基于信号放大策略构建的疾病标志物的传感研究

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单位代码10635学号112015316001086硕士学位论文基于信号放大策略构建的疾病标志物的传感研究论文作者：李靖指导教师：向云教授学科专业：分析化学研究方向：纳米材料及电化学生物传感器提交论文日期：2018年4月15日论文答辩日期：2018年5月22日学位授予单位：西南大学中国·重庆2018年5月 独创性声明学位论文题目：基于信号放大策略构建的疾病标志物的传感研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日 目录摘要...................................................................................................................................IABSTRACT....................................................................................................................III第一章绪论....................................................................................................................11.1荧光生物传感器的简介...................................................................................11.1.1荧光产生的原理....................................................................................11.1.2荧光生物传感器的分类及特点............................................................21.2荧光信号放大策略...........................................................................................71.2.1基于酶辅助的信号放大策略................................................................81.2.2基于DNA自组装的信号放大策略.....................................................111.2.3基于纳米材料的信号放大策略..........................................................131.3本文研究思路.................................................................................................17第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测........192.1前言.................................................................................................................192.2实验部分.........................................................................................................202.2.1试剂及材料..........................................................................................202.2.2滚环扩增辅助的UDG活性检测........................................................212.2.3UDG抑制剂活性的检测......................................................................212.3结果与讨论.....................................................................................................212.3.1UDG的检测原理图..............................................................................212.3.2UDG检测的可行性分析......................................................................222.3.3UDG检测的性能研究..........................................................................232.3.4UDG检测的选择性研究......................................................................242.3.5UDG抑制剂（UGI）的性能研究.......................................................242.4结论.................................................................................................................25第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测................................................................................................................................273.1前言.................................................................................................................273.2实验部分.........................................................................................................283.2.1试剂和材料..........................................................................................283.2.2凝血酶识别探针的制备......................................................................283.2.3荧光放大法检测凝血酶......................................................................293.3结果与讨论.....................................................................................................29 3.3.1荧光放大法检测凝血酶的原理...........................................................293.3.2Apt15的结构优化.................................................................................303.3.3检测凝血酶的可行性分析...................................................................313.3.4反应时间的优化...................................................................................323.3.5该方法分析性能的研究.......................................................................323.3.6该方法选择性的研究...........................................................................333.3.6实际样品中凝血酶的检测...................................................................333.4结论..................................................................................................................33第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测.....................................................................354.1前言..................................................................................................................354.2实验部分..........................................................................................................374.2.1材料及试剂...........................................................................................374.2.2实验仪器...............................................................................................374.2.3二氧化锰纳米片的合成与表征...........................................................384.2.4荧光猝灭和恢复实验...........................................................................384.2.5HCR体外扩增的FRET检测...............................................................384.2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）.........................................................384.2.7细胞培养和共聚焦荧光成像...............................................................394.2.8HeLa细胞对miRNA-21抑制剂的孵育..............................................394.2.9细胞毒性测定.......................................................................................394.3结果与讨论......................................................................................................394.3.1细胞内放大检测miRNA-21的原理图...............................................394.3.2MnO2纳米片的表征.............................................................................404.3.3纳米片的荧光猝灭能力分析...............................................................414.3.4传感器的可行性分析...........................................................................414.3.5纳米片对细胞活性的影响分析...........................................................434.3.6细胞孵育不同时间的成像分析...........................................................444.3.7细胞孵育不同探针的成像分析...........................................................444.3.8不同细胞孵育不同探针的成像分析...................................................454.4结论..................................................................................................................46参考文献.........................................................................................................................47在学期间发表的文章.....................................................................................................61致谢.................................................................................................................................63 摘要基于信号放大策略构建的疾病标志物的传感研究分析化学专业硕士研究生李靖指导教师向云教授摘要多年来，蛋白质及核酸等疾病标志物一直严重威胁着人类健康，给生物体的遗传、变异及新陈代谢等生命活动造成了重大影响。因此，致力于对这些生物分子的不断研究，将会对食品安全、环境监测、药物递送和疾病诊断等各个方面产生重要意义。随着生物医学和分析化学的快速发展，科学家们已经建立了一系列行之有效的方法来监测这些疾病标志物，但由于待测样品浓度低、干扰物多等局限性的存在，完善和推动更加灵敏、简单、精确、实时的分析方法已成为现代生物分析领域的重点。近年来，荧光信号放大技术因其具有灵敏度高、选择性好、响应速度快和检测成本低等优势而广受关注。本论文基于多种信号放大技术，以尿嘧啶糖基化酶（UDG）、凝血酶和microRNA-21为主要研究对象，结合滚环扩增、DNA自组装及活细胞成像等分子生物学技术手段分别构建了三种荧光生物传感器，实现了对生物分子的灵敏检测及实时分析。1.基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测作为一种重要的DNA修复酶，尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）可以用来识别和切除双链DNA中的尿嘧啶碱基，以驱动碱基切除修复（BER）过程，这在维持基因组完整性方面发挥着关键作用。因此，在基础生物分析和临床医学应用中进行UDG活性的研究是至关重要的。在这里，我们提出了一种基于滚环扩增辅助的免标记荧光法用于UDG的灵敏检测。在这项工作中，已设计好的用尿嘧啶碱基修饰的杂交三链DNA复合物被用于UDG的识别。在UDG的作用下，尿嘧啶碱基可以被特异性识别并从脱氧核糖磷酸骨架上切除以产生无碱基位点，这成功地导致杂交三链DNA复合物的解离和环状DNA的形成。环状体通过T4连接酶的连接后，可引发RCA反应并产生大量重复的G-四链体单元，可以与原卟啉IX（PPIX）相互作用以产生增强的荧光响应用于UDG活性的放大检测。该方法不仅可以成功区分UDG与其他非特异性生物分子，而且可以用于UDG抑制剂的筛选，实现了高灵敏度和高选择性，使检测限低至0.00014U/mL。这些结果表明，这种简单、灵敏和经济的检测策略在UDG相关研究和相关的临床诊断中具有很大的应用潜力。2.适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测I 西南大学硕士学位论文通过将一种适配体临位识别引发链迁移的策略与催化发夹组装（CHA）相结合进行信号放大的方式，我们构建了一种简单而灵敏的方法来检测人体血清样品中的凝血酶。首先，两条含有凝血酶适配体序列的探针能够同时结合到目标物凝血酶上以显著增加两条探针的局部浓度。其次，通过toehold引发的链置换来促进ssDNA从一条探针迁移到另一条探针上。这种链迁移使得其中一条适体序列产生一个单链引发端，由此通过CHA将两个荧光猝灭的发夹组装成许多双链DNA。DNA双链体的形成会促使大量的荧光恢复，从而达到放大检测凝血酶的目的，而其检测限也可降至8.3pmol/L。由于采用双重识别模式，该方法对于凝血酶靶标区别于其他干扰蛋白具有高度的选择性，并可用于人体血清样品的检测。它所具有的简单、灵敏及选择性好的优点，可以为检测其他蛋白质分子提供一个通用的无酶、无纳米材料的放大传感平台。3.可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测细胞内microRNA（miRNA）的监测对研究活细胞的生物学功能具有重要意义。但由于miRNA的体积小、浓度低且序列相似，这给细胞内低表达miRNA的检测带来了巨大挑战。为解决这一问题，我们报道了一种细胞内信号放大方法，基于可生物降解的MnO2纳米片介导的HCR自组装来检测活细胞中低表达的miRNA。该体系中，MnO2纳米片可以吸附由染料标记的发夹探针并对其表现出良好的猝灭效果。此外，由于其具有可生物降解性，MnO2纳米片对靶细胞的毒性明显降低。当探针复合物进入细胞后，纳米片表面吸附的发夹可通过其他蛋白质或核酸的置换反应以及细胞内GSH对MnO2纳米片的降解作用而释放出来。随后细胞内的目标探针miRNA-21可触发两个发夹级联组装成长的dsDNA聚合物，使荧光FAM（供体）和TMR（受体）紧密接近以产生显著放大的FRET信号，用于高灵敏检测活细胞中的少量miRNA-21。通过改变发夹序列，此方法可以为监测活细胞中其他低表达的微量miRNA靶标提供机会。关键词：荧光生物传感器疾病标志物信号放大策略活细胞成像II AbstractSensingResearchofDiseaseMarkersBasedonSignalAmplificationStrategyAnalyticalChemistryMasterPostgraduate:JingLiSupervisor:ProfessorYunXiangABSTRACTDiseasemarkerssuchasproteinsandnucleicacidshaveseriouslythreatenedthehealthofhumanbeing,whichcausedgreatinfluenceonvitalprocessesincludinghereditation,aberranceandmetabolism.Therefore,itwouldhaveimportantsignificanceonfoodsecurity,environmentmonitoring,drugdeliveryanddiseasediagnosistodevotetoworkingontheresearchofbiomolecules.Withtherapiddevelopmentofbiomedicineandanalyticalchemistry,scientistshaveestablishedaseriesofeffectivemethodstomonitorthesediseasemarkers.However,themainemphasisofmodernbioanalysishasshiftedtoestablishmoresensitive,simple,accurateandreal-timeanalysismethodsduetothelimitationsofinterferenceandlowconcentrations.Inrecentyears,fluorescencesignalamplificationtechnologyhasattractedwideattentionduetoitshighsensitivity,goodselectivity,fastresponsespeedandlowdetectioncost.Basedonavarietyofsignalamplificationtechniques,thisdissertationconstructedthreefluorescentbiosensorscombinedwithmolecularbiologytechniquessuchasrollingcircleamplification,DNAself-assemblyandlivecellimagingforreal-timemonitoringthetargetofuracilglycosylase(UDG),thrombinandmicroRNA-21.Part1.Alabel-freefluorescencebiosensorassistedbyrollingcircleamplificationstrategyforsensitivedetectionofuracilDNAglycosylase.AsasignificantDNArepairenzyme,uracil-DNAglycosylase(UDG)isresponsibleforrecognizingandeliminatinguracilbasefromduplexDNAtopioneerthebaseexcisionrepair(BER)process,whichplaysapivotalroleinthemaintenanceofgenomeintegrity.Therefore,itisessentialtocarryouttheresearchofUDGactivityinfundamentalbioanalysisandclinicalapplication.Here,wehaveproposedalabel-freefluorescentapproachbasedonG-quadruplexformonitoringUDGactivitybyusingrollingcircleamplification(RCA).Inthiswork,ahybridizedthree-strandedDNAcomplexmodifiedwithuracilbasesisdesignedforUDGrecognition.UndertheactionofUDG,theuracilbasescanbespecificallyrecognizedandexcisedfromthedeoxyribosesphosphatebackbonetocreateabasicsites,whichsuccessfullyresultinthedisassemblyofthehybridizedthree-strandedDNAsubstrateandtheformationIII 西南大学硕士学位论文ofannularprecursor.TheannularprecursorligatedbyT4ligasecouldsubsequentlytriggerRCAreactionandgenerateaprolongedmassiverepeatedG-quadruplexunittointeractwithprotoporphyrinIX(PPIX)toproduceanenhancedfluorescenceresponseforamplifieddetectionofUDGactivity.NotonlycanitsuccessfullydistinguishUDGfromothernonspecificbiomolecules,butalsocouldbeappliedforscreeningtheinhibitorsofUDG.Thisproposedstrategyishighlysensitiveandselectivewithadetectionlimitaslowas0.00014U/mL.Theseresultsindicatethatthesimple,sensitiveandeconomicstrategyholdsgreatpotentialapplicationsinUDGassociatedresearchesandrelatedclinicaldiagnosisstudies.Part2.Aptamerproximityrecognition-dependentstrandtranslocationforenzyme-freeandamplifiedfluorescentdetectionofthrombinviacatalytichairpinassembly.Bycouplinganewaptamerproximityrecognition-dependentstrandtranslocationstrategywithcatalytichairpinassembly(CHA)signalamplification,wehavedevelopedasimpleandsensitivemethodfordetectingthrombininhumanserums.SimultaneousbindingoftwoengineeredaptamerprobestothethrombintargetsignificantlyincreasesthelocalconcentrationsofthetwoprobesandfacilitatesthetranslocationofassDNAstrandfromoneoftheprobestotheotherthroughtoeholdmediatedstranddisplacement.SuchstrandtranslocationleadstothegenerationofassDNAtailintheaptamersequenceforsubsequentinitiationoftheassemblyoftwofluorescentlyquenchedhairpinintomanyDNAduplexesviaCHA.TheformationoftheDNAduplexesthusresultsinsignificantfluorescencerecoveryforamplifieddetectionofthrombindownto8.3pmol/L.Thedevelopedmethodishighlyselectivetothethrombintargetagainstotherinterferenceproteinsduetothedualrecognitionmode,andcanbeemployedtomonitorthrombininhumanserumsamples.Withtheadvantageofsimplicity,sensitivityandselectivity,thismethodcanbeauniversalenzyme-andnanomaterial-freeamplifiedsensingplatformfordetectingdifferentproteinmolecules.Part3.BiodegradableMnO2Nanosheet-MediatedSignalAmplificationinLivingCellsEnablesSensitiveDetectionofDown-RegulatedIntracellularMicroRNA.ThemonitoringofintracellularmicroRNAsplaysimportantrolesinelucidatingthebiogenesisandbiologicalfunctionofmiRNAsinlivingcells.However,becauseoftheirsmallsize,lowabundanceandsequencesimilarity,itisofgreatchallengetodetectintracellularmiRNAs,especiallyforthosewithmuchlowerexpressionlevels.Toaddressthisissue,wehavedevelopedanincellsignalamplificationapproachformonitoringdown-regulatedmiRNAsinlivingcellsbasedonbiodegradableMnO2nanosheet-mediatedandtarget-triggeredassemblyofhairpins.TheMnO2nanosheetscanadsorbandexhibitexcellentquenchingeffecttothedyelabeledhairpinprobes.Besides,duetotheirbiodegradability,theMnO2nanosheetsfeaturewithhighlyreducedcytotoxicitytothetargetcells.Uponenteringcells,theIV Abstractsurface-adsorbedFAM-andTamra(TMR)-conjugatedhairpinscanbereleasedduetothedisplacementreactionsbyotherproteinsornucleicacidsandthedegradationoftheMnO2nanosheetsbycellularGSH.Subsequently,thedown-regulatedtargetmiRNA-21triggerscascadedassemblyofthetwohairpinsintolongdsDNApolymers,whichbringsthefluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)pair,FAM(donor)andTMR(acceptor),intocloseproximitytogeneratesignificantlyamplifiedFRETsignalsforhighlysensitivedetectionoftracemiRNA-21inlivingcells.Bycarefullytailoringthesequencesofthehairpins,thedevelopedmethodcanoffernewopportunitiesformonitoringvarioustraceintracellularmiRNAtargetswithlowexpressionlevelsinlivingcells.Keywords:Fluorescencebiosensor;Diseasemarkers;Signalamplificationstrategy;LivecellimagingV 第一章绪论第一章绪论1.1荧光生物传感器的简介一直以来，生物传感器以其灵敏、快速、精确的特点，成为现代生物分析领域最为前沿的检测装置，它为众多生物活性分子如DNA、蛋白质、酶以及细胞等的分析应用提供了最为先进的技术手段。随着生物科技的不断进步与发展，荧光生物传感器作为生物传感器的一个重要分支，已经在食品工业、环境监测、生物[1-3]医药、疾病诊断等各个领域有了广泛应用。荧光生物传感器是一种通过分子识别元件与待测物质反应结合，以荧光信号输出作为检测基础，经信号转换及放大处理后以实现对目标物的分析检测的光学生物传感器（其工作原理如图1.1所示）。荧光生物传感器由于具有好的选择性、高的灵敏度、少的试样量以及快的响应速度等优点，已成为检测各种生物分子最普遍的光学生物传感器之一。图1.1荧光生物传感器的原理图。Fig.1.1Schematicillustrationoffluorescentbiosensor.1.1.1荧光产生的原理荧光是物质吸收光照或者电磁辐射后而发出的光。如图1.2所示，因为每个分子都存在其相应的电子能级,而其电子能级又包括振动和转动两种能级，此处的S0、S1和S2分别代表了基态、第一电子激发单重态和第二电子激发单重态，T1和T2分别代表第一电子激发三重态和第二电子激发三重态，而单重态与三重态的不同在于电子的自旋方向。根据保利不相容原理可知，处于基态的分子，其每个原子轨道的电子都是成对出现且自旋方向相反。当处于基态的分子被光照射或辐射时，基态分子中的电子就会吸收光子产生能量，被激发跃迁到高能级上。如果自旋方向仍然不变，则分子处于第一、第二激发单重态；但如果电子在跃迁过程中自旋方向发生了改变，即电子由相反自旋变成了平行自旋，则处于激发三重态。由洪特规则可知，等价轨道中非成对电子平行自旋的能量比成对相反自旋的能量更低更稳定，因此，三重激发态比相应的单重激发态的能级更低。由于处于激发态的分子是很不稳定的，往往会在短时间内以辐射跃迁或非辐射跃迁的方式返回基态，所以当电子由第一激发单重态恢复到基态时，能量就会以光的形式释放，从而产1 西南大学硕士学位论文生荧光。图1.2荧光产生的原理图。Fig.1.2Principleoffluorescencegeneration.1.1.2荧光生物传感器的分类及特点分子识别单元和信号转换单元是荧光生物传感器中最为重要的两大功能性元件。分子识别单元作为传感研究中特异性检测的基础，能够选择性地识别特定的生物活性物质如核酸、蛋白、细胞等。这些识别单元通过与被检测分子作用如碱基互补配对、抗原抗体识别、酶与底物结合等方式而形成复合物。因此，在构建传感器时，适于测定目标的识别单元的选择就显得尤为重要。根据分子识别单元和被测分子之间作用方式的不同，可以将荧光生物传感器大致分为以下四类：荧光适体传感器、荧光免疫传感器、荧光核酸传感器和荧光细胞传感器。1.1.2.1荧光适体传感器核酸适体是指可以跟有机或无机化合物、蛋白质分子及整个生物学细胞、病毒等特异性结合的一类特殊的DNA或RNA片段。核酸适体是通过体外筛选技术-指数富集配体进化系统（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,[4-6]SELEX）从核酸文库中得到的。筛选而来的适体有许多优点，比如合成方便、修饰简单、稳定性好、与被测分子结合的序列广泛、高的特异性及亲和力等。与传统抗体及其他仿生亲和试剂相比，核酸适体的这些优势使其在分析检测方面备受关注，因而在生物医学等各个领域都有了快速发展。荧光适体传感器是通过把适体识别作用与荧光检测手段相结合的方式，利用核酸适体在与被测分子结合过程中发生构型改变而导致体系中荧光输出信号改[7]变，从而对目标物进行定性、定量分析的感应装置。Pu基于氧化石墨烯对单链DNA的吸附作用以及适体链对小分子ATP的特异性识别作用，构建了一个用于ATP检测的荧光适体传感器（图1.3）。首先他们分别设计了两条DNA探针，其2 第一章绪论中一条标记有荧光基团FAM用作信号探针，另一条为识别ATP的适体探针。在没有目标分子ATP存在的情况下，信号探针和适体探针根据碱基互补配对原则可形成双链DNA复合物而不能吸附在氧化石墨烯的表面，因此此时显示出很强的荧光信号。一旦加入ATP，适体链则与ATP表现出更高的亲和性而结合成更稳定的生物复合体，此时由FAM标记的单链DNA被吸附在石墨烯表面，荧光被猝灭，信号大大降低。这种方法对ATP的检测具有很高的选择性，但由于这是一种“Off-On”的检测模式，因此其检测限（0.45mmol/L）不是特别理想。[7]图1.3利用GO作为荧光猝灭剂检测ATP的原理图。[7]Fig.1.3SchematicofATPdetectionusingaGOnano-platform.2++2+[8]图1.4基于适体荧光传感器进行Hg、Ag和Pb的多组分检测原理图。Fig.1.4Schematicillustrationofanaptamer-basedfluorescentsensorformultiplexdetectionof2++2+[8]Hg,AgandPbions.由于重金属离子的污染会给人体健康和生存环境构成严重威胁，因此对这些[8]离子进行有效的检测对生态系统的维护十分必要。Wang基于多壁碳纳米管2+（MWCNT）能量转移构建了一种新型适体生物传感器，用于均相溶液中Hg、+2+Ag和Pb高灵敏和高选择性的同时检测。如图1.4，首先不同荧光基团标记的三种适体由于其强烈的π-π堆积作用而吸附在MWCNT上，由于适配体和MWCNT之间的非共价组装，使荧光基团和MWCNT之间能发生能量转移，导致染料的荧光猝灭。在金属离子的存在下，适体和金属离子之间发生特异性结合将其从MWCNT上释放出来，导致该体系的荧光信号恢复。更重要的是，MWCNTs的高3 西南大学硕士学位论文比表面积可以猝灭用不同荧光染料标记的多个适体探针，导致该纳米传感器在同2++一溶液中可以同时检测多种金属离子。这种基于MWCNT的传感平台对Hg、Ag2+2++和Pb的检测表现出高的灵敏度和选择性，使Hg的检测限为15nmol/L，Ag的2+检测限为18nmol/L，Pb的检测限为20nmol/L。1.1.2.2荧光免疫传感器荧光免疫传感器是将荧光检测技术与免疫测定相结合而创建的一种新型传感装置。由于该传感过程是通过抗原抗体的特异性识别作用而构建的，因此非特异性结合非常少。随着荧光检测技术的逐渐完善，荧光免疫传感技术的检测时间也大大缩减，精确度及灵敏度等方面均有明显提高。由于该方法的测量程序简单，易于自动化，可实现对抗原的定量测定等优点，已引起了研究者们的浓厚兴趣。[9]图1.5基于临位触及的免疫传感器用于蛋白检测的原理图。[9]Fig.1.5Principleofthebinding-induced-basedimmunosensorforproteindetection.[9]Deng基于临位触及的原理，通过抗原抗体的特异性识别作用，构建了一系列荧光免疫传感器用于蛋白质的灵敏检测。如图1.5所示，首先他们设计了两条核苷酸链序列S1和S2，并在序列末端都修饰了亲和配体，同时分子信标标记有荧光基团和猝灭基团可作为信号探针。当目标物存在时，目标蛋白与其亲和配体特异性结合，使得两条单链能够杂交互补配对。结合后的DNA/蛋白复合物中，序列T与A的部分刚好可以与分子信标杂交使得发夹结构打开，同时荧光基团远离猝灭基团，使荧光信号恢复。而体系中的剪切酶可以剪切信号探针使目标物进入下一个循环实现信号放大。该体系实验过程中无需分离，在均相溶液中就能完成等温扩增及高灵敏分析，这给实时检测和现场分析的实现提供了潜在的应用前景。1.1.2.3荧光核酸传感器核酸分子作为生命遗传和基因表达的基础，在生物有机体的新陈代谢及生长发育等过程中有着举足轻重的地位。随着生物学研究的不断深入，核酸的灵敏检测变得尤为重要。最早的核酸检测方法包括分子印记杂交、原位杂交及凝胶电泳法等。但这些方法操作繁琐，耗时长，灵敏度低。基于这种情况，以碱基互补配4 第一章绪论对为理论基础的荧光核酸传感技术应用而生。荧光核酸传感器是结合荧光检测技术，以核苷酸链之间的互补配对为识别单元而建立的一种传感装置。由于该传感平台分析速度快、操作简单、灵敏度高等优点，基于荧光核酸传感器的研究已经得到了很多科研工作者的重视，并在环境监测、药物递送、疾病诊断等方面显示出广泛的应用前景。[10]图1.6基于HCR放大及荧光共振能量转移用于DNA检测的原理图。[10]Fig.1.6SchematicillustrationoftheFRET-basedamplificationfortargetDNAdetection。[10]Chen基于杂交链式反应（HCR）和荧光共振能量转移（FRET），构建了一个多功能的无酶检测脱氧核糖核苷酸（DNA）的方法。如图1.6所示，发夹H1和H2分别用作为荧光供体的羧基荧光素（FAM）和作为荧光受体的四甲基罗丹明（TAMRA）标记在环部与颈部。当目标DNA存在的情况下，目标DNA与发夹H1杂交并打卡H1的发夹结构，随后形成的杂交双链体通过HCR自组装过程又继续与H2反应生成长的双链DNA复合物。此时的荧光供体FAM与受体TAMRA之间的距离被拉进，使得他们之间能够发生FRET过程。而供体和受体的荧光强度比值可用于定量检测目标DNA，检测限为0.7nmol/L。该方法亦可用于生物样品中其他DNA的检测，结果同样令人满意。[11]图1.7基于荧光核酸传感器用于多重DNA同时检测的示意图。[11]Fig.1.7ThedetectionprincipleformultiplexDNAtargets.[11]基于核酸探针的互补配对原则，Zhu构建了一种灵敏的、多重的、通用的核酸探针检测方法。如图1.7所示，三条分子信标在序列末端分别标记了三种不同的荧光基团Alex488、ROX和Cy5。在没有目标DNA时，三条探针的粘性末端都可以依附在氧化石墨烯（GO）表面，此时的荧光是猝灭的。当三种目标寡核苷酸序5 西南大学硕士学位论文列存在时，它们可分别与相应的分子信标结合成双链结构脱离GO表面而使荧光恢复。由于三种染料的最大激发波长和最大发射波长之间的波长间隔非常接近，因此用荧光同步扫描就可同时检测出三种荧光基团的信号，达到同时检测人体免疫缺陷病毒（HIV）、天花病毒（VV）和埃博拉病毒（EV）的目的。该方法也同样可以运用到其他核苷酸的检测，实现在生物医学方面的应用。1.1.2.4荧光细胞传感细胞内的生物分子对生命有机体的生理功能起着关键的调节作用，研究细胞内各种分子的结构及浓度变化对认识细胞的动态过程及生理环境等问题至关重要。随着分析技术的不断发展，生物医学传感方法已经达到了单细胞水平，以活细胞作为识别单元的细胞传感技术已经成为生物医学领域的研究重点与热点。在此基础上，细胞的胞吞胞吐、信号转导、蛋白转运等过程都可以实现实时监测。结合荧光检测方法所具有反应速度快、灵敏度高、精确度准等优势，荧光细胞传感已经革新了生物学工作者研究细胞生理过程的方式，并获得了一系列重要成果。荧光细胞传感器是指以活细胞为检测单元，用荧光检测方法测量细胞表面或内环境的一类传感装置。细胞表面传感一般是通过抗体或适体序列与细胞表面受体的特异性免疫识别，经过一些反应变化使检测信号转化为荧光信号来定性或定量地检测受体。细胞内环境分子检测也就是活细胞成像，即荧光探针通过细胞胞吞作用及运载体的运输到达细胞内，在与细胞内的目标分子进行一系列生化反应后使荧光释放，在荧光生物显微镜等仪器的成像下，实现对活细胞的实时监测。[12]图1.8基于细胞表面受体识别进行癌细胞成像的原理图。Fig.1.8Schematicrepresentationofthefluorescenceprobingstrategyforcancercellsimagingbased[12]onreceptorrecognition.[12]Yan提出了一种基于荧光标记的适体/单壁碳纳米管（F-apt/SWNT）集合的用于癌细胞探测的新型可激活的适体探针策略。如图1.8所示，通过π-π堆叠作用和邻近诱导的能量转移，F-apt/SWNT在其自由状态下荧光被猝灭，但通过靶向细胞的表面受体对适体探针的识别作用可实现信号激活。该体系中，Sgc8c适体用6 第一章绪论于CCRF-CEM癌细胞的体外分析和体内成像。该自组装的Cy5-Sgc8c/SWNT复合物在生物学应用中保持相当好的稳定性，且在不同培养基中也具有良好的分散性，并在血清中也能持续2小时的超低荧光背景。流式细胞术检测显示，Cy5-Sgc8c/SWNT被靶向细胞特异性激活后荧光信号明显增强，在含有约100,000个非靶向细胞的混合样品中检测到低至12个靶向CCRF-CEM细胞，显示出很高的检测灵敏度。该策略的普遍适用性也通过适体探针TD05检测Ramos细胞得到证明。这意味着F-apt/SWNT复合体作为用于体外癌细胞检测和体内癌症成像的可激活平台具有简单、稳定、灵敏且多功能的应用潜力。[13]图1.9基于金纳米探针原位监测细胞内miRNA-21及光热治疗的原理图。Fig.1.9SchematicillustrationofinsitumonitoringofintracellularMiRNAandtheranosticefficacy[13]withAunanoprobe.近年来，随着细胞成像技术的逐渐完善，研究者们开始尝试利用该成像系统对细胞内的疾病标志物进行靶向治疗，使得一些光热疗法和光动力疗法也开始兴起。这些传感技术不仅可以实现对目标分子的实时监测，而且能够靶向给药、定点治疗，这对生物医学的疾病诊断及肿瘤治疗起到了更有力的调控作用。如图1.9[13]所示，Liu将叶酸分子作为靶向受体，用染料标记的分子信标作为识别元件和信号开关进行组装，通过金纳米探针把叶酸受体靶向递送到癌细胞中。该体系的荧光信号通过细胞内microRNA诱导分子信标的打开而产生，从而用于细胞内核酸的有效检测和成像，在单个HeLa细胞中miRNA-21的平均检测量为1.68pg。此外，在808nm的近红外照射下，金纳米载体的高光热转换效率可使剩余的折叠信标从纳米载体上分离使荧光增强，实现对光热疗效的实时监测和评估。这项工作对于癌症成像、监测及治疗方面具有巨大潜力。1.2荧光信号放大策略随着生物科学分析技术的不断发展，许多待检测的生物分子由于本身浓度较低或检测环境复杂等原因而不能直接进行检测。例如某些与癌症相关的蛋白及核酸在疾病诊断的早期含量非常低，并在检测时易受一些基质的影响而干扰检测结果的准确性。因此，在进行生物蛋白及核酸的检测时，除了高灵敏的检测仪器外，发展各种信号放大方法来提高实验检测灵敏度、降低检测限显得尤为重要。近年7 西南大学硕士学位论文来，在生化分析和临床研究中，荧光信号放大技术发展为一类高灵敏的检测技术，它可以通过增强检测信号而不直接扩增目标物的方式在蛋白质及核酸的检测中得到了极大应用，是目前生物化学及临床医学研究的重要手段，并成为生物分析领域中一个重要的分支。下面就荧光信号放大技术进行简单介绍。1.2.1基于酶辅助的信号放大策略核酸工具酶是一类由活细胞产生的具有高效的生物催化活性的分子，它是基因工程中不可或缺的工具，与我们的各种生命活动都密切相关。在催化反应体系中，酶作为一种催化剂可催化某一反应底物快速代谢及转化为另一种分子，但一种酶只针对某一个或一类特定的反应底物起作用，由此也确保了酶在分析检测系统中的专一性与高效性。目前，包括逆转录酶、连接酶、聚合酶及限制性酶等在内的核酸工具酶都常用于荧光生物传感器的研究中，这些酶在辅酶因子的帮助下可实现对核酸分子的修饰、连接、聚合以及切割等作用。由于酶反应是在恒温均相溶液中进行而无需反复退火，因此，基于酶辅助的信号放大技术在分析检测的各个领域得到了越来越多的关注。1.2.1.1聚合酶DNA聚合酶是一种能够对模板DNA进行修复和复制的功能性生物酶，它可以催化单个碱基在DNA3’端的连接，使其在整个核酸复制过程中发挥巨大作用。-DNA聚合酶种类较多，本实验中涉及到的Klenowfragmentexo聚合酶，是从大肠杆菌聚合酶Ⅰ的片断中提取出来并除去了具有外切酶活性部分的突变体，因此它仅仅保留了聚合酶Ⅰ中的5’→3’端的聚合酶活性，却缺失了完整的聚合酶所具有[14]的3’→5’和5’→3’的外切活性。作为现如今最受青睐的体外恒温扩增技术之一，滚环扩增（rollingcircleamplification,RCA）技术中DNA聚合酶的使用已经在生物分析测定及传感器应用方面彰显出了其巨大的前景。在这个等温酶促过程中，通过向反应体系中加入一种单链环形DNA分子作为滚环扩增的模板，以及一条短的能与部分环形模板互补的寡核苷酸链作为引物，并在DNA聚合酶的催化及辅酶因子等的共同作用下，便可按照碱基互补配对原则，使dNTPs原料沿着引物DNA的3’端进行无限单链复制延伸直至原料耗尽抑或酶失活，最终使其生长成一条具有多个重复序列的与环形模板互补的极长单链DNA。此延伸出的单链DNA通过特殊设计可产生成百上千倍放大的检测信号，可实现目标识别、药物传递、细胞成像等功能的应用。[15]如图1.10，Liu报告了一种多功能生物传感平台，能够实现对小分子和大分子等靶标的超灵敏检测。该传感平台由三个部分组成：首先还原型的氧化石墨烯8 第一章绪论可以非特异性吸附单链DNA分子，其次DNA适配体由于目标物靶向诱导产生构象变化可以从还原型的氧化石墨烯表面得到释放，最后滚环扩增（RCA）能够将引物-模板识别而产生易于检测的重复序列单元。该设计的关键在于标记有引物序列的适配体探针在没有目标物时能够有效地吸附到还原型氧化石墨烯表面上以避免反应发生，而在靶标存在时又能够有效地引起探针的释放使引物可与模板结合产生RCA，并且圆形模板本身不会引起引物探针从石墨烯表面的释放。DNA探针的协同释放被认为是高灵敏检测的促成因素，这种传感器能够实现对蛋白质靶标、DNA序列和小分子分析物的超灵敏检测，也将为生物、医学和环境等领域提供全新的应用。[15]图1.10滚环放大策略用于生物小分子检测的原理图。[15]Fig.1.10Schematicrepresentationofreducedgrapheneoxide-aptamer-RCAbiosensingplatform.1.2.1.2核酸外切酶核酸外切酶是一类能够依次催化水解DNA分子链中的磷酸二酯键，并使核苷酸链最终被切割为单个核苷酸的水解酶。不同类型的核酸外切酶其作用的方式及特性也各有不同，核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）就是其中一种。它主要是按照3’→5’的方向对3’凹末端及平末端的双链DNA进行催化水解，而对于3’凸末端及单链DNA则没有催化活性，无法完成酶切功能。由于ExoⅢ对DNA序列没有特定的识别切割位点，故在使用过程中也没有对核苷酸链的特殊选择性。因此ExoⅢ在构建生物传感器用于放大检测蛋白质及核酸等分子方面也有了广泛应用。[16]如图1.11，Xu描述了一个基于核酸外切酶III（ExoIII）催化的目标物循环（ECTR）放大和SYBRGreenI为指示剂的新型无标记的荧光生物传感平台用于ATP的灵敏检测。该体系中发夹适体探针在ATP存在时发生构象结构转换和重构，导致ExoIII能够催化剪切重构的适体探针并释放目标ATP以启动下一个ECTR过程。这种ECTR过程使大量发夹适体探针消化断裂，导致嵌入到发夹颈部的SYBRGreenI的量减少很多，这强烈抑制了ATP的荧光发射。由于适配体与ATP之间高特异性的结合，该方法对与ATP类似的分子也显示出优良的选择性。此外，此ATP检测方法使用的是未修饰的适配体探针，可以在均相溶液中以“混合检测”的方式进行。该方法的独特优点使其具有检测其他生物小分子的巨大潜力。9 西南大学硕士学位论文[16]图1.11ExoIII催化的目标物循环放大用于ATP检测的原理图。Fig.1.11SchematicExoIII-catalyzedtargetrecyclingamplificationforlabel-freeandsensitive[16]fluorescentdetectionofATP.1.2.1.3限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类可以特异性识别核苷酸序列，并对特定碱基位置上的磷酸二酯键进行切割使核苷酸链发生断裂的生物酶。根据限制性内切酶的结构及辅因子的需求切位不同，其作用方式也不一样。有的内切酶可切割回文序列，有的只切割多核苷酸链的其中一条DNA链，导致切割产物可能是完整的一条单链DNA抑或是两条双链DNA。[17]图1.12内切酶辅助信号放大检测UDG的原理图。Fig.1.12SchematicillustrationoftheUDGactivityassaybasedonnickingenzymeassistedsignal[17]amplification.[17]Liu提出了一种基于切口酶辅助的新型无标记信号放大方法用于可视化检测尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）活性的测定。原理如图1.12，在该方法中，两种发夹探针共同用于比色检测，即发夹探针1（HP1）的颈部含有两个尿嘧啶残基，10 第一章绪论发夹探针2（HP2）中包含有一段富G的DNAzyme片段以及一段识别序列用以切口酶的切割。在目标物UDG存在的情况下，HP1颈部的尿嘧啶碱基可被UDG特异性识别和水解，这导致其产生两个无碱基位点（AP位点），最终使HP1不稳定而形成单链。此时，打开的HP1可以与HP2杂交形成DNA双链体，由此形成了切口酶的识别位点，引发切口酶Nb.BbvCⅠ对HP2的特异性切割，使富G的DNAzyme片段得到释放。而HP1又可以参与到下一个循环与更多的HP2杂交结合以诱导HP2的连续切割，从而产生大量富G的DNAzyme片段。最后，通过与氯化血红蛋白的结合，富G的DNAzyme片段形成了具有催化活性的G-四链体-2--血红素脱氧核酶，可以催化H2O2介导的无色的ABTS变为绿色的ABTS，为UDG的可视化分析提供了一个很有前途的平台。1.2.2基于DNA自组装的信号放大策略DNA自组装几乎存在于每个生命体中，小到核酸蛋白质，大到组织个体，这些都是通过DNA自组装高度功能化集成的结果。最基本的DNA自组装是以两条互补的DNA序列为材料基元，严格遵循Watson-Crick碱基互补配对原则，自发地杂交组装成双链DNA的过程。不仅如此，经过合理设计的DNA序列还可以通过自组装实现由一维到多维、简单到复杂、无序到有序的复杂纳米结构的精密合成。借助于DNA自组装的装配方式，一系列可靠的信号放大技术得以构建。随着生物技术的不断发展，这些具有复杂空间设计的DNA纳米结构已经可以应用到生物分子、纳米机器、药物递送以及疾病诊断等各个领域。目前DNA自组装信号放大的方式主要有两种：杂交链反应和催化发夹组装。1.2.2.1基于杂交链反应的信号放大策略杂交链反应（HybridizationChainReaction,HCR）是指通过合理设计的DNA分子，在无酶条件下，通过诱发链而引发的核苷酸链之间的相互杂交，从而产生具有一定空间结构的双链DNA复合物的过程。由于每条诱发链都可以触发HCR反应使信号得到放大，因此，由此构建的传感器可最大程度规避假阳性信号的产[18]生，降低背景信号。自2004年Dirks和Pierce首次提出了这种体外扩增技术后，[19]就得到广泛应用。例如Huang报道了一种基于氧化石墨烯（GO）的荧光传感器，通过使用杂交链式反应用于水溶液中汞离子的检测。如图1.13，两条发夹探针和一条辅助DNA被用于实验，其中HP1标记有荧光基团FAM，而GO则用作捕获2+单链DNA的吸附材料和用于减少背景信号的有效荧光猝灭剂。在没有Hg时，HP1、HP2及辅助DNA探针同时被GO吸附，使HP1的荧光产生猝灭。当目标物2+2+Hg存在的情况下，Hg通过T-Hg-T配位化学启动两个发夹探针之间的HCR，此11 西南大学硕士学位论文时由于双链DNA产物不能被GO吸附而释放出来使荧光得到恢复。该传感方法的检测限为0.3nmol/L，这对实际应用而言已足够灵敏。该传感平台不仅表现出对其他二价金属离子的高选择性，而且对于饮用水等实际样品的检测也同样适用。[19]图1.13基于氧化石墨烯引发杂交链式反应的荧光传感器用于汞离子检测的原理图。2+Fig.1.13Schematicrepresentationofgrapheneoxide-basedamplifiedfluorescentbiosensorforHg[19]detectionthroughhybridizationchainreactions.1.2.2.2基于催化发夹组装的信号放大策略催化发夹组装(Catalytichairpinassembly,CHA)指的是两条能够互补杂交的发夹型DNA探针（H1和H2）本身在溶液中稳定存在，一旦加入目标物以后，两条核酸链的发夹结构被相继打开以形成H1-H2这样的双链DNA复合物，同时目标物也从中释放出来进入到下一个循环，实现对目标物放大检测的过程。在整个发夹装配过程中，目标物就好似起到了催化的作用，使原本单独稳定的发夹能够杂交结合。这种信号放大方法可以在较短时间内完成，并大大降低检出限。[20]图1.14基于催化发夹组装的无酶荧光放大法用于凝血酶检测的原理图。Fig.1.14Schematicillustrationofenzyme-freefluorescenceaptasensorforamplificationdetection[20]ofhumanthrombin.[20]如图1.14，Zheng开发了一种简单的无酶放大的适体传感器，通过靶向催化发夹组装进行凝血酶的检测。这个适体传感器含有两个DNA发夹探针H1和H2。12 第一章绪论H1分别在其5端和3端修饰了荧光基团和猝灭基团，其中一段序列是由人凝血酶的适体序列组成，另一段序列与H2部分互补。在没有凝血酶存在时，这两个发夹之间的相互作用非常缓慢。但在加入靶蛋白后，它可以促进H1发夹结构的打开，从而加速H1和H2之间的杂交结合，导致体系显著的荧光增强。通过监测荧光强度值的变化，可以高灵敏地检测目标蛋白。该适体传感器的检测限为20pmol/L，比之前所报道的非放大循环的适体传感器的检测限低两个数量级。此外，这种放大的适体传感器对其靶蛋白显示出很高的选择性，同样能够为其他蛋白质的检测提供简单、灵敏和高选择性的平台。1.2.3基于纳米材料的信号放大策略纳米材料是指其尺寸大小介于1⁓100nm尺度范围内的无机或有机材料，它可以是由纳米片、纳米线、纳米颗粒或原子团簇等构成的金属或高分子材料。由于其尺度接近于光的波长以及大的比表面积等特殊性能，纳米材料在热学、光学、力学、电学等各个领域都表现出独特效应，如量子尺寸效应、表面效应、隧道效[21]应及介电限域效应等。如今，在纳米材料基础上构建的理论研究及技术开发都获得了飞速发展，并在电子设备、纺织工业、医疗器械等各个科学领域取得巨大进步。随着纳米材料制备手段的不断完善，纳米技术在生物分析及应用方面也受到了越来越多的关注，这将为日后科研工作者在药物递送、疾病诊断、临床医学研究等生物传感方面提供新的研究动力。1.2.3.1基于量子点的信号放大策略量子点是一类用于生物探针荧光标记的纳米粒子，其直径大小介于2⁓20nm范围内。相比于其他的纳米材料，量子点的尺寸易于合成把控，且不同材料或尺寸大小的量子点所对应的发射波长不同，呈现的颜色也不一样。故常常用颗粒大小不同的量子点修饰不同的生物探针，就可在同一激发波长下检测出各个量子点所标记的生物探针的光学信号响应值，达到几组分同时监测的目的。此外，由于量子点的量子产率很高，其荧光强度相比于传统的有机荧光染料寿命更长、更稳定，是一种非常具有应用前景的荧光探针。除此之外，量子点所具有的大的斯托克斯位移、宽的发射光谱带、强的耐光性等多重优点，使其能够作为优良的光学探针应用到生物科学的各个领域，为科研工作者提供更多更好的研究契机。[22]Hansen利用PbS和CdS量子点的电化学发光性质，对两种蛋白质靶标分别进行标记，构建了一种多组分同时检测的超灵敏电化学生物传感器。如图1.15，蛋白质溶解酵素及凝血酶分别由量子点PbS和CdS进行标记，其相应的核酸适体探针组装在金电极表面可分别捕获相应的蛋白。当目标物存在时，它可通过置换13 西南大学硕士学位论文作用将金电极表面携带的PbS和CdS量子点置换下来，并通过电化学剥离的方式2+2+进行检测。由于一个CdS和PbS量子点可溶出多个Cd和Pb，因此该传感器达到了放大检测的目的。[22]图1.15基于量子点信号放大用于多种蛋白质检测的原理图。Fig.1.15Theprincipleofaptamer/quantum-dot-baseddual-analytebiosensor,involving[22]displacementofthetaggedproteinsbythetargetanalytes.1.2.3.2基于纳米金的信号放大策略纳米金通常是指直径在1⁓100nm之间的金的微小颗粒，其粒径均匀、性质稳定、易于合成且价格低廉。纳米金溶液颜色的变化随着金纳米粒子的聚集和分散分别呈现出紫色和红色的状态，这种灵敏的颜色变化使其成为比色传感研究方面独特的信号材料，并被广泛应用于比色法检测生物分子的研究中。[23]图1.16基于纳米金信号放大用于电化学免疫传感中IgE的灵敏检测原理图。[23]Fig.1.16Schematicrepresentationoftheelectrochemicalsandwichimmunoassay.随着分析检测技术的不断发展，基于纳米金材料的制备和修饰方法也在不断更新和完善，使其能够满足现代科学技术的应用和要求。相比于量子点，作为信号传感材料的纳米金往往经过生物修饰可以通过吸附作用固载更多的电活性物[23]质，因此已被广泛应用于电化学传感平台的构建。比如Wang结合了适体、纳米材料和抗体的优势，设计了一种电化学夹心免疫测定法，以亚甲基蓝（MB）作为电化学指示剂，对人体免疫球蛋白E（IgE）进行超灵敏检测。如图1.16，其夹心结构通过使用山羊抗人体IgE作为捕获探针来制造。适体-金纳米颗粒（AuNPs）缀合物既用作夹心放大元件又用作MB的积聚试剂。一旦适体-金纳米颗粒缀合物特异性结合到电极表面，MB分子就通过MB与适体-金纳米颗粒缀合物的G碱基14 第一章绪论之间的特异性识别作用而积聚在其表面上。因此，随着人体IgE浓度的增加，更多的适体-AuNPs缀合物被结合，因此更多的MB分子被累积。该体系在1⁓10,000ng/ml范围内检测人体IgE具有良好的线性关系，最低检测限为0.52ng/ml。此外，通过使用BSA、IgA和IgM作为对比，也证明了该传感系统对检测人类IgE的良好的选择性和特异性。1.2.3.3基于石墨烯的信号放大策略近年来，石墨烯作为一种性能优异的新型碳材料，受到了越来越多科研工作者的关注。它较高的比表面积和表面丰富的官能团，使得它在无机材料和复合材料等应用方面极具前景。如今，石墨烯的制备工艺成熟、方法繁多，其物理化学性质的应用也大获发展。首先，它能够通过强烈的π-π堆积作用使单链DNA吸附于其表面，但因双链DNA中裸露的磷酸骨架而吸附较弱，因此这种吸附能力的差异使其可用于DNA传感器的构建。其次，石墨烯良好的电子转移能力使其对荧光基团具有强烈的猝灭作用，可用于荧光传感器的创建。此外，它不易被核酸酶降解，具有良好的生物稳定性，也适于细胞成像的应用。而在电化学免疫传感平台的构建中，由于石墨烯具有机械强度好、带隙小、载流子迁移率高、比表面积大等新颖性能，引起了人们的极大关注。[24]图1.17基于石墨烯信号放大用于IgG检测的原理图。Fig.1.17Schematicillustrationofthepreparationofgraphene-basedhybridsandtheconstructionof[24]thesandwich-typeelectrochemicalimmunosensor.[24]Liu开发了一种具有石墨烯辅助的信号放大的高灵敏电化学免疫传感器。如图1.17，为了构建免疫传感器的基底，首先通过简单的超声诱导组装将聚（二烯丙基二甲基氯化铵）功能化的石墨烯纳米片（PDDA-G）和金纳米颗粒（AuNPs）组合来制造新的复合结构。形成的复合结构为抗体的固载提供了有效的基质，并具有良好的稳定性和生物活性。随后，又设计了一种含金纳米颗粒官能化的氧化石墨烯和辣根过氧化物酶二抗的多标记石墨烯纳米探针，用于构建新型夹心电化15 西南大学硕士学位论文学免疫传感器。通过复合结构高结合能力、优异的导电性及多标记信号放大的优点，此传感器的灵敏度得到增强。基于石墨烯结构和多标记的双重信号放大策略，该免疫传感器在检测人体IgG（HIgG）范围在0.1⁓200ng/ml时显示出优异的分析性能，在3σ标准内检测限为0.05ng/ml。此外，该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，可用于实际样品中HIgG的检测。因此，该策略也为石墨烯在临床研究中的广泛应用铺平了道路。1.2.3.4基于硅纳米颗粒的信号放大策略纳米硅材料往往通过掺杂荧光染料或磁性颗粒可作为亲水性生物材料使用，它不仅易于合成，而且具有良好的生物相容性，功能化的硅纳米颗粒在生物信号分子的运载及传输方面已有广泛应用。而荧光二氧化硅纳米颗粒因其较大的比表面积、较小的颗粒尺寸、较强的光稳定性以及大容量的荧光染料负载率，能够在生物分析中以高强度的荧光值实现对目标物的放大检测，提高灵敏度。基于此，[25]Tan小组使用生物荧光二氧化硅纳米粒子的夹心法，开发了一种新型的DNA生-15物分析方法，使检测限达到0.8fmol/L（0.8×10mol/L）。如图1.18，在该体系中，有机荧光染料掺杂的二氧化硅纳米粒子是通过改良的反相微乳液合成，由于纳米粒子包载了大量荧光分子，因此其极其耐光并易用于生物偶联，使其在仅有痕量DNA靶标存在的情况下表现出优良的信号传导能力，这种检测的荧光强度比Rubpy、Texas红和量子点605高了几十上千倍。而经过有效的表面修饰，非特异性的结合和纳米粒子的聚集也被降到最低。另外，基于二氧化硅纳米粒子的DNA生物分析测定法还可以有效地区分单碱基错配的DNA序列。该检测方法所具有的良好的重现性、选择性和灵敏度也是其能够广泛应用于生物医学领域至关重要的因素。[25]图1.18基于二氧化硅纳米颗粒信号放大进行DNA生物分析的原理图。[25]Fig.1.18SchematicofasandwichDNAassaybasedonNP.1.2.3.5基于磁性纳米颗粒的信号放大策略磁性纳米颗粒是指在外加磁场下具有磁性，并能够顺着磁场方向到达指定区域的复合纳米材料。磁性纳米材料的诞生对人类社会产生深远的影响，并在能源、信息、新材料等各个领域发挥着举足轻重的作用。而磁性纳米颗粒因其大的比表16 第一章绪论面积、纳米特性和超顺磁性等独特性质，在生物医学领域得到了日益广泛的应用。例如通过将功能化的磁性纳米颗粒与细胞、抗体、核苷酸链等具有生物活性的分子相连接，实现了其在核磁共振成像、靶向热疗、靶向给药以及生物分离等各个生物医学领域中的应用，并有可能从根本上解决人类面临的能源、健康和环境等重大问题。[26]Rusling课题组结合多酶标记的抗体-磁珠生物缀合物和密集包装的金纳米颗粒，构建了一个超灵敏的电化学免疫传感平台来检测血清样品中的癌症标志物。如图1.19，通过合成含有7500个辣根过氧化物酶（HRP）标记的磁性生物缀合物颗粒，并通过在羧基活化的直径为1μm的磁珠上附载检测抗体（Ab2），使灵敏度大大增强。这种传感器在10μL未稀释的血清中对前列腺特异性抗原（PSA）的灵敏度为31.5μAmL/ng，检测限（DL）为0.5pg/mL。这比先前报道的在碳纳米管（CNT）上标记多个碳纳米管森林免疫传感器的灵敏度高8倍，并接近或低于大多数癌症生物标志物的正常血清水平。在细胞裂解物和癌症患者的血清中PSA的测量结果与标准ELISA测定结果也具有极好的相关性。这种磁珠偶联放大在未来制造生物电子阵列方面具有良好的前景。[26]图1.19基于磁性纳米颗粒信号放大用于PSA免疫检测的原理图。[26]Fig.1.19SchematicofAb2-magneticbead-HRPprovidingmultipleenzymelabelsforPSAassay.1.3本文研究思路综上所述，随着现代科学技术的不断提高，人们对生活水平及健康状况也尤为重视，特别是在与癌症相关的疾病标志物的分析方面。虽然癌症的防治与治疗已成为世纪难题，但科研工作者们从来没有停止对更加灵敏、可靠的检测手段的追求。利用现代先进的生物分析材料和医学检测手段，一系列基于信号放大技术而建立的生物传感器给生物分析领域带来了新的契机，尤其是在核酸与蛋白质等生物活性分子研究上起到了积极的推动作用。基于以上热点，本论文将以信号放大方法为核心，结合荧光生物传感平台，发展对核酸及蛋白质等疾病标志物的研17 西南大学硕士学位论文究测定。主要内容如下：（1）基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测。在这项工作中，已设计好的用尿嘧啶碱基修饰的杂交三链DNA复合物被用于UDG的识别。在UDG的作用下，尿嘧啶碱基可以被特异性识别并从脱氧核糖磷酸骨架上切除以产生无碱基位点，这将导致杂交三链DNA复合物的解离和环状体DNA的形成。环状体通过T4连接酶的连接后可引发RCA反应并产生大量的重复的G-四链体单元，其可以与原卟啉IX（PPIX）相互作用以产生增强的荧光响应用于UDG活性的放大检测。（2）基于一种新型适配体临位识别引发链迁移的策略与催化发夹组装（CHA）相结合进行信号放大的方式，我们将构建一种简单而灵敏的方法来检测人体血清样品中的凝血酶。首先，两条含有凝血酶适配体序列的探针能够同时结合到目标物凝血酶上以显著增加两条探针的局部浓度。其次，通过toehold引发的链置换来促进ssDNA从一条探针迁移到另一条探针上。这种链迁移使得其中一条适体序列产生一个单链引发端，由此通过CHA将两个荧光猝灭的发夹组装成许多双链DNA而达到放大检测凝血酶的目的。（3）基于可生物降解的MnO2纳米片介导的HCR自组装来检测活细胞中低表达的miRNA。该体系中，MnO2纳米片可以吸附由染料标记的发夹探针并对其表现出良好的猝灭效果。此外，由于其具有可生物降解性，MnO2纳米片对靶细胞的毒性明显降低。当探针复合物进入细胞后，纳米片表面吸附的发夹可通过其他蛋白质或核酸的置换反应以及细胞内GSH对MnO2纳米片的降解作用而释放出来。随后细胞内的目标探针miRNA-21可触发两个发夹级联组装成长的dsDNA聚合物，使荧光FAM（供体）和TMR（受体）紧密接近以产生显著放大的FRET信号，用于高灵敏检测活细胞中的少量miRNA-21。18 第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测2.1前言近年来，包括错配修复（MMR）、核苷酸切除修复（NER）和碱基切除修复（BER）在内的几种用以消除对内源性DNA有害影响的特定DNA修复途径已经[27-29]受到了广泛关注。作为最重要的BER酶之一，UDG可以通过催化脱氧核糖主链和尿嘧啶碱基之间的N-糖基键的切割，产生无碱基（AP）位点来特异性地启动[30]尿嘧啶碱基切除修复过程。另外，尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）广泛分布于大多数生物体中，并在修复受损尿嘧啶碱基以保持细胞基因组信息完整性方面发[31-32]挥着重要作用。据报道，UDG的异常表达与各种疾病密切相关，其中包括淋[33][34][35-36]巴瘤，布卢姆综合征及人类免疫缺陷等。基于这一重要性，UDG已成为潜在的治疗靶向目标物和相关疾病诊断的生物标志物。因此，提供一个高选择性和高灵敏的检测UDG活性的方法对于掌握基本的生物分析过程和疾病预测至关重要。迄今为止，用于UDG活性测定的传统方法主要包括凝胶电泳法、放射性标记[37-40]法、质谱法和放射自显影技术等。但这些方法都存在或多或少的缺点，比如灵敏度有限、潜在的辐射、复杂的多步分离步骤以及耗时的程序等。因此，一系列在均相中反应的荧光法因其高的灵敏度、安全性和简单性等优势而得以发展[41-45][46]。例如，Lu和他的同事设计了一种基于DNAzyme激活的双标记（荧光/猝[47]灭剂对）DNA底物，用于UDG活性的荧光放大检测。Kool小组合成了一条含[48]芘的DNA序列，可以在不使用猝灭剂的情况下用于UDG活性的荧光监测。Yu[49]和Jiang等人分别通过使用金纳米颗粒和氧化石墨烯作为比色剂和猝灭剂开发了一种检测UDG活性的新策略。尽管上述方法能够避免传统方法对UDG活性灵敏检测的局限性，但昂贵的化学标记的要求、DNA序列的复杂设计以及纳米材料的繁琐合成过程仍然阻碍了其实际应用的发展。因此，设计一种方便、灵敏和经济的方法来监测UDG活性是相当必要的。已知作为一种生物感应元件，G-四链体这种核酸纳米结构在纳米技术和生物[50-53]学应用方面十分具有潜力。与标记方法相比，富G的寡核苷酸具有可调整的[54-56]构象和结构多态性，可以使其与各种卟啉分子结合以产生荧光信号增强。另据报道，滚换扩增（RCA）作为一种先进的等温核酸扩增技术已经被开发出来，[57-59]能够产生极长的并具有明确重复序列的ssDNA，可以广泛用于基于低背景和[60-61][62][63-64][65]超高灵敏度的核酸、小分子、蛋白质以及细胞的分析研究。受这些研究的启发，我们构建了一种基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传19 西南大学硕士学位论文感器用于UDG的灵敏检测，具有稳定性高、简单性好和重复性强等优势。在这项工作中，选择原卟啉IX（PPIX）作为信号输出工具，因为它是一种对G-四链体具[66]有结构选择性的阴离子卟啉。它可以在水溶液中以低荧光聚集成胶束，而在与[67]G-四链体结合后荧光强度得到增强。在此，首先设计好的三条DNA单链可以通过退火程序杂交形成一种三链DNA复合物，其中一条修饰有尿嘧啶碱基用于UDG的特异性识别。随着目标物UDG的加入，尿嘧啶碱基可被特异性识别并从脱氧核糖磷酸骨架上切除以产生AP位点，这导致其结构的不稳定而从杂交三链DNA复合物上脱离下来使其形成环状体。通过T4DNA连接酶连接后，形成的环状体可以在DNA聚合酶和三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）混合物的存在下诱发RCA反应的发生并产生重复的G-四链体单元序列。在这种情况下，大量结合的G-四链体/PPIX复合物可以产生增强的荧光响应信号以高灵敏地检测UDG。2.2实验部分2.2.1试剂及材料尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG），10×UDG反应缓冲液（200mMTris-HCl，100mmol/L氯化钠，10mmol/LEDTA，pH8.2），尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液（400mmol/LTris-HCl，100mmol/LDTT，100mmol/L氯化镁，5mmol/LATP，125mmol/LPEG4000，pH7.8），dNTPs，-Klenow片段（exo）聚合酶和10×反应缓冲液（500mmol/LTris-HCl，50mmol/L氯化镁，10mmol/LDTT，pH8.0）从NewEnglandBiolabsInc.（北京，中国）获得。BSA和hOGG1购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。KCl购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。PPIX由J&KScientificLtd.（中国北京）提供。本工作中使用的所有寡核苷酸均由InvitrogenBiotechnologyCo.，Ltd.（中国上海）合成并列于表2.1中。所有的荧光测量均在RF-5301-PC荧光分光光度计（日本东京Shimadzu）上进行，激发波长为416nm，荧光发射光谱记录在550-730nm之间。表2.1合成的寡核苷酸序列。Table2.1Sequencesoftheoligonucleotidesusedintheexperiments.NameSequencefrom5’to3’PO4’-CCACGACGTCGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCAACirculartemplate(P1)CCCGCCCTACCCGCCGTGAGAACAGAGAACAGPrimerprobe(P2)GAAGCGACGTCGTGGCTGTTCTCTGTTCTCACUDGrecognitionprobeCTGUUCTCTGUUCUCACGGCGGGUAACAAC(P3)20 第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测2.2.2滚环扩增辅助的UDG活性检测为了测定UDG的活性，我们首先将环形探针模板（P1）、引物探针（P2）和UDG识别探针（P3）的混合物在90℃退火10min，然后在70℃下缓慢冷却30min，随后冷却至室温30min。将制备的三链DNA底物在含有不同UDG浓度的1×UDG反应缓冲液（20mmol/LTris-HCl，10mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，pH8.2）中稀释至100nmol/L，使总体积达到20μL，然后将溶液在37℃下孵育60min使UDG驱动的尿嘧啶碱基切除修复充分进行。尿嘧啶去除反应完成后，加入2μL10×T4DNA连接酶缓冲液（400mmol/LTris-HCl，100mmol/LDTT，100mmol/LMgCl2，5mmol/LATP，125mmol/LPEG4000，pH7.8）和1μLT4DNA连接酶放入混合物中，在16℃过夜制备环形探针。然后，加入3μL10mmol/LdNTPs，1μLKlenow-Fragment（exo）聚合酶（5U/μL）和3μL10×反应缓冲液（500mmol/LTris-HCl，50mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，pH8.0）到反应溶液中37℃孵育2h，随后在75℃下加热10min以终止聚合酶反应。最后，将5μL2mol/LKCl和5μL0.5mmol/LPPIX加入到混合溶液中，37℃孵育60min。通过使用416nm的激发波长并在550-730nm的区域记录荧光发射光谱。2.2.3UDG抑制剂活性的检测为了测定UGI对UDG活性的抑制作用，首先将制备的100nmol/L三链DNA底物与不同量的UGI在37℃下反应60分钟，再在UDG反应缓冲液中加入UDG与其共同孵育。环形探针和RCA反应等后续制备程序与上述UDG测定的过程相同。2.3结果与讨论2.3.1UDG的检测原理基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG灵敏检测的原理如图2.1所示。一条设计的环状DNA模板（P1）最初与两条单链部分互补杂交，两条单链分别为引物探针（P2）和UDG识别探针（P3）。其中，P1用胸腺嘧啶核苷酸序列（20nt）修饰以确保其在没有P3的情况下能够弯曲形成环状体。此外，P3在适当的位置嵌入尿嘧啶碱基用于UDG的识别。在UDG的作用下，P3中的尿嘧啶碱基可以被特异性识别并从脱氧核糖磷酸骨架中切除以产生无碱基（AP）位点，这可以成功地导致探针P1和P3之间的分离。通过这种方式，由于与P2部分互补杂交，P1释放出的游离的3'末端可以弯曲接近其5'端以形成环状体。此时，在T4DNA连接酶存在的情况下，P1P2杂交环可以通过环化连接以触发随后进行的RCA21 西南大学硕士学位论文反应，并且在加入KF聚合酶和dNTPs混合物时产生大量的G-四链体的重复单元。+因此，在水溶液中原卟啉IX（PPIX）的低荧光强度可以在K协助下与大量的G-四链体结合使荧光显著增强。在此，我们所提出的荧光扩增方法在生物化学应用中确实具有高选择、高灵敏检测UDG的优点。图2.1基于滚环扩增辅助的免标记荧光检测UDG的原理图。Fig.2.1Schematicillustrationofthethelabel-freefluorescencebiosensorassistedbyrollingcircleamplificationstrategyforsensitivedetectionofuracilDNAglycosylase.2.3.2UDG检测的可行性分析图2.2不同反应条件下实验样品的荧光分析强度值。Fig.2.2Fluorescenceanalysisinresponsetodifferentreactionsolutions:(a)PPIX;(b)P1P2P3+T4DNAligase+KFpolymerase+dNTPs+PPIX;(c)P1P2P3+UDG+T4DNAligase+KFpolymerase+dNTPs+PPIX.TheconcentrationsofP1P2P3andUDGwere100nmol/Land1U/mL,respectively.Thefluorescenceintensitywasexcitedat416nm.22 第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测我们首先用UDG识别反应的荧光强度响应值来验证提出的方法的可行性。如图2.2所示，在仅有游离的PPIX存在时，溶液的荧光信号值最小（曲线a），这表明PPIX在水溶液中的背景信号很低。当杂交的三链DNA底物P1P2P3在水溶液中与T4DNA连接酶，KF聚合酶和dNTPs等共存时（曲线b），此时溶液的荧光强度值只有略微的增强。这也许是因为该混合溶液在没有UDG存在的情况下可能会引起RCA，导致一些背景信号的产生。然而，一旦在该混合溶液中加入目标物UDG后（曲线c），溶液的荧光信号明显增加，这表明UDG可以激发尿嘧啶切除反应以产生AP位点并进一步使P3从DNA底物P1P2P3上脱离下来，这极大地促进了环形体的形成以触发随后的RCA反应。以上实验结果揭示了我们所提出的无标记荧光扩增策略用于UDG灵敏检测的巨大潜力。2.3.3UDG检测的性能研究图2.3不同浓度UDG的实验样品的荧光响应值。Fig.2.3(A)ThefluorescenceresponseoftheproposedstrategyforamplifieddetectionofUDGactivitycorrespondingtodifferentconcentrations.Fromatoj:0U/mL,0.0005U/mL,0.001U/mL,0.005U/mL,0.01U/mL,0.02U/mL,0.035U/mL,0.05U/mL,0.5U/mL,1U/mL.(B)ThecorrespondingrelationshipofthefluorescenceintensityandtheconcentrationsofUDGrangingfrom0.0005U/mLto1U/mL.Inset:DynamicresponseforUDGactivitydetectionintherangefrom0.0005U/mLto0.05U/mL.Errorbars:SD,n=3.在相同实验条件下，我们根据不同溶液的荧光响应值对所提出的用于不同浓度UDG检测的方法作出了评估。从图2.3我们可以看到，随着UDG浓度从0.0005U/mL升高到1U/mL，溶液的荧光信号逐渐增加，这是由具有催化活性的G-四链体/PPIX复合物的积累引起的。这表明通过尿嘧啶切除反应，较高浓度的UDG将产生更多激活的G-四链体纳米结构。值得注意的是，图2.3B显示了不同浓度UDG的相关校准曲线，根据3σ规则我们得到在0.0005⁓0.05U/mL范围内的线性相关性，并得出其检测限低至0.00014U/mL。因此，这些结果表明我们构建的这种基于信号放大的传感器能够用于UDG的定量的灵敏检测。23 西南大学硕士学位论文2.3.4UDG检测的选择性研究为了进一步探索该传感系统检测的选择性，我们针对UDG靶标挑选了其他两种非特异性生物分子（包括BSA和hOGG1）来测量反应溶液的荧光响应值。如图2.4所示，我们可以从图中看到，只有UDG能够引起溶液荧光强度的显著增强，而BSA和hOGG1在相同实验条件下的荧光信号变化值微乎其微。即是说，这种高选择性表明该传感器对于UDG的检测具有很高的特异性。图2.4目标物UDG检测的选择性研究。Fig.2.4SpecificityevaluationoftheassayforUDGactivitydetectionagainstothernonspecificproteins(BSAandhOGG1).ConcentrationofUDGwas1U/mLandtheinterferenceproteinswere10U/mL.Errorbars:SD,n=3.2.3.5UDG抑制剂（UGI）的性能研究图2.5UGI对UDG抑制作用的性能研究。Fig.2.5InhibitedeffectofdifferentconcentrationsofUGI(0,0.001,0.01,0.05,0.5,1,2U/mL)onrelativeactivityofUDG.Errorbars:SD,n=3.另据报道，UGI可以与UDG以1:1的化学计量比进行结合，从而形成生[68]理上稳定的复合物以抑制UDG的活性。为了明确该方法是否具有检测UDG抑制作用的潜力，我们选择UGI作为与UDG反应的典型的抑制剂。如图2.524 第二章基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测所示，当UGI的浓度从0增加到1U/mL时，导致了相对荧光强度响应值的明显下降。这说明随着UGI浓度的增加，UDG与UGI结合的数量也逐渐增加，这最终导致了尿嘧啶碱基特异性识别和切割反应的减少，因此荧光强度也逐渐降低。该结果表明，我们所提出的方法可以很好地应用于对UDG抑制作用的评估。此外，我们将该方法与已报道的相关方法进行了比较，如下表所示：表2.2该实验与已报道的相关方法作比较。方法检测限参考文献免标记荧光法0.033U/mLAnal.Biochem.,2007,366,237-243.免标记荧光法0.002U/mLChem.Commun.,2012,48,8820-8822.免标记荧光法0.050U/mLChem.Eur.J.,2011,17,1635-1641.免标记荧光法0.020U/mLChem.Commun.,2013,49,5630-5632.免标记荧光法0.00044U/mLBiosens.Bioelectron.,2015,68,654-659.免标记荧光法0.00014U/mL本实验2.4结论综上，我们通过引入滚环扩增策略并使用PPIX作为信号输出探针，成功构建了一种基于G-四链体的无标记荧光平台，以简便、灵敏地检测UDG。通过与先前报道的基于荧光测定UDG的方法相比，无标记DNA探针的设计不需要化学标记或修饰，避免了对UDG活性的不利影响，并展现出了良好的分析性能，对于UDG活性的筛选也具有较高的特异性和良好的重复性。此外，该方法也可用于评估UGI对UDG活性的抑制作用。这些优势表明，该策略在临床诊断和生物医学研究中具有很大的应用潜力。25 西南大学硕士学位论文26 第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测3.1前言核酸适配体是一类功能特殊的DNA或RNA片段，其来源于核酸分子文库中的寡核苷酸序列，通常是通过体外筛选技术--指数富集的配体系统进化技术[4-6](SELEX)而得到。这些适配体可以折叠成特定的二级或三级结构，并且对于有机、无机化合物，蛋白质分子，甚至整个细胞等目标物都具有强的亲和性和特异[69-71]性。相比于传统抗体及其他仿生受体，适配体作为最有使用前景的替代识别元件，由于其具有体积小、成本低、结合亲和力高、修饰简单、热稳定性好等优[72-73]点而受到越来越多的关注。因此，适配体已被广泛应用于构建不同类型的生[74-75][76][77]物传感器来进行信号转导、药物递送和诊断治疗。例如凝血酶、可卡因、[78]生长因子等生物分子，这些基于适配体构建的传感器通常都是依靠适体序列识别目标物的不同位点引起其结构变化的。凝血酶是血液中的一种多功能蛋白酶，它在血液凝固、血栓形成和血管生成[79]等多种关键性生理及病理过程中都起着重要作用，在许多与凝血有关的反应中，[80]凝血酶可以将可溶性纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白而形成纤维蛋白凝胶。因此，高灵敏、高选择性地检测凝血酶具有十分重要的意义。迄今为止，有许多[81-83]检测方法已成功构建用以鉴定识别探针和凝血酶之间的相互作用。但由于一个靶标分子只能使一个猝灭的信号探针恢复荧光，因此大多数的相互识别作用还是极大地限制了其检测灵敏度。而近几年来，以适配体为基础的各类信号放大策[84-85][86-87][88-89]略，如滚环放大，纳米材料辅助放大和酶辅助循环放大等都已成功应用于凝血酶的检测。尽管这些放大的适体传感器确实提高了信号输出，但各种复杂的热循环步骤以及材料合成过程最终导致了生物测定程序的繁琐，这也明显地损害了分析方法中蛋白质检测的简单性。为解决这些问题，有报道指出在利用非酶核酸循环进行信号传导和放大方面[90-92]有了新的突破和进展，尤其是催化发夹组装（CHA），它作为一种等温、均相且无酶的信号生成策略来检测生物分子，已经成功实现了显著的信号放大，且[93]背景信号小到可忽略不计。在这种由toehold引发的链置换过程中，两条设计合理的发夹最初不能彼此杂交，并且只有当启动子DNA加入后才可以使得toehold部分和链迁移部分紧密靠近以形成双链体并催化CHA反应。由于CHA的方便性和灵敏性，它被广泛用作于构建不同生物传感器来检测核酸和小分子靶标的一种[94-97]新型信号放大手段。然而，由于缺乏一种通用性策略来构建蛋白质响应的27 西南大学硕士学位论文CHA，因此用CHA反应来检测蛋白质仍然是一个挑战。在这一点上，基于一种新的适配体邻位识别引发的链迁移策略，我们设计了一种简单而灵敏的通过CHA介导的荧光信号放大法来检测凝血酶。邻位识别涉及[98-99]两个探针在不同的结合位点同时结合相同的靶分子，这种识别可以显著增加[100][101]两个探针的局部浓度，从而有利于两条DNA链的连接或组装以放大检测不[102]同的靶分子。在我们的方法中，两条α-凝血酶的特征适体Apt15（15nt）和Apt29（29nt）可以分别与凝血酶两侧的纤维蛋白原结合位点和肝素结合位点结合来增加两条适体的局部浓度，促进ssDNA从Apt29迁移至Apt15，产生一个单链尾端以引发荧光猝灭的发夹探针通过CHA生成许多DNA双链体。这种由CHA诱导的荧光猝灭的发夹的打开可以产生大量的荧光恢复用以高灵敏地检测凝血酶。3.2实验部分3.2.1试剂和材料凝血酶，溶菌酶，小鼠免疫球蛋白G（IgG），正常人血清和牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）。磷酸盐缓冲液，氯化钠（NaCl），氯化镁（MgCl2），氯化钾（KCl）均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。Tris-HCl和下列所有合成的寡核苷酸均来自上海生工生物工程技术服务有限公司（中国上海）。序列如表3.1所示：表3.1实验中用到的寡核苷酸序列。Table3.1Thesequencesoftheoligonucleotidesusedintheexperiments.NameSequence5’-AGTCTAGGATTCGGCGAGGGTTAATTTTTAGTCCGTGGTAGGGCApt29AGGTTGGGGTGACT-3’Apt155’-CAACCAGTCTAGGATTCGGCGAGAGACTGGTTGGTGTGGTTGG-3’A15’-CTGGTTGGTGTGGTTGGCAACCAGTCTAGGATTCGGCGAG-3’5’-CAACCAGTCTAGGATTCGGCGAGCTAGACTGGTTGGTGTGGTA2TGG-3’Protectionstrand5’-TTAACCCTCGCCGAATCCTAGACTGGTTG-3’(PS)5’-TTAACCCT(Dabcyl)CGCCGAATCCTAGACTCCATGTGTAGAAGTCH1TAGGATTCGGCG(FAM)-3’5’-CCTAGACTTCTACACATGGAGTCTAGGATTCGGCGCCATGTGTAGH2A-3’3.2.2凝血酶识别探针的制备将Apt29（5μmol/L）和保护探针PS（5μmol/L）的混合物加热至90℃5min28 第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测后冷却至室温1h，使其形成Apt29/PS双链体。然后将Apt15、H1和H2也分别用相同的热退火步骤处理。在20mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4,5mmol/LKCl，10mmol/LMgCl2，100mmol/LNaCl）中将α-凝血酶稀释至最终浓度为5μmol/L。3.2.3荧光放大法检测凝血酶简言之，将不同浓度的凝血酶与探针Apt15（50nmol/L）、Apt29/PS（50nmol/L）、H1和H2（分别为200nmol/L）的混合物在20mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4，5mmol/LKCl，10mmol/LMgCl2，100mmol/LNaCl）中于37℃孵育100min。用不含凝血酶的相同反应混合液作为空白对照。之后在具有150W氙灯激发源和488nm激发波长的RF-5301PC荧光分光光度计（Shimadzu，Tokyo，Japan）上记录混合物的荧光发射强度。3.3结果与讨论3.3.1荧光放大法检测凝血酶的原理图3.1适配体临位识别引发链迁移和CHA诱导的无酶放大检测凝血酶的原理图。Fig.3.1TheprincipleoftheCHA-amplifiedfluorescentdetectionofthrombinbasedonaptamerproximityrecognition-dependentstrandtranslocation.基于适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的荧光检测原理如图3.1所示。此生物传感体系含有两条用于凝血酶识别的适体序列探针Apt29/PS和发夹Apt15，以及用于CHA组装的两条发夹DNA（H1和H2）。其中，H1用荧光基团（FAM）和猝灭基团（Dabcyl）标记用以产生信号。Apt29由三个区段组成：与凝血酶结合的适体序列（29nt，紫色部分），polyT间隔区段（黑色部分）和CHA反应的触发序列（绿色部分，用于H1和H2之间的组装）。29 西南大学硕士学位论文而Apt15以发夹结构设计，其茎部含有另一段与凝血酶结合的适体序列（15nt，紫色区段）及与保护序列（PS）区域相结合的互补序列（红色及蓝色区段）。刚开始时，红色互补序列被锁定在Apt15的茎部以抑制链迁移，并且Apt29中CHA的触发序列与PS杂交以抑制H1和H2的组装。因此，在没有目标物凝血酶存在的情况下，这四条探针可以共存，H1和H2的组装被抑制。而由于在H1的发夹结构中Dabcyl对FAM有荧光猝灭作用，所以仅能检测到很小的荧光信号。然而，随着凝血酶的加入，两条适体序列（Apt15和Apt29/PS中的紫色片段）可以同时结合到同一个凝血酶靶标的不同位点上以形成稳定的DNA/蛋白质复合物。这种结合使Apt15发夹结构打开以释放出互补链并使Apt15和Apt29/PS双链体靠得很近，这极大地增加了Apt15和Apt29/PS的局部浓度，并显著地加速了Apt15中的互补序列与PS中的toehold序列之间结合的动力学速率，导致PS链从Apt29/PS转移到Apt15以形成Apt15/PS双链结构。PS从Apt29/PS中成功迁移，导致Apt29中的触发序列（绿色部分）暴露出来由此结合并打开发夹H1使荧光信号恢复。而其又可进一步打开H2的发夹结构，催化H1和H2之间的CHA。因此，H1/H2双链体的催化组装形成使得更多H1展开，从而可以获得连续不断的荧光信号恢复实现对凝血酶的灵敏检测。3.3.2Apt15的结构优化图3.2Apt15结构对实验结果的影响。Fig.3.2EffectofdifferentstructuresofApt15onthefluorescenceintensityofourmethodforthepresence(red)andabsence(black)ofthrombin.TheconcentrationsofH1,H2,Apt29/PSandthrombinwere200nmol/L,200nmol/L,50nmol/Land10nmol/L,respectively.A1,A2andApt15were50nmol/Leach.Errorbars:SD,n=3.我们在设计的凝血酶检测方法中发现，Apt15的结构对信号输出及背景均存在着显著影响，从而阻碍了该方法的分析性能。基于此，我们设计了三种不同构型的Apt15探针，通过改变适体序列（具有5-nt与互补序列杂交的紫色区段）的位30 第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测置和茎部长度（7-12bp）来探究其结构对实验结果的影响。如图3.2所示，当探针（具有不同结构的Apt15）分别与10nM凝血酶孵育后，A1（茎部7bp）显示出最高的荧光信号强度，但其背景信号（没有凝血酶）也明显增加，导致信噪比（S/N）显著降低。这可能是由于A1的结构不稳定，它可以直接与Apt29/PS反应触发A1中互补序列（红色片段）的暴露，导致H1和H2之间的组装。而尽管茎部具有12bp的A2显示出了明显降低的背景信号，但由于其发夹结构的稳定性增加，使得凝血酶的结合难度变大，信号也随之降低，因此也产生了较低的信噪比。但是，茎部具有10-bp的Apt15的结构相对于A1表现出了较低的背景信号，相对于A2则具有明显增加的输出信号，获得最佳的信噪比。基于这些比较，Apt15的结构设计被用于随后的实验中。3.3.3检测凝血酶的可行性分析图3.3不同实验样品的荧光强度值。Fig.3.3Fluorescentresponsesofdifferentreactionmixturesofthesensingsystem:(a)H1;(b)H1+H2;(c)H1+H2+Apt29/PS;(d)H1+H2+Apt29/PS+Apt15;(e)H1+Apt29/PS+Apt15+thrombin;(f)H1+H2+Apt29/PS+Apt15+thrombin.TheconcentrationsofH1,H2,Apt29/PS,Apt15andthrombinwere200nmol/L,200nmol/L,50nmol/L,50nmol/Land10nmol/L,respectively.Thesolutionswereexcitedat488nm.为验证凝血酶荧光放大检测方法的可行性，我们记录了不同实验组的荧光信号强度。如图3.3所示，H1的溶液显示出最小的荧光强度值（曲线a），表明Dabcyl在发夹结构中能有效地猝灭FAM的荧光。而H1和H2的混合物引起了荧光发射信号的轻微增加（曲线b），可能是由于两个发夹之间发生了非特异性结合使部分H1打开了。当H1和H2的混合物中加入了Apt29/PS及Apt29/PS与Apt15时，荧光强度几乎不发生改变，表明PS链有效阻断了触发序列，并且通过发夹Apt15的结构设计抑制了链迁移的发生（曲线c,dvs.b）。然而，当凝血酶与Apt29/PS，Apt15和H1的混合物孵育120分钟后，该溶液的荧光信号值明显增强（曲线e），31 西南大学硕士学位论文这意味着PS链从Apt29/PS到Apt15的迁移过程是可行的，使其能够打开发夹H1。更重要的是，当向上述混合物中加入H2后，荧光强度显著增加（曲线fvs.e），表明少量凝血酶的存在就足以引起显著的荧光强度的恢复。因此，这些结果表明我们提出的用于灵敏检测凝血酶的方法具有巨大潜力。3.3.4反应时间的优化为了探究孵育时间对荧光强度的影响，我们记录了当目标物凝血酶（10nmol/L）存在时反应溶液的荧光强度值随时间的变化情况。根据图3.4可知，在20到100min之间，溶液的荧光强度随着孵育时间的延长逐渐增加，在100min后趋于平稳。因此，基于这种随时间变化的荧光强度值的变化，我们选择100min作为最佳孵育时间。图3.4凝血酶检测的时间优化图。Fig.3.4Optimizationofincubationtimeforthrombindetection.Thefluorescenceresponseswererecordedwiththeexcitationat488nm.Errorbars:SD,n=3.3.3.5该方法分析性能的研究图3.5该分析方法对不同浓度目标物的荧光响应值。Fig.3.5(A)Fluorescenceresponsesofthedevelopedmethodforamplifieddetectionofvariousconcentrationsofthrombin.Fromatoi:0pmol/L,20pmol/L,50pmol/L,100pmol/L,200pmol/L,500pmol/L,1nmol/L,10nmol/L,50nmol/L.(B)Thecorrespondingrelationshipofthefluorescenceintensityandtheconcentrationofthrombinrangingfrom20pmol/Lto50nmol/L.Inset:Dynamicresponseforthrombindetectionintherangefrom20pmol/Lto1nmol/L.Errorbars:SD,n=3.32 第三章适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测在最优的实验条件下，我们对该方法的分析性能进行了评估。如图3.5所示，通过改变凝血酶的浓度（0pmol/L到50nmol/L）来检测该方法的灵敏度，可以看出荧光信号随着凝血酶浓度的增加而逐渐增加，在20pmol/L⁓1nmol/L的范围内呈现良好的线性关系，由3σ原则得出该检测方法对凝血酶的检测限为8.3pmol/L。3.3.6该方法选择性的研究此外，我们还评估了该荧光放大法用于凝血酶检测的选择性研究。在这个传感器中，我们使用了三种蛋白，包括溶菌酶，IgG和BSA来研究这些非特异性蛋白质是否会干扰目标凝血酶的检测。如图3.6所示，在100nmol/L的浓度下，与空白试验（没有目标物凝血酶）相比，这三种非特异性蛋白在荧光信号强度方面都没有明显的变化。而不同的是，在相同实验条件下，即使加入比非特异性蛋白浓度低10倍的目标物凝血酶（10nmol/L），也能观察到明显的荧光信号。这些实验现象说明我们所构建的用于凝血酶测定的适体传感器具有良好的选择性，这进一步证明了适体探针与靶标蛋白之间的高亲和力。图3.6该分析方法的选择性研究。Fig.3.6Specificityofthemethodforthrombindetectionagainstotherinterferenceproteins.Concentrationofthrombinwas10nmol/Landtheinterferenceproteinswere100nmol/Leach.Errorbars:SD,n=3.3.3.6实际样品中凝血酶的检测表3.2在人体血清样品中凝血酶的分析。Table3.2.Recoveryofthrombinin10%humanserumsamples(n=6).SamplesAddedFoundRecovery(±RSD,%)1500pmol/L482.6pmol/L96.5±3.321nmol/L1.1nmol/L110.0±1.735nmol/L4.7nmol/L94.0±2.5为了进一步验证我们提出的用于实际样品中凝血酶检测的策略的可行性，我33 西南大学硕士学位论文们基于生物学标准加入的方法，分别将三种不同浓度的凝血酶（500pmol/L，1nmol/L和5nmol/L）加入到用缓冲液稀释了10倍的健康人血清样品中用以分析。如表3.2所示，该方法测定凝血酶的加标回收率在94.0％至110.0％的范围内，这证明了我们所提出的用于凝血酶检测的方法及其在真实生物样品中的应用是可接受的。3.4结论综上所述，我们提出了一种无酶放大荧光法用于检测人体血清样品中的凝血酶。这种方法依赖于适配体邻位识别产生链迁移触发CHA后通过信号放大来进行检测，通过使用该荧光增强法可以实现低至8.3pmol/L的检测限。构建的此传感平台具有良好的选择性，其可以从其他非特异性蛋白质中区分出目标凝血酶。随着核酸诱导的CHA到蛋白质间接触发CHA用于信号放大的成功转化，这种适体[103]邻位识别产生链迁移的策略可以被进一步拓展，当与适当的DNA-抗体或适体[104]识别对偶联时便可高灵敏地检测不同的蛋白质及生物标志物用于生物化学的研究。34 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测4.1前言MicroRNAs(miRNAs)是一种内生的、由大约18-25个碱基构成的单链RNA分[105]子，其通常在动物、植物体内及一些病毒中进行编码。MiRNAs可通过抑制蛋[106]白质翻译或促进靶向信使RNA的降解来进行基因表达的调控，因此，它在细[107-111]胞增殖、分化、凋亡及基因表达等许多生物学过程中起着非常重要作用。越来越多的研究证据表明，miRNAs的异常表达与不同癌症及其他多种病理状态的发[112-113]生、发展都密切相关，例如，miRNA-18b在乳腺癌患者的肿瘤样本中显示出[114-115]是高表达，而miRNA-143在乳腺癌和宫颈癌中却显示出是低表达。由于其[116]在基因表达和变化中的调节作用，miRNAs已被广泛用作疾病诊断的有效生物[117-120]标志物和疾病治疗的靶标。因此，miRNAs的鉴定及检测方法的发展具有重大的临床意义。[121][122]传统的miRNAs检测方法主要基于逆转录聚合酶链式反应、杂交印迹法[123]及微阵列技术三种。尽管它们都可以实现对多种miRNAs的定量检测，但是早期开发的这些检测方法仍然存在着成本高、时间长及灵敏度有限等缺陷，这引发了许多用于miRNAs检测的新型生物传感器技术的再次发展。这些替代方法通过[124][125]将各种信号放大法耦合在一起，比如将纳米材料放大法和酶放大法与光学[126][127-128][129]、电化学或电化学发光等手段相结合，实现了对miRNAs靶标的高灵敏和高选择性检测。毫无疑问，在过去的几十年中，miRNAs检测方法已经有了显著的进步，但这些方法大多只能检测从癌细胞中提取出来的miRNAs，活体细胞中[130]miRNAs的检测却很少报道，而miRNAs的体内检测才能更好地阐明其生物起源及生物学功能。[131-132][133-134]荧光原位杂交（FISH）和基于锁式核苷酸的荧光原位杂交测定法已经成为检测细胞内miRNAs分子的主要成像技术。但基于荧光原位杂交的成像方法需要固定细胞，并不适用于活细胞成像。此外，在区分miRNAs家族类似物[135]的灵敏度和选择性方面也受到了限制。最近，由于纳米材料所具有的独特的光[136]学、电学和热学特性，在检测活细胞中细胞内miRNAs的应用受到了广泛关注，尤其是碳（例如石墨烯、碳点和碳纳米管）和金（例如金纳米颗粒和金纳米棒）[137-138]材料可以针对不同的荧光染料展示出显著的猝灭作用，并且这些材料可以通[139]过固载核酸探针，使其成为应用于活细胞的理想材料。例如，Ju小组报道的用35 西南大学硕士学位论文[140]氮化碳纳米片吸附核酸探针来检测HepG2活细胞中的miRNA-18a，而Huh和他的同事们使用含有miRNA-34a信标的基于透明质酸的纳米容器作为探针来检测MCF-7癌细胞中的miRNA-34a。虽然这些基于纳米材料的方法的确推进了对细胞内高表达miRNAs的监测，但是由于某些低表达miRNAs在细胞内的量非常低，[141]因此对这些低含量的miRNAs的检测仍然是一个巨大的挑战。为了解决这个问[60][135]题，Li和Chu课题组分别将滚环扩增放大（RCA）与FISH结合，实现了对细胞内miRNAs的灵敏检测。然而，酶（phi29DNA聚合酶）在RCA反应中的参与及细胞固定的要求阻碍了这种方法在活细胞中监测miRNAs的应用。最近，尽管在活细胞中建立了级联杂交反应这种信号放大方法来进行低含量miRNAs的成[142]像，但是转染剂脂质体的使用又受到了转染效率低、有细胞毒性、包载量有限[143]以及操作步骤复杂等问题的限制。针对目前检测细胞内微量miRNAs所面临的挑战，我们提出了一种可生物降解的MnO2纳米片介导的杂交链式反应（HCR），用于实现活细胞中低表达的miRNAs的灵敏检测。MnO2纳米片是一种类似于石墨烯结构的纳米材料，它对有[144]机染料修饰的单链DNA（ssDNAs）表现出有效的荧光猝灭能力。此外，MnO2纳米片具有多样的生物功能性，可以被谷胱甘肽（GSH）等细胞物质降解，从而显著降低其对细胞的毒性，使其成为活细胞中很有前途的递送和传感中间体[144-146][18]。2004年，Pierce和他的同事们首次报道了HCR，指出两个带有粘性末端的能互补配对的发夹DNA可以在诱导ssDNA的存在下，通过自组装引发发夹DNA之间的杂交从而形成长双链DNA聚合物。这种发夹组装过程是在等温下进行，它可以提供完全无酶的信号放大，用于检测极低含量的不同的核酸目标物[147-149]。在我们设计的方法中，两个分别用荧光共振能量转移（FRET）有机染料标记的发夹DNA可以通过MnO2纳米片递送到活细胞中，一旦进入细胞，由于其[150]他蛋白或核酸的置换反应以及细胞内GSH对MnO2纳米片的降解作用，使得发夹DNA被释放出来。因此，游离于细胞中的低表达的miRNA便可触发这两个发夹DNA自组装形成长双链DNA聚合物，使得标记于DNA链上的荧光共振分子对紧密靠近，并产生显著增强的FRET信号用于活细胞中微量miRNA的检测。本文构建的细胞内传感的方法提供了三个比其他方法明显的优势。首先，我们使用的可生物降解的MnO2纳米片减少了对细胞的毒性。其次，基于FRET信号的方法可以最大限度地减少由于荧光探针的堆积或降解而在一般的猝灭剂/荧光剂检测系[151]统中出现的假阳性信号。第三，在细胞中，HCR信号扩增法使其能够实现无酶检测细胞内微量的miRNA。36 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测4.2实验部分4.2.1材料及试剂四水氯化锰（MnCl2·4H2O），四甲基氢氧化铵（TMA·OH），还原型L-谷胱甘肽（GSH），二甲基亚砜（DMSO），氯化钙（CaCl2），氯化镁（MgCl2），过氧化氢（H2O2,3wt％）和Tris-HCl购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和细胞培养产品购自鼎国生物科技有限公司（重庆，中国）。人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人宫颈癌细胞系（HeLa）从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库获得（中国上海）。脂质体及在表4.1中列出的所有合成的寡核苷酸序列从英骏生物技术有限公司订购（上海，中国）。表4.1合成的寡核苷酸序列。Table4.1.Thesequencesoftheoligonucleotidesusedintheexperiments.NameSequence(from5’to3’)(FAM)-CAGACTGATGTTGACGTGAAACTCAACATCAGTCTH1-FAMGATAAGCTAGTTTCACGTCAACATCAGTCTGT-(TAMRA)AGCTTATCAGACH2-TMRTGATGTTGA(FAM)-CAGACTGATGTTGACGTGAAACTCAACATCH3AGTCT-(Dabcyl)GATAAGCTAmiRNA-21UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAlet-7a(controlUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUmiRNA)mUmCmAmAmCmAmUmCmAmGmUmCmUmGmAmUmAmAmGmCmiRNA-21inhibitormUmA(m:2’-O-methyl)4.2.2实验仪器所有的荧光光谱都是在以150W氙灯为激发光源的RF-5301PC型荧光分光光度计（日本，岛津）上进行记录。纳米片形态是通过原子力显微镜（AFM）进行表征，其成像仪器型号为JPKNanoWizard3Bioscience，所使用的扫描探针为Bulgaria的Tap300Al-G硅探针，共振频率为320kHz，弹力常数为42N/m。凝胶电泳实验是在DYY-8C电泳设备（北京沃得生命科学仪器有限公司）上完成。共聚焦荧光成像研究在OlympusFV1000共聚焦激光扫描荧光显微镜上进行。MTT实验在RT6000酶标仪上进行测定。37 西南大学硕士学位论文4.2.3二氧化锰纳米片的合成与表征[152]根据已有的制备二氧化锰纳米片的报道，我们稍作修改。简言之，将TMA·OH（0.6mol/L）和H2O2（3wt%）的混合物（20mL）与MnCl2·4H2O（10mL，0.3mol/L）溶液在15s之内反应。待形成深棕色悬浮液后，将所得混合液在室温下搅拌过夜，以2000转离心10分钟，用去离子水和甲醇洗涤，然后在60℃下干燥。随后，将10mg干燥的粗产物分散在20mL去离子水中再超声10h。最后，将分散体以2000转离心30min，并将上清液用于实验。用电感耦合等离子体发射光谱仪测定MnO2纳米片的浓度。4.2.4荧光猝灭和恢复实验首先将两个发夹探针H1-FAM和H2-TMR分别退火加热到90℃5min，然后再冷却到室温1h待用。接下来，将不同浓度的MnO2纳米片（0⁓20μg/mL）加入到含有H1-FAM（25nmol/L）和H2-TMR（25nmol/L）混合液的Tris-HCl缓冲液（100mmol/L,25mmol/LMgCl2,5mmol/LCaCl2,pH7.5）中，并维持最终体积为200μL。待反应20min后，记录不同溶液的荧光强度。对于荧光恢复实验，首先在Tris-HCl缓冲液中，将GSH（最终浓度为1mmol/L）加入到含有H1-FAM/H2-TMR/MnO2纳米片（MnO2:20μg/mL，H1-FAM和H2-TMR的浓度均为25nmol/L）的混合溶液中以还原MnO25min，然后记录荧光强度值。4.2.5HCR体外扩增的FRET检测首先将MnO2纳米片（20μg/mL）加入到含有H1-FAM（25nmol/L）和H2-TMR（25nmol/L）混合液的Tris-HCl缓冲液中以制备H1-FAM/H2-TMR/MnO2探针溶液。之后，将GSH（1mmol/L）加入到溶液中反应5min。接着分别加入目标miRNA-21（2.5nmol/L）和对照miRNAlet-7a（2.5nmol/L），将溶液在37℃下孵育4h使miRNA能充分诱导H1-FAM和H2-TMR发生HCR。最后，将反应混合物直接转移到200μL石英比色皿中进行荧光测量。荧光光谱测定使用488nm为激发波长，收集500-640nm范围内的荧光发射光谱。4.2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳用来分析体外HCR。在这个实验中，H1（2μmol/L）和H2（2μmol/L）的混合物分别与目标miRNA-21及对照miRNAlet-7a在37°C下孵育4h。然后将所有样品加到16%聚丙烯酰胺凝胶基质中，加入载样缓冲，并在电压为100V的1倍TBE缓冲液中运行80min。最后用溴化乙锭（EB）染色30min，使用佳能数码相机（EOS550D）在365nm紫外灯照射下拍摄凝胶。38 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测4.2.7细胞培养和共聚焦荧光成像HeLa细胞和MCF-7细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供（中国上海）。在杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中加入10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素，将细胞在5%CO2的湿润条件下于37℃在此培养基中培养24h。随后用H1-FAM/H2-TMR/MnO2探针溶液在37℃的培养基中孵育活细胞4h。之后用PBS（0.1mol/L，pH7.4）洗涤细胞三次，并加入含有10%胎牛血清的新鲜培养基。最后在OlympusFV1000共聚焦激光扫描荧光显微镜系统（20倍物镜）下观察细胞。在绿色通道中记录FAM荧光图像，在红色通道中记录FRET荧光图像。4.2.8HeLa细胞对miRNA-21抑制剂的孵育R○根据脂质体试剂的使用说明，我们用Lipofectamine3000将最终浓度为500nmol/L的miRNA-21抑制剂转染到HeLa细胞中6h，然后将HeLa细胞与含有H1-FAM/H2-TMR/MnO2探针溶液的新鲜培养基再孵育4h，最后用PBS洗涤细胞并在共聚焦激光扫描荧光显微镜下记录荧光发射图像。4.2.9细胞毒性测定5将HeLa细胞（1×10个细胞/孔）接种在含有10%胎牛血清的200μL细胞培养基的96孔微量滴定板中，并在37℃及5%CO2/95%空气中培养24h。在用新鲜培养基替换后，将不同浓度的MnO2纳米片（0⁓60μg/mL）加入到细胞培养基中孵育24h。然后将MTT溶液（0.5mg/mL）与每个孔中的细胞再孵育4h，随后除去剩余的MTT培养基，并向各孔中加入DMSO（150μL）再孵育30min。MnO2纳米片的细胞毒性通过使用RT6000酶标仪在488nm下测量吸光度来确定。4.3结果与讨论4.3.1细胞内放大检测miRNA-21的原理图我们构建的HCR信号放大法进行细胞内miRNA的检测原理如图4.1所示。首先，两种DNA发夹探针H1-FAM和H2-TMR经过精心设计以避免在没有目标miRNA-21时发生发夹探针之间的自组装。在设计中，FAM荧光基团（供体）标记在H1的5'端，而TMR荧光基团（受体）则标记在H2的茎部，使H1-FAM和H2-TMR在自组装时两种荧光染料分子的距离在10nm范围以内以便发生FRET现象。H1-FAM和H2-TMR都能通过范德华力轻易地吸附在MnO2纳米片的表面[153]。由于MnO2纳米片具有良好的荧光猝灭能力和生物相容性，因此它可以有效39 西南大学硕士学位论文地猝灭染料分子FAM和TMR的荧光，并且可以通过细胞胞吞作用将这两种DNA发夹探针递送到细胞内以保护它们免受酶的降解。在进入细胞后，MnO2纳米片可2+以立即被分散在细胞质中的生物分子GSH还原成Mn，然后通过其他蛋白质或核酸的置换反应的共同作用将吸附的发夹释放到细胞中。当目标miRNA-21存在于细胞中时，它可以与H1-FAM的粘性末端特异性结合并打开发夹结构使其露出H1的单链区域，裸露的单链区域又可以与H2-TMR杂交并打开H2，展开的H2-TMR随后又再次与H1-FAM杂交以启动H1-FAM和H2-TMR之间的HCR，促使dsDNA聚合物的自组装形成。在此情况下，DNA探针上的荧光染料分子FAM和TMR相互靠近，使得供体荧光分子（FAM）的发射光谱与受体荧光分子（TMA）的吸收光谱重叠，从而产生显著放大的FRET信号，实现细胞内miRNA-21的高灵敏检测。图4.1MnO2纳米片介导的由目标miRNA-21触发的细胞内HCR信号放大策略原理图。Fig.4.1SchematicIllustrationofMnO2nanosheet-mediatedincellHCRsignalamplificationforsensitivedetectionofmiRNA-21inlivingcells.4.3.2MnO2纳米片的表征图4.2(A)AFM表征；(B)(A)部分的高度分布；(C)MnO2纳米片的紫外吸收光谱。Fig.4.2(A)AFMimage,(B)Heightprofileofthesectionin(A),and(C)UV-VisabsorptionspectrumofMnO2nanosheets.Insetof(A):Theenlargedviewofthewhitelinecircledarea.40 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测首先用原子力显微镜（AFM）对所制备的MnO2纳米片的形貌进行表征。如图4.2A和4.2B所示，MnO2纳米片显示出二维片状结构，其尺寸高度约为1.3纳米，宽度约为200纳米。此外，MnO2纳米片的紫外吸收光谱大约在370nm处显示最大吸收峰。这些实验结果表明了MnO2纳米片的成功制备。4.3.3纳米片的荧光猝灭能力分析接下来，通过将H1-FAM（25nmol/L）和H2-TMR（25nmol/L）的混合液与不同浓度的MnO2纳米片反应来评估所制备的MnO2纳米片的荧光猝灭能力。从图4.3A中可以看出，在488nm激发下，在没有MnO2纳米片时，H1-FAM发夹显示出强烈的荧光发射信号。随着MnO2纳米片浓度的增加（0⁓20μg/ml），H1-FAM和H2-TMR的荧光强度逐渐降低，当浓度达到20μg/ml时荧光完全猝灭（图4.3A插图）。该实验结果表明了发夹单体的荧光可以被MnO2纳米片有效地猝灭。然而，2+由于GSH可以将MnO2纳米片还原成Mn并释放出发夹探针，因此将GSH（1mmol/L）加入到上述完全猝灭的H1-FAM/H2-TMR/MnO2溶液中时，染料分子FAM的发射光强又得到恢复并达到原来的89.8%（图4.3B），这样的结果进一步证实了MnO2纳米片可以被GSH有效降解。图4.3(A)MnO2纳米片的荧光猝灭结果；(B)GSH对MnO2纳米片的降解实验。Fig.4.3(A)FluorescencespectraofthemixturesofH1-FAM(25nmol/L)andH2-TMR(25nmol/L)withtheadditionofdifferentconcentrationsofMnO2nanosheets.Fromatoi:0,5,8,10,12,14,16,18,20μg/mlofMnO2nanosheets.Themixtureswereexcitedat488nmtorecordtheemissionfromFAM.Inset:Changesinfluorescenceintensityvs.theconcentrationoftheMnO2nanosheets(themixtureswereexitedat488nmand540nm,respectively,torecordtheemissionsfromFAMandTMR).(B)FluorescencerecoveryofH1-FAM/H2-TMR/MnO2inthepresenceof1mmol/LGSH.FluorescencespectraofFAMwererecordedwiththeexcitationwavelengthof488nm.4.3.4传感器的可行性分析为了验证H1和H2的HCR自组装可以由miRNA-21触发，我们进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）实验（在PAGE实验中使用的H1和H2没有任41 西南大学硕士学位论文何染料标记）。如图4.4A所示，H1和H2以及H1和H2的混合物分别显示具有相似电泳迁移率的单一条带（泳道1至泳道3），表明H1和H2是亚稳态的，并且在没有目标miRNA-21触发器存在时二者可以稳定共存。此外，H1和H2与对照miRNA（let-7a）的孵育对电泳迁移率的变化几乎没有影响（泳道4vs.泳道3），表明对照miRNAlet-7a不能启动HCR反应。然而，一旦将目标miRNA-21（100nmol/L）引入到H1和H2的混合物中时，可以观察到具有迁移率低得多的泳带出现在槽口中（泳道5），并且当目标miRNA-21浓度增加到250nmol/L时会导致HCR反应中较长dsDNA聚合物的组装形成的减少（泳道6）。因此这里显示的结果表明这两个发夹可以通过miRNA-21触发两个发夹单体自组装形成dsDNA聚合物。图4.4(A)由目标miRNA-21引发的HCR的聚丙烯凝胶电泳分析；(B)不同实验样品的荧光响应值。Fig.4.4(A)(A)PAGEdemonstrationofmiRNA-21-triggeredHCRassemblyofH1andH2.Lane1:H1(2μmol/L);Lane2:H2(2μmol/L);Lane3:H1(2μmol/L)andH2(2μmol/L);Lane4:H1andH2inthepresenceofthecontrolmiRNAlet-7a(100nmol/L);Lane5:H1andH2inthepresenceofmiRNA-21(100nmol/L);Lane6:H1andH2inthepresenceofmiRNA-21(250nmol/L).(B)InvitroFRETanalysisofdifferentsolutions.(a):H1-FAM(25nmol/L);(b):H2-TMR(25nmol/L);(c):themixtureofH1-FAM(25nmol/L)andH2-TMR(25nmol/L)withtheadditionofMnO2nanosheets(20μg/mL);(d):GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2withtheadditionofGSH(1mmol/L);(e):miRNA-21(2.5nmol/L)/GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2;(f):let-7a(2.5nmol/L)/GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2.Allsolutionswereexcitedat488nm.为了证明将目标miRNA-21引入GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2溶液中可引发H1-FAM和H2-TMR之间的HCR并进一步激活FRET信号，我们在体外进行了系列荧光测试。如图4.4B所示，当在488nm的波长激发下，H1-FAM在520nm处显示出非常强的荧光发射信号（曲线a），但由于FAM和TMR之间存在着极少的FRET现象，因此在570nm处仅观察到H2-TMR非常弱的荧光发射光谱（曲线b）。随着MnO2纳米片的添加，MnO2纳米片对表面吸附的发夹具有显著的猝42 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测灭作用，因此发夹混合物的荧光几乎完全被猝灭了（曲线c），并且当向上述混合物中引入GSH时，又会导致FAM荧光的明显恢复（曲线d）。重要的是，目标miRNA-21与GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2溶液的孵育会产生明显的FRET现象，即在激发波长488nm下，分别导致了520nm处荧光强度的降低和570nm处荧光强度的增加（曲线e）。这样的FRET基本上是由于miRNA-21触发了H1-FAM和H2-TMR的自组装形成了dsDNA聚合物（在图4.4B中显示），其使荧光染料分子FAM和TMR紧密靠近以促使相应的FRET信号产生。通过将对照miRNA（let-7a）与GSH/H1-FAM/H2-TMR/MnO2一起孵育来进行对照实验发现，并不能观察到FRET信号产生（曲线f），表明对照miRNA不能触发HCR。因此这些结果表明我们设计的方法对目标miRNA-21灵敏的FRET检测具有高的选择性和巨大的潜力。4.3.5纳米片对细胞活性的影响分析MTT试验作为MnO2纳米片检测细胞内miRNA-21应用的第一步，其通过检测细胞活性来评估MnO2纳米片的细胞毒性。如图4.5所示，将HeLa细胞与0⁓60μg/mL不同浓度的MnO2纳米片进行孵育。随着MnO2纳米片浓度的增加，细胞活性稍有下降，MnO2纳米片浓度低于20μg/mL时细胞活性降低不明显。而且，当用60μg/mLMnO2纳米片处理细胞时，仍有86%的细胞存活。与其他常用的氧化[154-155]石墨烯细胞成像纳米探针相比，MnO2纳米片在细胞活性方面有了明显的改善。这些结果表明，MnO2纳米片具有理想的生物相容性和较低的毒性来进行探针运输。为了确保高的细胞活性，20μg/mL的MnO2纳米片将用于后续的实验中。图4.5MnO2纳米片浓度对细胞活性的影响。Fig.4.5CytotoxicityassayofHeLacellsincubatedwithdifferentconcentrationsofMnO2nanosheetsfor24h.43 西南大学硕士学位论文4.3.6细胞孵育不同时间的成像分析图4.6活细胞荧光成像探究不同孵育时间对FRET信号的影响。Fig.4.6HeLacellsincubatedwithH1-FAM/H2-TMR/MnO2nanosheetsfordifferenttimescalesfrom1hto4h.Scalebar=20μm.随时间变化的活细胞荧光成像实验是通过将H1-FAM/H2-TMR/MnO2溶液与HeLa细胞进行不同时间尺度的孵育监测FRET信号的改变来完成的。如图4.6所示，用H1-FAM/H2-TMR/MnO2与HeLa细胞孵育1小时后，没有观察到明显的FRET现象，这可能是由于能够产生FRET信号的HCR反应时间相对较短。而将孵育时间进一步延长至4小时后，更多的H1-FAM和H2-TMR探针被递送到了细胞中，使得目标miRNA-21能够触发其发生HCR并得到不断增加的FRET信号强度。4.3.7细胞孵育不同探针的成像分析为了验证此方法能够用于细胞内miRNA-21的检测，我们用不同探针与已知[156]miRNA-21表达水平较低的HeLa细胞进行孵育。首先将HeLa细胞与吸附在MnO2纳米片上的荧光已猝灭的发夹探针H3（具有与H1相同的序列但用FAM和Dabcyl荧光对标记）进行孵育。如图4.7b所示，由于本身miRNA-21在HeLa细胞中的表达水平较低且分子信标H3与目标miRNA-21以传统化学计量比1:1的方式结合，因此几乎检测不到来自FAM的绿色荧光信号。然而，当用H1-FAM/H2-TMR/MnO2纳米片处理HeLa细胞时，可以观察到明显的绿色和红色荧光信号（图4.7c）。这样的现象可以归因于以下原因：当探针溶液进入细胞后，细胞内的GSH首先将MnO2纳米片降解，其他蛋白质或核酸的置换作用共同将吸附的发夹H1-FAM和H2-TMR释放出来，而目标miRNA-21由此引发释放的发夹探针H1-FAM和H2-TMR之间的自组装使其转化为dsDNA聚合物，并使FAM和TMR两种荧光分子紧密靠近以产生有效的FRET信号，即导致红色荧光信号的产生，44 第四章可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测而绿色荧光信号的产生可能是由于细胞中还残留着未组装的H1-FAM。因此，图4.7b和4.7c的对比清楚地说明了我们的方法即通过目标miRNA-21在H1-FAM和H2-TMR之间触发HCR来检测活细胞中低表达的miRNA实现细胞内信号放大是可行的。最后，通过用H2-TMR/MnO2纳米片（图4.7d）和无MnO2纳米片固载的H1-FAM/H2-TMR这两种混合液分别与细胞孵育（图4.7e）进行两个对照实验发现，由于图4.7d中缺乏FRET供体（FAM），而图4.7e中没有使用MnO2纳米片载体不能将H1-FAM和H2-TMR递送到细胞中，因此两组实验均没有观察到FRET信号。图4.7活细胞荧光成像对不同探针孵育的HeLa细胞中miRNA-21的探究。Fig.4.7ConfocalfluorescenceimagesofmiRNA-21inHeLacellsincubatedwithdifferentprobes.(a)NormalHeLacellswithoutprobes;(b)H3(FAMandDabcyllabeledmolecularbeacon)/MnO2nanosheets;(c)H1-FAM/H2-TMR/MnO2nanosheets;(d)H2-TMR/MnO2nanosheets;(e)H1-FAM/H2-TMR.Allsampleswereincubatedat37ºCfor4h.Scalebar=50μm.4.3.8不同细胞孵育不同探针的成像分析为了研究此方法在区分不同癌细胞中miRNA-21表达水平的能力，我们分别对人乳腺癌细胞（MCF-7）和宫颈癌细胞（HeLa）中miRNA-21的含量进行了测定。据报道，MCF-7细胞中miRNA-21的表达水平相对较高，而与MCF-7细胞相[157]比，HeLa细胞中miRNA-21的含量就相对较低了。首先我们将两种细胞分别与探针H1-FAM/H2-TMR/MnO2纳米片在37°C下孵育4小时，并用共聚焦荧光显微镜进行记录。从图中我们可以看到，MCF-7细胞比HeLa细胞具有明显增强的FRET红色荧光信号（图4.8avs.4.8b），表明MCF-7细胞中miRNA-21的含量比HeLa细胞更高。这个结果与之前报道的miRNA-21在MCF-7细胞中过度表达的事[158]实完全一致。此外，通过将miRNA-21抑制剂（可以与miRNA-21杂交的抑制45 西南大学硕士学位论文剂被甲氧基化以防止细胞中核酸酶的消解）提前转染进HeLa细胞中，再进一步用H1-FAM/H2-TMR/MnO2纳米片孵育细胞可以发现，由于miRNA-21靶标可以与过量的抑制剂完全杂交并抑制H1-FAM和H2-TMR之间发生HCR，所以没有观察到FRET红色荧光信号（图4.8c）。因此，这些结果表明这种用于检测细胞内miRNA-21的方法的确具有信号大和背景低的优势。图4.8不同荧光探针与不同细胞孵育的荧光成像探究。Fig.4.8Confocalfluorescenceimagesof(a)MCF-7cells,(b)and(c)HeLacellstreatedwithoutandwiththemiRNA-21inhibitorsequences(500nmol/L),respectively.CellswereincubatedwithH1-FAM/H2-TMR/MnO2nanosheetsfor4h.Scalebar=20μm.4.4结论总之，我们已经证实了用MnO2纳米片介导的基于FRET信号产生的HCR扩增法检测活细胞中低表达的miRNA-21是可行的。首先MnO2纳米片可以轻易地将发夹探针递送到细胞中，通过细胞内GSH的还原作用及蛋白质或核酸的置换作用使MnO2纳米片降解并释放出发夹，从而发生HCR并产生显著放大的FRET信号用于活细胞中的微量miRNA-21的检测。此外，由于具有细胞毒性低、假阳性信号小和细胞信号放大明显等优点，我们所展示的方法为监测活细胞中的各种微量RNA提供了新的机会，也为各类癌症的早期诊断及治疗评估提供了新的契机。46 参考文献参考文献[1]Wang,J.,Rivas,G.,Cai,X.,Palecek,E.,Nielsen,P.,Shiraishi,H.,Farias,P.A.M.DNAelectrochemicalbiosensorsforenvironmentalmonitoring.Anal.Chim.Acta,1997,347(1):1-8.[2]Mello,L.D.,Lauro,T.K."Reviewoftheuseofbiosensorsasanalyticaltoolsinthefoodanddrinkindustries.FoodChem.,2002,77,2(2002):237-256.[3]Velasco-Garcia,M.N.,Mottram,T.Biosensortechnologyaddressingagriculturalproblems.BiosystemsEng.,2003,84(1):1-12.[4]Tuerk,C.,Gold,L.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science,1990,249(4968):505-510.[5]Ellington,A.D.,Szostak,J.W.Selectioninvitroofsingle-strandedDNAmoleculesthatfoldintospecificligand-bindingstructures.Nature,1990,355(6363):850-852.[6]So,H.M.,Won,K.,Kim,Y.H.,Kim,B.K.,Ryu,B.H.,Na,P.S.,Lee,J.O.Single-walledcarbonnanotubebiosensorsusingaptamersasmolecularrecognitionelements.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(34):11906-11907.[7]Pu,W.D.,Zhang,L.,Huang,C.Z.Grapheneoxideasanano-platformforATPdetectionbasedonaptamerchemistry.Anal.Methods.,2012,4(6):1662-1666.[8]Wang,S.E.,Si,S.Aptamerbiosensingplatformbasedoncarbonnanotubelong-rangeenergytransferforsensitive,selectiveandmulticolorfluorescentheavymetalionanalysis.Anal.Methods.,2013,5(12):2947-2953.[9]Deng,B.,Chen,J.,Zhang,H.AssemblyofmultipleDNAcomponentsthroughtargetbindingtowardhomogeneous,isothermallyamplified,andspecificdetectionofproteins.Anal.Chem.,2014,86(14):7009-7016.[10]Chen,Y.,Chen,L.,Ou,Y.,Guo,L.,Fu,F.Enzyme-freedetectionofDNAbasedonhybridizationchainreactionamplificationandfluorescenceresonanceenergytransfer.SensorsandActuatorsB:Chemical,2016,233:691-696.[11]Zhu,Q.,Xiang,D.,Zhang,C.,Ji,X.,He,Z.Multicolourprobesforsequence-specificDNAdetectionbasedongrapheneoxide.Analyst,2013,138(18):5194-5196.[12]Yan,L.A.,Shi,H.,He,X.,Wang,K.,Tang,J.,Chen,M.,Lei,Y.Aversatileactivatablefluorescenceprobingplatformforcancercellsinvitroandinvivobasedonself-assembledaptamer/carbonnanotubeensembles.Anal.Chem.,2014,86(18):9271-9277.[13]Liu,J.,Zhang,L.,Lei,J.,Ju,H.MicroRNA-responsivecancercellimagingandtherapywithfunctionalizedgoldnanoprobe.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7(34):19016-19023.[14]Yeung,S.S.,Lee,T.M.,Hsing,I.M.Electrochemicalreal-timepolymerasechainreaction.J.47 西南大学硕士学位论文Am.Chem.Soc.,2006,128(41):13374-13375.[15]Liu,M.,Song,J.,Shuang,S.,Dong,C.,Brennan,J.D.,Li,Y.Agraphene-basedbiosensingplatformbasedonthereleaseofDNAprobesandrollingcircleamplification.ACSNano,2014,8(6):5564-5573.[16]Xu,Y.,Xu,J.,Xiang,Y.,Yuan,R.,Chai,Y.Target-inducedstructureswitchingofhairpinaptamersforlabel-freeandsensitivefluorescentdetectionofATPviaexonuclease-catalyzedtargetrecyclingamplification.Biosens.Bioelectron.,2014,51:293-296.[17]Liu,X.,Chen,M.,Hou,T.,Wang,X.,Liu,S.,Li,F.Label-freecolorimetricassayforbaseexcisionrepairenzymeactivitybasedonnickingenzymeassistedsignalamplification.Biosens.Bioelectron.,2014,54:598-602.[18]Dirks,R.M.,Pierce,N.A.Triggeredamplificationbyhybridizationchainreaction.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101(43):15275-15278.[19]Huang,J.,Gao,X.,Jia,J.,Kim,J.K.,Li,Z.Grapheneoxide-basedamplifiedfluorescent2+biosensorforHgdetectionthroughhybridizationchainreactions.Anal.Chem.,2014,86(6):3209-3215.[20]Zheng,A.X.,Wang,J.R.,Li,J.,Song,X.R.,Chen,G.N.,Yang,H.H.Enzyme-freefluorescenceaptasensorforamplificationdetectionofhumanthrombinviatarget-catalyzedhairpinassembly.Biosens.Bioelectron.,2012,36(1):217-221.[21]Cavicchi,R.E.,Silsbee,R.H.Coulombsuppressionoftunnelingratefromsmallmetalparticles.Phys.Rev.Lett.,1984,52(16):1453.[22]Hansen,J.A.,Wang,J.,Kawde,A.N.,Xiang,Y.,Gothelf,K.V.,Collins,G.Quantum-dot/aptamer-basedultrasensitivemulti-analyteelectrochemicalbiosensor.J.Am.Chem.Soc.,2006,128(7):2228-2229.[23]Wang,J.,Munir,A.,Li,Z.,Zhou,H.S.Aptamer-AuNPsconjugates-accumulatedmethyleneblueforthesensitiveelectrochemicalimmunoassayofprotein.Talanta,2010,81(1-2):63-67.[24]Liu,K.,Zhang,J.J.,Wang,C.,Zhu,J.J.Graphene-assisteddualamplificationstrategyforthefabricationofsensitiveamperometricimmunosensor.Biosens.Bioelectron.,2011,26(8):3627-3632.[25]Zhao,X.,Tapec-Dytioco,R.,Tan,W.UltrasensitiveDNAdetectionusinghighlyfluorescentbioconjugatednanoparticles.J.Am.Chem.Soc.,2003,125(38),11474-11475.[26]Mani,V.,Chikkaveeraiah,B.V.,Patel,V.,Gutkind,J.S.,Rusling,J.F.Ultrasensitiveimmunosensorforcancerbiomarkerproteinsusinggoldnanoparticlefilmelectrodesandmultienzyme-particleamplification.ACSNano,2009,3(3):585-594.48 参考文献[27]David,S.S.,Williams,S.D.Chemistryofglycosylasesandendonucleasesinvolvedinbase-excisionrepair.Chem.Rev.,1998,98(3):1221-1262.[28]Batty,D.P.,Wood,R.D.DamagerecognitioninnucleotideexcisionrepairofDNA.Gene,2000,241(2):193-204.[29]Kunkel,T.A.,Erie,D.A.DNAmismatchrepair.Annu.Rev.Biochem.,2005,74:681-710.[30]Lindahl,T.AnN-glycosidasefromEscherichiacolithatreleasesfreeuracilfromDNAcontainingdeaminatedcytosineresidues.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1974,71(9):3649-3653.[31]Lindahl,T.,Wood,R.D.QualitycontrolbyDNArepair.Science,1999,286(5446):1897-1905.[32]Hoeijmakers,J.H.Genomemaintenancemechanismsforpreventingcancer.Nature,2001,411(6835):366-374.[33]Sousa,M.M.,Krokan,H.E.,Slupphaug,G.DNA-uracilandhumanpathology.Mol.AspectsMed.,2007,28(3-4):276-306.[34]Zharkov,D.O.,Mechetin,G.V.,Nevinsky,G.A.Uracil-DNAglycosylase:Structural,thermodynamicandkineticaspectsoflesionsearchandrecognition.Mutat.Res.,2010,685(1):11-20.[35]Imai,K.,Slupphaug,G.,Lee,W.I.,Revy,P.,Nonoyama,S.,Catalan,N.,Ochs,H.D.Humanuracil-DNAglycosylasedeficiencyassociatedwithprofoundlyimpairedimmunoglobulinclass-switchrecombination.Nat.Immunol.,2003,4(10):1023-1028.[36]Wu,Y.,Wang,L.,Zhu,J.,Jiang,W.ADNAmachine-basedfluorescenceamplificationstrategyforsensitivedetectionofuracil-DNAglycosylaseactivity.Biosens.Bioelectron.,2015,68:654-659.[37]DiNoia,J.,Neuberger,M.S.Alteringthepathwayofimmunoglobulinhypermutationbyinhibitinguracil-DNAglycosylase.Nature,2002,419(6902):43-48.[38]Ritzler,M.,Perschil,I.,Altwegg,M.Influenceofresidualuracil-DNAglycosylaseactivityontheelectrophoreticmigrationofdUTP-containingPCRproducts.J.Microbiol.Methods,1999,35(1):73-76.[39]Ischenko,A.A.,Saparbaev,M.K.AlternativenucleotideincisionrepairpathwayforoxidativeDNAdamage.Nature,2002,415(6868):183-187.[40]Nagelhus,T.A.,Slupphaug,G.,Lindmo,T.,Krokan,H.E.Cellcycleregulationandsubcellularlocalizationofthemajorhumanuracil-DNAglycosylase.Exp.CellRes.,1995,220(2):292-297.[41]Zhang,L.,Zhao,J.,Jiang,J.,Yu,R.Atarget-activatedautocatalyticDNAzymeamplification49 西南大学硕士学位论文strategyfortheassayofbaseexcisionrepairenzymeactivity.Chem.Commun.,2012,48(70):8820-8822.[42]Bellamy,S.R.,Krusong,K.,Baldwin,G.S.ArapidreactionanalysisofuracilDNAglycosylaseindicatesanactivemechanismofbaseflipping.NucleicAcidsRes.,2007,35(5):1478-1487.[43]Yang,X.,Tong,C.,Long,Y.,Liu,B.ArapidfluorescenceassayforhSMUG1activitybasedonmodifiedmolecularbeacon.Mol.Cell.Probes,2011,25(5-6):219-221.[44]Liu,B.,Yang,X.,Wang,K.,Tan,W.,Li,H.,Tang,H.Real-timemonitoringofuracilremovalbyuracil-DNAglycosylaseusingfluorescentresonanceenergytransferprobes.Anal.Biochem.,2007,366(2):237-243.[45]Hu,D.,Huang,Z.,Pu,F.,Ren,J.,Qu,X.Alabel-free,quadruplex-basedfunctionalmolecularbeacon(LFG4-MB)forfluorescenceturn-ondetectionofDNAandnuclease.Chem.-Eur.J.,2011,17(5):1635-1641.[46]Xiang,Y.,Lu,Y.ExpandingtargetsofDNAzyme-basedsensorsthroughdeactivationandactivationofDNAzymesbysingleuracilremoval:Sensitivefluorescentassayofuracil-DNAglycosylase.Anal.Chem.,2012,84(22):9981-9987.[47]Ono,T.,Wang,S.,Koo,C.K.,Engstrom,L.,David,S.S.,Kool,E.T.DirectfluorescencemonitoringofDNAbaseexcisionrepair.Angew.Chem.,Int.Ed.,2012,51(7):1689-1692.[48]Nguyen,V.T.,Le,D.V.,Nie,C.,Zhou,D.M.,Wang,Y.Z.,Tang,L.J.,Yu,R.Q.Enzyme-catalyzedassemblyofgoldnanoparticlesforvisualizedscreeningofDNAbaseexcisionrepair.Talanta,2012,100:303-307.[49]Zhou,D.M.,Xi,Q.,Liang,M.F.,Chen,C.H.,Tang,L.J.,Jiang,J.H.Grapheneoxide-hairpinprobenanocompositeasahomogeneousassayplatformforDNAbaseexcisionrepairscreening.Biosens.Bioelectron.,2013,41:359-365.[50]Hao,Y.,Guo,Q.,Wu,H.,Guo,L.,Zhong,L.,Wang,J.,Chen,G.AmplifiedcolorimetricdetectionofmercuricionsthroughautonomousassemblyofG-quadruplexDNAzymenanowires.Biosens.Bioelectron.,2014,52:261-264.[51]Lin,S.,Gao,W.,Tian,Z.,Yang,C.,Lu,L.,Mergny,J.L.,Ma,D.L.Luminescenceswitch-ondetectionofproteintyrosinekinase-7usingaG-quadruplex-selectiveprobe.Chem.Sci.,2015,6(7),4284-4290.[52]Wang,G.L.,Shu,J.X.,Dong,Y.M.,Wu,X.M.,Zhao,W.W.,Xu,J.J.,Chen,H.Y.UsingG-Quadruplex/heminto“switch-on”thecathodicphotocurrentofp-TypePbSquantumdots:Towardaversatileplatformforphotoelectrochemicalaptasensing.Anal.Chem.,2015,87(5):2892-2900.50 参考文献[53]Zhu,J.,Zhang,L.,Zhou,Z.,Dong,S.,Wang,E.Aptamer-basedsensingplatformusingthree-wayDNAjunction-drivenstranddisplacementanditsapplicationinDNAlogiccircuit.Anal.Chem.,2013,86(1):312-316.[54]Li,Y.,Geyer,R.,Sen,D.RecognitionofanionicporphyrinsbyDNAaptamers.Biochemistry,1996,35(21):6911-6922.[55]Arthanari,H.,Basu,S.,Kawano,T.L.,Bolton,P.H.FluorescentdyesspecificforquadruplexDNA.NucleicAcidsRes.,1998,26(16):3724-3728.[56]Li,Y.,Sen,D.AcatalyticDNAforporphyrinmetallation.Nat.Struct.Mol.Biol.,1996,3(9):743-747.[57]Long,Y.,Zhou,X.,Xing,D.Anisothermalandsensitivenucleicacidsassaybytargetsequencerecycledrollingcircleamplification.Biosens.Bioelectron.,2013,46:102-107.[58]Xu,W.,Deng,R.,Wang,L.,Li,J.MultiresponsiverollingcircleamplificationforDNAlogicgatesmediatedbyendonuclease.Anal.Chem.,2014,86(15):7813-7818.[59]Wang,F.,Lu,C.H.,Liu,X.,Freage,L.,Willner,I.AmplifiedandmultiplexeddetectionofDNAusingthedendriticrollingcircleamplifiedsynthesisofDNAzymereporterunits.Anal.Chem.,2014,86(3),1614-1621.[60]Deng,R.,Tang,L.,Tian,Q.,Wang,Y.,Lin,L.,Li,J.Toehold-initiatedrollingcircleamplificationforvisualizingindividualmicroRNAsinsituinsinglecells.Angew.Chem.,Int.Ed.,2014,53(9):2389-2393.[61]Li,Y.,Liang,L.,Zhang,C.Y.IsothermallysensitivedetectionofserumcirculatingmiRNAsforlungcancerdiagnosis.Anal.Chem.,2013,85(23):11174-11179.[62]Liu,M.,Zhang,W.,Zhang,Q.,Brennan,J.D.,Li,Y.Biosensingbytandemreactionsofstructureswitching,nucleolyticdigestion,andDNAamplificationofaDNAassembly.Angew.Chem.,Int.Ed.,2015,54(33):9637-9641.[63]Gao,X.,Hannoush,R.N.Single-cellimagingofwntpalmitoylationbytheacyltransferaseporcupine.Nat.Chem.Biol.,2014,10(1),61-68.[64]Wang,L.,Tram,K.,Ali,M.M.,Salena,B.J.,Li,J.,Li,Y.Arrestofrollingcircleamplificationbyprotein-bindingDNAaptamers.Chem.-Eur.J.,2014,20(9):2420-2424.[65]Ding,C.,Liu,H.,Wang,N.,Wang,Z.Cascadesignalamplificationstrategyforthedetectionofcancercellsbyrollingcircleamplificationandnanoparticlestagging.Chem.Commun.,2012,48(41):5019-5021.[66]Zhu,J.,Zhang,L.,Dong,S.,Wang,E.Four-wayjunction-drivenDNAstranddisplacementanditsapplicationinbuildingmajoritylogiccircuit.ACSNano,2013,7(11):10211-10217.51 西南大学硕士学位论文[67]Li,T.,Wang,E.,Dong,S.ParallelG-quadruplex-specificfluorescentprobeformonitoringDNAstructuralchangesandlabel-freedetectionofpotassiumion.Anal.Chem.,2010,82(18):7576-7580.[68]Kaushal,P.S.,Talawar,R.K.,Krishna,P.D.V.,Varshney,U.,Vijayan,M.Uniquefeaturesofthestructureandinteractionsofmycobacterialuracil-DNAglycosylase:structureofacomplexoftheMycobacteriumtuberculosisenzymeincomparisonwiththosefromothersources.ActaCrystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.,2008,64(5):551-560.[69]He,X.,Zhao,Y.,He,D.,Wang,K.,Xu,F.,Tang,J.ATP-responsivecontrolledreleasesystemusingaptamer-functionalizedmesoporoussilicananoparticles.Langmuir,2012,28(35):12909-12915.[70]Deng,B.,Lin,Y.,Wang,C.,Li,F.,Wang,Z.,Zhang,H.,Le,X.C.Aptamerbindingassaysforproteins:thethrombinexample-areview.Anal.Chim.Acta,2014,837:1-15.[71]Shangguan,D.,Li,Y.,Tang,Z.,Cao,Z.C.,Chen,H.W.,Mallikaratchy,P.,Tan,W.Aptamersevolvedfromlivecellsaseffectivemolecularprobesforcancerstudy.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103(32):11838-11843.[72]Shamah,S.M.,Healy,J.M.,Cload,S.T.ComplextargetSELEX.Acc.Chem.Res.,2008,41(1):130-138.[73]Liu,J.,Cao,Z.,Lu,Y.Functionalnucleicacidsensors.Chem.Rev.,2009,109(5):1948-1998.[74]Huang,Y.,Chen,J.,Zhao,S.,Shi,M.,Chen,Z.F.,Liang,H.Label-freecolorimetricaptasensorbasedonnickingenzymeassistedsignalamplificationandDNAzymeamplificationforhighlysensitivedetectionofprotein.Anal.Chem.,2013,85(9):4423-4430.[75]Tang,Y.,Wang,Z.,Yang,X.,Chen,J.,Liu,L.,Zhao,W.,Li,F.Constructingreal-time,wash-free,andreiterativesensorsforcellsurfaceproteinsusingbinding-induceddynamicDNAassembly.Chem.Sci.,2015,6(10):5729-5733.[76]Ang,Y.S.,Yung,L.Y.L.Engineeringself-containedDNAcircuitforproximityrecognitionandlocalizedsignalamplificationoftargetbiomolecules.NucleicAcidsRes.,2014,42(14):9523-9530.[77]Ma,D.L.,Wang,M.,He,B.,Yang,C.,Wang,W.,Leung,C.H.AluminescentcocainedetectionplatformusingasplitG-Quadruplex-selectiveiridium(III)complexandathree-WayDNAjunctionarchitecture.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7(34):19060-19067.[78]Zhang,L.,Zhang,K.,Liu,G.,Liu,M.,Liu,Y.,Li,J.Label-freenanoporeproximitybioassayforplatelet-derivedgrowthfactordetection.Anal.Chem.,2015,87(11):5677-5682.[79]Xu,W.,Xue,S.,Yi,H.,Jing,P.,Chai,Y.,Yuan,R.Asensitiveelectrochemicalaptasensor52 参考文献basedontheco-catalysisofhemin/G-quadruplex,platinumnanoparticlesandflower-likeMnO2nanospherefunctionalizedmulti-walledcarbonnanotubes.Chem.Commun.,2015,51(8),1472-1474.[80]Li,J.,Zhong,X.,Zhang,H.,Le,X.C.,Zhu,J.J.Binding-inducedfluorescenceturn-onassayusingaptamer-functionalizedsilvernanoclusterDNAprobes.Anal.Chem.,2012,84(12):5170-5174.[81]Chen,Z.,Tan,Y.,Zhang,C.,Yin,L.,Ma,H.,Ye,N.,Lin,Y.Acolorimetricaptamerbiosensorbasedoncationicpolymerandgoldnanoparticlesfortheultrasensitivedetectionofthrombin.Biosens.Bioelectron.,2014,56:46-50.[82]Chang,H.,Tang,L.,Wang,Y.,Jiang,J.,Li,J.Graphenefluorescenceresonanceenergytransferaptasensorforthethrombindetection.Anal.Chem.,2010,82(6):2341-2346.[83]Zheng,A.X.,Wang,J.R.,Li,J.,Song,X.R.,Chen,G.N.,Yang,H.H.Nickingenzymebasedhomogeneousaptasensorsforamplificationdetectionofprotein.Chem.Commun.,2011,48(3):374-376.[84]He,P.,Liu,L.,Qiao,W.,Zhang,S.Ultrasensitivedetectionofthrombinusingsurfaceplasmonresonanceandquartzcrystalmicrobalancesensorsbyaptamer-basedrollingcircleamplificationandnanoparticlesignalenhancement.Chem.Commun.,2014,50(12):1481-1484.[85]Gao,F.,Du,L.,Tang,D.,Lu,Y.,Zhang,Y.,Zhang,L.AcascadesignalamplificationstrategyforsurfaceenhancedRamanspectroscopydetectionofthrombinbasedonDNAzymeassistantDNArecyclingandrollingcircleamplification.Biosens.Bioelectron.,2015,66:423-430.[86]Zhao,J.,Xin,M.,Cao,Y.,Yin,Y.,Shu,Y.,Ma,W.AnelectrochemicalaptasensorforthrombindetectionbasedontherecyclingofexonucleaseIIIanddouble-strandedDNA-templatedcoppernanoparticlesassistedsignalamplification.Anal.Chim.Acta,2015,860:23-28.[87]Li,J.,Li,W.,Qiang,W.,Wang,X.,Li,H.,Xu,D.Anon-aggregationcolorimetricassayforthrombinbasedoncatalyticpropertiesofsilvernanoparticles.Anal.Chim.Acta,2014,807:120-125.[88]Yang,M.,Chen,Y.,Xiang,Y.,Yuan,R.,Chai,Y.Target-inducedstructureswitchingofDNAforlabel-freeandultrasensitiveelectrochemiluminescentdetectionofproteins.Chem.Commun.,2014,50(24):3211-3213.[89]Song,W.,Xie,X.,Sun,W.,Zhang,N.,Li,C.Ultrasensitiveelectrochemicaldetectionforthrombinusinghybridizationchainreactionwithenzyme-amplification.Anal.Chim.Acta,2015,860:77-82.53 西南大学硕士学位论文[90]Srinivas,N.,Ouldridge,T.E.,Šulc,P.,Schaeffer,J.M.,Yurke,B.,Louis,A.A.,Winfree,E.Onthebiophysicsandkineticsoftoehold-mediatedDNAstranddisplacement.NucleicAcidsRes.,2013,41(22):10641-10658.[91]Huang,J.,Wu,Y.,Chen,Y.,Zhu,Z.,Yang,X.,Yang,C.J.Tan,W.Pyrene-excimerprobesbasedonthehybridizationchainreactionforthedetectionofnucleicacidsincomplexbiologicalfluids.Angew.Chem.,Int.Ed.,2011,50(2):401-404.[92]Yang,J.,Dou,B.,Yuan,R.,Xiang,Y.Proximitybindingandmetalion-dependentDNAzymecyclicamplification-integratedaptasensorforlabel-freeandsensitiveelectrochemicaldetectionofthrombin.Anal.Chem.,2016,88(16):8218-8223.[93]Yin,P.,Choi,H.M.,Calvert,C.R.,Pierce,N.A.Programmingbiomolecularself-assemblypathways.Nature,2008,451(7176):318-322.[94]Quan,K.,Huang,J.,Yang,X.,Yang,Y.,Ying,L.,Wang,H.,Wang,K.PowerfulamplificationcascadesofFRET-basedtwo-layernonenzymaticnucleicacidcircuits.Anal.Chem.,2016,88(11):5857-5864.[95]Li,B.,Jiang,Y.,Chen,X.,Ellington,A.D.ProbingspatialorganizationofDNAstrandsusingenzyme-freehairpinassemblycircuits.J.Am.Chem.Soc.,2012,134(34):13918-13921.[96]Zheng,A.X.,Li,J.,Wang,J.R.,Song,X.R.,Chen,G.N.,Yang,H.H.Enzyme-freesignalamplificationintheDNAzymesensorviatarget-catalyzedhairpinassembly.Chem.Commun.,2012,48(25):3112-3114.[97]Jiang,Y.,Li,B.,Milligan,J.N.,Bhadra,S.,Ellington,A.D.Real-timedetectionofisothermalamplificationreactionswiththermostablecatalytichairpinassembly.J.Am.Chem.Soc.,2013,135(20):7430-7433.[98]Zhang,H.,Li,F.,Dever,B.,Wang,C.,Li,X.F.,Le,X.C.AssemblingDNAthroughaffinitybindingtoachieveultrasensitiveproteindetection.Angew.Chem.,Int.Ed.,2013,52(41):10698-10705.[99]Zhang,H.,Li,F.,Dever,B.,Li,X.F.,Le,X.C.DNA-mediatedhomogeneousbindingassaysfornucleicacidsandproteins.Chem.Rev.,2012,113(4):2812-2841.[100]Heyduk,E.,Dummit,B.,Chang,Y.H.,Heyduk,T.Molecularpincers:antibody-basedhomogeneousproteinsensors.Anal.Chem.,2008,80(13):5152-5159.[101]Zhang,H.,Li,X.F.,Le,X.C.Binding-inducedDNAassemblyanditsapplicationtoyoctomoledetectionofproteins.Anal.Chem.,2011,84(2):877-884.[102]Rinker,S.,Ke,Y.,Liu,Y.,Chhabra,R.,Yan,H.Self-assembledDNAnanostructuresfordistance-dependentmultivalentligand-proteinbinding.Nat.Nanotechnol.,2008,3(7):418-422.54 参考文献[103]Zou,M.,Li,D.,Yuan,R.,Xiang,Y.Metal-iondependentDNAzymerecyclingamplificationforsensitiveandhomogeneousimmuno-proximitybindingassayofα-fetoproteinbiomarker.Biosens.Bioelectron.,2017,92:624-629.[104]Nilsson,I.,Bahram,F.,Li,X.,Gualandi,L.,Koch,S.,Jarvius,M.,Baldwin,M.VEGFreceptor2/‐3heterodimersdetectedinsitubyproximityligationonangiogenicsprouts.EMBOJ.,2010,29(8):1377-1388.[105]He,L.,Hannon,G.J.MicroRNAs:SmallRNAswithabigroleingeneregulation.Nat.Rev.Genet.,2004,5(7):522-531.[106]Valencia-Sanchez,M.A.,Liu,J.,Hannon,G.J.,Parker,R.ControloftranslationandmRNAdegradationbymiRNAsandsiRNAs.GenesDev.,2006,20(5):515-524.[107]Dong,H.,Lei,J.,Ding,L.,Wen,Y.,Ju,H.,Zhang,X.MicroRNA:function,detection,andbioanalysis.Chem.Rev.,2013,113(8):6207-6233.[108]Ambros,V.ThefunctionsofanimalmicroRNAs.Nature,2004,431(7006):350-355.[109]He,L.,Thomson,J.M.,Hemann,M.T.,Hernando-Monge,E.,Mu,D.,Goodson,S.,Powers,S.,Cordon-Cardo,C.,Lowe,S.W.,Hannon,G.J.,Hammond,S.M.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Nature,2005,435(7043):828-833.[110]Selbach,M.,Schwanhäusser,B.,Thierfelder,N.,Fang,Z.,Khanin,R.,Rajewsky,N.WidespreadchangesinproteinsynthesisinducedbymicroRNAs.Nature,2008,455(7209):58-63.[111]Bartel,D.P.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions.Cell,2009,136(2):215-233.[112]Ruan,K.,Fang,X.,Ouyang,G.MicroRNAs:novelregulatorsinthehallmarksofhumancancer.CancerLett.,2009,285(2)116-126.[113]Tsitsiou,E.,Lindsay,M.A.MicroRNAsandtheimmuneresponse.Curr.Opin.Pharmacol.,2009,9(4):514-520.[114]Chen,J.F.,Murchison,E.P.,Tang,R.,Callis,T.E.,Tatsuguchi,M.,Deng,Z.,Rojas,M.,Hammond,S.M.,Schneider,M.D.,Selzman,C.H.,Meissner,G.,Patterson,C.,Hannon,G.J.,Wang,D.Z.Targeteddeletionofdicerintheheartleadstodilatedcardiomyopathyandheartfailure.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2008,105(6):2111-2116.[115]Yin,J.Q.,Zhao,R.C.,Morris,K.V.ProfilingmicroRNAexpressionwithmicroarrays.TrendsinBiotechnol.,2008,26(2):70-76.[116]Iorio,M.V.,Ferracin,M.;Liu,C.G.,Veronese,A.,Spizzo,R.,Sabbioni,S.,Magri,E.,Pedriali,M.,Fabbri,M.,Campiglio,M.,Menard,S.,Palazzo,J.P.,Rosenberg,A.,Musiana,P.,Volinia,55 西南大学硕士学位论文S.,Nenci,I.,Calin,G.A.,Querzoli,P.,Negrini,M.,Croce,C.M.,Ménard,S.MicroRNAgeneexpressionderegulationinhumanbreastcancer.CancerRes.,2005,65(16):7065-7070.[117]Lu,J.,Getz,G.,Miska,E.A.,Alvarez-Saavedra,E.,Lamb,J.,Peck,D.,Sweet-Cordero,A.,Ebert,B.L.,Mak,R.H.,Ferrando,A.A.,Downing,J.R.,Jacks,T.,Horvitz,H.,Golub,T.R.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature,2005,435(7043):834-838.[118]Calin,G.A.,Croce,C.M.MicroRNAsignaturesinhumancancers.Nat.Rev.Cancer,2006,6(11):857-866.[119]Brown,B.D.,Naldini,L.ExploitingandantagonizingmicroRNAregulationfortherapeuticandexperimentalapplications.Nat.Rev.Genet.,2009,10(8):578-585.[120]Cortez,M.A.,Bueso-Ramos,C.,Ferdin,J.,Lopez-Berestein,G.,Sood,A.K.,Calin,G.A.MicroRNAsinbodyfluids—themixofhormonesandbiomarkers.Nat.Rev.Clin.Oncol.,2011,8(8):467-477.[121]Pritchard,C.C.,Cheng,H.H.,Tewari,M.MicroRNAprofiling:approachesandconsiderations.Nat.Rev.Genet.,2012,13(5):358-369.[122]Pall,G.S.,Codony-Servat,C.,Byrne,J.,Ritchie,L.,Hamilton,A.Carbodiimide-mediatedcross-LinkingofRNAtonylonmembranesimprovesthedetectionofsiRNA,miRNAandpiRNAbynorthernblot.NucleicAcidsRes.,2007,35(8):1-9.[123]Nelson,P.T.,Baldwin,D.A.,Scearce,L.M.,Oberholtzer,J.C.,Tobias,J.W.,Mourelatos,Z.Microarray-based,high-throughputgeneexpressionprofilingofmicroRNAs.Nat.Methods,2004,1(2):155-161.[124]Xi,Q.,Zhou,D.M.,Kan,Y.Y.,Ge,J.,Wu,Z.K.,Yu,R.Q.,Jiang,J.H.HighlysensitiveandselectivestrategyformicroRNAdetectionbasedonWS2nanosheetmediatedfluorescencequenchingandduplex-specificnucleasesignalamplification.Anal.Chem.,2014,86(3):1361-1365.[125]Yin,B.C.,Liu,Y.Q.,Ye,B.C.One-step,multiplexedfluorescencedetectionofmicroRNAsbasedonduplex-specificnucleasesignalamplification.J.Am.Chem.Soc.,2012,134(11):5064-5067.[126]Cui,L.,Lin,X.,Lin,N.,Song,Y.,Zhu,Z.,Chen,X.,Yang,C.J.Grapheneoxide-protectedDNAprobesformultiplexmicroRNAanalysisincomplexbiologicalsamplesbasedonacyclicenzymaticamplificationmethod.Chem.Commun.,2012,48(2):194-196.[127]Miao,P.,Wang,B.,Chen,X.,Li,X.,Tang,Y.TetrahedralDNAnanostructure-basedmicroRNAbiosensorcoupledwithcatalyticrecyclingoftheanalyte.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7(11):6238-6243.56 参考文献[128]Shi,K.,Dou,B.,Yang,J.,Yuan,R.,Xiang,Y.Cascadedstranddisplacementfornon-enzymatictargetrecyclingamplificationandlabel-freeelectronicdetectionofmicroRNAfromtumorcells.Anal.Chim.Acta,2016,916:1-7.[129]Zhang,P.,Wu,X.,Yuan,R.,Chai,Y.An“off-on”electrochemiluminescentbiosensorbasedonDNAzyme-assistedtargetrecyclingandrollingcircleamplificationsforultrasensitivedetectionofmicroRNA.Anal.Chem.,2015,87(6):3202-3207.[130]Jin,Z.,Geißler,D.,Qiu,X.,Wegner,K.D.,Hildebrandt,N.Arapid,amplification-free,andsensitivediagnosticassayforsingle-stepmultiplexedfluorescencedetectionofmicroRNA.Angew.Chem.,Int.Ed.,2015,54(34):10024-10029.[131]Schneider,M.,Andersen,D.C.,Silahtaroglu,A.,Lyngbæk,S.,Kauppinen,S.,Hansen,J.L.,Sheikh,S.P.Cell-specificdetectionofmicroRNAexpressionduringcardiomyogenesisbycombinedinsituhybridizationandimmunohistochemistry.J.Mol.Histol.,2001,42(4):289-299.[132]Vargas,D.Y.,Raj,A.,Marras,S.A.,Kramer,F.R.,Tyagi,S.MechanismofmRNAtransportinthenucleus.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2005,102(47):17008-17013.[133]Kloosterman,W.P.,Wienholds,E.,deBruijn,E.,Kauppinen,S.,Plasterk,R.H.InsitudetectionofmiRNAsinanimalembryosusingLNA-modifiedoligonucleotideprobes.Nat.Methods,2006,3(1):27-29.[134]Silahtaroglu,A.N.,Nolting,D.,Dyrskjot,L.,Berezikov,E.,Moller,M.,Tommerup,N.,Kauppinen,S.DetectionofmicroRNAsinfrozentissuesectionsbyfluorescenceinsituhybridizationusinglockednucleicacidprobesandtyramidesignalamplification.Nat.Protoc.,2007,2(10):2520-2528.[135]Ge,J.,Zhang,L.L.,Liu,S.J.,Yu,R.Q.,Chu,X.Ahighlysensitivetarget-primedrollingcircleamplification(TPRCA)methodforfluorescentinsituhybridizationdetectionofmicroRNAintumorcells.Anal.Chem.,2014,86(3):1808-1815.[136]Wu,Z.,Liu,G.Q.,Yang,X.L.,Jiang,J.H.ElectrostaticnucleicacidnanoassemblyenableshybridizationchainreactioninlivingcellsforultrasensitivemRNAimaging.J.Am.Chem.Soc.,2015,137(21):6829-6836.[137]He,S.,Song,B.,Li,D.,Zhu,C.,Qi,W.,Wen,Y.,Wang,L.,Song,S.,Fang,H.,Fan,C.Agraphenenanoprobeforrapid,sensitive,andmulticolorfluorescentDNAanalysis.AdvancedFunctionalMaterials,2010,20(3):453-459.[138]Pei,H.,Li,J.,Lv,M.,Wang,J.,Gao,J.,Lu,J.,Li,Y.,Huang,Q.,Hu,J.,Fan,C.Agraphene-basedsensorarrayforhigh-precisionandadaptivetargetidentificationwithensemble57 西南大学硕士学位论文aptamers.J.Am.Chem.Soc.,2012,134(33):13843-13849.[139]Liao,X.,Wang,Q.,Ju,H.SimultaneoussensingofintracellularmicroRNAswithamulti-functionalizedcarbonnitridenanosheetprobe.Chem.Commun.,2014,50(88):13604-13607.[140]Kim,E.,Yang,J.,Park,J.,Kim,S.,Kim,N.H.,Yook,J.I.,Suh,J.S.,Haam,S.,Huh,Y.M.ConsecutivetargetablesmartnanoprobeformolecularrecognitionofcytoplasmicmicroRNAinmetastaticbreastcancer.ACSNano,2012,6(10):8525-8535.[141]Zhang,P.,He,Z.,Wang,C.,Chen,J.,Zhao,J.,Zhu,X.,Li,C.Z.,Min,Q.,Zhu,J.J.InsituamplificationofintracellularmicroRNAwithMNAzymenanodevicesformultiplexedimaging,logicoperation,andcontrolleddrugrelease.ACSNano,2015,9(1):789-798.[142]Cheglakov,Z.,Cronin,T.M.,He,C.,Weizmann,Y.LivecellmicroRNAimagingusingcascadehybridizationreaction.J.Am.Chem.Soc.,2015,137(19):6116-6119.[143]Arayachukiat,S.,Seemork,J.,Pan-In,P.,Amornwachirabodee,K.,Sangphech,N.,Sansureerungsikul,T.,Sathornsantikun,K.,Vilaivan,C.,Shigyou,K.,Pienpinijtham,P.,Vilaivan,T.,Palaga,T.,Banlunara,W.,Hamada,T.,Wanichwecharungruang,S.Bringingmacromoleculesintocellsandevadingendosomesbyoxidizedcarbonnanoparticles.Nanolett.,2015,15(5):3370-3376.[144]Fan,H.,Zhao,Z.,Yan,G.,Zhang,X.,Yang,C.,Meng,H.,Chen,Z.,Liu,H.,Tan,W.AsmartDNAzyme-MnO2nanosystemforefficientgenesilencing.Angew.Chem.,Int.Ed.,2015,127(16):4883-4887.[145]Zhao,Z.,Fan,H.,Zhou,G.,Bai,H.,Liang,H.,Wang,R.,Zhang,X.,Tan,W.Activatablefluorescence/MRIbimodalplatformfortumorcellimagingviaMnO2nanosheet-aptamernanoprobe.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(32):11220-11223.[146]He,D.,Yang,X.,He,X.,Wang,K.,Yang,X.,He,X.,Zou,Z.Asensitiveturn-onfluorescentprobeforintracellularimagingofglutathioneusingsingle-layerMnO2nanosheet-quenchedfluorescentcarbonquantumdots.Chem.Commun.,2015,51(79):14764-14767.[147]Chen,Y.,Xu,J.,Su,J.,Xiang,Y.,Yuan,R.,Chai,Y.InsituhybridizationchainreactionamplificationforuniversalandhighlysensitiveelectrochemiluminescentdetectionofDNA.Anal.Chem.,2012,84(18):7750-7755.[148]Ge,Z.,Lin,M.,Wang,P.,Pei,H.,Yan,J.,Shi,J.,Huang,Q.,He,D.,Fan,C.,Zuo,X.HybridizationchainreactionamplificationofmicroRNAdetectionwithatetrahedralDNAnanostructure-basedelectrochemicalbiosensor.Anal.Chem.,2014,86(4):2124-2130.[149]Xuan,F.,Fan,T.W.,Hsing,I.M.Electrochemicalinterrogationofkinetically-controlled58 参考文献dendriticDNA/PNAassemblyforimmobilization-freeandenzyme-freenucleicacidssensing.ACSNano,2015,9(5):5027-5033.[150]Huang,P.J.J.,Liu,J.Molecularbeaconlightingupongrapheneoxide.Anal.Chem.,2012,84(9):4192-4198.[151]Bao,G.,Rhee,W.J.,Tsourkas,A.Fluorescentprobesforlive-cellRNAdetection.Annu.Rev.Biomed.Eng.,2009,11:25-47.[152]Kai,K.,Yoshida,Y.,Kageyama,H.,Saito,G.,Ishigaki,T.,Furukawa,Y.,Kawamata,J.Room-temperaturesynthesisofmanganeseoxidemonosheets.J.Am.Chem.Soc.,2008,130(47):15938-15943.[153]He,D.,He,X.,Wang,K.,Yang,X.,Yang,X.,Li,X.,Zou,Z.Nanometer-sizedmanganeseoxide-quenchedfluorescentoligonucleotides:aneffectivesensingplatformforprobingbiomolecularinteractions.Chem.Commun.,2014,50(75):11049-11052.[154]Zhang,X.,Hu,W.,Li,J.,Tao,L.,Wei,Y.Acomparativestudyofcellularuptakeandcytotoxicityofmulti-walledcarbonnanotubes,grapheneoxide,andnanodiamond.Toxicol.Res.,2012,1(1):62-68.[155]Hu,W.,Peng,C.,Luo,W.,Lv,M.,Li,X.,Li,D.,Huang,Q.,Fan,C.Graphene-basedantibacterialpaper.ACSNano,2010,4(7):4317-4323.[156]Min,X.,Zhang,M.,Huang,F.,Lou,X.,Xia,F.LivecellmicroRNAimagingusingexonucleaseIII-aidedrecyclingamplificationbasedonaggregation-inducedemissionluminogens.ACSAppl.Mater.Interfaces,2016,8(14):8998-9003.[157]Esteban-FernándezdeÁvila,B.,Martín,A.,Soto,F.,Lopez-Ramirez,M.A.,Campuzano,S.,Vásquez-Machado,G.M.,Gao,W.,Zhang,L.,Wang,J.Singlecellreal-timemiRNAssensingbasedonnanomotors.ACSNano,2015,9(7):6756-6764.[158]Zhao,X.,Xu,L.,Sun,M.,Ma,W.,Wu,X.,Kuang,H.,Wang,L.,Xu,C.Gold-quantumdotcore-satelliteassembliesforlightingupmicroRNAinvitroandinvivo.Small,2016,12(34):4662-4668.59 西南大学硕士学位论文60 在学期间发表的文章在学期间发表的文章1.JingLi,DaxiuLi,RuoYuan,YunXiang,BiodegradableMnO2Nanosheet-MediatedSignalAmplificationinLivingCellsEnablesSensitiveDetectionofDown-RegulatedIntracellularMicroRNA.ACSAppliedMaterials&Interfaces.2017,9,5717-5724.(SCI,IF:7.504).2.JingLi,WenjiaoZhou,RuoYuan,YunXiang,Aptamerproximityrecognition-dependentstrandtranslocationforenzyme-freeandamplifiedfluorescentdetectionofthrombinviacatalytichairpinassembly.AnalyticChimicaActa.(Underreview)3.JingLi,WenjiaoZhou,RuoYuan,YunXiang,Alabel-freebiosensorassistedbyrollingcircleamplificationstrategyforsensitivedetectionofuracilDNAglycosylase.(Submitted)61 西南大学硕士学位论文62 致谢致谢时光飞逝，白驹过隙，转眼间，我在西大三年的硕士生涯即将落幕。三年来，无数个画面历历在目，博学多才的老师，互助友爱的同学，都给我留下了深刻的印象。在西大的求学经历不仅让我收获了知识、开拓了视野、磨练了意志、提升了能力，而且见证了我的成功与失败，欢笑与泪水，这必将成为我人生中一笔宝贵的财富。这一切都得益于我的师长及同学们，在此对那些曾经关心、帮助、激励过我的人表示由衷的感谢！首先，感谢我的导师向云教授，您严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。感谢袁若教授和柴雅琴教授，感谢您们提供了电分析化学实验室这个科研与成长的平台。在这里，我们是一个团结的整体，更是一个欢乐和谐的大家庭。感谢各位老师在硕士期间对我的帮助，使我顺利的完成学业，您们的教导我将铭记在心，永生难忘。再次，我要感谢弘光垒实验室所有师兄师姐师妹们，你们让我体会到了团结友爱互帮互助的同窗情谊，让我在温馨与愉快中度过了三年研究生生活。我相信，实验室中留下的汗水与泪水，欣慰与笑容，必将凝结成一幅幅温暖的画面并定格在我的心得深处，成为永不褪色的风景，感谢大家陪我走过的这段人生的美好旅程。最后，我还要感谢我的家人，你们是我坚强的后盾和精神上的支柱。感谢所有关心我和支持我的亲人和朋友，愿你们幸福！63