猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析.pdf

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·12·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第4期猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析樊振华，孟帆。吴忻，刘文俊，姚敬明，王娟萍，韩一超。米瑞娟，雷宇平(1．山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2．山西省动物疫病预防控制中心，山西太原030024)摘要：采用PCR方法对2011—2013年山西省分离的2株猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)的胸苷激酶(TK)基因进行了克隆和测序，并将其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外主要流行毒株Bartha株、Becker株、Ea株、Kaplan株、LA株、Mir卜A株、NIA一3株、SH株、SL株和Yangsan株进行了同源性分析。序列分析结果表明，核苷酸同源性分别为99．7、99．6、99．8、99．7、99．7、94．4、99．1、57．2、99．5、99．7；氨基酸同源性分别为99．1、99．1、99．7、99．4、99．4、90．3、98．1％、49．7、98．8、99．1。另外在核苷酸序列中起始密码子上游有3段GCbox的序列，终止密码子下游有多聚腺苷加尾信号AATAAA；TK基因均由320个氨基酸组成，氨基酸序列中有疱疹病毒TK基因共同的保守序列一R*Y*DG**G*GK*T一和一FDRHP*A***C*P*AR一。关键词：猪伪狂犬病病毒；TK基因；变异分析中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1671-7236(2014)040012—06猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(pseudorabies防控提供理论依据。virus，PRV)引起的一种高度接触性传染病。自1材料与方法1902年匈牙利首次发现该病以来已广泛分布于世1．1PRV的来源及处理2011—2013年采自山界各地，50多个国家和地区均已报道过该病的流西省太原、晋中、忻州、运城等不同地区疑似猪伪狂行。中国自1984年刘永纯首次报道此病后，迄今为犬病发病猪场。对发病猪及病死猪进行剖检，观察止已有20多个省份相继发生该病，并在许多种猪场并记录病理变化。无菌采取剖检猪的脑、脾脏、肺脏呈暴发流行趋势，给中国的养猪业特别是集约化养等作为检测PRV的材料，于一70℃保存备用。样猪场造成了巨大经济损失(殷震等，1997；中国农业品经PCR鉴定为PRV阳性，猪繁殖与呼吸综合征科学院哈尔滨兽医研究所，1999)。PRV基因组为病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒线性双股DNA分子，约150kb，至少包括7O多个(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪肺炎支原体(Mhp)阴基因，大部分为非必需基因。其中胸苷激酶(thymi—性，于一70℃保存备用。取适量PRV阳性病料加dinekinase，TK)基因是PRV的主要毒力基因和非1OmLPBS制成组织匀浆，然后加入双抗(2000必需基因(陈瑞爱等，2010)，也是病毒化学治疗和缺U／mL)，反复冻融3次，12000r／min离心30min，失致弱疫苗的主要靶基因(琚春梅等，2005；吴凤笋取上清液，经0．22Fm滤膜除菌后，取1mL接种于等，2006)。因此对TK基因进行序列分析，在一定长成单层的PK一15细胞，37℃吸附1h，弃上清，用程度上可反映PRV的毒力情况。2011～2013年Hank’S液洗涤3～4次，然后加入1OmL维持液，在山西发病猪群中分离出2株PRV，对其进行了置于5CO。的培养箱中37℃继续培养。接毒TK基因遗传变异分析，从分子生物学的角度分析12h后开始每6h观察1次致细胞病变效应山西省流行毒株与国内外其他毒株间的关系，以(CPE)，共观察72h。盲传3代，出现典型CPE者探求山西PRV毒株变异情况，为其亲缘关系、减继续传代至CPE稳定出现，当出现80以上细胞毒机理和分子流行病学调查的研究积累资料，并病变时收获病毒液。为其基因工程缺失疫苗或重组疫苗的研制提供详1．2主要试剂TRIZOLLSReagent购自In—细的分子生物学背景，进而为今后猪伪狂犬病的vitrogen公司；TaKaRaMiniBESTViralRNA／DNAExtractionKitVer．4．0和TaKaRaIA收稿日期：2013-09—25PCR。。KitVer．2．1试剂盒均购自TaKaRa公司；作者简介：樊振华(1964一)，男，山西人，学士，副研究员，研究方DNA胶回收试剂盒、普通质粒小量提取试剂盒均购向：畜禽传染病。通信作者：孟帆。E-mail：jcbyjs@sohu．corn自上海生工生物工程技术服务有限公司；PRRSV基金项目：山西省科技攻关项目(20110311034—3)。鉴别RT—PCR检测试剂盒及CSFV、Mhp、PPV、 中国畜牧兽医2014年第41卷第4期生物技术·13·PRV和PCVPCR检测试剂盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。1．3引物设计与合成据GenBank中收录的PRVMin—A、NIA一3、Ea和Bartha等毒株的基因序列，通过DNAStar软件分析比对，应用PrimerPremier5．0软件，设计出扩增TK基因全序列(58473-60068nt)的引物。引物序列为：上游引物P1：5，_GTCTTGAGCTCGATGACGAAG一3；下游引物P2：5，_ACCACCTGGTACGAGACGAG一3，预图1PRVPCR扩增电泳图期扩增片段大小为1596bp。注：1，DI2000DNAMarker；2、3，PRVPCR产物。1．4病毒基因组的提取将收获的病毒液反复冻融3次，2000r／min离心5min，弃上清液，收获病2．2PRVTK基因核苷酸序列分析测序结果显变细胞，用TE溶液重悬沉淀，转移至1．5mI离心示，目的片段包含TK基因完整编码区，共963bp，管，同上离心、弃上清，按TaKaRaMiniBESTViral编码320个氨基酸。在PRV山西株ORF起始密码RNA／DNAExtractionKitVer．4．0试剂盒说明书子上游未发现可使转录精确起始的TATAbox，但操作，从PRV中提取病毒基因组DNA，用适量的发现GCbox，在终止密码子下游发现了多聚腺苷加DEPC水溶解，于一8O℃保存备用。尾信号AATAAA。用DNAStar软件对获得2株1．5PRVTK基因的PCR扩增以提取的总PRV的TK基因序列与国内外代表毒株的TK基DNA为模板，用TaKaRaLAPCR丁MKitVer．2．1因序列进行了比对。序列分析结果显示：本研究所扩增TK基因。经多次试验，优化的PCR反应体系获得2株PRV的TK基因序列之间核苷酸同源性pO撇O重0量l0；姗)m5OuI：2×GCBufferI25tLL，dNTPMixture为100；与Bartha株核苷酸同源性为99．7，相8L，TaKaRaLATaq0．5t*L，上、下游引物(2O差3个核苷酸，即643A—G、644C-+T、851C-+T；与／,mol／I)各1I，模板3t,I，用灭菌超纯水补至Becker株核苷酸同源性为99．6，有4个核苷酸的50t,I。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变差异，即13A—C、643A—G、644C---~T、851C—T；与性60S，62℃退火60S，72℃延伸2min，共35个循Ea株核苷酸同源性为99．8，有2个核苷酸的差环；72℃延伸lOmin。反应结束后，取5LPCR异，即13A—C、648G—G；与Kaplan株核苷酸同源产物用1．0琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。性为99．7，有3个核苷酸的差异，即57G—T、1．6PRVTK基因的克隆及序列测定将TK643A—G、644C—T；与LA株核苷酸同源性为基因片段的PCR产物经回收纯化后与pMD18一T99．7，有3个核苷酸的差异，即18G—C、24A—C、载体连接过夜并转化大肠杆菌DH5a感受态细30G---~C；与Min—A株核苷酸同源性为94．4，其胞，筛选重组菌进行PCR鉴定。将鉴定的阳性菌868—873位缺失了GCGGCG6个核苷酸，而山西液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行株核苷酸差异为125C—T、865T—G、867C—G、测序。874T—C、875G—A、877A—G；与NIA-3株核苷酸1．7PRVTK基因序列的比对分析利用生物信同源性为99．1，有8个核苷酸的差异，即38A—息学分析软件DNAStar对测得的2株PRVTK基G、219C—G、220G—C、643A—G、644C—T、因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行分析，同国648G---~C、714T—C、877A—G；与SH株核苷酸同内外己发表的PRVBartha株、Becker株、Ea株、源性为57．2，有9个核苷酸的差异，即7G—A、Kaplan株、LA株、Min—A株、NIA一3株、SH株、SL13A—C、102A—G、451缺失一G、539G—C、585T—株和Yangsan株的TK基因进行同源性分析，并绘G、689G—A、840T-~C、903T—C；与SL株核苷酸制系统发生树。同源性为99．5，有5个核苷酸的差异，即643A—2结果与分析G、644C—T、684A—C、761C—T、931A—G；与2．1PRVTK基因的扩增结果经PCR扩增后，Yangsan株核苷酸同源性为99．7，有3个核苷酸琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增出约为1596bp的目的差异，即643A—G、644C--~T、808G--~C。结果表的条带(图1)，与预期片段大小相符。明，山西株与Ea株同源性最高，核苷酸同源性为 ·14·生物技术tf-国斋牧兽医2014q-第11卷第l期99．8；与SH株的同源性最低，核苷酸同源性为同源性为94．4～99．7(图2)。57．29／6；与其他分离株同源性介于2株中间。核苷酸同源性(％)1234567891011121_998gg．7gg5g98994940gg25719g79979961Yangsan202■■gg99g59989g4g409925739g7gg了g9．62Bartha30301I99．6997gg3g3g993572gg6gg6g9．53Becker4050504_9g5gg5g419g3572g989989g34Ea岔502020305l■■9g494O9g2571997gg7gg65Kap1an一60606D70506■■_940g8856gg979g79926IA762626366262_934579g44g449387Min—A80808070708136giI5699g19g1g908NIA一3g64163763g63g641646620646l5725725739SH10030304口2口3口35g0g63g_10o0g9510shanxi0I11030304020303590963g00_99511shanxi02120404050。0408641D5360505_'2SL123456789101112图2PRVTK基因核苷酸同源·陛比对2．3PRVTK基因系统发生树分析2株PRV分SH与其他毒株距离都很远，为单独一群；其余几个离株的丁K基因和GenBank中收录的10株国内外分离毒株为一群。山西分离株在分子水平L明与代表毒株『K基因序列绘制系统发生树结果见图IA株最近。3。由图3可知，将PRV毒株分为2个大群，毒株ALhShSEaNBaBeYaKaLSMHS．_Xna_lXna3A—htrakreCaSgnlnap^n—)()(Irl20核苷酸置换(×loo)图3PRVTK基因的系统发生树2．4PRV丁K基因氨基酸序列分析本研究所获99．19／6，有2个氨基酸的差异，分别是2l5Thr—得2株PRV的丁K基因序列推导出的氨基酸同源Val、270Ala—Prol与Min—A株氨基酸同源性为性为99．7；与Bartha株和Becker株氨基酸同源90．3，由于Min—A株缺失了第867位后面的6个性均为99．1，有2个氨基酸的差异，分别是碱基，所以其氨基酸序列在第289位后和其他株差2l5Thr—Va1、284Ala—Val；与Ea株氨基酸同源性异较大，在前289个氨基酸和山西株只有42Ser一为99．7，氨基酸无差异；与Kaplan株氨基酸同源Phe这一个差别；与SH株氨基酸同源性为49．7，性为99．4，只有215Thr--~Val；与IA株氨基酸同SH株由于第45l处的碱基缺失，造成其氨基酸序源性为99．4，只有6Met-~Ile；与NIA一3株氨基酸列在第l5O位后氨基酸翻译移码，因此SH株氨基同源性为98．1，有4个氨基酸的差异，分别是酸序列在第150位后和其他株的差异较大，在前13Asp—Gly、73His—Gln、74Asp—His、215Thr—150个氨基酸和山西株只有3Val—Ile这一个差别。Val；与sL株氨基酸同源性为98．8，有3个氨基虽然山西株和其他毒株的氨基酸序列有所区别，但酸的差异，分别是2l5Thr—Val、254Pro—I．eu、它们具有共同的保守序列，即一R*Y*DG**G*3l1Met—Val；与Yangsan株氨基酸同源性为GK*T一和一FDRHP*A***C*P*AR，它们正是 ,tI寄牧医2o14年第41卷第4期生物技术888888888888所有疱疹病毒TK催化结构域中的亚结构域(ATP结合结构域和核苷酸结合结构域)(图4)。ILEIYLD^TTIX：TTAE口^L5^LYpEPH^6】ATLrDTDTAITD^0TEXO日G：L0EED^^LT^0O^ArATMBILEIYLDE^YT‘XSTTARVALI5ALYpEPM^Y0】TLFDTDT^BITDA0TRX0‘3LSr￡D^^LT^0Ite^Ar^T~angsanHBILEIYLD5^Y0T‘X：TTAR"^Lee^LYpIiPM^Y6】lTLFDTDT^IYDAOTRXOH55LSEED^ALT^0^^r^TBartha^^HRILRIYLD^YITX‘：TTT^RVM^L55^LTPEP日^WlTLrDTDT^5ITDaqTRX05SL3￡ED^^LT^0O^^P^TBeeker‘MRILRIYLD‘^YrtTTX：TTT^RV目^LALYPEp日^YWlTLrDTDT12A5IYD^0TXONrtSLS￡EIA^L1tT^00AAr^THRILBIYLDTTaRL^LYPEPH^YWBTLrDTDTAYD^TBXO11EED^^L1TAO0^Ar^TMILB口TLDTT^RbAL矗LYP￡PM^YWRTLrDTDT^TD^TBXQ11EED^^LVT^O科0^^r^TMAILBIYLD^7rsTTTAR日ALAtTPEPH^TwBTL日DTDTATD^TRKO11EED鱼^LT^Q0AAFAT"RILBILD^Y国TTT^R日^L矗LYPEpH^YW曩TLrDTDTAYD^TRXO11￡EDA^LT^田0^ArATNI^一3MB日LEIYLD^YTTTAR口H^L^LPEPM^Y0】TLrDTDT^TD^TRXQNEED^^LVTa0It0^^r^TSItMBILRITLDAY‘TTT^R口真LaLTpEpM^Y0】ETLFDTDT^YD^TX0HEED^^LTA0It0^^rATsh~tnxi0lMBILEITLD^Y0TTT^BV"^L鱼LpEPH^YWlTLFDTDT^YD^TBXO11rEDA点LVT^0^ArATshanxi02H叠ILBIYLD^YTTTARM^L矗LYpEpM^Y6】lTLrDTDTAD^TiX01EEDAALT^0Q^Ar^TSLpYLLLHTRLPLr5P^E‘PPETVrDRp^ATcrPL^BrI5DISAA^rELA^TLP5IiPp‘G／1LV^：LDpDEttL0l0l，0l4lSoPYLLLItTELPLr‘P^ErlPPIHTrDRItPA^Tcr，LARrI‘DISa^Ar8L^^TLP5EPPrsrs1L"^3LDPDrItL~angsanpYLLLHtLpLr‘P^E‘PpE再T"rDIP^^TcrPL^RrIDIS^A^rBLA^TLp5￡PP‘5L"A：LDPDEHLBarthaPYLLLHTELpLr‘PAE‘PpEHTrDRPAATcrpLARrl‘DISAAArVL^^TLp‘EPP‘‘_LVV^SLDpDEHLBeckerPPPPYLLLTRLPLr‘p矗EBPPEHTrDRp^^TVcrPL^RrI‘DI3^^^rV5LA^TLP0EPP5KLVVA：LDPDELEaPYLLLHTRLUpLr‘PAE5PPE日TrDk斟P^^TcrPLABrIVBDIS^A^rL^^TLP5EPP65NLV^：LDPDEHLKaplanPYLLLTRLVPLr‘P^EGPPEHTrDRHP^ATerPL^RrI‘0IS^^ArL^鱼TLP5EPP55目LVV^：LDpDEHLl，APYLLLHT莹LPLr5P^EGPPEMTVrRHP^^TcrPL^ErIDISA^^F5LaaTLP5EPP目L^5LDPDEHLMin—ApYLLLT自L"PLr5P^E5PpEHTV"rDRPAATcrPL^RrIBDI：鱼^^rBLA矗TLp5￡Pp5_LA：LDPDEHLNIA一3PYLLLHT§LVpLr6P^EGppEMTrDP^ATcrPL^RrI‘DIS鱼^^rBLAATLP5EpP‘NLSHPLLLHTELVPLr‘P^E‘PPE琦TVrDRHpAATcr，L^RfI5DI3AA^rV5LA^TLP5EPPⅪLVA：LDpDE日Lsh8nxi0lPYLLLHTELpLr‘P^EPPE为TrBP^^TcrPL^RrI‘DI3^^arGL^^TLP5EpP‘‘LVVa3LDPD￡_Lshanxi02PYLLLBTkLVPLrBP^VE5PPE—TrDtP^ATVcrPL^BFIGDl：AAarGL^矗TLPBEpP‘‘lLVVa3LDpD￡日LSIBELRA君ARA0ED^量LLT^L譬HY^HLWT5PTLS：RBWRDDAPEFDOTTnDeLALNELcBP量DDPEL0DTLr‘§l70l80l9O2日012020240l61BELB^BAR^EHD^LLT^LHY^MLHT3BYL3BB∞BDDWR^PRrDTRDCL^LNELcBPBDDPEL0DTLrAYangsa“161BELR^R^R^ED^叠LLT^LlHY^玎LT3BYLSE∞RDDWR^PRFDTRDCL^LHELcRPBDDPELODTLr^Barthal61RLR^R^AC日D^嚣LLTALlHYAHLNTSL：WRDDR^PRrDTBDCLALNELCPRDDPEL0DTLrB^Ijeckerl6lRBLE^R^A‘￡D^BLLTALB_Y^HL目T3L3WRDD∞R^PBFD日RDcLALNELcBPRDDPEL0nTLr0AEal6lRRLAR^骑A‘ED^LLTaLR日YAHLNT：BYL33l譬WlDD噼B^PRrD0TTBDCLALHELCRpDDPEL0DTLf0AKaplanl6lRRLR^R^量^￡VD^ELLT^LR_Y^HLHTSTL：35嚣WDD∞BRAPBrDOTL^l6lBBLBB^^EHVD^LLTALR_Y^HLHT：lYL3SeWBDD吣BR^PRrDOTMin一^16lRRLR^B^职^EHD^RLLTaLR_Y^HLVlT：日LS3‘R聃BDD∞BB^PRrD0TT囊nCL^LNELCBPBDDPELODTLr‘^NI^～3SHshanxiO1shanxiO2a^SlJYXAPELCDBB§iPLEA口AHD^L直XLLPLESTVDLPSPRc^^^AA0^R5HETES^YBDHI0cCarT3EMG2S0￡5010￡802’a2jl￡24lYxAP￡LcDRB‘PLEAq^日DALVaxLL目LRTVDLA^^^AOAEMETE^YDH^rTE日Yan窟san241YX^PELCDRB5RPLEH^q^MD^LAXLLPLEVTDL^^^AA0^B柏EVTEAYDB^rTE日Bartha24lYX^p￡LCDtR0RPLEVH^噼AHD^L点XLLpLBVTDL^^点V^A0^采HETEADH^rTE口8ecker241TXApELCDREPLEV^口AMD^L^XLLPLRVTDLA^^"^^0^BHETEAY丑科^rTEMEa241Kaplan241l^241YX^PEL￡DBB6BPLe^a日D^L鱼XLLpLRUSTDL5Min—A241YX^PEL￡DBBRPLE^^BD^LV^XLLPLRV：TDL5NIA一3241匝匝圃SH241shanxi0l24lshanxi0224lSL图4PRV基因推导的氨基酸序列比对注：F划线处分别代表ATP结合结构域和核苷酸结合结构域。3讨论的增殖有关(萨姆布鲁克等，2()(]2)。其编码产物丁K基因属于PRV的早期基因(IoiacOn。等，TK是嘧啶生物合成补救途径中所必需的限速酶。2O04)，与病毒在机体中的潜伏感染和在神经组织中它可催化胸腺嘧啶被ATP磷酸化为dTMP，然后 ·16·生物技术中国畜牧兽医2014年第4l卷第4期继续磷酸化成为dTTP，参于PRVDNA的合成(葛酸进行多序列比对，得出各株PRVTK氨基酸序列菡等，2008)。TK活性对在分裂细胞中的PRV复在这些位置上都是保守的。推测这些保守氨基酸对制是非必需的，但对在非分裂细胞如高度分化的神于PRVTK结构的稳定性和催化活性的发挥是必经元中的复制是必需的，缺失TK基因的PRV在需的，这为TK基因缺失弱毒株的构建提供了理论神经元中的复制能力极弱(Coen等，1989)。利用基依据。因技术，敲除病毒的TK基因，可使毒株毒力下降和本试验对PRVTK基因进行了初步理性分析，潜伏感染能力降低(周国辉等，2005)。因此，TK基为研究TK基因的结构与功能奠定了基础，同时也因的有无，对病毒毒力的影响很大，是PRV主要的为PRV致病的分子机理、病毒基因组的改造等提毒力决定因子。因此对山西分离毒株进行了TK基供了理论依据。因遗传变异分析，从分子生物学的角度分析了山西目前疫苗免疫接种是防制乃至根除该病的主要省流行毒株与国内外其他毒株间的关系。手段之一，伪狂犬病疫苗大多缺失了TK基因(赵武参考GenBank收录的PRVTK基因及其邻近等，2006；江云波等，2005)，近年来人们广泛应用猪的UL24、UL22基因的核苷酸序列，采用特异性引伪狂犬病基因缺失疫苗，有效地控制了该病的流行，物进行了山西株TK基因的PCR扩增，并测序确定但2012年中国南方地区一些猪场即使在猪伪狂犬了全长1596bp的DNA序列，该序列包括1个完整病疫苗免疫抗体较高的情况下，也发生母猪流产，1的963bp的ORF，其转录、翻译产物即为TK。除周龄乳猪有神经症状、口吐白沫、死亡现象，并被实这一完整的TKORF外，TK基因上游前3个GC验室确诊为猪伪狂犬病。提示应该每年对山西box序列区间，估计与TK基因的转录调控密切相PRV流行毒株进行基因测序，分析其遗传变异情关，可被转录因子SPI所识别。PRV山西株TK况，为控制该病的流行不断提供依据。基因起始密码子上游没有发现TATAbox结构，在参考文献其终止密码子(TGA)后85bp处有其polyA信号AATAAA，这与Dezelee等(1996)报道的结果相1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所．动物传染病学[M]．北京：中符。本试验测得的PRV山西株TK基因与Bartha国农业出版社，1999．2江云波，方六荣，肖少波，等．表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰株、Becker株、Ea株、Kaplan株、LA株、Min—A株、型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应NIA一3株、SH株、SI株和Yangsan株TK基因进[J]．养殖与饲料，2005(11)：7～l4．行比对，核苷酸同源性分别为99．7、99．6、3吴凤笋，李文刚，樊淑华．应用伪狂犬病毒表达载体研制重组疫99．8、99．7、99．7、94．4、99．1、57．2、苗的研究进展[J]．郑州牧业工程高等专科学校学报，2006，2699．5、99．7，氨基酸同源性分别为99．1、(3)：21～23．99．1％、99．7、99．4％、99．4、90．3、98．1、4陈瑞爱，邵定勇，韩静芳，等．猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV／TK一的构建及其生物学特性[J]．中国兽医学报，2010，：30(5)：49．7、98．8、99．19／6。可见不同PRV毒株问577～582．TK基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性均较高，5周国辉，仇华吉，田志军，等．伪狂犬病病毒基因缺失及活载体疫表明PRVTK具有高度的保守性，同时也说明了利苗研究进展[J]．动物医学进展，2005，26(3)：19～22．用PCR方法扩增PRV基因具有良好的可靠性。6赵武．肖少波，方六荣，等．融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪Prieto等(1991)报道了由于第13位的Gly突繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK2／gE2／VP22GP5的构建[J]．病毒学报，2006，22(1)：62～66．变为Asp而导致PRVTK活性的丧失，表明PRV7殷震，刘景华．动物病毒[M]．第2版．北京：科学出版社，1997．TK功能区域的个别核苷酸和氨基酸的突变会造成8萨姆布鲁克J，拉塞尔Dw．分子克隆实验指南[M]．黄培堂，王毒力的很大改变，提示可在ATP结合结构域和胸嘉玺，朱厚础等译．北京：科学出版社，2002．苷嘧啶核苷酸结合结构域进行定点诱变来达到减弱9琚春梅，陈焕春，樊惠英，等．猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基毒力的目的。本研究结果发现PRV山西分离株第因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究[J]．生物工程学报，2005，21(3)：370～374．215位的Thr突变为Val，这与Ea株、LA株、Min—1o葛菡，程安春，汪铭书，等．疱疹病毒TK基因的研究进展[J]．中A株突变相一致。Darb等(1986)研究认为518国兽医科学，2008，38(1)：86～9O．区间的一R*Y*DG**G*GK*T一为ATP结合位11CoenDM，Kosz—VnenchakM，JacobsonJG，eta1．Thymidine点，107—122区间的一FDRHP*A***C*P*AR一kinase-negativeherpessimplexvtrusIllUtaIltsestablishlatencyin为核苷酸结合位点，通过对多株PRV丁K基因氨基mousetrigeminalbutdonotreactivate[J]．ProcNatlAcadSei 中国畜牧兽医2014年第41卷第4期生物技术·17·USA，1989，86(12)：4736～4740．12DarbYG。LarderBA．Evidencethatthe‘activecentre’oftheherpessimplexvirusthymidinekinaseinvolvesaninteractionbe—tweenthreedistinctregionsofthepolypeptide[J]．JGenVirol，1986。67：753～758．13DezeleeS，BrasF，VendeP，eta1．TheBamHIfragment9ofpseudorabiesviruscontainsgeneshomologoustotheUL24，SequenceAnalysisofTKGeneofPorcinePseudorabiesVirusIsolatedfromShanxiAreaFANZhen—hua，MENGFan，WUXin，LIUWen—jun，YAOJing—ming，WANGJuan—ping，HANYi—chao，MIRui-juan，LEIYu—ping(1．InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030032，China；2．ShanxiVeterinaryPreventionandTreatmentStation，Taiyuan030024，China)Abstract：TKgenesoftwopseudorabiesvirus(PRV)strainsthathadbeenisolatedfromShanxiprovincewereamplifiedbyRT—PCRamong2009and2011。clonedandsequenced．TheobtainedsequencesandthededucedaminoacidwereanalyzedandcomparedwiththedomesticandinternationalmajorepidemicstrainsofPRVBarthastrain，Beckerstrain，Eastrain，Kaplanstrain，LAstrain，Min—Astrain，NIA一3strain，SHstrain，SLstrainandYangsanstrainbyhomologousanalysis．Sequencea—nalysis～sh4一l砉．o．weR～一掀dt～hn耋a：t～tt∞～Ⅲhe一-h蒌nuc～leotidehomologiesofTKgeneswere99．7，99．6％，99．8％o，99．7，99．7，94．4，99．1，57．2，99．5and99．7，respectively，andtheaminoacidhomologieswere99．1，99．1％，99．7，99．4，99．4，9O．3，98．1，49．7，98．8and99．1．3sectionsofGCboxlikesequenceupstreamoftheinitiationcodonandpolya—denosi5ne2po1ya，denylationsignalAATAAAdownstreamofthestopcodonwerefoundinnucleotidesequence，TKgenewascomposedof320aminoacids，withaconservedsequenceofTKgeneofherpesviruscommonaminoacidsequence，namely—R*Y*DG¨㈣**卜G=蓥耍*GmK*lcT—nand—FDRHP*A***C*P*AR一．Keywords：porcinepseudorabiesvirus；TICgene；variationanalysisw一啡～eL叭一一mp刚～．g鲫：V∞限饲赖氨酸后对瘦肉型去势公猪补偿生长反应和胴体品质的影响㈨．SamMillet等著孙鹏摘译晋大鹏校摘要：由于日粮限制饲喂与猪的性别有关，因此试验采3组(P<0．05)。屠宰率和瘦肉率取决于育肥后期饲料中充用2×2因子设计测定了不同饲喂阶段赖氨酸水平和去势公足的氨基酸供给量(尸<0．05)。降低日粮氨基酸浓度降低猪生产性能和胴体品质的相互作用。试验选用192头去势了每千克增重和胴体瘦肉增重的赖氨酸需要量。不同阶段公猪分养在32圈中，每圈6头猪。饲喂4种目粮：①生长期氨基酸水平和胴体瘦肉增重间存在互作，LL组胴体瘦肉增(25~42kg体重)、育肥早期(42～73体重)、育肥晚期重低于其他3组(P