帕金森体外模型

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1、帕金森体外模型体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型实验操作:实验采用胚胎龄14一16天的大鼠,剖子宫取胎,取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起,置Fl2培养基(Gibco)至35mm的培养皿中,以细剪刀剪碎。将2ml含0.125%的胰酶的F12加入到组织中,该混合物于37oC孵育10分钟后,加入DNaseI(Sigma)至终浓度80ng/m1,继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞悬液以种植培养基稀释(种植培养基:MEM,补充以2mm谷氨酰胺,6mg/ml

2、葡萄糖,1mg/ml谷胱甘肽,10units/ml青霉素,10ul/ml链霉素和7.5%胎牛血清)。细胞然后种植于35mm的预先以10ug/m1po1y1ysine(Sigma)和2.5ug/mlmerosin(Chemicon)铺底的培养皿中,种植密度为50,000细胞/cm2。培养16小时后,培养基换为无血清培养基。该培养基为F12和basa1Eag1e’smedium,补充以33mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺,15mM碳酸氢钠,10mMHEPES(pH7.0),1ug/ml谷胱甘肽,20ug/ml胰岛素,100ug/m

3、l转铁蛋白,60uM腐胺,20nM孕酮,20nM亚硒酸钠(NaSe),30nM三碘甲状腺原氨酸,0.5unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素。毒物处理:于第4天以1uMMP+处理48小时。然后进行分析。模型评价:倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型采用上述方法选择胎鼠,分离中脑腹侧部,解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管,用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎,移入0.25%胰蛋白酶溶液中,37oC振荡消化30分钟,后加入血清数

4、滴终止消化,用吸管轻轻吹打后,加入不含血清的DMEM培养液混匀,1000rpm,10min离心收集细胞,反复2次,后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞,过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液,计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中,置37oC、5%CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时,置换旧培养液,以后每隔2天更换一次培养液。培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍,再加入完全DMEM培养液继续置5%CO2培养箱中

5、培养24小时,采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色,计数TH阳性细胞,确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。

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