毒症和脓毒性休克没有特效药物。相反，早期诊断和因而进行的早期管理如：初始管理治疗是改善脓毒症预后的关键。作为脓毒症的早期检测，生物标记物可以帮助临床医生区分感染和炎症反应。理想情况下，生物标志物可用于风险分级、诊断、治疗反应检测和疗效的预测。超过170种生物标记物对标记和评估脓毒症,包括c反应蛋白、降钙素原、各种细胞因子和细胞表面标记物。最近,研究抗生素管理生物标记导向移植的有效性。然而，众多的生物标志物被研究也说明了没有单一标志物可以诊断、预测和评价脓毒症的治疗。本文总结了脓毒症生物标记物的最新进展。关键词：生物标志物；细胞因子；诊断；疗效；预后；脓毒症[1]严重脓毒症和脓毒性休克是ICU患者死亡的主要原因。脓毒症治疗结果令人失望，尽管长期大量的治疗措施，如大量抗生素应用、努力遵循脓毒症的指导方针(SSC)，和不断发展中的脓毒症器官障碍支持方式(如：透析、呼吸支持、体外膜氧合等)。我们看到重组人活化蛋白C治疗严重脓毒症的兴衰，世界范围内C蛋白临床评估显示重[2、3]症脓毒症死亡率降低没有统计学意义(25%)。除了活化蛋白C，TLR4受体抑制剂[4-6]和重组人乳铁蛋白的疗效也令人怀疑。这些治疗手段在临床试验中的失败几个原因是可以提前预料。脓毒症是，由先天和后天免疫引发包括补体系统的激活、凝血级联和血管内皮系统反应，复杂系统的结果(图1)。针对单一免疫系统的药物改善脓毒症的疗效非常困难。此外，免疫反应是基于个体化患者因素-年龄、基础疾病、营养状态、甚至遗传变异性。由此，相应的治疗，尤其是免疫治疗，必须个体化。此外，患者的致病因素也各不相同。鉴于脓毒症中辅助治疗的疗效不佳，传统的一般治疗的就更显得重要。实际上，脓毒症的标准化治疗，包括基于SSC指南的早期针对性抗生素的使[7、8]用和支持治疗确实提高了疗效。这个结果说明脓毒症的早期、准确检测的必要性。[9、10]然而，临床表现为脓毒症患者的微生物明确诊断不到三分之一。因此，生物标志物可以指导脓毒症的早期诊断和治疗。在这里,我们讨论脓毒症生物标志物的研究方向。60 第三军医大学博士学位论文图1机体对脓毒症的反应和可能的生物标志物机体对脓毒症反应导致多个炎性变化、凝血系统和血管系统。蛋白质生物标记物如细胞因子、可溶性受体和急性期反应产物。DAMP:损伤相关分子模式；PAMP：病原体相关分子模式；SIRS：全身炎症反应综合征脓毒症是机体对微生物病原体感染反应的结果，这意味着抗菌药物对感染性疾病治疗的不足。1904年，WilliamOsler指出，“病人死亡变现出不是来自感染，而是反应”。脓毒症一直被认为是炎症反应失调的结果，“炎症风暴”，导致休克或器官功能障[11]碍。30多个临床试验主要集中在阻止这些炎症级联反应，如类固醇、TNF-α拮抗剂、[12]内毒素抗体。然而，脓毒症的理解和治疗进而转向其免疫抑制作用。例如，老年脓毒症患者缺乏发烧和其他免疫反应，并出现与之相关的不良预后。现在，免疫抑制被认为是脓毒症的死亡率关键点。免疫抑制可能出现由于院内病原体如不动杆菌、肠球菌、嗜麦芽窄食单胞菌或念珠菌，导致的继发感染，进而出现不良预后。此外，一些[13、14]临床试验表明，任何治疗，如重组人白介素7，集落刺激因子可能有效。在脓毒[11、15]症死亡患者的回顾研究中发现有免疫抑制。脓毒症患者脾脏细胞LPS刺激后产生的细胞因子，包括TNF、干扰素γ、IL-6和IL-10均明显降低。此外，脓毒症死亡[15]患者脾组织的免疫效应细胞，包括CD4、CD8细胞和HLA-DR均降低。在当前的脓毒症的免疫模型中早期免疫亢进和后期代偿性炎症反应综合症均可复制(图2)。然而，这并不是一个简单的两相模型。患者之间免疫反应的程度、持续时间因为年龄、基础状态、并发症、病原体毒性、病原体负荷以及遗传因素而不同。随着疾病临床症状的变化，这些因素都会发生变化。脓毒症过程中，免疫抑制持续的时间和程度可能会影响结果，促使我们考虑免疫调节治疗的个性化。61 第三军医大学博士学位论文图2脓毒症的炎症反应脓毒症免疫反应是促炎和抗炎。初始炎症促发阶段，随后免疫抑制阶段。免疫抑制导致老年患者脓毒症死亡率增加。理想生物标志物能反映过度（A）或免疫抑制(B)状态以及炎症反应的方向(A或者C)。理想的生物标志物可以客观地衡量和反映正常和致病过程，并对治疗出现相应的[16]反应。相关实验已经标定了一些潜在生物标记物，超过170的评估脓毒症生物标[17]记物已被研究。脓毒症的发展改变了数以万计炎症、凝血、中间代谢产生的内源[18、19]性炎症介质。生物标志物基础在平衡状态，炎症反应的影响也会导致生物标记物反向变化(图2)。虽然早期诊断是很有有，但是基于变化或反复变化的脓毒症模型的生物标志物水平很难观察死亡率和预测预后。理想的生物标志物可以在脓毒症筛查、早期诊断、危[19、20]险分级、病情评估、预后预测和改善预后中发挥作用,(表1)。62 第三军医大学博士学位论文表1理想脓毒症生物标记物的特征生物标志物的作用有效生物标志物的必要条件筛查患者脓毒症风险客观测量风险分级，甄别患者不良预后的危险有明确参考标准建立脓毒症早期诊断重复性试验验证监测治疗反应生物代谢明确预测预后成本效益较好对正常生理状态下、病理状态或者药物对治疗的反应进行客观观察本综述主要讨论已经计划用于临床使用的脓毒症生物标志物。1.针对脓毒症早期反应的生物标记物传统的脓毒症模型模拟巨噬细胞表面的TLR识别革兰氏阴性细菌的细胞壁后的免疫激活。这是一个模式识别受体(PRR)和病原体相关分子模式(PAMP)的案例。这种识别刺激促炎细胞因子的分泌,如TNF-α、IL-1β、IL–6等。各种炎性细胞因子和LPS因此被作为脓毒症生物标记进行研究。1.1细胞因子和趋化因子TNF-α、IL-1β和IL-6负责中介先天免疫系统对损伤或感染的初始反应。这些促炎细胞因子导致发烧、内皮细胞活化、循环中性粒细胞的趋化以及进入循环系统。研究已经证明，脓毒症患者血液中细胞因子含量增加。然而,这些细胞因子水平的创伤、手术、中风、后或自身免疫性疾病也会增加。因为它们的非特异性，无法区分感染和炎症，使用这些炎性细胞因子诊断脓毒症不现实。报道称TNF-α和il-6水平与器官[21-23]损伤和死亡率有关，可能可以预测预后情况。然而,多克隆羊抗肿瘤坏死因子片[24、25]段的抗原结合片段(CytoFab)预处理的临床试验显示,28天死亡率没有区别。两份报告的不一致可以用半衰期进行解释，TNF半衰期为17分钟，比其他促炎细胞因子生物标记的更早达到峰值浓度。IL-1β水平升高与TNF不同步。因此，TNF和IL-1β不能认为是脓毒症的有效生物标志物。因为炎症反应的复杂性，很难将临床情况认为[26]是特定细胞因子的作用,这可能是由于复杂的炎症反应的结果。最近的研究提出,同[26-28]时测量多种细胞因子观察与疾病严重程度和预后密切相关。63 第三军医大学博士学位论文1.2LPS结合蛋白LPS结合蛋白(LBP),主要由肝脏合成，结合脂多糖的多肽。该LPS-LBP复合物启动的信号转导取决于LBP水平。该复合物具有双重作用,在LPS信号低和高的水平分[29][30、别增强和抑制其水平。血清LBP水平在脓毒症重可增加数倍,促使其可用于诊断31][32、33]。也可能有效预测疾病严重程度和预后。然而,LPS和LBP水平受抗生素的影[34]响，而且一般不与脓毒症的临床相关。因此,作为脓毒症生物标志物作用有限。2．败血症晚期标记物TNF-α和IL-1β发布几分钟的接触有限合伙人。在1990年代后期,研究人员发现LPS处理大鼠死前血清TNF-α和IL-1β回到基线的水平,表明TNF-α以外的介质可能导致死亡。严重感染的后期阶段有两个著名的炎性介质,高迁移族蛋白B1(HMGB1)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)。2.1高迁移族蛋白B1HMGB1是健康者不能检测到，在激活的单核细胞、感染损伤组织或创伤后产生。这一促炎细胞因子8-12小时达到可检测水平，并稳定18-32小时。血浆HMGB1浓[35、36]度被证明严重脓毒症和脓毒性休克患者增加，并与器官衰竭程度相关。在一个前瞻性研究中,HMGB1测量区别3天内幸存者与死亡者中敏感性和特异性分别为66%和[37]67%。HMGB1含量大于4ng/mL3天内死亡的风险增加5.5倍。2.2巨噬细胞迁移抑制因子[38]另一个“迟发”促炎因子,循环MIF通常在2-10ng/mL低水平。血浆MIF浓[39]度在感染时增加,严重脓毒症和脓毒性休克情况下增加明显。最近的一项研究表明，[40]MIF水平可作为脓毒症预后不良的早期指标。这些结果表明，迟发介质如HMGB1和MIF可以预测脓毒症预后。2.3c反应蛋白c反应蛋白(CRP)在1930年的大叶性肺炎患者体内被首次发现。它被确认为在肺[41]炎链球菌感染急性期负责沉淀多糖蛋白质。心内膜炎以及风湿热患者的体内也发现有CRP。在急性严重患者其水平增高，病情缓解则C反应蛋白水平降低。这些特点使CRP被认为是急性期反应物的成员。CRP是临床中最常使用的古老生物标志物。它是一种非特异性炎症的标志物,手术后,烧伤,[42]心肌梗死和风湿性疾病情况下其水平均可增加。CRP作为细菌感染标记物的敏感性[43-46]和特异性分别是68-92%和40-67%。特异性低,无法区分细菌感染和非感染性炎症，使CRP诊断价值有限。然而,c反应蛋白被认为可以评估脓毒症严重程度和预后。[47]c反应蛋白血浆水平已被证明与感染的严重程度相关。据报道，败血症患者抗菌治64 第三军医大学博士学位论文[48]疗后，CRP水平迅速降低与抗炎效果反应相关。c反应蛋白是监测治疗反应的有效生物标志物。然而,在很多临床病例中，经验性抗生素治疗后1-2天，其指导意义是有问题的。临床医生不能脱离C反应蛋白本身的动力学去解释c反应蛋白水平变化。2.4降钙素原降钙素原(PCT)是血降钙素的前体,由健康个体甲状腺组织分泌，监控钙的激素。感染状态下,几乎所有组织包括肺、肝、肾、胰腺、脾脏、结肠癌、脂肪组织均可释放[49]PCT。1993年PCT被第一次被描述为细菌感染的标志物，其在细菌感染后水平升高。2008年美国重症监护医学学院和美国传染病学会提出,PCT作为辅助诊断标记来区分[50]急性细菌感染和其他炎症。在系统回顾和荟萃分析中,PCT被认为其(特异性为81%(95%置信区间:67-90%))比CRP(67%(95%置信区间CI:56-77%))对区分住院病人[46]细菌感染方面更有效。这一荟萃分析PCT中值1.1ng/mL(四分位范围:0.5-2.0ng/mL)。脓毒症诊断或指导抗生素的PCT值尚未完全确定；其诊断的敏感性和特异性需要进一步估算。PCT值需要根据不同感染类型,宿主和病原体进一步评估。另一个最近的荟萃分析表明,PCT是脓毒症重症病人早期诊断的有用的标记物，其敏感性以及特异[51]性则分别为77%(95%的置信区间:72-81%)和79%(95%的置信区间:74-84%)。手术后、心源性休克、热休克、急性移植物排异反应和粒细胞输血等免疫疗法后PCT水平[52、53]均可升高,这可能会限制其败血症生物标志物的可靠性。PCT也被认为可以用于[54]指导抗生素管理，来减少不适当的抗生素使用。然而,许多专家建议PCT指导的决策应该是基于考虑病人临床病情后的一个辅助方法。2.5乳酸在严重脓毒症和脓毒性休克中，血清乳酸水平能反映组织低灌注和低氧代谢。在细胞水平上,能量生产取决于氧气和葡萄糖的新陈代谢，糖酵解的葡萄糖转化为丙酮酸,产生2份腺苷三磷酸(ATPs)。丙酮酸进入三羧酸循环,并产生更多的ATPs。在缺氧的情况下,丙酮酸转化为乳酸。乳酸水平和乳酸-丙酮酸比率升高主要是因为组织低氧进而糖酵解增加,乳酸生产增加。乳酸水平升高也与肝脏乳酸清除功能和线粒体功能障碍[20][55-58]有关。几项研究已经表明,乳酸水平升高与脓毒症患者的死亡率相关。在危重患者的回顾性研究,血清乳酸水平大于2mmol/L与乳酸水平低于2mmol/L患者比较，死[59]亡率为其1.94-10.89倍。在1278患者的一项大型研究中,乳酸水平高于4mmol/L[57]患者与乳酸水平低于2.5mmol/L患者住院死亡率相比较为(28.4%比4.9%)。[60]另一项研究报道,持续高乳酸血症可以预测住院死亡率。与之相对照的是,严重[61]脓毒症和脓毒性休克患者早期乳酸清除与预后结果的改善相关。最近的一个系统回65 第三军医大学博士学位论文[58]顾进一步证实了血乳酸和预测死亡率的标志物价值。最近,从一个回顾性研究的数据，血管加压素脓毒性休克试验和单中心脓毒性休克试验(圣保罗医院队列)曾提出，即使是动脉乳酸很小的浓度增加(1.4-2.3mmol/L)可能预测28天死亡率(敏感性和特异性分别为86%和27%)。此外,数据表明,乳酸水平低于1.4mmol/L患者使用血管加压[56]素可能有益。因此,乳酸筛查和监测可能是用于风险分级和预测脓毒症的结果一个有价值的工具。2.6肾上腺髓质素前体肽原肾上腺髓质素前体肽原(proADM)是一种“细胞因子激素”,与PCT类似，在炎症和感染中发挥细胞因子作用的激素。肾上腺髓质素(ADM)是一个肾上腺髓质产生的52[62]肽氨基酸。ADM生理应力下产生并具有血管扩张和抗炎、抗菌作用的各种功能。[63]脓毒症患者血浆ADM浓度和ADM基因表达增加。然而,循环ADM清除迅速,使其不易测量。因此，血清量化肾上腺髓质素前体肽原片段的研究替代ADM。最近的临床数据表明,脓毒症患者循环肾上腺髓质素前体肽原水平显著高于全身炎症反应综[64]合征(SIRS)患者。恶性血液病患者发热相关最近的一项研究报道,proADM可以预测[65]局部细菌感染，并区分脓毒症与SIRS。此外,proADM与严重脓毒症低血压相关,已[64、66]被建议作为脓毒症一个风险评估和预后预测的标志物。如果进一步的数据支持proADM的预测价值,它就可能是作为预后标记和局部感染的早期诊断的有效标记物。2.7细胞表面标记物和可溶性受体2.7.1CD64CD64是膜糖蛋白，细菌感染患者的CD64表达增加。先天免疫激活后数小时CD64表达增加，健康的个体中性粒细胞不表达。因此,CD64的表达可以反映感染的早期阶段,并帮助做出早期诊断和预后预测。CD64指数被认为是预测细菌培养和并区别脓毒[67]症和其他细菌感染的有效实验。另一项研究表明,成人细菌感染发热患者CD64指[68]数增高,敏感性为87%(95%置信区间:79-92%)，并且CD64高表达与生存率相关。相比之下,报道指其预测危重患者细菌感染，CD64>2.2有特异性，(89%特异性[69](95%CI:83-94%))，但敏感性不高(63%敏感性[95%CI:55-71%])。系统回顾和荟萃分析指出,CD64作为是细菌感染的标志物的敏感性和特异性分别为79%(95%CI:70-86%)和95%(95%CI:85-95%)。然而,由于报道质量较低，还需要进一步的研究来证实[70]。2.7.2可溶性髓系细胞触发受体-166 第三军医大学博士学位论文可溶性触发受体表达髓系细胞1(sTREM-1)是一种是TREM-1的可溶形式，髓样细胞的表面表达的糖肽受体，如中性粒细胞，成熟的单核细胞和巨噬细胞。细菌或真[71–73]菌感染状态下TREM-1表达增加。Gibot等人的前瞻性研究表明，sTREM-1的[74、75]敏感性和特异性诊断败血症与CRP和PCT。分析报道,sTREM-1诊断细菌感染的敏感性和特异性分别为82%(95%置信区间:68-90%)和86%(95%置信区间:77-91%)[76][77]。另一个最近的荟萃分析显示，血浆sTREM-1只能适度区别诊断脓毒症与SIRS。[78]在单中心前瞻性研究报道，严重脓毒症患者生存者入院sTREM-1有独立显著性。[72]此外，sTREM-1快速下降与更好的预后相关。因此，sTREM-1可能用于败血症诊断或预测脓毒症预后。sTREM-1作为生物标志物的有效性需要在临床单独或结合其他生物标记进一步评估。2.7.3可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)是一个在大多数白细胞表面信号表达的受体，[79]在1990年第一次报道。uPAR最初认为协助定向迁移细胞的入侵，但目前认为，其[80]参与多种免疫功能包括细胞粘附、分化、增殖、血管生成以及迁移等。在炎症过程中，uPAR从细胞表面通过蛋白酶裂解，释放可溶性uPAR(suPAR)。其在血液和各种体液包括尿液、脑脊液、支气管冲洗液和唾液等中均可测定。血浆suPAR水平反映细菌或病毒感染、癌症、烧伤和风湿性疾病后的免疫活化。脓毒症患者suPAR水平显著[81]高于那些其他类型危重病人，以及对照组。然而，最近的研究证明，与CRP和PCT[82–84]相比，suPAR对脓毒症的诊断价值较低(特征曲线以下[AUC-ROC]0.62)。几项研[81,84–87]究表明suPAR是脓毒症的严重程度的标记物。在543名急性病患者的前瞻性研究中，在调整了年龄、CRP和Charlson合并症指数后，suPAR基线水平与30天及90[86]天死亡率显著相关。在最新的系统回顾中指出，suPAR预测预后优于包括c反应蛋[84]白、PCT、sTREM-1的其他生物标记。总的来说，suPAR在脓毒症方面可能有更好的预测预后价值，而不是诊断价值。2.8血管生成素血管生成素(Ang)1和2是内皮源性血管生长因子，其二者在脓毒症中作用相反，Ang1稳定内皮，而Ang-2促进内皮完整性破坏和促进血管渗出。Ang-1或Ang-2激活[88]横跨膜的内皮酪氨酸激酶Tie2，而Tie2调节血管的正常稳定状态。[88，89]Ang-2在炎症的诱导中扮演着关键角色。循环高浓度的Ang-2与脓毒症症和多器官功能障碍相关，这表明血管内皮的完整性受损。一项观察脓毒症幸存者队列67 第三军医大学博士学位论文[90]研究表明，其Ang-1水平升高和Ang-2水平降低。内皮系统和Ang-Tie2系统已经成为新进脓毒症研究的焦点。2.9生物标志物和脓毒症评分系统联合评价我们已经讨论了几个脓毒症生物标记物，众多的生物标志物评估脓毒症的诊断和预后中均有中度至良好的敏感性和特异性。然而，在临床中发现，测量一个生物标志物的结果进行判断是不确定的。因此，最近多个生物标志物组合测量被引入。合并有临床和实验室指标的“评分系统”也被开发出来[28、91、92]。2003年,感染概率评分(IPS)介绍了评估危重病人感染的可能性。IPS范围从0到26分，包括病人的体温(0-2分)、心率(0–1分)、呼吸频率(0–1分)、白细胞计数(0-3分)、c反应蛋白(0-6分)、脓毒症相关器官衰竭评估评分(0-2分)。IPS预测感染的ROC曲线下面积是0.82。<14[93]分的患者只有10%的感染风险。几个脓毒症的临床生物标志物和得分组合如表2所[27、31、44、82、91、92、94、95]示。表2生物标志物合并检测的临床试验作者（参考文献）生物标记物检测指标结果Bozzaetal.[27]MCP-1,APACHE-IIPredict28-daymortalityAUC-ROCof0.89aSelbergetal.[44]PCT,C3aDifferentiatesepsisfromSIRSAUC-ROCof0.93suPAR,sTREM-1,MIF,CRP,DifferentiatebacterialinfectionAUC-ROCof0.88Kofoedetal.[82]PCT,WBCfromSIRSbGibotetal.[91]sTREM,PCT,CD64DiagnosesepsisAUC-ROCof0.95Predictseveresepsis,septicAUC-ROCof0.80,0.77,Shapiroetal.[92]NGAL,proteinC,IL-1racshock,anddeathand0.79Kofoedetal.[94]suPAR,sTREM-1,MIF,age30-dayand180-daymortalityAUC-ROCof0.93and0.87Harbarthetal.[95]Temperature,HR,BP,WBC,PCTDifferentiatesepsisfromSIRSAUC-ROCof0.94(−28.6106+0.8912×ln(PCT)+4.3571×ln(C3a)(−28.6106+0.8912×ln(PCT)+4.3571×Ap(sepsis)=e/[1+eln(C3a)].B“bioscore”wascalculatedbyscoringas0or1valuesbeloworaboveeachthresholdvalueforsTREM,PCT,andCD64index.(rawscore)(rawscore)CSepsisScore=probabilityofseveresepsis=[e/1+e]×100;RawScore=−8.7+0.63(NGALquartile)+0.41(IL-1raquartile)+0.50(proteinCquartile)68 第三军医大学博士学位论文APACHE-II,acutephysioloogyandchronichealthevaluationII;AUC-ROC,areasunderreceiveroperatingcharacteristiccurves;BP,bloodpressure;CD,clusterofdifferentiation;CRP,C-reactiveprotein;C3a,complement3a;HR,heartrate;IL-1ra,interleukin-1receptorantagonist;MCP,monocytechemoattractantprotein;MIF,macrophagemigrationinhibitoryfactor;NGAL,neutrophilgelatinase-associatedlipocalin;PCT,procalcitonin;sTREM-1,solublletriggeeringreceptorexpresedonmyeloidcel1,suPAR;solubleformoffurokinase-typeplasminogenactivatarreceptor,WBC;whitebloodcell.包含生物标志物和脓毒症评分系统显示其AUC-ROC值比单一的生物标志物较好。理论上,结合多个标记可以提高诊断和预后价值，因为脓毒症是由多个免疫反应、细胞因子和生物标志物的变化。然而，大量生物标志物组合尚未作为一种高通量技术使用进行研究，其成本效益的评估和综合临床评价还必须进行。3.结论生物标记物对脓毒症的早期诊断、结果预测、抗生素治疗选择的指导有意义。正确理解和合理使用生物标志物是必要的。生物标志物临床评分联合评价以及相关的新进技术，还需要进一步评估。69 第三军医大学博士学位论文参考文献1.LevyMM,DellingerRP,TownsendSR,Linde-ZwirbleWT,MarshallJC,BionJ,SchorrC,ArtigasA,RamsayG,BealeR,ParkerMM,GerlachH,ReinhartK,SilvaE,HarveyM,ReganS,AngusDC.TheSurvivingSepsisCampaign:resultofaninternationalguideline-baseperformanceimprovementprogramtargetinngseveresepsis.IntensiveCareMeed2010;36:221-31.2.RanieriVM,ThompsonBT,BariePS,DhainautJF,DouglasIS,FinferS,GårdlundB,MarshallJC,RhodesA,ArtigasA,PayenD,TenhunenJ,Al-KhalidiHR,ThompsonV,JanesJ,MaciasWL,VangerowB,WilliamsMD;PROWESS-SHOCKStudyGroup.Drotrecoginalfa(activated)inadultswithsepticshock.NEnglJMed2012;366:2055-64.3.VincentJL.Theriseandfallofdrotrecoginalfa(activated).LancetInfectDis2012;12:649-51.4.GuntupalliK,DeanN,MorrisPE,BandiV,MargolisB,RiversE,LevyM,LodatoRF,IsmailPM,ReeseA,SchaumbergJP,MalikR,DellingerRP;TLFLF-0801InvestigatorGroup.Aphase2randomized,double-blind,placebo-controlledstudyofthesafetyandefficacyoftalactoferrininpatientswithseveresepsis.CritCareMed2013;41:706-16.5.McCullohR,OpalSM.Humanrecombinantlactoferrinforsepsis:toogoodtobetrue?CritCareMed2013;41:908-9.6.OpalSM,LaterrePF,FrancoisB,LaRosaSP,AngusDC,MiraJP,WitteboleX,DugernierT,PerrotinD,TidswellM,JaureguiL,KrellK,PachlJ,TakahashiT,PeckelsenC,CordascoE,ChangCS,OeyenS,AikawaN,MaruyamaT,ScheinR,KalilAC,VanNuffelenM,LynnM,RossignolDP,GogateJ,RobertsMB,WheelerJL,VincentJL;ACCESSStudyGroup.Effectoferitoran,anantagonistofMD2-TLR4,onmortalityinpatientswithseveresepsis:theACCESSrandomizedtrial.JAMA2013;309:1154-62.7.DellingerRP,LevyMM,RhodesA,AnnaneD,GerlachH,OpalSM,SevranskyJE,SprungCL,DouglasIS,JaeschkeR,OsbornTM,NunnallyME,TownsendSR,ReinhartK,KleinpellRM,AngusDC,DeutschmanCS,MachadoFR,RubenfeldGD,WebbSA,BealeRJ,VincentJL,MorenoR;SurvivingSepsisCampaignGuidelines70 第三军医大学博士学位论文CommitteeincludingthePediatricSubgroup.Survivingsepsiscampaign:internationalguidelinerformanagementofseveresepsisanddsepticshock:2012.CritCaresMed2013;41:580-637.8.ChoiJH.Recentevidencesofsepsistreatment.InfectChemother2008;40:67-75.9.SandsKE,BatesDW,LankenPN,GramanPS,HibberdPL,KahnKL,ParsonnetJ,PanzerR,OravEJ,SnydmanDR,BlackE,SchwartzJS,MooreR,JohnsonBLJr,PlattR;AcademicMedicalCenterConsortiumSepsisProjectWorkingGroup.Epidemiologyofsepsissyndromesin8academicmedicalcenter.JAMA1997;277:234-40.10.VincentJL,SakrY,SprungKL,RanieriVM,ReinhartK,GerlachHL,MorenoR,CarletJ,LAGallJR,PayenDD;SepsisOccurrenceinAcutellyIllPatientsInvestigators.SepsisinnEuropeanintensivecareunits:resultoftheSOAPstudys.CritCareMed2006;35:344-52.11.HotchkissRS,KarlIT.Thepathophysiologyandtreatmentsofsepsis.NEnglJMedd2003;348:138-51.12.HotchkissR,MonneretG,PayenDR.Immunosuppressioninsepsis:anovellunderstandingofthedisordersandanewtherapeuticsapproach.LancetInfectDisc2013;13:260-68.13.UnsingerJ,McGlynnM,KastenKR,HoekzemaAS,WatanabeE,MuenzerJT,McDonoughJS,TschoepJ,FergusonTA,McDunnJE,MorreM,HildemanDA,CaldwellCC,HotchkissRS.IL-7promotesTcellviability,trafficking,andfunctionalityandimprovessurvivalinsepsis.JImmunol2010;184:3768-79.14.MeiselC,SchefoldJC,PschowskiR,BaumannT,HetzgerK,GregorJ,Weber-CarstensS,HasperD,KehD,ZuckermannH,ReinkeP,VolkHD.Granulocyte-macrophagecolony-stimulatinggfactortoreversesepsis-associattedimmunosuppression:adouble-blind,randomizedd,placebo-controlledmulticentertriall.AmJRespirCritCareMedd2009;180:640-8.15.BoomerJS,ToK,ChangKC,TakasuO,OsborneDF,WaltonAH,BrickerTL,JarmanSD2nd,KreiselD,KrupnickAS,SrivastavaA,SwansonPE,GreenJM,HotchkissRS.Immunosuppressioninpatientwhodieofsepsisandmultiplesorganfailure.JAMA2011;305:2594-605.71 第三军医大学博士学位论文16.BiomarkersDefinitionsWorkingGroup.Biomarkersandsurogateendpoints:preferreddefinitionsandconcepteualframework.ClinPharmacoleTher2001;69:89-96.17.PierrakosC,VincentJ.Sepsisbiomarkers:areview.CritsCare2010;14:R15.18.CalvanoSE,XiaoW,RichardsDE,FelcianoRM,BakerHV,ChoR,ChenRO,BrownsteinBH,CobbJ,TschoekeSK,Miller-GrazianioC,MoldawerLL,MindrinosM,DavisRW,TompkinsRG,LowryF;InflammandHostResponsetoInjuryLargeScaleCollab.Res.Program.Anetwork-basedanalysissofsystemicinflammationinhuman.Nature2005;437:1032-37.19.MarshallJC,ReinhartK;InternationalSepsisForum.Biomarkersofsepsis.CritCareMed2009;37:2290-8.20.SamrajRS,ZingarelliB,WongHR.Roleofbiomarkersinsepsiscare.Shock2013;40:358-65.21.PettiläV,HynninenM,TakkunenO,KuuselaP,ValtonenM.Predictivevalueofprocalcitoninandinterleukin6incriticallyillpatientswithsuspectedsepsis.IntensiveCareMed2002;28:1220-5.22.OberholzerA,SouzaSM,TschoekeSK,OberholzerC,AbouhamzeA,PribbleJP,MoldawerLL.Plasmacytokinemeasurementsaugmentprognosticscoresasindicatorsofoutcomeinpatientswithseveresepsis.Shock2005;23:48893.23.PinskyMR,VincentJL,DeviereJD,AlegreM,KahnRJ,DupontET.Serumcytokinelevelsinhumansepticsshock.Relationtomultiple-systemsorganfailureandmortalitys.Chest1993;103:565-85.24.QiuP,CuiX,BarochiaA,LiY,NatansonC,EichackerPQ.TheevolvingexperiencewiththerapeuticTNFinhibitioninsepsis:consideringthepotentialinfluenceofriskofdeath.ExpertOpinInvestigDrugs2011;20:1555-64.25.RiceTW,WheelerAP,MorrisPT,PazHL,RussellJA,EdensTY,BernardGR.Safetyandefficacyeofaffinity-purified,anti-tumorsnecrosisfactor-alphas,ovinefabforinjection(CytoFabs)inseveresepsis.CritCareMeds2006;34:2271-92.26.LvovschiV,ArnaudL,ParizotC,FreundY,JuillienG,Ghillani-DalbinP,BouberimaM,LarsenM,RiouB,GorochovG,HausfaterP.Cytokineprofilesinsepsishavelimitedrelevanceforstratifyingpatientsintheemergencydepartment:aprospectiveobservationalstudy.PLoSOne2011;6:e28870.72 第三军医大学博士学位论文27.BozzaFA,SalluhJI,JapiassuAQ,SoaresM,AssisEF,GomesRR,BozzaMT,Castro-Faria-NetHC,BozzaPT.Cytokineprofileasmarkersofdiseasedseverityinsepsis:amultiplexedanalysis.CritCare2007;12:R49.28.Andaluz-OjedaD1,BobilloF,IglesiasV,AlmansaR,RicoL,GandíaF,ResinoS,TamayoE,deLejarazuRO,BermejoMartinJF.Acombinedscoreofpro-andanti-inflammatoryinterleukinsimprovesmortalitypredictioninseveresepsis.Cytokine2012;57:332-6.29.JeralaR.StructuralbiologyoftheLPSrecognition.IntJMedMicrobiol2007;297:353-63.30.ZweignerJ,GrammHJ,SingerOC,WegscheiderK,SchumannRR.Highconcentrationsoflipopolysaccha-ride-bindingproteininserumofpatientswithseveresepsisorsepticshockinhibitthelipopolysaccharideresponseinhumanmonocytes.Blood2001;98:3800-8.31.GaïniS,KoldkjaerOG,PedersenC,PedersenSS.Procalcitonin,lipopolysaccharide-bindingprotein,interleukin-6andC-reactiveproteinincommunity-acquiredinfectionsandsepsis:aprospectivestudy.CritCare2006;10:R53.32.OpalSM,ScannonPJ,VincentJK,WhiteM,CarrollSF,PalardyJR,ParejoNA,PribbleJP,LemkeJW.Relationshipbetweenplasmalevelsoflipopolysaccharider(LPS)andLPS-bindingproteinsinpatientwithseveresepsisandsepticshocks.JInfectDis1999;181:1584-9.33.SakrY,BurgettU,NaculFE,ReinhartK,BrunkhorstF.Lipopolysaccharidebindingproteinsinasurgicalintensivecareunits:amarkorofsepsis?CritCareMed2008;36:201422.34.ChoiJH,ShinWS.Pathogenesisofsepsisandconceptsofimmunotherapy.KoreanJInfectDis2000;32:148-57.35.Sundén-CullbergJ,Norrby-TeglundA,RouhiainenA,RauvalaH,HermanG,TraceyKJ,LeeML,AnderssonJ,TokicsL,TreutigerCJ.Persistentelevationofhighmobilitygroupbox-1protein(HMGB1)inpatientswithseveresepsisandsepticshock.CritCareMed2005;33:564-73.36.HatadaT,WadaH,NoboriT,OkabayashiK,MaruyamaK,AbeY,UemotoS,YamadaS,MaruyamaI.PlasmaconcentrationsandimportanceofHighMobilityGroupBox73 第三军医大学博士学位论文proteinintheprognosisoforganfailureinpatientswithdisseminatedintravascularcoagulation.ThrombHaemost2005;94:975-9.37.GibotS,MassinF,CravoisyA,BarraudD,NaceL,LevyB,BollaertPE.High-mobilitygroupbox1proteinplasmaconcentrationsduringsepticshock.IntensiveCareMed2007;33:1347-53.38.PetrovskyN,SochaL,SilvaED,GrossmanAB,MetzC,BucalaRO.Macrophagemigrationinhibitoryfactorsexhibitsapronouncedcircadianrhythmrelevantedtoitsroleasaglucocorticoidscounter-regulator.ImmunolCellBiols2003;81:137-43.39.CalandraT,EchtenacherBT,RoyDL,PuginJ,MetzCNN,HultnerL,HeumannD,MännelDD,BucalaR,GlauserMP.Protectionsfromsepticshockbyneutralizationsofmacrophagemigrationinhibitoryfactors.NatMed2000;7:164-70.40.BozzaFA,GomesRN,JapiassúAM,SoaresM,Castro-Faria-NetoHC,BozzaPT,BozzaMT.Macrophagemigrationinhibitoryfactorlevelscorrelatewithfataloutcomeinsepsis.Shock2004;22:309-13.41.TillettWS,FrancisT.Serologicalreactionsinpneumoniawithanon-proteinsomaticfractionofpneumococcus.JExpMed1930;52:561-71.42.VincentJL,DonadelloK,SchmitX.Biomarkersinthecriticallyillpatient:C-reactiveprotein.CritCareClin2011;27:241-51.43.MüllerB,BeckerKL,SchächingerH,RickenbacherPR,HuberPR,ZimmerliW,RitzR.Calcitoninprecursorsarereliablemarkersofsepsisinamedicalintensivecareunit.CritCareMed2000;28:977-83.44.SelbergO,HeckerH,MartinM,KlosA,BautschW,KöhlJ.Discriminationofsepsisandsystemicinflammatoryresponsesyndromebydeterminationofcirculatingplasmaconcentrationsofprocalcitonin,proteincomplement3a,andinterleukin-6.CritCareMed2000;28:2793-8.45.SuprinE,CamusC,GacouinA,LeTulzoY,LavoueS,FeuilluA,ThomasR.Procalcitonin:avaluableindicatorofinfectioninamedicalICU?IntensiveCareMed2000;26:1232-8.46.SimonL,GauvinF,AmreDK,Saint-LouisP,LacroixJ.SerumprocalcitoninandC-reactiveproteinlevelsasmarkersofbacterialinfection:asystematicreviewandmetaanalysis.ClinInfectDis2004;39:206-17.74 第三军医大学博士学位论文47.PóvoaP,CoelhoL,AlmeidaE,FernandesA,MealhaR,MoreiraP,SabinoH.C-reactiveproteinasamarkerofinfectionincriticallyillpatients.ClinMicrobiolInfect2005;11:101-8.48.SchmitX,VincentJL.ThetimecourseofbloodC-reactiveproteinconcentrationsinrelationtotheresponsetoinitialantimicrobialtherapyinpatientswithsepsis.Infection2008;36:213-9.49.AssicotM,GendrelD,CarsinH,RaymondJ,GuilbaudJ,BohuonC.Highserumprocalcitoninconcentrationsinpatientswithsepsisandinfection.Lancet1993;341:515-8.50.O'GradyNP1,BariePS,BartlettJG,BleckT,CarrollK,KalilAC,LindenP,MakiDG,NiermanD,PasculleW,MasurH;AmericanCollegeofCriticalCareMedicine;InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.Guidelinesforevaluationofnewfeverincriticallyilladultpatients:2008updatefromtheAmericanCollegeofCriticalCareMedicineandtheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica.CritCareMed2008;36:1330-49.51.WackerC,PrknoA,BrunkhorstFM,SchlattmannP.Procalcitoninasadiagnosticmarkerforsepsis:asystematicreviewandmeta-analysis.LancetInfectDis2013;13:426-35.52.ReinhartK,MeisnerM.Biomarkersinthecriticallyillpatient:procalcitonin.CritCareClin2011;27:253-63.53.SchuetzP,AffolterB,HunzikerS,WinterhalderC,FischerM,BalestraGM,HunzikerP,MarschS.Serumprocalcitonin,C-reactiveproteinandwhitebloodcelllevelsfollowinghypothermiaaftercardiacarrest:aretrospectivecohortstudy.EurJClinInvest2010;40:376-81.54.KopteridesP,Siempos,II,TsangarisI,TsantesA,ArmaganidisA.Procalcitonin-guidedalgorithmsofantibiotictherapyintheintensivecareunit:asystematicreviewsandmeta-analysisofrandomiezedcontrolledtrial.CritCareMed2010;37:2229-41.55.MikkelsenME1,MiltiadesAN,GaieskiDF,GoyalM,FuchsBD,ShahCV,BellamySL,ChristieJD.Serumlactatisassociatedwithmortalitysinseveresepsisindependentedoforganfailureandshocks.CritCareMed2009;38:1670-7.75 第三军医大学博士学位论文56.WacharasintP,NakadaTA,BoydJH,RussellJA,WalleyKR.Normal-rangebloodlactateconcentrationinsepticshockisprognosticandpredictive.Shock2012;38:4-10.57.ShapiroNI,HowellMD,TalmorD,NathansonLA,LisbonA,WolfeRE,WeissJW.Serumlactateasapredictorofmortalityinemergencydepartmentpatientswithinfection.AnnEmergMed2005;45:524-8.58.KruseO,GrunnetN,BarfodC.Bloodlactateasapredictorforin-hospitalmortalityinpatientsadmittedacutelytohospital:asystematicreview.ScandJTraumaResuscEmergMed2011;19:74.59.KhosravaniH1,ShahporiR,StelfoxHT,KirkpatrickAW,LauplandKB.Occurrenceandadverseeffectonoutcomeofhyperlactatemiainthecriticallyill.CritCare2009;13:R90.60.ClaridgeJA,CrabtreeTD,PelletierSJ,ButlerK,SawyerRG,YoungJS.Persistentocculthypoperfusionisassociatedwithasignificantincreaseininfectionrateandmortalityinmajortraumapatients.JTrauma2000;48:8-14;discussion14-5.61.NguyenHB,RiversEP,KnoblichBP,JacobsenG,MuzzinA,ResslerJA,TomlanovichMC.Earlylactateclearanceisassociatedwithimprovedoutcomeinseveresepsisandsepticshock.CritCareMed2004;32:1637-42.62.LinscheidP,SeboekD,ZulewskiH,KellerU,MüllerB.Autocrine/paracrineroleofinflammation-mediatedcalcitoningene-relatedpeptideandadrenomedullinexpressioninhumanadiposetissue.Endocrinology2005;146:2699-708.63.HinsonJP,KapasS,SmithDM.Adrenomedullin,amulti-functionalregulatorypeptide.EndocrRev2000;21:138-67.64.Christ-CrainM,MorgenthalerNG,StruckJ,HarbarthS,BergmannA,MüllerB.Mid-regionalpro-adrenomedullinasaprognosticmarkerinsepsis:anobservationalstudy.CritCare2005;9:R816-24.65.AlShuaibiM,BahuRR,ChaftariAM,AlWohoushI,ShomaliW,JiangY,DebianeL,RaadS,JabbourJ,AlAkhrassF,HachemRY,RaadI.Pro-adrenomedullinasanovelbiomarkerforpredictinginfectionsandresponsetoantimicrobialsinfebrilepatientswithhematologicmalignancies.ClinInfectDis2013;56:943-50.66.SuberviolaB,Castellanos-OrtegaA,RuizRuizA,Lopez-HoyosM,SantibañezM.HospitalmortalityprognosticationinsepsisusingthenewbiomarkerssuPARand76 第三军医大学博士学位论文proADMinasingledeterminationonICUadmission.IntensiveCareMed2013;39:1945-52.67.IcardiM,EricksonY,KilbornS,StewartB,GriefB,ScharnweberG.CD64indexprovidessimpleandpredictivetestingfordetectionandmonitoringofsepsisandbacterialinfectioninhospitalpatients.JClinMicrobiol2009;47:3914-9.68.CidJ,García-PardoG,AguinacoR,SánchezR,LlorenteA.NeutrophilCD64:diagnosticaccuracyandprognosticvalueinpatientspresentingtotheemergencydepartment.EurJClinMicrobiolInfectDis2011;30:845-52.69.GrosA,RousselM,SauvadetE,GacouinA,MarquéS,ChimotL,LavouéS,CamusC,FestT,LeTulzoY.ThesensitivityofneutrophilCD64expressionasabiomarkerofbacterialinfectionislowincriticallyillpatients.IntensiveCareMed2012;38:445-52.70.CidJ,AguinacoR,SánchezR,García-PardoG,LlorenteA.NeutrophilCD64expressionasmarkerofbacterialinfection:asystematicreviewandmeta-analysis.JInfect2010;60:313-9.71.BouchonA,FacchettiF,WeigandMA,ColonnaM.TREM1amplifiesinflammationandisacrucialmediatorofsepticshock.Nature2001;410:1103-7.72.GibotS.Clinicalreview:roleoftriggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1duringsepsis.CritCare2005;9:485-9.73.FordJW,McVicarDW.TREMandTREM-likereceptorsininflammationanddisease.CurrOpinImmunol2009;21:38-46.74.GibotS,Kolopp-SardaMN,BénéMC,CravoisyA,LevyB,FaureGC,BollaertPE.Plasmalevelofatriggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1:itsdiagnosticaccuracyinpatientswithsuspectedsepsis.AnnInternMed2004;141:9-15.75.ZhangJ,SheD,FengD,JiaY,XieL.Dynamicchangesofserumsolubletriggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1(sTREM-1)reflectsepsisseverityandcanpredictprognosis:aprospectivestudy.BMCInfectDis2011;11:53.76.JiyongJ,TianchaH,WeiC,HuahaoS.Diagnosticvalueofthesolubletriggeringreceptrrexpressedonmyeloidcell-1inbacterialinfection:ametaanalysis.IntensiveCareMeda2009;35:587-95.77 第三军医大学博士学位论文77.WuY,WangF,FanX,BaoR,BoL,LiJ,DengX.AccuracyofplasmasTREM-1forsepsisdiagnosisinsystemicinflammatorypatients:asystematicreviewandmeta-analysis.CritCare2012;16:R229.78.JeongSJ,SongYG,KimCO,KimHW,KuNS,HanSH,ChoiJY,KimJM.MeasurementofplasmasTREM-1inpatientswithseveresepsisreceivingearlygoal-directedtherapyandevaluationofitsusefulness.Shock2012;37:574-8.79.PlougM,RønneE,BehrendtN,JensenAL,BlasiF,DanøK.Cellularreceptorforurokinaseplasminogenactivator.Carboxyl-terminalprocessingandmembraneanchoringbyglycosyl-phosphatidylinositol.JBiolChem1991;266:1926-33.80.BlasiF,CarmelietP.uPAR:aversatilesignallingorchestrator.NatRevMolCellBiol2002;3:932-43.81.KochA,VoigtS,KruschinskiC,SansonE,DückersH,HornA,YagmurE,ZimmermannH,TrautweinC,TackeF.Circulatingsolubleurokinaseplasminogenactivatorreceptorisstablyelevatedduringthefirstweekoftreatmentintheintensivecareunitandpredictsmortalityincriticallyillpatients.CritCare2011;15:R63.82.KofoedK,AndersenOL,KronborgG,TvedeM,PetersernJ,Eugen-OlsenJ,LarsernK.UseofplasmaCreactiveprotein,procalcitonion,neutrophils,macrophagemigratininhibitoryfactor,solubleurokinasetypeplasminogenactivatorreceptors,andsolubletriggeringreceptorexpresseedonmyeloidcells-1incombinrationtodiagnoseinfections:aprospectivedstudy.CritCare2007;12:R38.83.KochA,TackeF.WhyhighsuPARisnotsuper--diagnostic,prognosticandpotentialpathogenicpropertiesofanovelbiomarkerintheICU.CritCare2011;15:1020.84.BackesY,vanderSluijsKF,MackieDP,TackeF,KochA,TenhunenJJ,SchultzMJ.UsefulnessofsuPARasabiologicalmarkerinpatientswithsystemicinflammationorinfection:asystematicreview.IntensiveCareMed2012;38:1418-28.85.DonadelloK,ScollettaS,CovajesC,VincentJL.suPARasaprognosticbiomarkerinsepsis.BMCMed2012;10:2.86.HauptTH,PetersenJ,EllekildeG,KlausenHH,ThorballCW,Eugen-OlsenJ,AndersenO.PlasmasuPARlevelsareassociatedwithmortality,admissiontime,andCharlsonComorbidityIndexintheacutelyadmittedmedicalpatient:apreospectiveobservationalstudyy.CritCare2012;16:R130.78 第三军医大学博士学位论文87.Uusitalo-SeppäläR,HuttunenR,TarkkaM,AittoniemiJ,KoskinenP,LeinoA,VahlbergT,RintalaEM.Solubleurokinase-typeplasminogenactivatorreceptorinpatientswithsuspectedinfectionintheemergencyroom:aprospectivecohortstudy.JInternMed2012;272:247-56.88.DavidS,KümpersP,vanSlykeP,ParikhSM.Mendingleakybloodvessels:theangiopoietin-Tie2pathwayinsepsis.JPharmacolExpTher2013;345:2-6.89.FiedlerU,ReissY,ScharpfeneckerM,GrunowV,KoidlS,ThurstonG,GaleNW,WitzenrathM,RosseauS,SuttorpN,SobkeA,HerrmannM,PreissnerKT,VajkoczyP,AugustinHG.Angiopoietin-2sensitizesendothelialcellstoTNF-alphaandhasacrucialroleintheinductionofinflammation.NatMed2006;12:235-9.90.RicciutoDR,dosSantosCC,HawkesM,ToltlLJ,ConroyAL,RajwansN,LaffertyEI,CookDJ,Fox-RobichaudA,KahnamouiK,KainKC,LiawPC,LilesWC.Angiopoietin-1andangiopoietin-2asclinicallyinformativeprognosticbiomarkersofmorbidityandmortalityinseveresepsis.CritCareMed2011;39:702-10.91.GibotS,BénéMC,NoelR,MassinF,GuyJ,CravoisyA,BarraudD,DeCarvalhoBittencourtM,QuenotJP,BollaertPE,FaureG,CharlesPE.Combinationbiomarkerstodiagnosesepsisinthecriticallyillpatient.AmJRespirCritCareMed2012;186:65-71.92.ShapiroNI,TrzeciakS,HoallanderJE,BirkhahnR,OteroaR,OsbornTM,MoretiE,NguyenHB,GunersonKJ,MilzmanD,GaieaskiDF,GoyalM,CairansCB,NgoL,RiverEP.Aprospective,multi-centerderivationofabiomarkerpaneiltoassessriskoforgandysfunctions,shock,anddeathinemergencydepartmentspatientswithsuspectsepsis.CritCareMed2009;(38):96-104.93.PeresBotaD,MélotC,LopesFerreiraF,VincentJL.InfectionProbabilityScore(IPS):Amethodtohelpassesstheprobabilityofinfectionincriticallyillpatients.CritCareMed2003;31:2579-84.94.KofoedK,Eugen-OlsenJ,PetersenJ,LarsenK,AndersenO.Predictingmortalityinpatientswithsystemicinflammatoryresponsesyndrome:anevaluationoftwoprognosticmodels,twosolublereceptors,andamacrophagemigrationinhibitoryfactor.EurJClinMicrobiolInfectDis2008;27:375-83.79 第三军医大学博士学位论文95.HarbarthS,HoleckovaK,FroidevauxC,PittetD,RicouB,GrauGE,VadasL,PuginJ;GenevaSepsisNetwork.Diagnosticvalueofprocalcitonin,interleukin-6,andinterleukin-8incriticallyillpatientsadmittedwithsuspectedsepsis.AmJRespirCritCareMed2001;164:396-402.80 第三军医大学博士学位论文文献综述二脓毒症中MicroRNA作用的研究进展[摘要]:脓毒症是重症监护室（ICU）死亡的主要原因。为识别脓毒症的原因和严重程度，大量生物标记物已被研究，但均不能区别感染性和非感染性炎症反应。microRNA（miRNA）是非编码RNA，可以通过抑制翻译或降解mRNA来调控目标基因的表达。重要的是，miRNA能够被释放到细胞外，从而容易在体液中（血液，汗液，尿液和母乳等）被检测出。分析脓毒症患者体液中miRNA的失调，把细胞外miRNA作为生物标记物的研究正大量进行。迄今为止，在预测和诊断脓毒症方面，miR-223、miR-146a、miR-150都被认为有潜在可能。此外，多个细胞内的miRNA在调节TLR-NF-κB途径中起关键作用。在这里，我们综述了脓毒症中miRNA作用，脓毒症循环系统中的miRNA作为生物标志物和细胞内miRNA调节脓毒症炎症反应可能机制的最新进展。关键词：脓毒症，miRNAs，生物标志物，炎性反应，NF-κB脓毒症是一种感染导致的以严重的全身性的炎症反应为特征的医学状况，在严重的创伤、冲烧伤、各种休克、大型手术术后等情况下多见,进一步的发展就可能导致[1]感染性休克和MODS,是临床ICU危重病患者死亡中最常见的原因。约28.3％至41[2]％脓毒症患者因多器官功能衰竭进而死亡。脓毒症的相关病理机制被认为错综复杂，免疫促进和抑制在脓毒症中矛盾存在，并与病情发展同步，呈现出相应的变化。机体为病源微生物入侵后，出现炎症性因子的瀑布式释放，免疫能力亢进，机体内由于相关炎症性反应过于强大进而引发免疫源性伤害；而同时机体的相关免疫源性的病例伤害也被过于强大的相关炎症性反应所引发；而同期，脓毒症病例的机体内环境发生变化，以淋巴细胞为代表的大量免疫细胞出现凋亡，机体免疫能力的抑制逐渐发展。免疫的相关调控在脓毒症的病理过程中起着关键的作用。脓毒症的临床表现以全身性的炎症性反应（SIRS）初始，随后进展为伴随有MODS的严重脓毒症，进而导致伴有持[3]续性低血压的脓毒性休克。此外，由于最初的炎症反应也可以由非感染性因素，如[4]烧伤、创伤和急性胰腺炎等，脓毒症可能被误诊为SIRS。因此，迫切需要开发出用于诊断脓毒症更精准的生物标志物。在过去的十年中，已经进行大量研究，以找出可以明确脓毒症阶段、严重程度，并可以预测治疗预后的生物标志物。但这些这些生物标志物均不能识别SIRS和脓毒症导致的炎症反应的区别，现在新进的生物标志物如C81 第三军医大学博士学位论文反应蛋白（CRP），降钙素原（PCT），白细胞介素-6（IL-6），可溶性髓系细胞触发受体-1（sTREM-1）以及其他多种标志物正在被研究来检测是否为感染引发的SIRS。CRP，[5]肝脏中发现的一种急性期蛋白，被认为在的感染清除病原体中发挥的辅助作用。降[6]钙素，在甲状腺C-细胞中发现的前体激素，感染期间大量释放到血流中。可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)，在细菌或真菌感染过程中被巨噬细胞被释放到血浆中，[7]是髓样细胞1表达的触发受体。这些因素都可能成为一个感染诱发炎症反应的指标，[4]但实验数据表明在非感染性炎症反应中也同时存在。1.MicroRNAs简介MicroRNAs（miRNA，miR）由19-22核苷酸组成，为单链非编码内源性RNA，通过5′末端的2～8个碱基种子区域与靶向mRNA的3′末端完全匹配或者匹配不完全，从而降解靶向mRNA或者抑制其进行翻译，从而在mRNA水平对目标基因的蛋白表达进行调控。通过抑制mNRA的翻译或通过降解mRNA从而在翻译后基因沉默，发[8]挥作用。人们普遍认识到，单一的miRNA可以调节数百个基因的转录，从而组织基[9]因表达的复杂程序，进而影响细胞的整体运行。生物信息学的相关预测指出，miR的靶向基因非常广泛，据信人类基因中30%以上都可以被miR所调控。与蛋白分子的调节方式不同，miR通过数个碱基的互补联系，便可以发挥相当精确的调节和控制效能，以定量的精准方式进行靶控基因的调节表达。显而易见，miRNA表达的变化已经牵涉多种疾病状态，如心血管疾病，自身免疫性疾病，神经变性疾病，肝脏疾病和[10]炎性疾病。Lawrieetal比较B细胞淋巴瘤患者与健康人血清miRNA水平后，第一个[11]提出miRNA作为疾病的潜在生物标志物。随后，各种miRNA在胞内和胞外表达特异性的多个研究，均指向miRNA可以成为脓毒症的潜在生物标志物。本综述中，我们将总结这方面的进展，并讨论潜在的问题。此外，在脓毒症中胞内的miRNA被认为与调节炎症信号通路有紧密联系。目前，Toll样受体（TLR）介导的信号传导途径[12]被公认是参与感染性休克的发展。在人体中，10种功能性的toll样受体（TLR1-10）的已确定。TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6由各种脂类和蛋白在微生物壁刺激产生，而TLR7，TLR8和TLR9识别细胞内微生物核酸，[13]因为它们的定位内质网，内溶酶体，溶酶体和内涵体。TLR4被认为通过脂磷壁酸[13]和肽聚糖刺激TLR2识别细菌脂多糖（LPS）。新进，大量胞内的miRNA被认为可以调节TLR2/4-NF-κB信号转导通路。综述中，我们也会讨论的miRNA如何影响脓毒症炎症信号通路。82 第三军医大学博士学位论文2.microRNA的合成和释放初级miRNA的转录（PRI-miRNA）通常是通过RNA聚合酶II在细胞核中作为一[14,15]个长黑头的前体miRNA或成熟从内含子转录形成。核糖核酸酶（RNA酶）IIIDorsha酶和pri-miRNA中的双链发夹RNA结构（DGCR8）蛋白构成复合物的微处理器，成熟miRNAs都是由一系列核酸酶对初级miRNA(pri-miRNA)进行剪切加工进而产生的。pri-miRNA的长度从数百到数千核苷酸不等，含有5’的帽子以及3’的polyA尾巴，并有1个或者几个发夹结构。Pri-miRNA被剪切之转化为约70核苷酸大小的miRNA前体（pre-miRNA），其含有单一的发夹结构，5‘端含有磷酸性基团，同时3’端含有两个突出核苷酸，3‘末端并有羟基。而pre-miRNA被剪切，就形成约22个核苷酸长度的成熟单链miRNA。在出核转运Exportin5的帮助下，pre-miRNA导出到细[16]胞质。在它的端环，该前miRNA相互作用RNA酶III核酸内切酶Dicer酶蛋白质和辅因子的双链转录应答的RNA结合蛋白（TRBP）来处理〜22个核苷酸的miRNA[16]双链体。所述miRNA双链体被整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC），其包括一[17]个Argonaute（AGO）蛋白和182kDa的甘氨酸色氨酸含重复蛋白。以前，人们认为miRNA的双链（俗称“过客链”）的一条链atthe3'末端被释放和降解，而另一条链（称为“引导链”）被保留在RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)[18][19]。然而，已经证明，两条链都可以被加工成成熟miRNA和用于翻译抑制。从3'[19]末端加工成熟miRNA被指定与3P后缀而从5'端加工的miRNA识别用5P后缀。RISC复合物被引导mRNA到3'or5'的非编码区（UTR），其中有2至8个核苷酸的碱[20]基配对（称为“种子序列”）的成熟miRNA的。MicroRNAs有能力被释放到胞外进[21]入血浆，并保持在循环中以稳定的形式存在。与以前的观点相反，microRNA在进化中高度保守，并且对内源性和外源性核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase）活性，急[22,23]性pH和温度条件均高度抵抗。这些属性在等离子体通过，micorRNA被限制在膜结合的微泡和核外颗粒体实现。通过微泡/核外颗粒体释放的miRNA与ATP和温度相[23][23]关。微泡通常在尺寸约为100-1000纳米和直接向外出芽细胞膜的产生。相反地，核外颗粒体的面积约为30-100纳米，从多泡体（multivesicularbody,MVBs）时产生的MVBs与细胞膜融合并胞吐出细胞[24]。该MVBs起源于内含体内腔的囊泡，收集细胞内的内吞膜蛋白。核外颗粒体已经于各种体液如血浆，尿液，血清，乳房乳汁和唾[24]液中被发现。虽然很少发生，已经观察到，组织损伤或细胞凋亡中一些miRNA作为凋亡小体[25]释放到血浆中。此外，还已经发现的Argonaute2（Ago2）蛋白和高密度脂蛋白可充[26,27]当miRNA的载体。83 第三军医大学博士学位论文miRNA的生物合成和释放总结在图1。图1首先miRNA在胞核中转录出pri-miRNA，随后继续在核内被Drosha加工成为60~70核苷酸的pre-miRNA，然后由Exprotin-5的复合物辅助转出胞核，再在细胞胞浆里被Dicer剪切进而终于成为成熟的miRNA，接着被整合进入RISC。microrna也可在细胞凋亡和组织损伤是随凋亡小体释放。此外,microrna可能绑定到一些蛋白如高密度脂蛋白和Ago2,从而释放到胞外。miR能使机体免疫能力上调，并增强机体防御力。与野生型小鼠相比较，LPS刺激下，miR-155的转基因小鼠机体B细胞中的TNF-α表达增强，小鼠的免疫应答被[28]增强，形成对照的是，在miR-155的基因敲除小鼠则发现，其抗感染能力明显下[29，30]降，并发现体液免疫出现缺陷，同时还发现其生发中心的形成发生障碍，其各项免疫功能均受到了抑制。还发现脓毒症状态下miR-146b和miR-150下调，并可以导致炎症性细胞因子表达增加，机体免疫能力增强。3.细胞外microRNA作为脓毒症的潜在生物标志物显然，在临床存在于血液、汗液、尿液和母乳的miRNA可迅速快速测量，较微84 第三军医大学博士学位论文生物培养快速简便。胞外miRNA使许多调查人员检测可能的疾病生物标志物。在脓毒症领域，已经进行了大量的研究，分析脓毒症患者血浆中的miRNA。几个miRNAs被挑选出来作为潜在的诊断和预后的脓毒症生物标志物（表1）。表1脓毒症患者血液标本的microRNA表达SpecimenStudySampleSizeMainfindingsReferenceBlood10sepsispatients↓miR-150,miR-342-5p[31]leukocytes12healthyindividuals↑miR-486,miR-182insepsispatients138sepsispatients↑miR-150amongstICUpatientswithorSerum85ICUpatientswithoutsepsis[33]withoutsepsisenhancessurvival76healthyindividuals50sepsispatientsSerum30SIRSpatients↓miR-223andmiR-146ainsepsispatients[34]20healthyindividuals117survivingsepsispatients↑miR-223,miR-16Serum97non-survivingsepsispatients↓miR-15a,miR-122,miR-193,miR-483-5p[37]insurvivingsepsispatients14non-sepsisSIRSpatientsPlasma↑miR-146ainnon-sepsisSIRSpatients[35]14sepsispatients23sepsispatients↑miR-4772familyBlood22SIRSpatientsmiR-150insepsispatients[38]leukocytes21healthypeople78survivingsepsispatients↑miR-574-5pPlasma[40]64non-survivingsepsispatients↓miR-297insurvivingsepsispatients17ICUpatientswithoutsepsisSerum↓miR-181binsepsispatients[41]36sepsispatientsBloodSepsispatientsandnon-sepsis↓miR-466Iinnon-survivingsepsispatients[42]leukocytesICUpatients138sepsispatientsSerum85ICUpatientswithoutsepsis↑miR-133acorrelatedwithseverityofsepsis[43]76healthyindividuals85 第三军医大学博士学位论文3.1mir-150最近，有研究比较了12个健康人和10例脓毒症患者的miRNA表达。作者的分[31]析表明，在两组外周血白细胞之间mir-150水平发生失调。明显，在脓毒症患者mir-150减少与疾病严重程度，器官衰竭（SequentialOrganFailureAssessment,SOFA）[32]评分，呈正相关。但SOFA评分不参与评定脓毒症的病理过程，他们进一步分析了mir-150在脓毒症的发病机制中的作用，并观察在脓毒症患者的促炎性细胞因子[31]（IL-18）的增加与mir-150减少相关。然而，另外的研究，分析血清mir-150在危[33]重症患者223例（138例脓毒症患者和85无脓毒症）和76例正常人。他们的分析结果表明，危重患者，与健康人相比，mir-150只有轻微下降。他们的结论是：mir-150不是脓毒症的诊断工具。尽管如此，他们观察到在危重患者中，血清mir-150高水平的患者生存机率较大，而血清mir-150水平较低的患者的器官衰竭率和死亡率较高。[33][31]他们推测，mir-150可以扮演预测脓毒症预后的工具。与的研究结果一致。两项研究均观察脓毒症患者mir-150水平轻度下降。3.2miR-223andmiR-146amiR-223和miR-146a代表在各种疾病的发病机制中的作用中研究最多的两个miRNA。在脓毒症领域，有研究表明mir-223、miR-146a在脓毒症患者中的表达发生[34]变化。炎症和感染相关疾病中，研究者检查7种miRNA，脓毒症患者50例，30例SIRS患者和20例健康人。他们测试了miR-132，miR-146a，miR-155，miR-223，miR-15B，miR-126和let-7i。通过使用定量PCR，他们报告说，脓毒症患者与SIRS患者及健康人比较，血清miR-146a和miR-223的明显减少。更重要的是，相比于健康人，SIRS患者水平没有显著变化。随后，另一项研究中，采用RT-PCR，检测在14个非感染SIRS患者血浆标本和14例脓毒症患者miR-146a的表达差异。研究人员观[35]察到，非感染SIRS患者与脓毒症患者相比，血清miR-146a表达升高。这些研究表明，miR-146a和miR-223可能是脓毒症的最佳诊断工具。最近，一项研究包含214例患者（117例存活和97例死亡患者）血清miRNA，发现在死亡脓毒症患者中miR-223[36]水平明显降低。使用基因敲除小鼠模型对比野生型小鼠，观察到pre-mir-223的减[37]少加剧脓毒症心肌功能障碍、炎症反应和死亡率。因此，miR-223可能作为判断预后的一项工具，较低水平的miR-223可能会导致脓毒症休克进而死亡。3.3miR-4772系列最近，miR-4772家族如miR-4772-3p，miR-4772-5p，miR-4772-5p-iso（miR-4772-5p86 第三军医大学博士学位论文的异构体〕已经显示出具有脓毒症预后和诊断价值。相关研究利用线性判别分析（LDA）用于23例证实细菌感染的脓毒症患者，22SIRS患者和21名健康个体的血[38]液样品进行比较。首先，从各组选4个血液样本进行RNA测序，并证明了miR-4772-5p-iso在脓毒症组中显著增加，但与SIRS组和对照组之间没有统计学区别。在脓毒症组与健康人组比较，mir-4772-3p、mir-4772-5p显著上调，但脓毒症和SIRS组间没有显著差异。在体外的工作也表明，24h后与特定的TLR配体结合，mir-4772-5p-iso上调原发性外周血单核细胞，从而提供一个可能的机理。然而，在剩余的血液样本的进一步分析表明，mir-150是三组之间唯一明显区分的miRNA。然而，这项研究证实mir-150为脓毒血症的潜在生物标志和说明mir-4772的家庭组合表明可能存在脓毒症。此外，mir-4772-5p-iso位于白细胞介素18（Interleukin-18receptoraccessoryprotein，il-18rap）受体辅助蛋白基因内含子区，这也增加了脓毒症的发生。[39]更有趣的是，此前报导在脓毒症中il-18自身上调，表明il-18rap和IL-18可共调控脓毒症。3.4其他miRNAs除了对miRNA概述，相关研究观察其他miRNAs。例如有研究发现，与健康人相比，脓毒症患者的外周血白细胞中miR-486和miR-182过表达，同时mir-342-5p水平[31]减少。其他研究观察到脓毒症生存组患者与非存活组相比较，血清中miR-16的水[33]平增加，同时miR-15a，miR-122，mir-193，mir-483-5p则减少。值得注意的是，其他组还研究了miRNAs的差异表达不同的主题。例如，通过比较脓毒症患者幸存者[40]12例和死亡者12例患者的血清样品，用基因芯片筛选出差异表达的miRNA。他们观察到，存活组和死亡组比较，只有mir-297和mir-574-5p水平显著差异。在存活组中，血清mir-297水平下调而mir-574-5p水平上调。这些结果在额外66个存活组和52个死亡组患者的血清样本中进一步验证。当miRNA表达与脓毒症进展阶段，结合SOFA评分，最后得出mir-574-5p有更好的预测值，可能被用于脓毒症患者的预后。另外研究分析了对照组患者（ICU患者无脓毒症）和脓毒症患者血清样本中的[41]miR-181b水平。他们观察到，与ICU患者无脓毒症相比，脓毒症患者血清miR-181b水平降低约40%。最近，研究报道脓毒症死亡组白细胞中mir-466i水平高于脓毒症存[42]活组。但是，存活组和死亡组之间，血清mir-466i并无差异。[43]此外，研究发现脓毒症患者及危重病人的miR-133a水平上调。在223危重病人（138脓毒症85无脓毒症）和76例健康人，miR-133a与上调脓毒症的严重程度，87 第三军医大学博士学位论文SOFA评分和细菌感染标志物CRP和PCT比较。在这个研究中，作者描述了盲肠结扎穿孔（cecalligationandpuncture,CLP）所致脓毒症小鼠中观察到，与mir-150，miR-155和miR-125b相比，血清miRNA高度（16倍）变换。另有研究做了显示,脓毒症小鼠[43]的血液样本可以用来筛选以便确定miRNA的表达。取C57BL／6小鼠CLP诱导脓[44]毒症模型的血液样本进行筛选，以确定实验脓毒症小鼠全血样品中miRNA的改变。通过微阵列分析，miR-16，miR-17，miR-20a，mir-20b，miR-26a，miR-26b，mir-106a，miR-106b及miR-451的水平，脓毒症小鼠均高于对照组。进一步分析，在TLR2−/−、TKR4−/−和NF-κB−/−小鼠与TLR2+/+，TLR4+/+和NF-κB+/+小鼠CLP后无明显差异。这一结果表明，这血液中这10种miRNA的表达不依赖于TLR2，TLR4和NF-κB[45]途径。另外，还有利用基因芯片表达谱和miRNA调控网络分析。研究分析了各种研究通过验证和预测数据库如TarBase和hoctarmiRNAs的表达谱，并通过t检验测量统计意义。由此进一步研究途径分析，疾病肿瘤分析，蛋白-蛋白相互作用网络（PIN），ROC曲线分析来确定他们对脓毒症的预后或诊断价值。总之，miR-15a，miR-16，miR-122，miR-146a，miR-223，mir-499-5p和mir-150有脓毒症的诊断价值，同时，miR-193bmir-574-5pmir-483-5p，发现有预测预后价值。回顾以上，一些胞外miRNA已经被建议用于脓毒症诊断的可能生物标志物。在进行了有限样本量分析脓毒症/SIRS后，有必要采用随机前瞻性大型临床试验，在较大量的患者群体对这些miRNA的生物标志物的未来做出进一步评价。4．细胞内的小分子RNA作为脓毒症炎症信号转导调节众所周知，在脓毒症的炎症反应是通过巨噬细胞和单核细胞Toll样受体（Toll-like[12]receptors,TLR）介导的激活下游NF-κB通路介导。LPS作为一种革兰氏阴性细菌的细胞壁最主要的化学成分，由多糖链、寡聚糖以及类脂A所构成，而在内毒素的结构中，类脂A部分被认为是最保守的，同时也被认为是内毒素之“毒力中心”，其在内毒素所具有的生物活性之中起到了关键性的作用。在感染的状态下，LPS被释放入血，其通过多种途径触发TLR4跨膜的信号通道，并进而将宿主的免疫细胞激活，分泌促炎介质TNF-α，IL-6等，这是机体免疫系统对抗细菌及LPS的有效反应，是生物体生存的必需条件；但过度的反应会诱导内毒素血症及脓毒症的发生，引发炎性细胞因子以及相关炎性介质的级联放大效应反应，并最终导致了机体的细胞和组织的损伤、MOF，甚至导致死亡。已有的研究表明LPS可以诱导TLR4的跨膜信号传递通路的激活，但大量的信号88 第三军医大学博士学位论文蛋白或者受体均可对其进行调控，LBP、CD14、MD-2以及TLR4是其中最为重要的相关调控分子。在此过程中，在相应免疫细胞的表面MD-2和TLR4结合形成了TLR4-MD-2的复合体，而当LPS被释放进入循环血液中，循环中LBP或者由肝细胞所分泌的LBP对LPS进行调理，并可作为蛋白载体把LPS进而传递给CD14，而后者则将LPS凝集，并向TLR4-MD-2的复合体呈递LPS。随后，LPS被MD-2所识别，并与其结合形成了TLR4-MD-2-LPS的复合体，从而对TLR4的跨膜信号通道进行激活。TLR4的跨膜信号道被激活之后，随后TLR4的胞浆区与接头蛋白MyD88[46]（myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88，MyD88）相互作用，依次激活IL-1受体相关激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF6）、NF-κB诱导[47-48]激酶（NIK）和IκB激酶（IKK），最终使IκB磷酸化而被降解掉，而活化的[49]NF-κB则转移入核，进而使基因的转录启动。此外，TLR4-MD-2-LPS复合体还能活化AP-1，从而导致如IL-8、TNF-α、NO、粘附分子和IL-6等炎症性细胞因子的大量表达，并最终导致了SIRS的发生。目前公认，TLR-NF-κB途径参与脓毒症的过程。然而，抗炎性反应的使用如糖皮质激素，抗内毒素抗体，肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂，白细胞介素-1–受体拮抗剂等[50]在治疗脓毒症方面均不成功。表明脓毒症可能与其他因素相关。最近的研究表明，许多细胞内的miRNA在TLR信号通路和NF-Bκ介导的炎症反应调节发挥关键作用（图2）。89 第三军医大学博士学位论文图2：microRNA负调控TLR信号通路let-7i、mir-146b负调控TLR4。mir-200b、mir-200c、mir-149、mir-203、mir-146-b负调控MyD88。mir-146家族靶向调控IRAK1和TRAF6。mir-223、miR-15a、miR-16负调控IKK-α。mir-199a负调控IKK-β。mir–126靶向调控IkBα。mir-221、mir-579和mir-125b负调控TNFα。4.1let-7i作用于TLR4TLR4受体本身将成为let-7i的目标，报道指出体外培养的人胆管上皮细胞，let-7i[51]通过转录后抑制调节TLR4的表达。他们观察到体外培养的人胆管上皮细胞在微小90 第三军医大学博士学位论文隐孢子虫感染后，出现MyD88/NF-κB-依赖性前let-7i和成熟let-7i表达减少。感染细胞中let-7i表达降低与隐孢子虫感染细胞中TLR4升高有关。此外，在人胆管上皮细胞let-7i前体过表达减少TLR4蛋白含量。这些结果表明，let-7i调节TLR4在胆管上皮细胞中表达，有助于上皮对小隐孢子虫感染的免疫反应。此外，数据提高了miRNA介导的转录后途径通路可能是一般宿主细胞调节微生物感染反应的关键。4.2miR-200家族，miR-149和miR-203最近进行的一项研究表明miR-200家族（miR200a，miR-200b，和miR-200c）能[52]调节TLR4信号通路和NF-κB活化。他们使用HEK293细胞和荧光酶分析，发现当miR-200b和miR-200c模仿剂转染时，出现剂量依赖性NF-κB活性荧光素酶抑制，而转染miR200a模拟剂无效。当miR-200b和miR-200c转染时，检测MyD883'UTR的报告基因荧光素酶活性下降。相反，当miR-200b和miR-200c转染突变的MyD883’UTR时，其活性没有变化。此外，在所有三个miR-200家族miRNAs对TLR4，IRAK1和TRAF6的3‘UTR没有影响。因而，这项研究表明MyD88是miR-200b和miR-200c的真正的目标。[53]此外，研究显示miR-149能显著下调MyD88蛋白水平。他们发现当RAW264.7细胞被牛结核分枝杆菌刺激后，MyD88水平增加而mir149水平下降。当mir146慢病毒载体转入转染RAW264.7细胞表达后，MyD88mRNA水平没有变化，但MyD88蛋白水平显著降低。因此认为，miR-149抑制MyD88的翻译却对转录没有影响。同样，另外一项研究证明在RAW264.7细胞中，miR-203显著减少MyD88蛋白质表达而不是[54]其mRNA水平。4.3mir-146家庭负调控IRAK1和TRAF6mir-146家族（mir-146a和mir-146b）被认为可以负调节IRAK1和TRAF6的翻译。相关研究观察mir-146家族在NF-κB相关免疫反应中的作用，发现在LPS刺激的[55]THP-1细胞中mir-146、miR-155和miR-132显著上调。因为miR146对LPS刺激的快速反应，其被选作进一步的分析。使用构建荧光素酶作为IRAK1和TRAF63′-UTR的报告基因，转染进入HEK293细胞后，他们发现miR-146a和mir-146b引起[56]荧光素酶活性显著降低，在mir-146b被更加注意后，一项研究表明，mir146b通过靶向针对TLR4受体、MyD88、IRAK1和TRAF6，进而影响TLR4信号转导途径。在荧光素酶检测HEK293细胞，发现mir-146b转染时，含TLR4，MyD88，IRAK1和TRAF63′-UTR的报告基因活性降低。为了确认的靶向的特异性，用mir-146b转染含有TLR4，MyD88，IRAK1和TRAF6突变的区域的3UTR′的报告基因，发现活性没91 第三军医大学博士学位论文有变化。此外，作者观察到，当IL-10刺激人单核细胞细胞时，mir-146b水平增加，而miR-146a和mir155并没有增加。4.4miRNA-15，miR-16，miR-223，miR-199a与IKK复合物（inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinase复合物），miR-126与Iκ-Bα（核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白α）IKK复合物，由IKKα，IKK-α和IKK-β和IKK-γ（NEMO）构成，对NF-κB的活化至关重要。以MSKCC中心的miRNA数据库，研究者发现miR-15a，miR-16和[57]miR-223拥有与IKK-α的3’UTR互补的基因序列。分化的人单核细胞被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激后，miR-15a，miR-16和miR-223水平降低而IKK-α水平增加。miR-15a，miR-16和miR-223模拟剂转染单核细胞后，导致IKK-α[58]蛋白水平的减少。同时，另一项研究使用PicTar算法，发现IKKβmRNA的3′-UTR有3个miR-199a互补序列。构建含有包含IKKβ的3′UTR架构的荧光素酶的miR-199a[59]转染进入卵巢癌细胞，发现荧光素酶活性下降。最近的一项研究表明，通过Micro-CosmTargets、TargetScan和PicTar技术，证明IκBα的3′-UTR是miR-126的互补序列。在HT29细胞miR-126模拟物的转染导致IκBα蛋白水平降低57%。4.5miR-221，miR-579，miR-125b靶向作用于TNF-α[60]Mirna可直接靶向炎性反应中的炎性因子的生成。研究通过的计算机分析预测，以确定miR-221，miR–579，miR-125b为作用于TNF-α的3'非翻译区。他们通过LPS耐受的THP-1细胞确定miR-579，miR-221和miR-125对TNFα的抑制作用。转染miR-221减少THP-1细胞中TNF-α的mRNA水平，而转染miR579、miR-125b则显著减少TNF-α的蛋白水平。miR-125b抑制TNF-α的作用在另外一篇文献中也被[61]报道。研究者观察到，miR-125b与TNF-α的3′utr共转染HEK293细胞时，A型荧光素酶活性降低。因此，在LPS处理的巨噬巨噬细胞中，TNFα上调同时miR-125b下调。4.6其他影响炎症信号的miRNA（Programmedcelldeath4，程序性细胞凋亡因子4）PDCD4，已知可促进NF-κB[62][63]的活化。miR-21被认为可调节PDCD4的表达。这个研究通过把miR-21的反义寡核苷酸转染到RAW264.7细胞，导致LPS刺激后PDCD4生成增加。而转染miR-21前体则导致LPS刺激后，与对照组相比，PDCD4生成减少和IL-10的生成增多。因而认为miR-21可能抑制PDCD4对NF-κB的作用和参加从而促进抗炎细胞因子的产生。同样，受体相互作用蛋白140(receptor-interactingprotein140,RIP140)被认为可促进[64]巨噬细胞中NF-κB途径促炎细胞因子的转录。使用急性化脓小鼠模型，明确miR-3392 第三军医大学博士学位论文[65]靶向作用于RIP140mRNA的3'非编码区。他们观察到RAW264.7巨噬细胞中miR-33的转染导致了，LPS刺激后，RIP140mRNA，TNFα和IL-1βmRNA水平的减少。此外报道表明，TLR2-/-和TLR4-/-小鼠感染金黄色葡萄球菌后PPARGC1A[66]水平的失调。PPARGC1A，属于PPAR-γ共激活因子（PGC）家族，参与线粒体的[67]生物发生，并且被认为脓毒症中在有线粒体损伤时被刺激。研究中观察到，当miR-202-3p模拟物转染到AML12肝细胞，PPARGC1AmRNA降低。计算机分析显示在PPARGC1AmRNA的3'UTR是miR-202-3p的结合位点，证实了miR-202-3p的活[66]性和PPARGC1A成反比关系。[68]C反应蛋白（aPC），肝脏内源蛋白质，已被认为可减少炎症和血栓形成。已[69]经表明控制APC可通过调节肝窦血管和恢复肝氧合，以提高脓毒症患者死亡率。[70]研究者已经证明在脓毒症休克中，aPC的活化是由于决定于miRNA表达的变化。在CLP模型雄性SD大鼠肝脏细胞中，他们发现miR-182，miR-199a-5P，miR-203，miR-211，miR-222和miR-29b的水平增加。他们认为，这些miRNA可能是通过APC途径调控肝组织粘附。另一项研究检测miR-155在LPS诱导脓毒症雌性BALB/c小[71]鼠肝脏中的表达。其中一组小鼠地塞米松LPS前腹腔内给药预处理。两组小鼠的肝组织的分析显示，与未预处理组相比，预处理组miR-155的水平上调70倍。此外，预处理组还发现炎细胞因子TNFα和IL-6水平降低。miR-155，已经发现靶向FADD（(FloationgPointAddition)）和受体相互作用蛋白-1激酶（Ripk1）转移，并间接促进[61]TNFα的翻译。关于miRNA对炎症反应介质的作用总结在表2中。表2microrna通过与各靶点之间的相互作用调节胞内炎症反应MiRNATargetsEffectsReferencemiR-21pro-inflammatoryproteinPDCD4InhibittheactivationofNF-κB[63]Receptor-interactingprotein140ReducetheproductionofTNFαandmiR-33[65](RIP140)IL-1βInhibitPGCfamily–mediatedmiR-202-3pPpargc1abiogenesisofmitochondriaduring[66]sepsismiR-182,miR-203,miR-211,miR-222,InhibitformationoffocaladhesionsinActivatedProteinC(aPC)[70]miR-199a-5p,hepatictissuemiR-29bmiR-155FADDandRipk1PromotetranslationofTNFα[61]93 第三军医大学博士学位论文5结论脓毒症可引起肝，肾，肺和心脏的多器官功能障碍，其临床表现和病理机制复杂多样。miRNA可以为脓毒症患者提供快速甄别和诊断，被用作病理学指标是有前途的。而本文中提到的众多miRNA已被证实可调节炎性反应，而其可能的具有潜力脓毒症的治疗作用仍然未被发掘。此外，尽管被确认为TLR-NF-κB途径的关键调节剂，MiRNA还并没有在脓毒症模型研究中被广泛地应用。与此同时，所有以特定介质/途[72,73]径来抑制在脓毒症炎症反应的治疗性干预，均未能提高疗效。继续研究的细胞外和细胞内的miRNA在脓毒症的作用具有重要意义，因为它不仅能帮助我们理解脓毒症的复杂机理，同时也为有效治疗脓毒症提供了新的方向。94 第三军医大学博士学位论文参考文献1.D.C.Angus,W.T.Linde-Zwirble,J.Lidicker,G.Clermont,J.Carcillo,M.R.Pinsky,EpidemiologyofseveresepsisintheUnitedStates:analysisofincidence,outcome,andassociatedcostsofcare,Crit.CareMed.29(7)(2001)1303–1310.2.M.M.Levy,A.Artigas,G.S.Phillips,A.Rhodes,R.Beale,T.Osborn,R.P.Dellinger,OutcomesoftheSurvivingSepsisCampaigninintensivecareunitsintheUSAandEurope:aprospectivecohortstudy,LancetInfect.Dis.12(12)(2012)919–924.3.R.C.Bone,W.J.Sibbald,C.L.Sprung,TheACCP-SCCMconsensusconferenceonsepsisandorganfailure,Chest101(6)(1992)1481–1483.4.V.Sankar,N.R.Webster,Clinicalapplicationofsepsisbiomarkers,J.Anesth.27(2)(2013)269–283.5.C.Gabay,I.Kushner,Acute-phaseproteinsandothersystemicresponsestoinflammation,N.Engl.J.Med.340(17)(1999)448–454.6.F.Bloos,J.C.Marshall,R.P.Dellinger,J.-L.Vincent,G.Gutierrez,E.Rivers,F.M.Brunkhorst,Multinational,observationalstudyofprocalcitonininICUpatientswithpneumoniarequiringmechanicalventilation:amulticenterobservationalstudy,Crit.Care15(2)(2011)R88.7.A.Bouchon,F.Facchetti,M.A.Weigand,M.Colonna,TREM-1amplifiesinflammationandisacrucialmediatorofsepticshock,Nature410(6832)(2001)1103–1107.8.J.Krol,I.Loedige,W.Filipowicz,ThewidespreadregulationofmicroRNAbiogenesis,functionanddecay,Nat.Rev.Genet.11(9)(2010)597–610.9.D.Baek,J.Villén,C.Shin,F.D.Camargo,S.P.Gygi,D.P.Bartel,TheimpactofmicroRNAsonproteinoutput,Nature455(7209)(2008)64–71.10.A.M.Ardekani,M.M.Naeini,TheRoleofMicroRNAsinHumanDiseases,AvicennaJ.Med.Biotechnol.2(4)(2010)161–179.11.C.H.Lawrie,S.Gal,H.M.Dunlop,B.Pushkaran,A.P.Liggins,K.Pulford,A.L.Harris,Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma,Br.J.Haematol.141(5)(2008)672–675.12.H.Tsujimoto,S.Ono,P.aEfron,P.O.Scumpia,L.L.Moldawer,H.Mochizuki,RoleofToll-likereceptorsinthedevelopmentofsepsis,Shock29(3)(2008)315–321.95 第三军医大学博士学位论文13.T.Kaisho,S.Akira,Toll-likereceptorsasadjuvantreceptors,BiochimBiophysActa.1589(1)(2002)1–13.14.Y.Lee,K.Jeon,J.-T.Lee,S.Kim,V.N.Kim,MicroRNAmaturation:stepwiseprocessingandsubcellularlocalization,EMBOJ.21(17)(2002)4663–4670.15.Y.Lee,C.Ahn,J.Han,H.Choi,J.Kim,J.Yim,V.N.Kim,ThenuclearRNaseIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing,Nature425(6956)(2003)415–419.16.E.Lund,S.Güttinger,A.Calado,J.E.Dahlberg,U.Kutay,NuclearexportofmicroRNAprecursors,Science303(5654)(2004)95–98.17.M.R.Fabian,N.Sonenberg,ThemechanicsofmiRNA-mediatedgenesilencing:alookunderthehoodofmiRISC,Nat.Struct.Mol.Biol.19(6)(2012)586–593.18.W.Filipowicz,S.N.Bhattacharyya,N.Sonenberg,Mechanismsofpost-transcriptionalregulationbymicroRNAs:aretheanswersinsight?Nat.Rev.Genet.9(2)(2008)102–114.19.X.Yang,W.W.Du,H.Li,F.Liu,A.Khorshidi,Z.J.Rutnam,B.B.Yang,BothmaturemiR-17-5pandpassengerstrandmiR-17-3ptargetTIMP3andinduceprostatetumorgrowthandinvasion,NucleicAcidsRes.41(21)(2013)9688–9704.20.I.Lee,S.S.Ajay,J.I.Yook,H.S.Kim,S.H.Hong,N.H.Kim,B.D.Athey,NewclassofmicroRNAtargetscontainingsimultaneous5′-UTRand3'-UTRinteractionsites,GenomeRes.19(7)(2009)1175–1183.21.X.Chen,Y.Ba,L.Ma,X.Cai,Y.Yin,K.Wang,C.-Y.Zhang,CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases,CellRes.18(10)(2008)997–1006.22.K.Okamura,M.D.Phillips,D.M.Tyler,H.Duan,Y.Chou,E.C.Lai,TheregulatoryactivityofmicroRNA*specieshassubstantialinfluenceonmicroRNAand3′UTRevolution,Nat.Struct.Mol.Biol.15(4)(2008)354–363.23.C.Théry,M.Ostrowski,E.Segura,Membranevesiclesasconveyorsofimmuneresponses,Nat.Rev.Immunol.9(8)(2009)581–593.24.S.Ramachandran,V.Palanisamy,HorizontaltransferofRNAs:exosomesasmediatorsofintercellularcommunication,WileyInterdiscip.Rev.RNA3(2)(2012)286–293.25.A.Zernecke,K.Bidzhekov,H.Noels,E.Shagdarsuren,L.Gan,B.Denecke,C.Weber,DeliveryofmicroRNA-126byapoptoticbodiesinducesCXCL12-dependentvascular96 第三军医大学博士学位论文protection,Sci.Signal.2(100)(2009)1–11.26.A.Turchinovich,L.Weiz,A.Langheinz,B.Burwinkel,CharacterizationofextracellularcirculatingmicroRNA,NucleicAcidsRes.39(16)(2011)7223–7233.27.K.C.Vickers,A.T.Remaley,Lipid-basedcarriersofmicroRNAsandintercellularcommunication,Curr.Opin.Lipidol.23(2)(2012)91–97.28.TiliE,MichailleJJ,CiminoA,etal.ModulationofmiR-155andmiR-125blevelsfollowinglipopolysaccharide/TNF-alphastimulationandtheirpossiblerolesinregulatingtheresponsetoendotoxinshock[J].JImmunol,2007,179(8):5082-5089.29.RodriguezA,VigoritoE,ClareS,etal.Requirementofbic/microRNA-155fornormalimmunefunction[J].Science,2007,316(5824):608-611.30.ThaiTH,CaladoDP,CasolaS,etal.RegulationofthegerminalcenterresponsebymicroRNA-155[J].Science,2007,316(5824):604-608.31.C.Vasilescu,S.Rossi,M.Shimizu,S.Tudor,A.Veronese,M.Ferracin,G.A.Calin,MicroRNAfingerprintsidentifymiR-150asaplasmaprognosticmarkerinpatientswithsepsis,PLoSOne4(10)(2009)e7405.32.J.-L.Vincent,A.deMendonca,F.Cantraine,R.Moreno,J.Takala,P.M.Suter,S.Blecher,UseoftheSOFAscoretoassesstheincidenceoforgandysfunction/failureinintensivecareunits,Crit.CareMed.26(11)(1998)1793–1800.33.C.Roderburg,M.Luedde,D.VargasCardenas,M.Vucur,D.Scholten,N.Frey,T.Luedde,CirculatingmicroRNA-150serumlevelspredictsurvivalinpatientswithcriticalillnessandsepsis,PLoSOne8(1)(2013)e54612.34.J.Wang,M.Yu,G.Yu,J.Bian,X.Deng,X.Wan,K.Zhu,SerummiR-146aandmiR-223aspotentialnewbiomarkersforsepsis,Biochem.Biophys.Res.Commun.394(1)(2010)184–188.35.L.Wang,H.-C.Wang,C.Chen,J.Zeng,Q.Wang,L.Zheng,H.-D.Yu,DifferentialexpressionofplasmamiR-146ainsepsispatientscomparedwithnon-sepsis-SIRSpatients,Exp.Ther.Med.5(4)(2013)1101–1104.36.H.Wang,P.Zhang,W.Chen,D.Feng,Y.Jia,L.Xie,SerummicroRNAsignaturesidentifiedbySolexasequencingpredictsepsispatients'mortality:aprospectiveobservationalstudy,PLoSOne7(6)(2012)e38885.37.X.Wang,W.Huang,Y.Yang,Y.Wang,T.Peng,J.Chang,G.-C.Fan,LossofduplexmiR-97 第三军医大学博士学位论文223(5pand3p)aggravatesmyocardialdepressionandmortalityinpolymicrobialsepsis,Biochim.Biophys.Acta1842(5)(2014)701–711.38.Y.Ma,D.Vilanova,K.Atalar,O.Delfour,J.Edgeworth,M.Ostermann,G.M.Lord,Genome-widesequencingofcellularmicroRNAsidentifiesacombinatorialexpressionsignaturediagnosticofsepsis,PLoSOne8(10)(2013)e75918.39.S.W.Standage,H.R.Wong,Biomarkersforpediatricsepsisandsepticshock,ExpertRev.Anti-Infect.Ther.9(1)(2011)71–79.40.H.Wang,K.Meng,W.J.Chen,D.Feng,Y.Jia,L.Xie,SerummiR-574-5p:aprognosticpredictorofsepsispatients,Shock37(3)(2012)263–267.41.X.Sun,B.Icli,A.K.Wara,N.Belkin,S.He,L.Kobzik,M.W.Feinberg,MicroRNA-181bregulatesNF-κB–mediatedvascularinflammation,J.Clin.Investig.122(6)(2012)1973–1990.42.Y.Li,J.Dalli,N.Chiang,R.M.Baron,C.Quintana,C.N.Serhan,PlasticityofleukocyticexudatesinresolvingacuteinflammationisregulatedbyMicroRNAandproresolvingmediators,Immunity39(5)(2013)885–898.43.F.Tacke,C.Roderburg,F.Benz,D.V.Cardenas,M.Luedde,H.J.Hippe,T.Luedde,LevelsofCirculatingmiR-133aAreElevatedinSepsisandPredictMortalityinCriticallyIllPatients,Crit.CareMed.42(5)(2014)1096–1104.44.S.C.Wu,J.C.S.Yang,C.S.Rau,Y.C.Chen,T.H.Lu,M.W.Lin,C.H.Hsieh,ProfilingcirculatingmicroRNAexpressioninexperimentalsepsisusingcecalligationandpuncture,PLoSOne8(10)(2013)e77936.45.J.Huang,Z.Sun,W.Yan,Y.Zhu,Y.Lin,J.Chen,J.Wang,IdentificationofmicroRNAassepsisbiomarkerbasedonmiRNAsregulatorynetworkanalysis,BioMedRes.Int.2014(2014)594350.46.Y.C.Lu,W.C.Yeh,P.S.Ohashi,LPS/TLR4signaltransductionpathway,Cytokine42(2)(2008)145–151.47.T.Kawagoe,S.Sato,K.Matsushita,H.Kato,K.Matsui,Y.Kumagai,S.Akira,SequentialcontrolofToll-likereceptor-dependentresponsesbyIRAK1andIRAK2,Nat.Immunol.9(6)(2008)684–691.48.X.Ma,L.E.BeckerBuscaglia,J.R.Barker,Y.Li,MicroRNAsinNF-kappaBsignaling,J.Mol.CellBiol.3(3)(2011)159–166.98 第三军医大学博士学位论文49.T.Kawai,S.Akira,Theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity:updateonToll-likereceptors,Nat.Immunol.11(5)(2010)373–384.50.R.S.Hotchkiss,I.E.Karl,Thepathophysiologyandtreatmentofsepsis,N.Engl.J.Med.348(2)(2003)138–150.51.X.M.Chen,P.L.Splinter,S.P.O'Hara,N.F.LaRusso,Acellularmicro-RNA,let-7i,regulatesToll-likereceptor4expressionandcontributestocholangiocyteimmuneresponsesagainstCryptosporidiumparvuminfection,J.Biol.Chem.282(39)(2007)28929–28938.52.E.B.Wendlandt,J.W.Graff,T.L.Gioannini,A.P.McCaffrey,M.E.Wilson,TheroleofMicroRNAsmiR-200bandmiR-200cinTLR4signalingandNF-κBactivation,InnateImmunity.18(6)(2012)846–855.53.G.Xu,Z.Zhang,Y.Xing,J.Wei,Z.Ge,X.Liu,X.Huang,MicroRNA-149negativelyregulatesTLR-triggeredinflammatoryresponseinmacrophagesbytargetingMyD88,J.Cell.Biochem.115(5)(2014)919–927.54.J.Wei,X.Huang,Z.Zhang,W.Jia,Z.Zhao,Y.Zhang,G.Xu,MyD88asatargetofmicroRNA-203inregulationoflipopolysaccharideorBacilleCalmette-GuerininducedinflammatoryresponseofmacrophageRAW264.7cells,Mol.Immunol.55(3–4)(2013)303–309.55.K.D.Taganov,M.P.Boldin,K.Chang,D.Baltimore,NF-κB-dependentinductionofmicro-RNAmiR-146,aninhibitortargetedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses,PNAS103(33)(2006)12481–12486.56.G.Curtale,M.Mirolo,T.A.Renzi,M.Rossato,F.Bazzoni,M.Locati,NegativeregulationofToll-likereceptor4signalingbyIL-10-dependentmicroRNA-146b,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(28)(2013)11499–11504.57.T.Li,M.J.Morgan,S.Choksi,Y.Zhang,Y.S.Kim,Z.Liu,MicroRNAsmodulatethenoncanonicaltranscriptionfactorNF-kappaBpathwaybyregulatingexpressionofthekinaseIKKalphaduringmacrophagedifferentiation,Nat.Immunol.11(9)(2010)799–805.58.R.Chen,A.B.Alvero,D.A.Silasi,M.G.Kelly,S.Fest,I.Visintin,G.Mor,RegulationofIKKbetabymiR-199aaffectsNF-kappaBactivityinovariancancercells,Oncogene27(34)(2008)4712–4723.99 第三军医大学博士学位论文59.X.Feng,H.Wang,S.Ye,J.Guan,W.Tan,S.Cheng,Y.Zhou,Up-regulationofmicroRNA-126maycontributetopathogenesisofulcerativecolitisviaregulatingNF-kappaBinhibitorIκBα,PLoSOne7(12)(2012)e52782.60.M.ElGazzar,C.E.McCall,MicroRNAsdistinguishtranslationalfromtranscriptionalsilencingduringendotoxintolerance,J.Biol.Chem.285(27)(2010)20940–20951.61.E.Tili,J.J.Michaille,A.Cimino,S.Costinean,C.D.Dumitru,B.Adair,C.M.Croce,ModulationofmiR-155andmiR-125blevelsfollowinglipopolysaccharide/TNF-alphastimulationandtheirpossiblerolesinregulatingtheresponsetoendotoxinshock,J.Immunol.179(8)(2007)5082–5089.62.H.S.Yang,A.P.Jansen,R.Nair,K.Shibahara,A.K.Verma,J.L.Cmarik,N.H.Colburn,Anoveltransformationsuppressor,Pdcd-4,inhibitAP-1transactivationbutnotNFkappaBorODCtransactivation,Oncogeene20(6)(2001)669–76.63.F.J.Sheedy,E.Palsson-McDermott,E.J.Hennessy,C.Martin,J.J.O'Leary,Q.Ruan,L.A.O'Neill,NegativeregulationofTLR4viatargetingoftheproinflammatorytumorsuppressorPDCD4bythemicroRNAmiR-21,Nat.Immunol.11(2)(2010)141–147.64.I.Zschiedritch,U.Hardeland,A.Kroneos-Herzig,M.BerrielDiaz,A.Vegiopoulous,J.Müggenburg,S.Herzeig,CoactivatorfunctionofRIP-140forNFkappaB/Rel-A-dependentcytokinegeneexpresion,Blood12(2)(2008)264–76.65.P.C.Ho,K.C.Chang,Y.S.Chuang,L.N.Wei,Cholesterolregulationofreceptor-interactingprotein140viamicroRNA-33ininflammatorycytokineproduction,FASEBJ.25(5)(2011)1758–1766.66.T.E.Sweeney,H.B.Suliman,J.W.Hollingsworth,C.A.Piantadosi,DifferentialregulationofthePGCfamilyofgenesinamousemodelofStaphylococcusaureussepsis,PLoSOne5(7)(2010)e11606.67.D.W.Haden,H.B.Suliman,M.S.Carraway,K.E.Welty-Wolf,A.S.Ali,H.Shitara,C.A.Piantadosi,MitochondrialbiogenesisrestoresoxidativemetabolismduringStaphy-lococcusaureussepsis,Am.J.Respir.Crit.CareMed.176(8)(2007)768–777.68.N.C.Fisher,J.T.Wilde,J.Roper,E.Eliias,DeficiencyofnaturalanticooagulantproteinsC,S,andanttithrombininportalveinthrombosis:asecondaryphenommenon?Gut46(4)(2000)534–39.69.G.R.Bernard,J.L.Vincent,P.F.Laterre,S.P.LaRosa,J.F.Dhainaut,A.Lopez-100 第三军医大学博士学位论文Rodriguez,C.J.FisherJr.,EfficacyandsafetyofrecombinanthumanactivatedproteinCforseveresepsis,N.Engl.J.Med.344(10)(2001)699–709.70.C.C.Moore,I.H.McKillop,T.Huynh,MicroRNAexpressionfollowingactivatedproteinCtreatmentduringsepticshock,J.Surg.Res.182(1)(2013)116–126.71.Z.Wang,Y.Liang,H.Tang,Z.Chen,Z.Li,X.Hu,Z.Ma,Dexamethasonedown-regulatestheexpressionofmicroRNA-155intheliversofsepticmice,PLoSOne8(11)(2013)e80547.72.K.N.Iskander,M.F.Osuchowski,D.J.Stearns-Kurosawa,S.Kurosawa,D.Stepien,C.Valentine,D.G.Remick,Sepsis:multipleabnormalities,heterogeneousresponses,andevolvingunderstanding,Physiol.Rev.93(3)(2013)1247–1288.73.J.A.Russell,K.R.Walley,Updateinsepsis2012,Am.J.Respir.Crit.CareMed.187(12)(2013)1303–1307.101 第三军医大学博士学位论文博士研究生期间发表的论文1.热休克蛋白70-1基因多态性对中暑易感性的影响[J].临床急诊杂志，2015；2：123-126.2.MicroRNA-23bregulatestheexpressionofinflammatoryfactorsinvascularendothelialcellsduringsepsis[J].ExperimentalandTherapeuticMedicine，2015Apr；9：1125-1132.102 第三军医大学博士学位论文致谢光阴荏苒如白马过隙,回望过去的三年时光，心中有不尽感慨。衷心感谢我的恩师陶国才教授。能够成为您的学生，是我莫大的荣幸，您敏锐的思维、严谨的治学态度、渊博的学识、诚挚谦虚的品格和宽厚善良的处世方式，永远值得我学习。衷心感谢西南医院麻醉科这个团队，在这里体会到了浓厚学术氛围，优秀的科研作风和团结协作、务实创新的科研精神，让我获得了重要的人生财富。衷心感谢鲁开智教授在学习和生活中对我的热心帮助和精心指导。衷心感谢麻醉科易斌和顾健腾副教授，以及麻醉科各位教授、老师和同事在整个实验过程中的关心、指导以及在我的学习和工作上给予的帮助、支持与鼓励。衷心感谢中心实验室刘鑫博士在课题研究过程中给我的大力支持和热忱指导！衷心感谢感谢我的全体同学和同门师兄弟姐妹们，因为你们，使我在求学的道路上感到力量！大家彼此关爱，同喜同悲，这段时光将会是大家心底最珍贵的回忆，希望大家前程似锦！感谢在百忙中为我的论文进行评阅和答辩的专家们！特别感谢我的父母、妻子和儿子，感谢对我的支持、理解、关心和照顾。你们的无私付出使我坚持完成学业，你们是我的动力源泉！最后，我要向所有关心、帮助和支持我的老师、同学和朋友们表示由衷的感谢，谢谢你们！103