实验指导书-基因工程

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1、生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二00七年八月-LX.—1—刖吞该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的皐因的分离、克隆，载体的构建等方而的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。通过木课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。实验设置内容包抓目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验）,农杆菌

2、介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。本课程的目的是培养高年级木科生及研究生进行棊因操作的能力。教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。本书可作为高等院校生物技术、牛物科学等牛命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定104、实验报告基本内容要求12

3、5、实验报告格式13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运丿IJPCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程和关研究奠定基础。二、实验内容1、廿的基因的PCR扩增2、DNA片断的体外连接及转化3、连接产物的酶切鉴定4、DNA琼脂糖凝胶电泳三、实验原理、方法和手

4、段(一)目的基因的PCR扩增以植物基因组为模板，利川特定的引物，进行PCR扩增。可扩增出目的基因片断，并在片断末端加碱基“A”。PCR实验原理：双链DNA在多种酶的作用下nJ以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后乂可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入耐热DNA聚合同酶-Taq酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性(90°C

5、-96°C)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2.退火(25°C-65°C)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3•延伸(70°C-75°C)：在Taq酶(在72°C左右最佳的活性)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5,端-3,端延仲，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DVA含量既增加一倍。PCR结杲可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。附，引物设计原则①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段

6、。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嚟吟或喘唳核廿酸的成串排列。①避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产牛非特异的扩增条带。②引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱棊，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。③引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这対酶切分析或分子克隆很有好处。④引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显

7、同源性。引物量：每条引物的浓度0.1〜lumol或10〜lOOpmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏髙会引起错配和非特异性扩增，II可增加引物之间形成二聚体的机会。（二）DNA片断的体外连接及转化实验原理：T4噬菌体DNA连接卿可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体Z间形成新的歹，5磷酸二酯键。实验所用载体为TakaRa公司T载体pMD18-TSimpleVector,PCR胶冋收产物游离T末端与载体的游离A末端町互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌

8、体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCI2法），其原理是细菌处于0°C,CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的泾基•钙磷酸复合物粘附于细胞表血，经42°C短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富