鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究.docx

《鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究Mx蛋白是一类由干扰素诱导产生具有抗病毒活性的动力蛋白样GTP酶,在脊椎动物中普遍存在。目前对于鼠源、鱼源、鸡源等动物的Mx蛋白抗病毒活性的研究已较为深入,但是对于鸭Mx抵抗RNA病毒的病毒活性还并未确定,因此鸭Mx抗RNA病毒活性还需要进一步评价。本研究分别用四种RNA病毒水疱性口炎病毒（VSV）、新城疫病毒（NDV）、1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）感染人胚胎肾上皮细胞（HEK293T）,盲传3代后测定半数细胞培养物感染量(TCID₅₀),最终测定VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3的TCID

2、ub>50分别为10^-5.164/0.1mL、10^-6.181/0.1mL、10^-7.748/0.1mL和10^-9/0.1mL。提取293T细胞中四种病毒的RNA,将其反转录为cDNA,利用PCR技术扩增目的基因,构建了四种RNA病毒的标准质粒,并以标准质粒为模板制作标准曲线,通过重复性、灵敏度和特异性检测,成功建立了分析病毒载量的实时荧光定量RT-PCR检测方法。合成带有红色荧光标签的慢病毒穿梭质粒pLV-mCherry-Mx-2166,利用脂质体转染技术将pLV-mCherry-Mx-216

3、6导入293T细胞,并对转染剂量和时间进行优化。Westernblot结果显示用2μg/孔的pLV-mCherry-Mx-2166瞬时转染293T细胞24h时,鸭Mx蛋白的表达量优于其他时间点的表达量。在此基础上,分别用四种RNA病毒感染293T细胞,利用Westernblot和RT-qPCR方法检测感染后6h、9h、12h、24h和36h细胞样品中鸭Mx的表达水平和RNA病毒的病毒载量,试验结果表明与对照组相比体外瞬时过表达鸭Mx可显著抑制VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3病毒的复制。根据鸭Mx基因的保守编码区设计并合成了3对siRNA引物siRNA-Mx1、siRNA-Mx2、si

4、RNA-Mx3及阴性对照引物siRNA-NC。利用Westernblot和RT-qPCR方法筛选出干扰效果较稳定的siRNA-Mx2,并优化干扰载体的最佳使用浓度。结果显示,干扰鸭Mx抗VSV和NDV的最佳使用浓度为40pmol/孔,干扰鸭Mx抗DHAV-1和DHAV-3的最佳使用浓度为50pmol/孔,与未干扰组相比干扰效率可降低50%以上。利用优化好的条件探究干扰鸭Mx蛋白表达后对VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3的抗病毒活性。结果表明,与未干扰组相比siRNA-Mx2显著抑制鸭Mx抗VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3病毒的活性。本研究利用过表达及RNA干扰技术,从正反两个

5、方面揭示鸭Mx在293T细胞中过表达后对VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3四种RNA病毒具有体外抗病毒活性,为今后深入研究鸭Mx蛋白的抗病毒功能及其机制奠定了重要的理论基础。