体外受精技术.ppt

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1、体外受精技术体外受精的概念狭义：将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的现象。包括自然条件下的体外受精(两栖类和鱼类)，和人为培养条件下的体外受精(哺乳动物)。广义：经过特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的技术，所以体外受精的胚胎移植后所生婴儿又称为“试管婴儿”。包括卵母细胞的体外成熟和受精卵的体外培养两项配套技术。优点：与体内受精相比，所需精子数减少，提高精液利用率。Example:流式细胞含仪分离的性控精子只能用于体外受精。国内外研究现状1878年，Schenk(Germany)将体内成熟的家兔和豚鼠

2、卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体的排出和卵裂现象；1945年，张明觉(华裔)偶然获得兔体外受精卵，但无重复性，且无试管动物出生；1951，张明觉与Austin(澳)同时发现精子获能现象；1959年，他首次获得体外受精兔；80年代以来，对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等体处胚相继获得了成功，国内90年代在家畜上也获得了成功；现已将卵母细胞体外成熟--体外受精--早期胚体外发育--冷冻保存结合在一起，建立工厂化胚胎生产。国内外研究现状世界体外受精的首创纪录动物种

3、类首创纪录文献兔Thibault(1954)叙利亚仓鼠Yanaginmachi,chang(1963)小鼠Whittingham(1968)中国仓鼠Pickworth,Chang(1969)猫Hammer(1970)土拨鼠Yanagimachi(1972)大鼠Miyamoto,Chang(1973)狗Mahi,Yanagimachi(1976)牛Brackett(1978)猪Iritani,Niwa(1977)绵羊Bondioli,Wright(1980)山羊花田章(1985)国内外研究现状我国体外受精的首创

4、纪录动物种类首创纪录文献小鼠陈秀兰(1986)兔范必勤(1987)绵羊旭日干(1989)牛旭日干(1989)山羊钱菊汾(1990)猪范必勤(1990)水牛蒋和生(1993)体外受精技术流程卵母细胞的体外成熟精子的体外获能卵母细胞的体外受精受精卵的体外发育配子的冷冻保存体外胚胎生产技术要点卵母细胞的采集与体外培养1.离体采集：30min内取卵巢，置生理盐水或PBS（25℃-35℃），3h内回收。⑴卵泡抽吸法：针头穿刺，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染；缺点：容易损伤卵母细

5、胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的采集⑵卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高；缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的采集2.活体采集(OvumPick-Up,OPU)⑴腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来优点：比较直观，容易掌握；缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的采集⑵B

6、型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵；缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的筛选只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上；B级：卵丘细胞为2-4层；C级：卵母细胞

7、大部分被包裹；D级：卵母细胞少量被包裹；E级：裸卵。A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟目的：提供可利用的卵母细胞用于体外受精、克隆等；研究其体内成熟的模型。卵母细胞体外成熟的特征生发泡破裂；染色体凝集；纺缍体形成；极体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。体外胚胎生产技术要点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟培养液以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵母细胞体外成熟率高达80%以上。添加成分：促性腺激素：FSH、LHFCS、BSA：有认为FCS比BSA好，而发情牛

8、血清或发情羊血清比FCS好。抗生素体外胚胎生产技术要点卵母细胞的体外成熟培养OocyteCollectionMedium(OCM)最常用的是碳酸氢钠或Hepe’s缓冲的TCM-199;2.OocyteMaturationMedium（1)Bovinesteerserum (2)Folltropin(3)Estradiol(4)NaPyruvate(5)Glutamine体外胚胎生产技术要点卵母细胞