生化实验五大技术

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1、生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t、定性分析的技术。2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK为吸光率，L为溶液厚度(em),c为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm的吸光度。 c=A/ε3.定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2)对比法元-KCLCx (3)计算法:  e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5)多组分

2、湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分 光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。2.基本原理:球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移

3、率加速溶液的PH值:溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5.电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或

4、其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(2)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分

5、子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。适合研究蛋白质的数观不均性⑸毛细管电泳①高灵敏度②高分游率③高效快速④样品少⑤成本低------------符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的分离条件三层析技术固定相:固体物质或者是固定于固体物质上的成分;流动相:可以流动的物质，如水和各种溶媒1.原

6、理:当待分离的混合物队流动相通过固定相时。由于各组份的理化性质有在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解。结合等)的能力不同。在两相中的分配(含量对比)不同，面口随流动相向镇移动。各组份不断地在两相中进行再分配与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。2.技术分类①按层析原理分类，名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂结合力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因此在凝胶上受

7、阻滞得程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和其无亲和力的其他组份分离②按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达到分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质分离3.层析法的特点与应用①根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量:②析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图