对一株藤黄微球菌合成海藻糖能力的鉴定

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1、万方数据2004年31(4)微生物学通报对一株藤黄微球菌合成海藻糖能力的鉴定欧阳立明”王善利1施超欧2张惠展1袁勤生1(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237)(华东理工大学分析测试中心上海200237)2·49·摘要：报道了一株藤黄微球菌(舰一us￡娩m)具有产酶能力，可以淀粉糊精为底物合成海藻糖，从还原糖含量变化、纸层析和高效阴离子交换．脉冲安培法检测几方面对酶反应予以证实。关键词：海藻糖，藤黄微球菌，高效离子色谱中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：0253．2654(2004)04-0049一04Menti触ofn砼A砌够ofndla搬synth

2、e豳byEIl靴行帅M泐w唧配F妣珊0uYANGn一腼n91’WANGShan一Ⅱ1SmCllao-0u2zHANGHui．盈姗1Ⅵ．n州Qin-shen91(

3、s胁^巧￡础om研矿挠D，删抑n蒯凸删昭们吣r，黼埘增^缸200237)1(呻缸∞d拖辩们^G巴，胁’劂r，虢nr咖i200237)2Abstmd：As嘶n0f肘赫wo∞wf眦mwas咧ed，枷chc锄pmducee玎zyrneto8yll山esizetrehaloseusingstarchd“nilssubstI诅te．IdeIlt蛳ngt}Ie∞zyn狞re日西0n缸吼tllefbuowingaspects：tI

4、leoontentvarie【yofreductionsugar；p印目chⅫm￡o鲫hyandlli咖pe南rnlallce∞ionexchall扩pI】1sed∞p∞Ⅱ幽cde【ection(}吼也一P舡))．KeyⅥmds：7rrehalose，胍h∞00吼岱矗腑m，Hi曲pe击舯aIlceionicchm】Tlatography(删c)海藻糖是两个葡萄糖分子以a．1，1键连接形成的非还原性二糖，广泛存在于微生物、低等动植物体内。海藻糖的存在赋予这些生物以抗干旱、抗高温、抗冷冻的抗逆特性。此外，海藻糖通过外加的方式同样能对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用。因

5、此，海藻糖在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广阔的应用前景。海藻糖的生物合成途径可以按以葡萄糖、麦芽糖和淀粉部分水解物作为底物分为3类，而其中以淀粉部分水解物作为底物生产海藻糖因为与传统的酵母提取法相比具有大幅降低成本的优势，所以最具有工业生产的意义，已成为海藻糖工业生产的主要工艺之一。这种方法的关键是寻找海藻糖合成能力较强的菌株，或者用基因工程对野生菌株进行改造以提高合成能力。目前已证明具有以淀粉部分水解物为底物生成海藻糖的微生物涉及节杆菌[1]、微球菌【21和硫化叶菌等古细菌b“1属，其合成途径均在麦芽糖寡糖基海藻糖合成酶(M]【’Sase)和麦芽糖寡糖基海藻糖水解酶(

6、Mmase)的双酶体系下完成，其反应过程如下bJ：麦芽低聚糖(Gn)』坠竺孓麦芽糖寡糖基海藻糖(G+：．T)』竖海藻糖(T)+麦芽低聚糖(艮：)其中，Gn表示有n个葡萄糖残基的麦芽低聚糖，T为海藻糖基，艮：表示葡萄糖残。联系人EIrm：mlymgkn@eyw．哪收稿日期：2008．09一12。修回日期：2008．11．11万方数据微生物学通报2004年31(4)基数目为n．2的麦芽低聚糖。日本林原公司自1995年将自主筛选到的一株节杆菌用于海藻糖酶法工业生产，使海藻糖价格由2cHD美元／kg降至2美元／kg，并成为全球最大的海藻糖供应商。为了开发具有自主知识产权的生产菌株，国

7、内外相关机构都在寻找新的微生物资源；而克隆相关酶基因，进行基因工程改造，也是一条极具希望的途径。为了从一株野生藤黄微球菌出发克隆"rsase和瑚【Hase基因，本文首先对该菌株的海藻糖合成能力进行了鉴定。1材料与方法1．1主要试剂、材料、仪器麦芽糊精(DEl2～14，上海融氏企业有限公司)，糖化酶DeXt彻呷e。GA(N0一vOzYME，可外切d．1，4和a．1，6葡萄糖苷键)，海藻糖(林原生化有限公司)，啊pepton，YeastEXtmct(Oxoid．Ltd．E时and)；其他试剂为国产分析纯。烟台产Hs．GF254(10×20cm)硅胶板，新华一号滤纸。上海产unic

8、07200型分光光度计。1．2细菌培养慨揪凇z蚍哪(IF03064)由本室袁勤生教授惠赠。培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl5g，定容至1L，pH7．O。1．3粗酶液提取菌种在种子培养基中30℃下活化培养20h，以4％接种量接种于产酶培养基，30cC培养36h，3，600r／IIlin离心30IIlin获取菌体，然后按湿菌体2倍质量加入磷酸缓冲液(pH7．0)重悬，置冰浴中超声破碎(工作4s，问歇4s，工作功率400w，80次)，12，000r／min离心15min，收集上清液为粗酶液、