转基因技术在大豆育种上的研究进展及发展趋势

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转基因技术在大豆育种上的研究进展及发展趋势摘要：近年来，转基因技术在大豆上的研究重点主要集中在建立高效再生体系和稳定地遗传转化体系方面，随着遗传转化技术的发展，我国已获得了抗病、抗虫转基因的大豆植株并取得突破性进展。本文就大豆遗传转化在受体系统(器官发生受体系统、体细胞胚胎发生受体系统、原生质体受体系统)以及转化方法(农杆菌介导法、基因枪法)等方面的研究进展情况进行了综述，并对今后大豆转基因研究方向进行了探讨。关键词：大豆；遗传转化；转基因；农杆菌；基因枪1大豆再生体系研究进展大豆的组织培养于20世纪60年代开始，一直到80年代分别建立了组织、细胞、原生质体水平的植株再生技术，为大豆的外源DNA导人提供了有效的受体系统。1．1大豆体细胞胚胎发生再生系统大豆体细胞胚胎发生本身繁殖快、单细胞起源、两极性等优点，是遗传转化的基础，不会出现嵌合体问题，而且体细胞胚团高密度高质量，遗传上稳定，可以一次获得大量植株；体细胞胚团可以在适宜的条件下保存，仍然具有再生能力，因此是基因枪和农杆菌转化的最适宜的受体系统。大豆体细胞胚胎发生再生系统采用的外植体主要为未成熟子叶、胚轴、完整幼胚。诱导培养基主要为Ms以及改良培养基，生长调节物质主要为2，4．D和NAA。80年代初期，Christianson等旧1以幼胚轴为外植体，诱导体细胞胚胎发生，首先获得再生植株。随后，Ranch等对2，4．D诱导的大豆未成熟胚的体细胞胚胎发生系统进行了较为详细的研究。Lazzeri等用10mg．L～2，4．D诱导了大豆幼胚子叶的体细胞胚胎发生。他们认为2，4一D诱导大豆体细胞胚胎发生虽然频率高，但形态不正常，难以萌发形成完整植株。NAA诱导的大豆体细胞胚胎发生虽然频率低，但是形态正常，可以不经过愈伤组织而直接生成子叶期体细胞胚。最后获得可育再生植株。 周思军等通过大豆幼胚培养，经过体细胞胚胎发生和组织培养获得再生植株，并对影响大豆体细胞胚胎发生的因素进行了系统研究。Finer等M1报道了一个体细胞胚胎发生的悬浮培养系统并认为该系统是基因枪和农杆菌转化的理想的靶组织，目前为大豆转化的最适宜的受体系统。周思军、王萍一、王罡等详细研究了固体培养的大豆体细胞胚胎发生与增殖的影响因子，认为基因型、低温预处理、激素、取材时间等因子影响再生率；曲桂芹等，王晓春等研究了影响大豆体细胞胚萌发与再生的因子，提出基因型和体细胞胚形态正常是提高再生率的主要因素。大豆体细胞胚胎发生为原生质体培养、人工种子(体细胞胚外面包上人工胚乳和人工种皮，就可以制备人工种子)制作、优良无性系的繁殖以及植物基因工程和突变体筛选提供良好的试验体系。但是此系统再生频率低，诱导出的体细胞胚畸形很多，不能发育成正常植株，而且体细胞胚多次继代增殖以后，胚性可能丧失以及体细胞变异等问题可能造成再生频率下降。因此有必要建立适合大豆体细胞胚基因转化的高效组织培养体系和遗传转化体系。1．2大豆器官发生再生系统Cheng等首次报道用无菌苗的子叶节为外植体，诱导丛生芽获得高频率的再生植株。Kartha等相继用无菌苗茎尖；Barwale等用未成熟胚子叶；Wright用上胚轴和初生叶；Hinchee等¨纠用成熟胚子叶；Mccabe等Ⅲo用幼胚轴；Kim等以下胚轴ll副相继通过器官发生获得再生植株。国内最先报道的是中国科学院植物所和黑龙江省农科院从大豆下胚轴诱导出再生幼苗。随后，1983年陈云召等从大豆下胚轴和小真叶离体培养成再生植株；1994年薛仁镐等¨引培养幼胚、幼胚子叶、成熟子叶节、成熟子叶等再次从大豆下胚轴和小真叶离体培养成再生植株。至今已经获得成功的器官发生再生系统的外植体有成熟胚子叶、无菌苗的子叶节和幼胚轴等再生系统。大豆器官发生再生系统外植体来源广泛，组织培养时间短，仅仅3个月就可以得到再生植株，但是此再生系统不经过愈伤组织的继代增殖，转化以后，即使在筛选浓度相对较高的培养基中筛选，部分非转化的不定芽仍然可以存活。所以筛选较难，而且得到的植株多为嵌合体，增大了鉴定、筛选传代和纯化的工作量。1．3原生质体再生系统Wei等心叫首次获得大豆原生质体再生植株。随后，罗希明等和Dhir等以相似的方法获得不同品种的大豆原生质体再生植株。张贤泽等眩副和肖文言等培养大豆原生质经胚胎发生获得再生植株。从理论上讲，原生质体再生系统是克服嵌合体问题的最有潜力的系统，但是此系统工作量大，操作复杂，再生不易成功。2大豆遗传转化研究进展 大豆的遗传转化方法主要有农杆菌介导、基因枪、电击、花粉管通道与注射、原位转化、PEG介导等，已经获得转抗虫基因植株。但是，大豆组织培养有一定的难度，是公认的难转化的作物，其主要原因是从转化的细胞或组织分化再生植株困难，尽管许多研究者致力于优化大豆的转化系统，但是大豆转化的频率仍然很低，受基因型限制，重复性很差。另外，大豆的再生系统尚不能与现有的植物转化方法很好的结合。2．1农杆菌介导法Hinchee等首次用农杆菌介导法以子叶为受体，经不定芽获得大豆转基因植株。Di等旧纠以卡那霉素为筛选剂将BPMV外壳蛋白基因导人大豆。Zhang等以Bar基因作选择标记基因，用除草剂草苷膦进行筛选获得转化植袜。1998年，Trick坤列发现在外植体接种于农杆菌后进行短暂的超声波处理，使外植体表面产生大量的细小通道，农杆菌易于渗入，从而促进转化。还有与该法类似的真空抽滤或粒子轰击与农杆菌介导相结合等方法，其效果尚无定论。此后，该方法在大豆转化中取得了相当的进展。如周思军等引用农杆菌介导法将觑基因导入大豆；吴颖等以大豆子叶节为材料，王萍等以大豆幼胚为材料，分别将双价抗虫基因和cpⅣ转人大豆获得双价抗虫转基因植株；2004年，尹青女等转化热激转录因子6基因转入大豆；2006年，李小平等旧纠转化大豆子叶节将受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi转人大豆获得转基因植株。2007年，党尉等卜纠利用根癌农杆菌对来自大豆成熟种子的胚尖进行遗传转化，将双价抗虫基因crylA(C)和pta整合到大豆的基因组中，获得了7个大豆品系的转基因植株，转化频率为4．29％～18％。在农杆菌介导大豆转化过程中，影响转化的因子许多如基因型、培养条件、农杆菌菌株类型、感受态、再生率等等。农杆菌介导法主要优点是操作方便，可以转移大于30bp的外源基因，而且外源基因整合的拷贝数二般比较低，并且完整，有利于外源基因的表达以及遗传。而其他方法(如基因枪法)容易引起多拷贝的整合和变异，从而影响外源基因的表达和遗传。农杆菌转化大豆的主要限制是寄主和组织特异性，即不同大豆品种对农杆菌敏感性不同，农杆菌可能对再生的组织如体细胞胚、芽分生组织的转化频率比较低，低敏感性和低效率可以通过添加乙酰丁香酮或高毒性农杆菌菌株部分加以克服，但是此系统转化频率低。2．2基因枪法 此方法是对农杆菌不敏感的物种和基因型转化的常规方法，也是研究瞬时表达的常规技术，Mccabe等首次用基因枪法转化大豆未成熟胚的生长点，获得大豆转基因植株。Finer等用携带Hpt和Gus基因的DNA包裹的钨粒轰击大豆的悬浮胚性细胞团，通过潮霉素筛选获得大量转基因植株。Stewart等旧刊用合成的Bt(CrylAC)基因，通过基因枪轰击悬浮培养的球形体细胞胚，经过潮霉素筛选获得3个转基因株系。1994年，Maughan等用基因枪轰击固体培养的胚性细胞团，并在固体培养基上筛选，将牛酪蛋白基因转入大豆，获大量可育转基因植株。2002年，王萍等用基因枪法将双价抗虫基因Bt和CpTI转入固体培养的大豆胚性细胞团，获得Gus的高效率的表达。2007年，王晓春等用基因枪法将晚基因转入大豆。基因枪法有许多优点，但是其价格昂贵，转化率低，转化过程中经常发生重排和高拷贝插入现象，容易导致外源基因的失活和后代遗传规律紊乱，后期筛选能够表达目的基因转基因植株比较困难。因此尽量缩短和避免组织培养过程也是所有植物遗传转化的方向。农杆菌介导和基因枪法以及其他转基因的方法必须经过组织培养过程，而且组织培养过程常常发生变异，既然大豆再生植株难，尽量避免和缩短组织培养过程也是所有植物遗传转化的方向。2．3原位转化法Chee等用农杆菌感染大豆发芽种子的腋芽区，获得植株中0．07％产生了转化的种子。Bechtold等创立了拟南芥侵染转化法，将组织在含5％蔗糖和0．05％表面活性剂的菌液中侵一下，可获得0．5％转化了的种子，目前已被用于大豆的遗传转化。2．4花粉管通道法雷勃钧等H¨提取野生大豆的总DNA，经花粉管导人大豆，获得变异的大豆。刘博林等H纠用子房微注射法将龙葵的Atrazine抗性基因导人大豆叶绿体中并得到表达。崔岩M纠利用花粉管通道法首次将几丁质酶基因转人大豆。刘德璞等Ⅲ1用大豆花粉管通道技术转化雪花莲凝集素(GNA)基因获得转基因植株。2．5电激和PEG／电激的基因转化方法大豆的电激和PEG／电激的基因转化方法的原理是有电激或PEG／电激的处理下细胞膜通透性的可逆性，使溶液中的大分子物质进入细胞，并改变细胞的物质构成。黄健秋等’4纠利用改良PEG介导法对大豆原生质体进行GUS基因转化，检测到了GUS基因的稳定表达。南相日等用PEG介导法将励毒蛋白基因导人大豆的原生质体，经潮霉素筛选，选择有抗生素的愈伤组织分化获得再生植株。另外，与其相关的电激和PEG法与脂质体法，由于效率低，可以转移的外源基因为6—8kb，所以在大豆的转化中不常用。 其它外源基因导入方法在大豆基因工程中尚未报道。3展望基因工程技术在大豆育种中尽管取得了很大成就，但是目前大豆的转化率低，分析原因可能有以下几点：(1)外植体细胞表达外源选择抗性基因，从而为其他非转化细胞提供了一道屏障，逃避了选择压力的影响而继续分裂分化；(2)选择压力加的太迟或太少，致使非转化细胞分裂分化。(3)由于目的基因片段较大，在转化过程中发生断裂致使转化率低。(4)转化细胞的存活率可能较低。(5)在长时间的转化和筛选培养过程中，大豆对抗生素产生抗性以及实验的污染等问题使转化率下降。(6)外植体的感受状态及其分化能力可能下降致使转化率较低。因此仍然需要对转化的受体体系及转化体系进行深入研究。目前，大豆的组织培养体系主要是器官发生即子叶节为外植体的再生和体细胞胚胎发生，前者再生率高，但是用于遗传转化嵌合体较多，增大了鉴定、筛选传代和纯化的工作量。后者再生频率低，诱导出的体细胞胚畸形很多，不能发育成正常植株，而且体细胞胚多次继代增殖以后，胚性可能丧失以及体细胞变异等问题可能造成再生频率下降。两个体系均存在大豆基因型对组织培养的特异性。因此在今后应深入探讨大豆组织培养的条件，筛选适合多种基因型的培养基配方，减少大豆基因型对组织培养的特异性。在大豆的遗传转化方面，主要问题是转化率低，重复性差，因此需要更进一步研究影响大豆转化的因素。从转入的目的基因来看，主要是抗虫基因、除草剂基因、几丁质酶基因等单个基因。在转人抗虫基因方面，抗虫范围已经越来越成为科学家感兴趣的研究领域。由于害虫对单个抗虫基因容易产生抗性，因此，同时将两种或两种以上具有不同抗虫机制的基因导入同一植物，试图通过不同基因之间的互补作用扩展抗虫谱和提高抗虫能力，从而达到有效和持久抗虫的目的。近年来，转双基因和多基因以增加作物抗性的报道越来越多，利用多种抗性基因和多种抗性机制可以增加作物抗性的有效性和持久性，例如对蛋白酶抑制剂基因、外凝集素基因等，尤其是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的研究。人们利用位毒蛋白基因与蛋白酶抑制剂基因的抗虫特性，开始尝试将胁毒蛋白基因与CpTI基因同时转人植物，以获得抗虫能力更强的转基因植物，减少害虫对单一盈毒蛋白基因植物产生抗性的潜在威胁。如转Bt和CpTI双价抗虫基因已经在大豆、烟草、棉花等作物上获得了成功，为将双价抗虫基因转入农作物奠定了基础。由于昆虫对两种独立杀虫剂产生耐受型几率很小，因此使用双价抗虫基因可能是解决这一问题的重要途径。 以上是大豆生物工程近年来的研究进展，有的尚处于起步阶段，有的获得了突破性进展，有的已经进入大田试验。勿容置疑，生物工程技术即将在大豆育种改良中大显身手。参考文献[1]张洁,张东旭,商蕾等.转基因技术在大豆育种上的应用与研究[J].华北农学报,2008,23(z2)_6.[2]王晓春,刘尚前,罗永华等.大豆再生体系和遗传转化研究进展[J].大豆科学,2009,28(4)_6.[3]王振华,杨德光,张辉等.大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用[J].生物技术通报,2010,(10).[4]王芳,朱洪德,李伟等.转基因技术在大豆育种中的应用[J].黑龙江农业科学,2007,(1)_3.[5]韩阳,王昌凌,赖冰冰等.转基因技术在大豆抗病毒育种中的应用研究进展[J].江苏农业科学,2010,(1)_3.[6]叶展辉.大豆PM2蛋白（LEA3）中11氨基酸重复序列区的功能及结构研究[D].2006.[7]马立晖,胡秀臣.转基因技术在大豆抗病虫害育种上的应用[J].内蒙古农业科技,2004,(z1)_2.[8]练云,梁慧珍,王树峰等.农杆菌介导大豆遗传转化研究进展及转基因作物现状[J].大豆科学,2009,28(3)_6.[9]赵桂兰.大豆生物技术研究进展及发展趋势[A].吉林省第三届科学技术学术年会论文集[C].2004.[10]SantosFerrari,C.dos,LehmkuhlValente,L.,AngonesiBrod,F.C.etal.EvaluationofpolymerasechainreactionandDNAisolationprotocolsfordetectionofgeneticallymodifiedsoybean.[J].Internationaljournaloffoodscience&technology,2007,42(10)_7.