基因工程实验指导-专业实验I

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1、工程实验指导书缩略词表缩写英文名称中文名称AmpAmpicillin氨茉青孫素6-BA6-Benzylaminopurine6■节氨基嚟吟bpBasepair碱基对CbCarbenicillin竣节青霉素CcfCephamycin头抱霉索CTABHexadecyl-trimethyl-ammoniumbromide十六烷基三乙基浪化较dNTPDeoxyribonucleiosidetriphosphate脱氧核糖核廿三磷酸EBEthidiumbromide漠化乙锭EDTAEthylenediamemnettraaceticacid乙一钱四乙酸IPTGIso

2、propyl-p-D-1-Thiogalactopyranoside界丙基■卩・D・硫代半乳糖莒KanKanamycin卡那霉素NAAa-naphthaleneaceticacid*荼乙酸NOSNopalinesynthase胭脂碱合成酶NPTIINeomycinphosphotransferaseII新寄素磷酸转移酶ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingfi-ame开放读码框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PVPPolyvinylpyrolidonc聚乙烯毗咯烷酮RifRifampicin利福

3、平SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠StrStreptomycin链霉素TrisTrishydroxymethylaminomethane三疑甲基氨基甲烷实验一植物总DNA的抽提及电泳检测一【实验目的】1、了解植物DNA抽捉的主要方法；2、掌握快速抽提DNA的方法。3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法；4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶屮泳动速率的因素；5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。二【实验原理】该方法简便、快速,DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分了生物学操作)°CTAB(十六烷基三乙基澳化鞍)是一种非离子去污

4、剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放击来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度(0.1-0.5mMNaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70-75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋片质、多糖、色索等來纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细

5、胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA,进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态卜•选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗■离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况匚单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的

6、迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。浪化乙锭（EB）是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光，DNA分子与EB形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用來观察凝胶中DNA条带的位置。三【试剂】试剂盒（BufferPkBufferP2.BufferP3>RNaseA.漂洗液WB、洗脱缓冲液EB、吸附柱AC、分离柱A、收集管）、、70%

7、乙醇、无水乙醇、B•筑基乙醇、浪化乙锭（EB）；TE缓冲液（含lOmmol/LTris和lmmol/LEDTA,pH&0,高压灭菌）；琼脂糖凝胶（0.7〜1.5%,琼脂糖粉末与lxTAE配成）；TAE（Tris-乙酸盐，EDTA）电泳缓冲液（50x浓缩贮存液）：Tris碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL；加600mL蒸惚水，剧烈搅拌，加蒸饴水至1000mL,浓盐酸调pH至8.0。10x加样缓冲液：0.25%漠酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0、1

8、.0%SDS。四【仪器设备及材料】1、仪器设备离心机、水浴锅、液氮