GHSR基因多态性与黔北麻羊生长性状关联性分析.pdf

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广东农业科学2013年第22期161GHSR基因多态性与黔北麻羊生长性状关联性分析刘彬，宋桃伟，罗卫星，蔡惠芬，孙岩岩(贵州大学动物科学学院／高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025)摘要：为了将GHSR基因应用于山羊生长性状的标记辅助选择中，利用PCR—SSCP技术分析了黔北麻羊生长激素促分泌素受体G基因外显子1、2、3’UTR区及5’UTR区的多态性及其与黔北麻羊生长性状的关联。结果表明．在GHSR基因外显子2和3’UTR区各检测到2个SNP位点G996A和T1424C，其中G996A位点为错义突变，氨基酸由甘氨酸变为丝基酸．表现为3种基因型，分别命名为GG、GA和AA；外显子1和5’UTR区未发现多态位点。进一步将G996A位点与生长性状进行关联性分析，发现GG和GA基因型个体的体重显著高于AA基因型个体，胸深显著低于AA基因型个体。初步推断GHSR基因G996A位点是非常有价值的辅助选择标记，可为黔北麻羊生长性状方向选择提供理论依据。关键词：黔北麻羊；GHSR基因；单核苷酸多态性；生长性状中图分类号：Q343．1+5：$827文献标识码：A文章编号：1004—874X(2013)22—0161—05StudyonrelationshipbetweenpolymorphismofGHSRgeneandtg~rowthtraitsinQianbei’M‘‘agoatLIUBin，SONGTao-wei，LUOWei-xing，CAIHui—fen，SUNYan-yan(CollegeofAnimdScience，GuizhouUniversity~KeyLaboratoryyorAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMount~nousRegion，nfofEducation，Guiyang550025，China)Abstract：Inordertoincreasethepossibilityofapplicationofgrowthhormonesecretagoguereceptor(GHSR)geneinMAS(Marker-assistedselection)，PCR-SSCPtechnologywasappliedtodetectpolymorphismsofExonl，2，3’UTRand5’UTRofGHSRgeneinQianbeiMagoat，andtheirassociationswithbodyweightandbodysizewereanalyzed．TheresultshowedthatG996AandT1424CweredetectedinExon2and3’UTR，whereas，therewasnoSNPsinExonland5’UTRofGHSRgeneinQianbeiMagoat．TheSNP(G／A)wasamissensemutation，whichmadeGlytoSerandwasdefinedasthreegenotypes：GG，GAandAA．ThestudyongrowthtraitsandGHSRgenepolymorphismrevealedthatthebodyweightofindividualswithgenotypeGGandGAweresignificantlyhigherthanthatofgenotypeAA，smallerthanthoseforchestwidth．ItwasconcludedthatG996AsiteinGHSRgenewasasignificantmoleculargeneticmarkerofMAS，providingatheoreticalbasisforselectinggrowthtraitsofQianbeiMagoat．Keywords：QianbeiMagoat；GHSRgene；SNPs；growthtrait生长素(Ghrelin，GHRL)是一个新发现的由28个GH)的分泌具有促进作用，而且在调节摄食和能量代氨基酸组成的内源性肽，对机体器官系统具有广泛的谢、胃肠运动和分泌、心血管功能等方面也发挥重要作生物学作用⋯。生长激素促分泌素受体(Growth用[2】。GHSR基因定位于绵羊1号染色体上，由2个外显hormonesecretagoguereceptor，GHSR)是GHRL的内源子和1个内含子组成[31。Shuto等通过构建能够表达性受体，二者结合不仅对生长激素(Growthhormone，GHSR基因的反义mRNA转基因小鼠，而导致该转基因小鼠不能翻译正常的蛋白质，且转基因小鼠的体重、收稿日期：2013—07一l1脂肪含量、摄食量等都低于正常小鼠。廖东[51在兔GHSR基金项目：贵州省农业科技攻关项目(黔科合NY字[2012]基因两个外显子部分共发现2个单核苷酸多态性3006号)(SNP)位点，其中SNP+3121位点基因型AA所对应的作者简介：刘彬(1987一)，女，在读硕士生，E—mail：liubin8799活重、全净膛重极显著高于BB型。Fang等同检测鸡@yahoo．anGHSR基因SNPs位点的多态性，通过构建单倍型并进通讯作者：罗卫星(1958一)，男，硕士，教授，E—mail：ef．wxluo@gzu．edu．an行方差分析发现，c．739+726T>C(M2)与28、90日龄的 l62质量、全净膛质量、胸腺质量显著相关。以上研究表明1．1．1试验羊供试的黔北麻羊来自贵州省习水县富GHSR基因可能是影响机体生长发育的重要候选基因兴牧业种羊场，为同一饲养管理条件下24～48月龄空黔北麻羊是贵州省优良的地方山羊品种，具有适怀期健康母羊，共201只。应性强、耐粗饲、繁殖率高、产肉性能良好、膻味轻、肉1．1．2主要试剂丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺购自鲜美可口、板皮品质优良等优点。罗卫星等[7】研究表明，北京鼎国生物技术有限公司，血液基因组DNA提取试黔北麻羊的肉用性能和肉质特性良好，具有很高的开剂盒、核酸染料、DL2000Marker、Mixture等购自上海生发价值。目前，国内外关于山羊GHSR基因变异与生长工生物工程有限公司；双蒸水、TBE缓冲液、无水乙醇性状关联性的研究鲜见报道，因此本试验以黔北麻羊等实验室自备。为研究对象，采用DNA混合池、PCR产物直接测序及1．1．3引物设计与合成根据绵羊G日5尺基因的相关PCR—SSCP技术相结合的方法对黔北麻羊GHSR基因序列(GenBank号：NM_O01009760)，利用Premier5．0进行了SNPs检测，旨在探索GHSR基因多态性与黔北软件设计6对引物，并通过Oli~n6．0进行检测，扩增山麻羊生长性能的关联性，为其遗传资源保护与开发奠羊GHSR基因目的序列，引物送上海生工生物工程有定理论基础限公司合成(表1)。1．2试验方法1材料与方法1．2．1血样采集及指标测定对201只黔北麻羊分别1．1试验材料进行颈静脉采血5～8mid只，装于真空采血管中，充分表1引物序列、退火温度、目的片段及扩增区域颠倒混匀，放入冰盒带回实验室，置于一40℃低温冰箱号1～4)。PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳检测。中保存备用。同时按要求测量每只羊的体重、体高、体1．2．4直接测序及BLAST检测选取特异性好、产量斜长、胸围、胸深、胸宽和管围7个指标。高的PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测1．2．2基因组DNA的提取采用血液基因组DNA提序。利用DNASTAR软件中的SeqMan程序对测序结果取试剂盒提取DNA，用核酸蛋白测定仪测定浓度，进行校正和BLAST分析确定SNPs。一20℃保存备用。从所采集样品中选取个体差异较大的1．2．5PCR—SSCP分析PCR反应体系为15L，包个体构建DNA池[8]。括DNA模板2L，上下游引物(10pmol／L)各lL，2×1．2．3DNA池PCR扩增利用构建的DNA池进行raqPCRMasterMix7．5txL，加双蒸水至15L。PCR反应。PCR反应体系为50L：DNA模板4L，上PCR反应条件：94℃预变性4／5rain，94℃变性30下游引物(10pmol／IxL)各3L，2x~aqPCRMasterMixS；61．7／59．6℃退火35S，72cIC延伸35S，30个循环：72℃25L，加双蒸水至50L。再延伸10／8rain；最后4℃保存(数字取舍顺序按表1PCR反应条件：95／94／94／95℃预变性4／4／4／5min。中引物5—6)。94cI二变性45／40／40／40S：58．1／62．5／58．6／57．7℃退火45／将5LPCR产物和8L上样缓冲液(95％去离45／45／40S，72℃延伸90／50／45／45S，35个循环；72℃再子甲酰胺，25mmol／LEDTA，0．025％二甲苯青，0．025％延伸10min；4~C保存备用(数字取舍按表1中引物序溴酚蓝)混合，98℃变性15min，迅速置于一20℃冰箱中 1642．2．2PCR—SSCP分型及测序SSCP分析发现，在黔GAGAAAA北麻羊GHSR基因外显子2第200bp处检测到3种基因型，分别命名为GG、GA和AA，2个等位基因G和A。GHSR基因外显子2扩增产物经变性显色后电泳图谱见图3。挑选不同基因型个体(各2个)的PCR产物进行测序，运用SepMan程序分析测序结果，比较发现，GG型个体的序列与GenBank上(登录号：NM一001009760)提图3黔北麻羊GHSR基因G996A位点交的序列一致，定义为野生型，AA型定义为突变型。测PCR—SSCP电泳图谱序峰图见图42∞2oo图4G基因G996A突变位点测序峰图2-3GH基因外显子2的群体遗传结构分析0．0846，G为优势等位基因，其频率为0．71l4，多态信息对SNPs位点在黔北麻羊试验群体中进行遗传参含量(PIC)为0．3263，表现为中度多态(0．25GA>AA，其频率分别为0．5074、0．4080和因座处于Hardy—Weinberg平衡状态。表2G996A位点基因型频率、等位基因频率及群体遗传特性注：af=2，x∞=5．99，x2n=9．21；PIC>0．5为高度多态，0．25