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1、基因工程实验注意事项1.上实验课不能迟到。2.一处要提前预习实验内容，弄懂实验原理，理淸实验顺序。根据实验内容和步骤制定一个详细的试验计划（没有计划或计划不合理者不能进入实验操作）O3.实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一-种相关的实验操作技术。各小组学生需要根据整体的实验策略制定白己的实验顺序和计划。4.由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。5.本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等严格的作息安排，一切服从实验进度，但必须在10天之内完成。6.实验的
2、每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！7.对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程屮发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。8.写作实验报告一定要文字整洁，观察记录详细（包括操作的错谋），分析现象透彻。9.在实验室内不能大声喧哗。10.在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在口己的桌面一角），严禁随地投弃！11.实验结束厉要把用过的器皿清洗厉归放整齐并清点数日，向教师汇报征得同意厉方可离开实验实O12.值/组用同学最后离开，筹待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。13.实验时损坏
3、的任何物品都要按规处赔偿。实验流程参考图入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快速,而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋H质和人分子RNA—起沉淀卜去。3.器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混介器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面离心管架，试管架，标签纸等，磁力搅拌机。4.试剂pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载休菌，LB培养基1000ml(含100ug/ml氨茉青霉素)，衙萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液(solutionI),NaOH/SDS
4、溶液(solutionII),KAc溶液(pH4.8)(solutionIII),RNaseA,95%乙醇,70%乙醇,TEbuffer(pH&O)。5.实验准备氨节青霉素储存液(无菌水配制5mg/ml,分装后-20°C保存)，配制LB培养基(唳化蛋白陈10g,酵母提取物5g,NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200pL5NNaOH调pH至7.0,加ddwater至IL,121°C20min灭菌);溶液I(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTrisHC1pH&0,lOmmol/LEDTApH8.0)；溶液II(0.2m
5、ol/LNaOH,1%SDS)：溶液III(60mL5mol/LKac,加冰乙酸调pH4.8,补ddwater至100ml),70%乙醇(-20°C保存)，TEbuffer(lOmmol/LTrisHC1pH8.0,lmmol/LEDTApH8.0)；lOmg/mLRNaseA(RNA酶溶于lOmmoI/LTrisHC1pH7.5,15mmol/LNaCl+);摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌(121°C30min)o6.操作步骤(1)在超净工作台中取5mlLB(Amp+),加入灭菌的
6、摇菌管中。(2)从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种(操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！)，在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LE培养液(含100ug/ml氨节青霉素)中搅拌一下，37°C摇床中摇20h。pET-his菌：接种于5mlLB(Amp+)pMD18-T
7、W：接种于2mlLB(Amp*)(3)取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心lmin,弃上请液(尽量弃］：净)，留沉淀备用。pET-his
8、M
9、"：3管(3X1.5ml)pMD18-T菌：1管
10、(1.5ml)(4)在沉淀中加入100川溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5mino(等待的同时，取一个須料盒，装上适量的冰块备用。)(5)加入200卩1溶液II,盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。(6)加入150pl溶液III,盖上盖后上下颠倒儿次混匀，插入冰中，放置5min。(7)15000ipm离心5min,小心吸取400卩1上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，(不要将白色沉淀物带入！)，加入800卩195%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。(8)15000rpm离心10min,小心
11、弃掉上清液,加入500^170%乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min,小心弃掉上清液，尽量
