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1、《基因工程》课程实验指导书生物技术专业黄淑坚黄良宗编写佛山科学技术学院2005年12月34目录前言Ⅱ实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）1实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接7实验三重组DNA的转化10实验四重组DNA的鉴定13实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达16实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE18附录22参考文献3434前言基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导
2、书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。编者2005年12月34实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）一、目的和要求了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR反应的基本技术。二、实验内容RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。三、仪器、设备和实
3、验准备1、仪器恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。2、试剂反转录酶、RNA酶抑制剂（RNaseInhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。3、实验准备用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。四、实验原理RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用
4、反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。34（一）PCR反应中的主要成份： 1.引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物
5、所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引
6、物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：Xmol/L＝
7、OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。 2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应
