血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)人工重建的研究

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1、+中图分类号：R331.38硕士学位论文血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）人工重建的研究院（系）、所研究生姓名学科、专业导师姓名二Ο一三年四月目录1血管平滑肌大电导钙激活钾通道人工重建的研究………………………………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………111.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………81.4材料与方法……………………………………………………111.5结果……………………………………………………………231.6讨论………………………………

2、……………………………331.7结论……………………………………………………………401.8参考文献………………………………………………………411.9英汉缩略词对照表……………………………………………452致谢……………………………………………………………473平面双分子层脂质膜技术及其应用进展（综述）……………………………………………………………48血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）人工重建的研究摘要目的：血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMCs）上的大电导钙激活钾通道（largeconductancecalcium-a

3、ctivatedpotassiumchannels,BKCa）的活动直接参与了血管平滑肌的舒张调节，在血压维持中起重要作用。在天然细胞上有关BKCa通道的动力学特性、通道调控点、药物作用靶点等的研究存在一定的局限性，但是将BKCa通道蛋白重建到平面双分子层脂质膜（Panarlipidbilayers,PLBMs）上则可更好地进行以上研究。本实验旨在摸索建立稳定的平面双分子层脂质膜制备方法，并摸索将克隆的血管平滑肌细胞BKCa通道蛋白融合其上进行单通道电流研究。本项目通过联合单通道膜片钳技术，考马斯亮蓝染色和免疫印迹法（Westernblot）等方法证实所建立的人工BKC

4、a通道重建技术的可行性，为下一步研究BKCa通道调控点和药物作用靶点提供技术支持。方法：（1）PLBMs实验：将不同浓度的卵磷脂或不同比例的卵磷脂与胆固醇混合液作为成膜液，采用涂抹法制备PLBMs；实验中控制膜脂质的成分和周围电解质环境，寻找最佳成膜条件；将含有两性霉素B的脂质体或α-toxin加入膜的一侧溶液内,使其与PLBMs融合并形成孔道，观察孔道形成过程中脂质膜的稳定性；（2）重建到PLBMs上的BKCa的单通道实验：将BKCa通道蛋白重建到PLBMs上进行单通道电流记录，通道信号经BC-535放大器放大，1KHz滤波，Clampex10.2软件采集，并经Cla

5、mpfit10.1软件分析。（3）转染有BKCaα国家自然基金资助项目（No:81173661）四川高等学校科技创新重大培育项目（No:川教函[2010]597号文件）1亚基的人胚肾（humanembryonickidney，HEK293）细胞上的BKCa单通道膜片钳实验：该实验作为重建到脂质膜上的BKCa的对照实验。选取立体感强、状态好并转染有BKCaα亚基的HEK293细胞进行实验，在对称性高钾溶液中，采用内面向外模式（inside-outpatch）记录BKCa的单通道电流。单通道电流信号经CEZ-2200膜片钳放大器放大，1KHz滤波后输入计算机，经pClam

6、p10.0软件采集记录，并用Clampfit10.1软件进行数据分析。（4）考马斯亮蓝染色和Westernblot检测制备的BKCa脂质体的纯度：收集低渗裂解的转染有BKCaα亚基的HEK293细胞碎片，经20%-38%蔗糖/MOPS密度梯度离心得BKCa脂蛋白体，将BKCa脂蛋白体变性处理后加样，选择合适的电压进行SDS-PAGE电泳和转印。用BKCaα兔抗人多克隆抗体（1：500）孵育，洗膜后加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1：10,000）孵育。GEL-Doc凝胶成像系统采集图像，QuantityOne软件分析结果。结果：（1）涂抹法制备PLBMs实验：采用不同

7、浓度卵磷脂（phosphatidylcholine,PC）制备的PLBMs可稳定3.5h，而用不同比例的卵磷脂（PC）和胆固醇（Cholesteryl,CH）制备的PLBMs可稳定2.5h。两性霉素B及α-toxin形成孔道过程中，脂质膜很稳定。（2）重建到平面双分子层脂质膜上的BKCa的单通道基本特性：①重建的BKCa通道电导值大，为206.8±16.86pS（n=4）。②通道具有明显的电压依赖性，在-60mV~+60mV的测试电压下，随着细胞膜电位去极化程度的增加，BKCa通道的电流幅度（Amplitude,Amp）及通道的开放概率（