DB22∕T 2788-2017 猫泛白细胞减少症诊断 实时荧光PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：59152-2018DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2788—2017猫泛白细胞减少症诊断实时荧光PCR法ThediagnosticofFelinepanleukopeniavirusReal-timePCRmethod本标准仅供内部使用不得翻印2017-12-11发布2018-04-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2788—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015

2、给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林农业大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：程荣华、呼延含蓉、王开、郭衍冰、王楠、丁世杰、邵洪泽、于钦磊、白翠、李昱洁、陆伟、何浩、刘沂霖、赵欣、肖玉海、王辉。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2788—2017本标准仅供内部使用不得翻印猫泛白细胞减少症诊断实时荧光PCR法1范围本标准规定了猫泛白细胞减少症实时荧光PCR方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于猫泛白细胞减少

3、症的实验室诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应（Polymerase本标准仅供内部使用不得翻印ChainReaction）Ct：循环阈值（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）4材料4.1仪器设备4.1.1分析天平，感量0.1mg。4.1.2高速冷冻离心机，1

4、2000r/min以上。4.1.3荧光定量PCR扩增仪。4.1.4冰箱，2℃～8℃和-20℃两种。4.1.5可调移液器，最大量程为10μL，200μL，1000μL。4.1.6恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。4.1.7高压蒸汽灭菌器。4.1.8干热箱。4.2器械与耗材4.2.1组织匀浆器或研钵。4.2.2医用剪刀。4.2.3医用镊子。4.2.41.5mL离心管。4.2.515mL离心管。4.2.650mL离心管。1DB22/T2788—20174.2.71000mL量筒。4.2.81000mL容量瓶。4.2.9PCR八联排管。本标准仅供内部使用不

5、得翻印4.2.10吸头，10μL，200μL，1000μL。4.2.11医用棉签。4.3试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。4.3.10.02mmol/LPBS，见附录A。4.3.2基因组DNA提取试剂盒。4.3.3SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）。4.3.4灭菌双蒸水。4.4引物上游引物F：5'-AATGCTTGGGGAGTTTGGTTT-3'。下游引物R：5'-TTTAGTTGGTGGCTGAGTAGCAGA-3'。5操作步骤5.1采样器具前处理本标准仅

6、供内部使用不得翻印5.1.1组织匀浆器或研钵（4.2.1）、医用剪刀（4.2.2）、镊子（4.2.3）经160℃干热灭菌2h。5.1.2离心管经121℃±2℃高压蒸汽灭菌15min。5.2样品的采集和处理5.2.1用拭子（4.2.11）采集猫眼周分泌物、鼻液、粪便，采集样品的拭子用少量PBS（4.3.1）浸润后，3000r/min离心15min，取上清液待检。5.2.2采集病死猫肠道、肝、脾等组织器官，加等体积PBS（4.3.1）研磨匀浆，3000r/min离心15min，取上清液待检。5.3DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒说明书要求操作，提取的基

7、因组DNA应迅速进行荧光定量PCR扩增，或置于-20℃冰箱（4.1.4）备用。5.4反应体系5.4.1实时荧光PCR扩增反应体系见表1。表1实时荧光PCR反应体系试剂剂量上游引物F(10μmol/L)1.0μL下游引物R(10μmol/L)1.0μL待检样品DNA2.0μL灭菌双蒸水8.5μL2DB22/T2788—2017表1（续）试剂剂量SYBR本标准仅供内部使用不得翻印PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）12.5μL总体积25.0μL5.4.2以灭菌双蒸水为阴性对照，以猫泛白细胞减少症病毒基因组DNA或含目的片段的阳性

8、质粒为阳性对照。5.5反应程序实时荧光PCR反应程序见表2。表2实时荧光PCR反应程序温度时间