卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究.pdf

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1、424中国医药生物技术2009年l2月第4卷第6期ChinMedBiotechnol，December2009，Vo1．4，No．6DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673-713X．2009．06．005·论著·卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究张果，昌晓红，成夜霞，叶雪，程洪艳，魏丽惠，崔恒【摘要】体存在，得到有活性的目的蛋白需要在体外进行复目的探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体／d,鼠性。然而，由于不同蛋白理化性质不同，复性方法热休克蛋白70(6B11ScFv／mHSP70)融合蛋白包涵体变性、和条件存在很大差异，因此体外复性

2、蛋白成为一项复性条件，以确定其最佳体外复性条件。艰巨的任务[Jj；同时建立融合蛋白的高效复性程序方法大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv／mHSP70：①也成为科研、医疗和工业生产中应用融合蛋白的关比较不同的裂解液(8mol／L尿素和6mol／L盐酸胍)对包键环节。卵巢癌抗独特型单链抗体／4,鼠热休克蛋白涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响；②探索序贯稀70(6B11ScFv／mHSP70)重组蛋白是北京大学人民释方法，以及氧化还原环境和复性液中不同浓度L一精氨酸医院妇科肿瘤中心构建的卵巢癌抗独特型抗体融对蛋白稀释复性的影响；③比较稀释复性和柱复性对融合合疫苗，经体内外研究证实，具有诱导

3、有效抗卵巢蛋白复性效率及活性的影响。采用Bradford法测定包涵体癌免疫反应的能力j，有望进一步应用于卵巢癌的裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋白活性的检测均采用免疫治疗，但大规模制备活性较好的该蛋白尚存在ELISA方法。困难。本研究拟采用大肠杆菌表达系统制备结果以包涵体形式表达6B11ScFv／mHSP70蛋白：①经6B11ScFv／mHSP70融合蛋白，探讨其包涵体的变6mol／L盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8mol／L尿素，但性、复性条件，以确定最佳复性和纯化条件，为规前者复性所得蛋白活性低，6mol／L盐酸胍彻底裂解的包涵模化生产奠定基础。体经8mol／L尿素透析后再复性，复性效率显

4、著提高；②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率；加入0．5mol／LL一精氨1材料与方法酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生，提高复性效1．1材料率；加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)1．1．1质粒和菌种质粒pET30a(+)．6B11ScFv／浓度比为1：5时，可提高复性后蛋白活性；③柱上复性可mHSP70由北京大学人民医院妇科肿瘤中心构一步完成蛋白的复性和纯化，所得蛋白纯度较高，但复性效建L2J；表达菌E．coliBL21(DE3)购自德国Novagen率和复性后蛋白活性较稀释复性低。公司。1．1．2主要试剂和仪器小鼠抗HSP70抗体购结论本研究建立了6B11ScFv／m

5、HSP70融合蛋白的最自美国BDBiosciencesPhanningen公司；卵巢癌佳复性条件：包涵体经6mol／L盐酸胍彻底裂解后，再经单抗COC166—9由北京大学人民医院妇科肿瘤中8mol／L尿素透析，然后进行序贯稀释复性，且复性液中加心制备；HRP羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物入0．5mol／LL．精氨酸和GSH：GSSH=1：5以提高复性效技术有限公司；Ni+-NTA柱填料购自德国Qiagen率和蛋白活性，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。公司；异丙基硫代一D—D半乳糖甙(IPTG)、尿【关键词】卵巢肿瘤：重组融合蛋白质类；HSP70热素、盐酸胍、L一精氨酸、GSSH、GSH均

6、购自美休克蛋白质类；抗体；包涵体国Sigma公司；XK16柱床购白美国Amershamwww：cmbpnet．cn中国医药生物技术20094l61：424．429PharmaciaBiotech公司；蛋白纯化试剂盒(TheQtAexpressionistforhigh—levelexpressionandpurification随着基因工程不断发展，重组蛋白的应用也逐渐增加，表达重组蛋白可以根据需要选择不同的宿基金项目：国家自然科学基金(30772320)主，其中以大肠杆菌为代表的原核生物表达系统具作者单位：100044北京大学人民医院妇科肿瘤中心有操作简单、成本低、蛋白表达水平高等优点，但通

7、信作者：崔恒，Email：cuiheng20@tom．com由于蛋白表达量大，重组蛋白通常以无活性的包涵收稿日期：2OO9一O8—18中国医药生物技术2009年12月第4卷第6期ChinMedBiotechnol，December2009，Vo1．4，No6of6XHis—taggedprotein)购自德国Qiagen公司，稀释过程中水平缓慢摇动复性液，肉眼观察是否形752型紫外分光光度计购自上