提高大鼠脂肪间充质干细胞转化为胰岛样细胞能力的实验研究

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1、类号：R329.2密级：UDC：615学校代码：11065硕士学位论文提高大鼠脂肪间充质干细胞转化为胰岛样细胞能力的实验研究何辉指导教师史光军教授学科专业名称肝胆血管外科论文答辩日期2015-05-21摘要目的：（1）大鼠脂肪间充质干细胞的分离、提取和培养。（2）探讨损伤胰腺提取液和细胞生长因子对脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响。方法：（1）无菌条件下通过手术获取大鼠脂肪组织，用胶原酶消化法获取脂肪间充质干细胞，并通过胰蛋白酶消化法传代细胞以达到纯化的目的。（2）按对照组、药物诱导组、混合诱导组和损伤胰腺提取液组的顺序进行分

2、组，各组加入不同的细胞诱导因子和损伤胰腺提取液对细胞进行诱导11d，诱导完毕后，于倒置显微镜下观察细胞形态变化；用双硫腙(STZ)染色鉴定胰岛素阳性细胞；用酶联免疫吸附试验(ELISA)来比较高糖环境刺激前后各组胰岛素分泌量的多少；通过免疫荧光染色和荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)来检测相关基因的表达量。结果：（1）获取的大鼠脂肪间充质干细胞贴壁生长，原代细胞呈圆形；36-48h开始有梭形细胞贴壁或者成团的细胞集落形成；7-8天左右，原来成团聚集的细胞向外扩散生长，细胞之间的间隙逐渐缩小并相互融合，呈现旋涡状生长。约10天左

3、右，瓶底细胞达到80%-90%融合。经过消化传代，细胞的纯度逐渐增高。（2）诱导组细胞形状变为圆形并聚集成团，出现DTZ染色阳性细胞；在高糖环境作用下分泌胰岛素且混合诱导组相比较于其余诱导组分泌量多；混合诱导组相关基因的表达量多于其余两组。对照组未出现上述变化。结论：（1）胶原酶消化法能够分离出大鼠脂肪间充质干细胞，通过胰蛋白酶消化法可以实现细胞的纯化。（2）损伤胰腺提取液对大鼠脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用,可以提高脂肪间充质干细胞的转化能力。硕士研究生：何辉（肝胆外科）指导老师：史光军主任医师关键词：脂肪间充质干

4、细胞，损伤胰腺提取液，胰岛样细胞，胰岛素AbstractObjective:(1)Theseparation,extractionandcultureofratadiposemesenchymalstemcells.(2)Tostudytheeffectsofinjuriedpancreaticextractandcytokinesontheindudceddifferentiationofratadiposemesenchymalstemcells(AMSCs)toislet-likecells.Methods:(1)Thead

5、iposetissueswereseparatedfromratbythesurgicaloperationunderasepticcondition.ThecollagenaseandtrypsindigestionwereusedtoextracttheAMSCsfromtissuesandcells’purification.(2)Itconsistedoffourgroups:controlgroup,celldruginducedgroup,mixedinducedgroupandinjuriedpancreaticex

6、tractgroup.Differentcytokinesandinjuriedpancreaticextractwereaddedtodifferentgroups.Thecellwasinducedwithdifferentmethodsfor11days.Cells’morphologychangeswereobservedandrecordedwithinvertedmicroscope.Insulin-positivecellswereidentifiedbydithizone(DTZ)stainingandtheamo

7、untofinsulinofeachgroupafterbeingstimulatedinthehighglucoseenvironmentweremeasuredthroughenzyme-linkedimmunosorbentassay.Therelatedgeneexpressionwasdetectedwithreal-timequantitativepolymerasechainreaction(RT-PCR)andimmunofluorescencestaining.Results:(1)TheratAMSCsatta

8、chedtotheplate.Theprimarycellswerenearlyround.Thespindlecelltypeorcellclustersappearedafter36-48h.Cellclustersgrewaroundandt