基因工程实验指导书

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1、基因工程实验指导书THEEXPERIMENTALGUIDEFORGENEENGINEERING马月萍崔振波编写东北大学理学院生物技术研究所二零零六年一月实验须知上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须予以足够的重视。为此，必须做到：一、实验前预习实验指导书并复习有关内容二、按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验报告，字迹要整洁、清楚。三、爱护实验

2、仪器、设备，注意节约药品和各种实验材料，按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器附件，如有损坏，照价赔偿。四、注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时报告指导教师。五、保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流打扫卫生。目录实验一质粒DNA的小量提取与纯化-1-实验二限制性内切酶消化质粒DNA-5-实验三感受态细胞的制备-7-实验四聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA-11-实验五大分子DNA的制备-15-实验六Southern杂交-19-实验七R

3、NA的制备及Northern杂交分析-25-参考文献-32--1-参考文献实验一质粒DNA的小量提取与纯化一实验目的1．学习质粒DNA的制备原理。2．掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。3．掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。二实验原理质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA编码的蛋白

4、质往往赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。质粒DNA的制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。一般它们包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。1．细菌的生长和质粒的扩增从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养，对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地

5、扩增质粒DNA，但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。2．细菌的收集、裂解和质粒DNA提取细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒DNA提取的基本原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）

6、大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。-32-参考文献（3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋白质一起沉淀下来，环状质粒DNA存在于上清液中。3．质粒DNA的纯化纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，绿化铯-溴化乙锭剃度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的

7、首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有

8、不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。三实验器材、试剂及材料1．实验器材超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电泳仪、电泳槽、小型混合器、冰箱、试管、1.5ml离心管2．实验试剂（1）LB培养基1L蛋白胨10g酵母浸膏5gNaCl10g固体加15gAgar,定容至1L后，高压灭菌20分钟（2）