鳗弧菌研究概况【文献综述】

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毕业论文文献综述生物技术鳗弧菌研究概况摘要：鳗弧菌(Vabrioanguallanim)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。本文从鳗弧菌的分类地位、生物学特性、致病性研究等方面对该菌的性状进行了系统的分析；并讨论了目前一些检测鳗弧菌方法，以及对发展和现状情况进行了简单的介绍。从而为对鳗弧菌进行更深入研究提供一些依据。关键词：鳗弧菌；分类地位；致病机理；感染；防治鳗弧菌（Vabrioanguallanim）是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，其流行区域广泛，能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病，常给水产养殖业造成巨大的经济损失[1]。它还可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病[2]。因此对该病原进行深入的研究，寻找防止和减少该病爆发的方法，对于为人类提供高质量的水产品具有重要的意义。同时，使人们广泛重视对于鳗弧菌的研究。为了全面了解鳗弧菌并有效地检验该菌及预防与控制相应的感染，现对该菌做如下简要介绍。一、鳗弧菌的分类地位和主要生物学特征1.1鳗弧菌的分类地位鳗弧菌隶属于弧菌科（vibrionaceae）弧菌属（Vibrio）[3]，是引起多种海水鱼类出血性败血症的病原菌[4]，是一种可导致多种海洋鱼类弧菌病（Vibriosis）的高致病性病原体[5,6]。它是水环境的正常菌群，在夏天数量最多，在冬天最少，在海水微生态环境中该菌存活期超过50个月。1.2鳗弧菌的主要特征鳗弧菌为有鞭毛的革兰氏阴性细菌，无荚膜，不形成芽孢，能运动，氧化酶阳性，对O/129敏感。葡萄糖氧化反应呈阳性，具有典型的弧菌属细菌特征[7]。莫照兰等报道的导致牙鲆出血症的鳗弧菌呈短杆状，有1根很长的极生单鞭毛，可运动；在2216E培养基上培养24h的菌落呈圆形、半透明，直径约1.5mm；在TCBS培养基上培养24h的菌落呈黄色，直径约3mm，菌体大小为（0.8～1.0）×（1.5～1.7）μm[8]。1.3鳗弧菌的生化特性鳗弧菌能产氧化酶和过氧化氢酶，发酵葡萄糖。菌株能在4～35℃范围内生长，适宜温度是13～37℃；在含3%～6%的NaCl的培养基上能生长，但在无盐的培养集上生长不良；能利用柠檬酸盐。V-P反应呈阳性，能产生吲哚，不产硫化氢；能发酵蔗糖、肌醇、山梨醇产气，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇（CW3除外）、D-半乳糖、果糖、甘露糖为唯一碳源[8]。二、鳗弧菌致病性的研究2.1致病性与症状5 鳗弧菌是危害鱼类的主要的条件性病原菌之一，能引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等[9]。鳗弧菌是条件致病菌：当水温较高、营养较丰富时数量急剧增加。因此在夏季，特别是养殖密度、盐度和有机物含量较高的条件下，水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。鳗弧菌的感染会引起全身性的组织病变。不同的鱼感染鳗弧菌后会有不同的症状，但主要症状是体表出血，症状逐步加深的。有研究学者报道，部分感染鳗弧菌的鱼体表最初出现局部褪色，鳍条、鳍基部及鳃骨下部充血发红，肛门红肿，继而肌肉组织有弥撒性或点状出血，体表发黑，鳍部出现溃烂；解剖检验时有明显的黄色粘稠腹水，肠粘膜组织腐烂脱落，部分鱼肝脏坏死[10]。感染鳗弧菌的养殖牙鲆最明显的症状是鳍部严重出血以及体表溃烂感染了鳗弧菌的大菱鲆，出现全身性的出血性败血症，鳍基部出血，眼球突出，角膜混浊，肝脏苍白，有时伴有腹水症状[11]。2.1致病因素鳗弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等系列过程，而这些过程又与细菌产生的各种致病因子有关。目前已经发现的致病因子有外毒素、粘附因子、侵袭因子、细胞表面成分、铁吸收系统等。2.2.1外毒素(exotoxin)目前研究的外毒素主要有两种，溶血素(hemolysin)和重复序列毒素(repeatintoxin，RTX)。已经被发现鳗弧菌胞外产物中的溶血素具有溶血活性。溶血素为单一的多肽分子，具有溶血性细胞毒性，使动物致死性。据报道：鳗弧菌的溶血素毒性可能与被注射鱼的贫血症状有关，这些溶血素被认为是一种热不稳定酶，50℃加热10min可灭活，最适pH7.2～7.4，可以被神经节昔脂失活。[12]鳗弧菌的溶血素，可使鳗鲡致死，其溶解红细胞的活性依赖温度，低于10℃时溶解活性下降，最适作用温度20～22℃，红细胞溶解后释放的血红蛋白为细菌提供营养需要。RTX毒素是部分革兰氏阴性菌产生的重要毒力因子，属于I型分泌系统的孔形成毒素家族，该家族还包括溶胞素、金属蛋白酶和脂肪酶，都有共同的基因组分和显著不同于其它的结构[13]。RTX毒素的结构组成通常是在蛋白的C末端附近富含重复序列LIFGGXGNDDX[14]。RTX毒素在多种病原菌中都有论述,如霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌和大肠杆菌O157:H7[14、15、16]，Rodkhum（2006）首次报道了鳗弧菌的RTX毒素基因(rtxA)、RTX毒素转运基因(rtxB)、RTX毒素激活蛋白基因(rtxC)和RTX毒素转运基因(rtxD)[17]。2.2.2粘附因子（adherenceclonizationfactor）鳗弧菌主要是在皮肤和消化道经粘附感染的。在该阶段，细菌鞭毛（flagellum）及菌毛(pilus)有重要的作用。鳗弧菌的鞭毛是感染鱼类的毒力细胞器,Milton等认为由鳗弧菌flaA基因编码的40ku的鞭毛蛋白是细菌毒力所必需，而且flaA还和另外3个分子量为41ku、42ku和45ku的鞭毛蛋白有关[18]。实验证明：flaA必须越过鱼类体表这一屏障,在对宿主的侵袭中起重要作用[18]。而另外3个分子量鞭毛蛋白与鳗弧菌的毒力有关[13]。5 鳗弧菌的菌毛毒力机制的影响目前还尚不清楚。Rodkhum鉴别出鳗弧菌与霍乱弧菌和创伤弧菌具有很高相似性的菌毛基因：IV型菌毛亚单位生物合成蛋白基因(pilC)、IV型菌毛装配蛋白基因(pilB)和IV型菌毛装配蛋白(pilQ)[17]。2.2.3侵袭因子（invasionfactor）Norqvist分离到一个有侵袭缺陷的鳗弧菌突变株，并从胞外产物中分离鉴别了一个与侵袭力有关的锌金属蛋白酶（empA），分子量为36kD，它需要Zn2+的激活，稳定性与Ca2+有关[19]。遗传研究资料表明锌金属蛋白酶与鳗弧菌NB10的侵袭机制有关，是鳗弧菌感染过程中很重要的毒力因子，它的表达需要σs、群体感应分子和鱼类胃肠粘液的存在[20]。2.2.4细胞表面成分（cellsurfacecomponents）主要表面抗原在鱼类感染过程中被表达,鞭毛鞘结构在侵袭的最初阶段是不起作用的,而是在鱼类爆发性系统感染时起协同作用[21]。研究发现鳗弧菌表面抗原脂多糖与血细胞凝集活性有关，在细菌的粘附过程中发挥作用。脂多糖是革兰氏阴性细菌的外膜主要组份，O-特异性多糖链具有亲水性，带负电荷，可保护细菌抵抗吞噬细胞的吞噬作用，O-抗原的多样化，使细菌免遭机体内已存在的抗体和消化酶的作用，对细菌本身有保护作用。脂多糖也是细菌主要的致病因子。脂多糖的类脂A可引起宿主产生非特异性的病理生理反应（内毒素反应）。Montero和Austin等的研究表明脂多糖是哈维氏弧菌E2对对虾的致死性毒素的组成部分[22]。2.2.5铁吸收系统（ironuptakesystem）铁摄取能力是病原菌在宿主体内生存能力的一个重要方面。鳗弧菌存在一条特殊的铁摄取途径通过质粒编码的的铁摄取系统进行。质粒编码的铁离子吸收系统由铁载体anguibactin和特殊的铁离子转运蛋白组成。含有毒力质粒的鳗弧菌能够利用氯高铁血红素和血红蛋白作为自身新陈代谢的离子源[23],从载铁蛋白螯合物的周质中形成铁anguibactin复合物从而摄取铁离子。质粒编码的铁吸收系统在缺铁的环境中能得到高效表达，而铁调节基因的表达与调控非常复杂，它涉及到细菌细胞的信号转导、转录控制及转录后调节等过程。铁转运系统在铁离子有限的条件下被最大量的表达,AngR蛋白和TAF区域产物协同正向调节这一系统的表达;在二价铁离子存在条件下,Fur蛋白和反义RNA(RNA)介导铁离子转运基因的反向调节,高浓度的铁本身也会关闭这一系统许多基因的表达,这个过程与Fur蛋白一起行使抑制功能[23]。2.1鳗弧菌的验证方法　目前,鳗弧菌的检测方法报道有很多，免疫学检测如间接荧光抗体技术[24]、核酸杂交[25,26]及PCR检测[27]等，它们的灵敏度一般可达到每克鱼组织106个细菌，核酸杂交灵敏度可以达到150pg，但是免疫检测需要制备抗血清。近年来,不少学者以毒力基因设计引物进行PCR检测，Rodkhum针对鳗弧菌的五个溶血素基因设计引物进行多重PCR检测，这种方法不仅成功的在含有100fg染色体模板DNA中检测出溶血素基因，甚至能直接检测出仅含有10个鳗弧菌的临床样品。一、鳗弧菌的防治5 在预防方面，在保持良好环境和优良饵料的基础上，可以根据具体情况对一些养殖种类进行接种疫苗或免疫增强剂，这是防治水产养殖动物疾病的安全有效的方法。虹鳟注射生长激素（GH）、左旋咪唑、壳多糖或口服转铁蛋白等都能增强对鳗弧菌的抵抗力。大西洋鲑腹腔注射酵母葡聚糖后，对鳗弧菌、杀鲑弧菌的抵抗力增强。据报道，使用壳多糖、肽聚糖、生长激素、转铁蛋白等免疫增强剂可以提高虹鳟的非特异性免疫功能，从而提高鱼体对鳗弧菌的抵抗能力；使用酵母葡聚糖可以明显提高大西洋鲑抗鳗弧菌的能力[28]。在治疗方面，由于使用方便、见效快和疗效好等优点，在相当长的时间内，使用抗生素仍是控制水产动物疾病的主要手段。张昕等测定了4种海洋致病弧菌对8种常用抗生素药物的敏感性，结果表明鳗弧菌对庆大霉素敏感[28]。一、展望目前对此种菌的诊断主要通过临诊病理观察及细菌学鉴定，防治方面也仅限于利用抗生素或减活、灭活疫苗[29]。在国内，海水鱼类的养殖过程中，频繁使用抗生素使致病菌产生耐药性，耐药质粒在细菌之间的水平传播给鱼病防治工作带来了新的挑战。近年来，随着分子生物学技术的发展，许多研究毒力基因的缺失和突变对菌株致病力的影响结果发现很多毒力基因和鳗弧菌的致病性直接相关。因此可以根据其基因的特性研制其防治方法。不过，到现在为止，还没有彻底阐明鳗弧菌的致病机理，所以对于毒力基因功能的研究还应该继续开展，在此基础上，制备具有强大检测功能的基因芯片，快速高通量的检测会缩短诊断时间，加快研制口服和浸浴疫苗也是一种极具生产应用价值的防治途径。参考文献：[1]EgidiusE.Vibriosis,pathogenicityandpathology,arenew[J].Aquaculture,1987,67:15~18.[2]ToranzoAB,SantosY,BarjaJI.Immunizationwithbacterialantigens:vibrioinfections[J].DevBiolStand,1997,90:93~105.[3]布坎南RE，吉本斯NE．中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》编译组译．伯杰细菌鉴定手册[M]．(第八版)．北京：科学出版社,1984．Pp．475~481．[4]MiltonDL,NorqvistA,Wolf-watzH.JournalofBacteriology[M],1992,174(22):7235~7244.[5]BoesenHT,PedersenK,LarsenJL,etal.BoesenHT,PedersenK,LarsenJL,etal.InfectImmun[J].InfectImmun,1999,67:294~301.[6]KusudaR,KawaiK.GyobyoKenkyu[M],1998,33:221.[7]孟思妤，孟长明，陈昌福．鳗弧菌（Vibrioanguillarum）的病原生物学研究现状（上）[J]．渔业致富指南，FisheryGuidetobeRich，2010，（01）63~64．[8]莫照兰，茅云翔，陈师勇，张培军.一株牙鲆皮肤溃烂症病原菌的鉴定[J]．微生物学报，2002，（03）．[9]高冬梅，李健，王群．鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究[J]．海洋水产研究，2004，25（1）：486~492．[10]肖慧，李军，徐怀恕等．鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原的研究[J]．青岛海洋大学报，1999，29（1）：89．5 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