《褐飞虱内共生菌Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及作用机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：论文编号：中国农业科学院学位论文褐飞虱内共生菌对黄绿绿僵菌毒力的影响及作用机制ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｆＡｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓｏｎｔｈｅＶｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍｌａｖｏｖｉｒｉｄｅｔｏＮｉｌａａｒｖａｔａｌｕｅｎｓｆｐｇ硕士研究生：朱欢欢指导教师：傅强研究员申请学位类别：农学硕士专业：农业昆虫与害虫防治研究方向：昆虫生理与分子生物学培养单位：中国水稻研究所中国农业科学院研究生院２０１７年５月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文褐飞虱内共生菌Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及作用机制ThemechanismandeffectofArsenophonusontheVirulenceofMetarhiziumflavoviridetoNilaparvatalugens硕士研究生：朱欢欢指导教师：傅强研究员申请学位类别：农学硕士专业：农业昆虫与害虫防治研究方向：昆虫生理与分子生物学培养单位：中国水稻研究所中国农业科学院研究生院2017年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationThemechanismandeffectofArsenophonusontheVirulenceofMetarhiziumflavoviridetoNilaparvatalugensM.S.Candidate：ZhuHuanhuanSupervisor：Prof.FuQiangMajor：AgriculturalEntomologyandPestControlSpecialty:InsectPhysiologyandMolecularBiologyMay,2017 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：时间：年占月二拍关于论文使用授权的声明、本人完全了解中国农业科学院有关保留使用学位论文的规定：，即中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容研宄生签名：床缠时间：％丨７年￥月；＾曰：导师签名时间：年ｉ月日 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目褐飞虱内共生菌对黄绿绿僵菌毒力的影响及作用机制￣￣￣￣￣￣￣＂ｒｒｒ农业昆虫与害昆虫生理及分ｍ年－论文作者朱欢欢：专业｜研究方向｜虫＾治子生物学｜丨｜丨指导教师傅强培养单位（研究所）中国水稻研究所￣￣￣￣１硕（）导姓名职称ｉｉ专业＾｜＝师硕口导Ｉｒｕ博口导评」￣口硕导阅（盲）审口博导人＾＾博导口７Ｓ硕导，农业昆虫与答害辩Ｔ讲虫勒＾，王Ｉ觀Ｍ１＾杭州师沮大学主席口嫌博导治冯国忠研宄员中国水稻研农业生物学宄所微＾吕麵研究员浙江农业学院省科Ｊ＾認农业害江学浙大！＾ｇ；虫究硕昆副研导辺中国农业科学院茶叶研农业虫与害Ｌ鄕％僅＾５千口治导虫防员博一＾氏ｊ一例口＇硕导笔口导博画硕导口排口博导序＿．—＂一记录（秘）会议书万品俊副研员宄２０１７２２论文辩时间地点年５日，水稻研答月中国宄所 摘要褐飞虱Nilaparvatalugens(Stål)是我国水稻上的主要害虫，黄绿绿僵菌是其重要的病原真菌。本实验室前期研究发现，褐飞虱内生共生菌Arsenophonus可抑制黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力。已有研究表明，影响黄绿绿僵菌毒力的因素较多，除病原菌自身毒力外，还有环境温度、菌株保存方法等因素。此外，水稻品种抗性不利于宿主昆虫——褐飞虱的生长发育，是否进而影响黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力也值得关注。为此，本研究在筛选黄绿绿僵菌菌株和探索其保存方法的基础上，就共生菌Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与环境温度、水稻品种的关系进行了研究，并通过褐飞虱体内血细胞类型与数量的观察初步探讨了共生菌Arsenophonus影响黄绿绿僵菌毒力的机制。1、黄绿绿僵菌菌株的分离鉴定、毒力测定及保存方法比较：从田间病虫分离到一株褐飞虱黄绿绿僵菌菌株，利用ITS4/ITS5进行基因的克隆、测序和序列比对，从而确定该菌株与黄绿绿僵菌ARSEF1764相关序列的相似性为99%，可确定为ARSEF1764菌株。该菌株对褐飞虱有较强的毒力，处理后9d的褐飞虱发病率达73.5%。比较了滤纸片法和PDA平板法对黄绿绿僵菌的保存效果，发现采用两种方法保存的F4代菌株对褐飞虱的毒力有明显差异，褐飞虱喷菌处理后7d发病率分别为63%和23%，表明滤纸片法的保存效果明显较好。2、Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和温度的关系：喷施黄绿绿僵菌孢子悬浮液后，不同水稻品种上黄绿绿僵菌发病率均以含Arsenophonus的褐飞虱（下文简称BPH++）较低，而不同温度下的黄绿绿僵菌发病率则仅在25℃、27℃和29℃时于喷菌后第3d和5d时BPH++的发病率显著较低，其它温度下无显著差异。双因素方差分析结果发现，Arsenophonus与水稻品种双因素试验中均以BPH++黄绿绿僵菌的发病率显著较低，而Arsenophonus与温度双因素试验中仅在喷菌处理后第3d、5d以BPH++黄绿绿僵菌的发病率显著较低。温度显著影响褐飞虱的发病率，23℃~29℃为黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的适温范围，其中27℃时最为适宜；31℃和21℃条件时黄绿绿僵菌对褐飞虱毒力相对较弱。温度还影响BPH++与BPH--（不含Arsenophonus）试虫LT50的相对大小，其中27℃、29℃时BPH++试虫的LT50长于BPH--，在其它温度条件下则相同甚至较短。由上可知：共生菌Arsenophonus显著抑制黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力，且该作用受到温度的显著影响；温度亦显著影响黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力，而水稻品种以及Arsenophonus和水稻品种间、Arsenophonus和环境温度间的交互作用均无显著影响。3、Arsenophonus对黄绿绿僵菌处理的褐飞虱血细胞的影响：明确褐飞虱的3种血细胞种类，即浆血胞、粒血胞和脂血胞，其中浆血胞最多，粒血胞次之，脂血胞最少。BPH++、BPH--试虫的血细胞构成种类一致，褐飞虱体内3种血细胞数量均以浆血胞最多，粒血胞次之，脂血胞最少。黄绿绿僵菌处理后不同时间，不同血细胞数量的变化规律明显不同，其中，浆细胞数量在喷菌处理后1~5d的褐飞虱体内显著升高，且BPH++试虫高于BPH--试虫，并在第2d两者之间差异极显著；粒细胞和脂细胞数量则仅在黄绿绿僵菌处理初期有显著差异，且第0d和1dBPH--试虫显著高于BPH++试虫。推测浆细胞在褐飞虱应对黄绿绿僵菌感染过程中有重要作用，且Arsenophonus能进一步激发该作用；粒细胞和脂细胞的作用较不明显。I 综上所述，本文分离获得了对褐飞虱有较高毒力的黄绿绿僵菌ARSEF1764，滤纸片法适合其长期保存；褐飞虱感染Arsenophonus对黄绿绿僵菌的毒力有明显抑制作用，且该作用受环境温度的显著影响，但似与水稻品种无关。褐飞虱体内的浆细胞可能参与Arsenophonus对黄绿绿僵菌的褐飞虱毒力的抑制作用。研究结果为进一步揭示Arsenophonus在黄绿绿僵菌致病褐飞虱过程中作用和机制，进而为利用黄绿绿僵菌控制褐飞虱提供了重要的基础资料。关键词：褐飞虱，黄绿绿僵菌，Arsenophonus，影响因素，血细胞II AbstractThebrownplanthopper(BPH),Nilaparvatalugens(Stål)isaprimaryimportantricepestinChina.MetarhiziumflavovirideisakindofimportantentomopathogenicfungiinBPHs.Inourpreliminarystudies,wefoundthatsymbioticbacteriaArsenophonuscouldinhibitthevirulenceofM.flavoviridetoBPHs.PublishedresultshaveshownthatmanyfactorscouldaffectthevirulenceofM.flavoviride.Inaddtiontoitsvirulence,environmentaltemperatureandpreservationmethodsaretheonesofthosefactors.Furthermore,theeffectsofresistantricevarietiesonvirulenceofM.flavoviridetoBPHsshouldbefocused,duetotheirnegativeeffectsonthegrowthanddevelopmentofBPHs.Therefore,basedonthescreeningofM.flavoviridestrainsandexplorationofpreservationmethods,theinfluenceofArsenophonusonthevirulenceofM.flavoviridetoBPHswasstudied,alongwiththerelationshipbetweenArsenophonusandricevarieties,andArsenophonusandenvironmentaltemperature.AfterobservatinghemocytestypesandtheirnumbersinBPHs,themechanismthatArsenophonusaffectsonthevirulenceofM.flavoviridetoBPHswaspreliminarilyexplored.1.Isolation,identification,toxicitydeterminationandpreservationofM.flavoviride:AM.flavoviridestrainwasisolatedfromindividualsthathavebeeninfectedwithbacterias.Onesequencewasclonedusingonepariofprimers,ITS4/ITS5.Thesequencealignmentshowedthatthissequenceshared99%identitywiththatfromM.flavovirideARSEF1764.Accordingtothese,theM.flavoviridestrainwereconsideredasM.flavovirideARSEF1764.AfterexposuretoM.flavovirideARSEF1764for9d,theincidencerateofBPHswas73.5%,revealingitshighvirulence.Furthmore,theeffectofthefilterpaperpreservationmethodonvirulenceofM.flavoviridewascomparedwiththatofPDAculturedishpreservation.TheresultsshowedthatthedifferencevirulencesofM.flavovirideF4generationwerefoundbetweenthetwomethods.TheincidenceratesofBPHsthatwerefromtwomethodswere63%and23%,respectively.TheseresultsshowedthatthefilterpapermethodwasbetterthanPDAculturedishpreservation.2.EffectofArsenophonusonthevirulenceofM.flavoviridetoBPHsanditsrelationshipwithricevarietiesandtemperatures:AfterexposuretothesporesuspensionsofM.flavoviride,theincidenceratesofBPHswithArsenophonus(BPH++)toM.flavoviridewerelowerthanBPHswithoutArsenophonus(BPH--)foralltestedricevarieties.Outoftestedtemperatures,onlyat25°C,27°Cand29°C,BPH++hadlowerincidenceratesthanBPH--at3dand5d.Incontrast,therewasnosignificantdifferenceamongothertemperatures.Thetwo-wayANOVAbetweenArsenophonusandricevarietiesalsoindicatedthattheeachincidencerateofBPH++waslowerthanthatofBPH--.However,two-wayANOVAbetweenArsenophonusandtemperaturesonlyindicatedtheincidenceratesofBPH++werelowerthanthatofBPH--at3dand5d.TheeffectoftemperatureonthevirulenceofM.flavoviridetoBPHswassignificant.ThesuitabletemperaturerangeofM.flavovirideinfectedwithBPHwas23°C-29°C,amongwhich27°Cwasthebestone.ThevirulenceofM.flavoviridetoBPHswaslowat31°Cor21°C.ThetemperaturealsoaffectstheLT50ofBPHs.TheLT50ofBPH++waslongerthanthatIII ofBPH--at27°Cand29°C,respectively.However,theLT50ofBPH++wasequalorevenshorterthanthatofBPH--atothertemperatures.Insummary,ArsenophonussignificantlysuppressesthevirulenceofM.flavoviridetoBPHswhichisaffectedbytemperature.ThetemperaturealsoaffectsontheincidencerateofBPHstoMetarhiziumflavoviride,significantly.However,theeffectsofricevarietiesandinteractionsofArsenophonusandricevarietiesandArsenophonusandtemperaturesontheincidencerateofBPHswerenotsignificant,respectively.3.EffectofArsenophonusandM.flavovirideonhemocytesinBPH:TheresultsshowedthatthethreetypesofhemocytesinBPHswerefoundincludingplamatocyte,granulocyteandadipocyte.Amongthesehemocytes,thenumberofplamatocyteswerethehighest,followedbygranulocytesandadipocytes.ThetypesofhemocyteswerethesamebetweenBPH++andBPH--.Thenumbersofplamatocyteswerethehighest,followedbygranulocytesandadipocytesinBPHs.AfterexposuretoM.flavoviridefor1-5d,thenumbersofplamatocytesinM.flavoviride-treatedBPHswereincreasedsignificatly,andthenumbersofplamatocytesinBPH++werehigherthanthatofBPH--atdifferenttimes,andtherewasasignificantdifferencebetweentwospeciesofbrownplanthopperpopulationat2d.ThedifferenceswithingranulocyteandadipocytewerefoundattheearlystageofM.flavovirideexposure,andthenumbersofgranulocytesandadipocytesinBPH--werehigherthanthatofBPH++at0dand1d.ItisinferredthatplamatocyteplaysimportantrolsintheprocessofM.flavoviride,andArsenophonuscanpromoteitseffect.Theeffectsofgranulocyteandadipocyteonthisprocesswerenotsignificant.Insummary,M.flavovirideARSEF1764thathashighvirulencetoBPHwasisolatedandidentified.Thefilterpaperpreservationmethodissuitableforlong-termpreservationofM.flavovirideARSEF1764.ArsenophonussuppressesthevirulenceofM.flavoviridetoBPH.Thesuppressionisaffectedbytemperatures,butisnotrelativewithricevarieties.PlamatocyteofBPHmayparticipateintheinhibitionofArsenophonusonthevirulenceofM.flavoviridetoBPH.TheseresultsprovideanfundemtnalmaterialsforrevealingtherolesanditsmechanismofArsenophonusintheprocessofM.flavoviride,andforusingofM.flavoviridetocontrolBPH.Keywords:Nilaparvatalugens,Metarhiziumflavoviride,Arsenophonus,Influencefactor,HemocytesIV 目录第一章引言.......................................................................................................................11.1褐飞虱简介................................................................................................................11.2绿僵菌在褐飞虱生物防治中的应用........................................................................21.2.1绿僵菌的分类及形态特征..................................................................................21.2.2绿僵菌的侵染机制..............................................................................................21.2.3绿僵菌应用现状..................................................................................................41.3绿僵菌对稻飞虱毒力的影响因子............................................................................51.3.1共生菌Arsenophonus对绿僵菌致病力的影响.................................................51.3.2水稻品种对绿僵菌致病力的影响......................................................................71.3.3环境温度对绿僵菌致病力的影响......................................................................71.4寄主昆虫对绿僵菌的防御机制................................................................................71.4.1体壁防御..............................................................................................................71.4.2消化道防御..........................................................................................................81.4.3细胞防御..............................................................................................................81.4.4体液防御..............................................................................................................81.5本研究的目的与意义................................................................................................9第二章黄绿绿僵菌的分离鉴定、毒力测定及保存方法比较.....................................102.1材料与方法..............................................................................................................102.1.1供试材料............................................................................................................102.1.2黄绿绿僵菌的分离与纯化................................................................................102.1.3黄绿绿僵菌的培养及保存................................................................................132.1.4黄绿绿僵菌的活化及孢子悬浮液的配制........................................................142.1.5黄绿绿僵菌的毒力测定....................................................................................142.1.6两种保存方法对黄绿绿僵菌毒力的影响........................................................152.1.7统计分析方法....................................................................................................152.2结果与分析..............................................................................................................152.2.1黄绿绿僵菌的分离鉴定结果............................................................................15V 2.2.2黄绿绿僵菌的毒力测定结果............................................................................162.2.3两种保存方法对黄绿绿僵菌毒力的影响结果................................................172.3讨论..........................................................................................................................18第三章Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和温度的关系.....203.1材料与方法..............................................................................................................203.1.1供试材料............................................................................................................203.1.2试验设计............................................................................................................223.1.3统计分析方法....................................................................................................223.2结果与分析..............................................................................................................223.2.1Arsenophonus和水稻品种对黄绿绿僵菌毒力的影响结果.............................223.2.2Arsenophonus和温度对黄绿绿僵菌毒力的影响结果.....................................263.3讨论..........................................................................................................................29第四章Arsenophonus对黄绿绿僵菌处理的褐飞虱血细胞的影响.............................324.1材料与方法..............................................................................................................324.1.1供试材料............................................................................................................324.1.2试验设计............................................................................................................324.1.3统计分析方法....................................................................................................334.2结果与分析..............................................................................................................334.2.1血细胞类型与数量............................................................................................334.2.2BPH++、BPH--试虫黄绿绿僵菌处理后不同时间的血细胞数量（DHC）..344.3讨论..........................................................................................................................40第五章全文结论与展望.................................................................................................415.1结论..........................................................................................................................415.1.1黄绿绿僵菌菌株的分离鉴定、毒力测定及保存方法比较............................415.1.2Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和温度的关系.....415.1.3Arsenophonus对黄绿绿僵菌处理的褐飞虱血细胞的影响.............................415.2本论文的特色与创新之处......................................................................................425.3展望..........................................................................................................................42参考文献.............................................................................................................................43附录..................................................................................................................................52VI 致谢..................................................................................................................................54作者简历.............................................................................................................................55VII 图表清单表1.1A.nasoniae基因组一般统计学特征表……………………………………….......6图2.1不同绿僵菌菌株的序列比对图…………………………………………………..16图2.2不同处理时间下褐飞虱成虫的累积发病率……………………………………..17图2.3两种保存方法下的黄绿绿僵菌处理后褐飞虱校正发病率的比较……………..18图3.1黄绿绿僵菌处理后三个水稻品种上含Arsenophonus与不含Arsenophonus褐飞虱发病率的比较…………………………………………………………………..22表3.1喷菌后3d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..22表3.2喷菌后5d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..23表3.3喷菌后7d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..23表3.4喷菌后9d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..24图3.2共生菌Arsenophonus（左）和水稻品种（右）对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的影响…………………………………………………………………………………..24图3.3黄绿绿僵菌处理后在不同温度条件下含Arsenophonus与不含Arsenophonus褐飞虱发病率的比较………………………………………………………………..25表3.5喷菌后3d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..26表3.6喷菌后5d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..26表3.7喷菌后7d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..27表3.8喷菌后9d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..27图3.4共生菌Arsenophonus（左）和温度（右）对褐飞虱黄绿绿僵菌校正发病率的影响…………………………………………………………………………………..28表3.9不同温度下黄绿绿僵菌处理后褐飞虱的致死中时间LT50……………………..28表4.1不同类型血细胞的形态特征……………………………………………………..31图4.1褐飞虱雌成虫血细胞类型………………………………………………………..32VIII 图4.2褐飞虱雌成虫不同血细胞的数量比较…………………………………………..32表4.2Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的浆血胞数量三因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..34表4.3Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的粒血胞数量三因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..35表4.4Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的脂血胞数量三因素方差分析结果…………………………………………………………………………………..36图4.3不同时间BPH++、BPH--及喷菌与否的褐飞虱雌成虫血细胞数量的比较…………………………………………………………………………………..37图4.4不同时间褐飞虱雌成虫血细胞的数量比较……………………………………..37IX 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称BPHBrownplanthopper褐飞虱PDAPotatoDextroseagar马铃薯葡萄糖琼脂DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核苷酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应dNTPDeoxy-ribonucleotidetriphosphate三磷酸脱氧核苷X-galβ-galactosidase5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷LBLuria-BertaniLB培养基NCBINationalstatebiotechnologyinformationcenter美国国立生物技术信息中心BLASTTheBasicLocalAlignmentSearchTool一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具qPCRQuantitativereal-timePCR实时荧光定量PCRX 第一章引言1.1褐飞虱简介水稻（Oryzasativa）是我国最重要的粮食作物之一，约占粮食总产量的40%，在保障国家持续的粮食供给中扮演着重要角色（程式华等,2008;梁永书等,2016）。同时，水稻害虫是制约水稻生产的主要生物因子，每年给水稻生产造成严重损失（傅强等,2013）。褐飞虱（Nilaparvatalugens）属于半翅目飞虱科（Hemiptera:Delphacidae），是危害水稻生产的主要害虫（程遐年等,2003）。褐飞虱的卵一般为香蕉形，中间略微弯曲，上端呈尖形，下端呈椭圆形。长约1.04mm，宽0.22mm。若虫分为5个龄期。体色随着龄期的增长而加深，待二龄时翅芽开始长出，五龄时可看到明显的翅芽。成虫具有两种翅型：长翅型，体连翅长雄虫3.6~4.2mm，雌虫4.2~4.8mm；短翅型，体连翅长雄虫2.4~2.8mm，雌虫2.8~3.2mm（傅强等,2015）。褐飞虱的口器为刺吸式，通过吸食水稻茎秆韧皮部的汁液获取营养，并对稻株造成危害。危害情况主要表现为：叶片中的水分含量下降，稻株营养成分流失，造成稻谷颗粒干瘪，总重量降低；而且在取食时分泌蜜露，滋生烟霉，严重时稻丛1/3以下或全部部位变黑；此外，褐飞虱取食时可传播水稻草状矮缩病（ricegrassystuntvirus,RGSV）和齿叶矮缩病（riceraggedstuntvirus,RRSV）等病毒，间接对稻株造成危害（Naultetal.,1989;Hibino,1996;丁锦华等,2012）。高密度的褐飞虱可对稻株造成严重的危害，导致稻株整株枯死，引起“虱烧”（Zhangetal.,2004）。据统计，自20世纪80年代以来，我国每年因褐飞虱的危害造成谷物损失的重量可达10~15亿Kg（傅强等,2015）。以往，褐飞虱是我国及其它亚洲国家的一种次要水稻害虫，但自20世纪60年代后期以来，已成为我国和多数亚洲国家水稻上的重要害虫（Sogawa,1982;丁锦华等,2012）。目前，防治褐飞虱主要依赖于化学杀虫剂的使用和抗虫水稻品种的应用。一方面，化学防治是防治褐飞虱的重要手段（Endoetal.,2001）。有机氯类杀虫剂曾被广泛地使用，随后有机磷类和氨基甲酸酯类农药成为化学杀虫剂中的中坚力量。但是，由于它们存在高残留、选择性差等不足而逐渐被淘汰掉。目前，应用较多的是新型高效氯化烟碱类杀虫剂。但是，由于化学杀虫剂使用方法和使用量不当，导致褐飞虱产生高抗性而对水稻造成危害（Heinrichsetal.,1984;Hirai,1993）。另一方面，抗性品种的应用是水稻害虫防治较为安全有效的手段（Khush,2001）。20世纪70年代初至80年代，含有Bph1或Bph2和Bph3等抗性基因的水稻品种曾一度控制住了褐飞虱的危害（Khushetal.,1991;PenalverCruzetal.,2011）。但是，由于褐飞虱对水稻品种的致害性发生改变，致使抗性水稻品种的抗性丧失，阻碍了抗性水稻品种的选育和推广，成为有效利用水稻品种防治褐飞虱工作中面临的一大难题（吕仲贤等,2001;周亦红等,2003b;傅强等,2015）。化学杀虫剂污染环境，破坏生态平衡，抗性水稻品种的培育又面临困境，探索其它途径防治褐飞虱就显得尤为重要。目前，利用天敌、病原微生物等生物防治技术防治褐飞虱是研究的一大热点。1 1.2绿僵菌在褐飞虱生物防治中的应用生物防治技术广泛应用于农业害虫的防治中（肖英方等,2013）。目前，关于稻飞虱的生物防治研究得比较多的主要包括两个方面：1）天敌，包括蜘蛛（孟伟华等,2007）、稻虱缨小蜂（林庆胜等,2009）、寄生蜂（毛润乾等,1999;张晓燕等,2014）和黑肩绿盲蝽（峗庆才,1988;娄永根等,1996;黄林茂等,2010）；2）病原菌，研究较多的有白僵菌、绿僵菌和虫霉。其中，绿僵菌（Metarhizium.sp）是一类重要的生防真菌，全世界大约有200多种昆虫、线虫及螨类可以被其感染致死（Mnyoneetal.,2010）。绿僵菌作为一种潜在的病原真菌，在稻飞虱的生物防治中的作用突出。刘苏等（2010）研究发现金龟子绿僵菌Ma22的浓度为1×109、1×1010个孢子/L时，褐飞虱若虫的LT50值分别为5.38d、4.52d。潘春艳等（2016）将0.05μg/μL褐飞虱体内的dsCHSA与绿僵菌混用防治褐飞虱，褐飞虱2、4龄若虫的死亡率分别为89.63%和93.94%。张松影等（2011）用高毒力的黄绿绿僵菌Mf82对褐飞虱成虫进行防治，试虫的防治效果显著，死亡率高达83.8%。1.2.1绿僵菌的分类及形态特征绿僵菌的分类地位依次隶属于真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomyeetes）、球壳菌目（Sphaeriales）、麦角菌科（Elavisipitetaeeae）（蒲蛰龙,1996）。Sorokin建立了绿僵菌属MetarhiziumSorokin。Tulloch（1976）和Rombach等（1986）分别对金龟子绿僵菌（M.anisopliae）和黄绿绿僵菌（M.flavovirideGamsandRozsypal）下面的变种进行了划分，其中金龟子绿僵菌包括小孢变种（M.anisopliaevar.anisopliae）和大孢变种（M.anisopliaevar.majus），黄绿绿僵菌划分为黄绿小孢变种（M.flavovirideGamsandRozsypalvar.minusRombach）和大孢变种（M.flavovirideGamsandRozsypalvar.flavovirideRombach）。樊美珍等（1994）又进一步将绿僵菌划分为7个种或变种：白色绿僵菌（M.albumPetch）、金龟子绿僵菌小孢变种（M.anisopliaevar.anisoplia）、大孢变种（M.anisopliaevar.majus）、双型孢绿僵菌（M.biformisporae）、黄绿绿僵菌小孢变种和戴氏绿僵菌（M.taiiZQ.LiangandA.Y.Liu）。绿僵菌的菌落特征为：绿僵菌在培养基上进行培养，随着菌丝的生长发育，菌落呈显出白色绒毛状，后期为絮状；待其长出分生孢子后，整个菌落呈现出绿色，有时为黄绿色；受到绿僵菌感染的寄主昆虫体表布满绿僵菌的菌丝，整个虫体呈现出白色；分生孢子为单孢，通常呈柱形至卵圆形，通常中部稍细，在瓶梗上向基性排列成分生孢子长链，成堆时颜色呈绿色或黄绿色（蒲蛰龙,1996）。1.2.2绿僵菌的侵染机制寄主昆虫的体壁是绿僵菌入侵寄主昆虫的主要途径，还有消化道和气门也是绿僵菌入侵的主要方式（Liuetal.,2010）。绿僵菌通过5步来完成对寄主昆虫的侵染：1）分生孢子附着于寄主昆虫表皮；2）分生孢子在寄主昆虫表皮上萌发；3）穿透寄主昆虫表皮；4）菌丝在寄主昆虫血腔内生长并产生有毒物质；5）菌丝穿出寄主昆虫体表，形成新的分生孢子并进行再侵染（Robertset2 al.,1981）。1.2.2.1分生孢子附着于寄主昆虫表皮绿僵菌分生孢子附着于寄主昆虫的体表，这是绿僵菌成功侵入寄主昆虫体表内部的第一步。绿僵菌自身含有的附着胞是可以识别寄主昆虫的，进而帮助绿僵菌顺利地入侵。绿僵菌分生孢子附着于寄主昆虫表皮的这一过程不是主动的和必然的。绿僵菌孢子表面和寄主昆虫体表的亲脂基团使得绿僵菌孢子的疏水表面可以在寄主昆虫疏水的外表皮上附着（McCoyetal.,1988）。此外，绿僵菌孢子和寄主昆虫的附着具有专化性，其中绿僵菌孢子所含有的抗原可能会影响绿僵菌的专化性。此外，寄主昆虫表皮还含有大量由蜡质层和脂蛋白组成的复合结构，这也可以影响寄主昆虫的专化性（Halletal.,1982;Rathetal.,1996）。除此以外，分生孢子表面还有一些与最初识别有关的抗原决定因子。在侵染过程中，绿僵菌孢子表面会产生一些酶和粘性物质，这些化学物质可以促进绿僵菌分生孢子和寄主昆虫之间的结合（Bouciasetal.,1988;王海川等,1999）。另外，分生孢子表面还可以产生一些蛋白质，并与寄主昆虫表皮的某些葡萄糖结合。由此可见，附着关系的建立并不是单一的过程，而是多种方式共同作用的结果（Fargues,1984）。1.2.2.2分生孢子在寄主昆虫表皮上萌发温湿度、寄主昆虫表皮的刺激因子和抑制因子等因素均能影响分生孢子的萌发率，进而直接影响绿僵菌对寄主昆虫的致病力。首先，分生孢子对生长环境的相对湿度要求较高，其能在寄主昆虫表皮萌发必须要有相对湿度较高的环境条件（王达,2009）。其次，寄主表皮的淀粉、几丁质和长链脂肪酸等化学物质刺激分生孢子萌发出芽管，并为孢子萌发提供营养；寄主昆虫表皮含有辛酸、癸酸等短链脂肪酸，这些物质可以对绿僵菌分生孢子的萌发起到抑制作用。1.2.2.3穿透寄主昆虫表皮表皮对于寄主昆虫来说至关重要，它是绿僵菌成功入侵寄主昆虫体内的第一道障碍，也是寄主昆虫对绿僵菌产生防御机制的第一步。芽管萌发时产生的机械压力和相关酶是穿透寄主昆虫表皮所必须具备的（Charnley,1984;St.Legeretal.,1989）。在绿僵菌侵染初期，分生孢子的表面产生亮氨酸氨基肽酶、脂肪酶、碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶等能与碳水化合物相结合的蛋白质和酶（Zimmermann,1993）。这些酶可以有效降解寄主昆虫的脂质层，这有利于芽管穿透寄主昆虫的表皮。附着胞之所以能成功地附着在寄主昆虫体表并穿入其上表皮，是因为胞内蛋白酶将附着胞体表的蜡层降解掉的缘故。1.2.2.4菌丝在寄主昆虫血腔内生长并产生有毒物质绿僵菌菌丝成功穿透寄主昆虫体表之后，下一步就是侵占寄主昆虫的血腔。此时，寄主昆虫也会相应地做出反应，主要为浆血胞和粒血胞等起免疫作用的细胞对绿僵菌进行吞噬和包囊作3 用，致使绿僵菌死亡（蒲蛰龙,1996）。但是，绿僵菌菌丝的蔓延速度快于寄主昆虫体内的血细胞的免疫反应速度，并且绿僵菌在侵占血腔的过程中还会产生一些有毒的代谢物，这些物质可以导致寄主昆虫血淋巴中相关酶的活性降低，进而抑制寄主昆虫对其产生的防御机制，导致寄主昆虫的免疫力迅速下降，最终寄主昆虫死亡（Vilcinskasetal.,1997）。1.2.2.5新的分生孢子的形成及再侵染寄主昆虫被绿僵菌侵染致死后，寄主昆虫的血腔中充满快速繁殖的菌丝，最终菌丝从寄主昆虫体表穿出。在合适的自然条件下，菌丝在寄主昆虫体表继续产孢，待遇到合适的寄主昆虫又可开始新的侵染循环。1.2.3绿僵菌应用现状绿僵菌能感染8目42科约200种农林害虫（Mnyoneetal.,2010）。绿僵菌可以有效地用于鳞翅目害虫的防治。绿僵菌对烟田上的斜纹夜蛾幼虫的防治效果显著（Dayakaretal.,2001;Rajeshetal.,2009）。Nguyen等（2007）和Kpindou等（2012）发现绿僵菌可有效防治棉花上的棉铃虫幼虫和蛹。赵俊生等（2001）采用绿僵菌防治甘蓝上的菜青虫和小菜蛾，5d后菜青虫的死亡率高达77.7%，7d后小菜蛾的死亡率高达74.5%。绿僵菌可以有效地用于鞘翅目害虫的防治。樊美珍等（1987）利用绿僵菌Ma83菌株分别在室内和田间对青杨天牛1龄幼虫进行毒力测定，结果表明绿僵菌Ma83菌株对青杨天牛1龄幼虫的防治效果较好，尤其是使用剂量为8925个孢子/mg虫体时，绿僵菌Ma83菌株对青杨天牛1龄幼虫的致死中时间为1.91d。赵文琴等（2005）采用浸渍法测定Bbr17菌株对铜绿绿金龟幼虫的感染率，发现Bbr17菌株对铜绿绿金龟幼虫的感染率可达95.83%。常静等（2015）分别将阿维菌素、茚虫威和鱼藤酮3种杀虫剂与绿僵菌孢子悬浮液混配使用，可有效地防治沙葱萤叶甲幼虫。同样，绿僵菌可以有效地用于半翅目害虫的防治。李茂业等（2015）研究发现，采用具有较高毒力的黄绿绿僵菌Mf96菌株的孢子悬浮液对烟粉虱2龄若虫进行生物防治，7d后累计校正死亡率为89.5%，LT50为3.65d。黄志等（2009）研究发现，单独利用绿僵菌JF-813或溴氰菊酯对荔枝椿蟓若虫进行防治，防治效果不显著，若是将两者混用防治荔枝椿蟓若虫，其平均死亡率为90.40%。绿僵菌已生产成商品制剂用于蝗虫的生物防治。Langewald等（1997）将5×1012孢子/Mu的绿僵菌油剂喷洒在沙漠飞蝗发生基地上，第11d，沙漠飞蝗的日死亡率达40%左右。张泽华等（2000）表明，若用2000ml/hm2绿僵菌油剂对小车蝗3龄蝗蝻展开田间防治，8d的虫口减退率达50.8%，防效达48.0%；12d的虫口减退率达89.2%，防效达88.1%，防治效果显著。刘宗祥等（2004）研究发现，将绿僵菌、绿百克和0号柴油按1：1：3的比例进行混配用于田间蝗虫的防治，大田样筐取样调查显示：7d平均虫口密度由391头/m2降至94头/m2，防效达75.8%。董辉等（2011）将绿僵菌油悬浮剂按6×107孢子/m2的量喷洒在试验区，15d的虫口减退率达77.88%，防效达73.34%；50d的虫口减退率达96.75%，防效达87.22%。4 1.3绿僵菌对稻飞虱毒力的影响因子绿僵菌菌株对害虫的毒力除取决于菌株自身的毒力外，还受到许多其他因素的影响。例如，较多高毒力菌株经多代培养后，菌株的毒力会下降（唐晓庆等,1996;张正坤等,2012）；菌株的生化特性（樊美珍等,1990）、寄主昆虫的发育历期和生理状况（王音等,2005）及温湿度（汪敏捷等,2014）等。下文重点就与褐飞虱生理状况有关的共生菌、水稻品种，以及对褐飞虱、病原菌、共生菌等均有作用的环境温度等几个重要因素的研究情况进行概述。1.3.1共生菌Arsenophonus对绿僵菌致病力的影响内共生菌是指存在于昆虫体内的共生细菌，其与昆虫的共生关系在自然界普遍存在（Brownlieetal.,2009），是体现昆虫生理状况的一个重要方面。初级内共生菌（primaryendosymbiont）和次级内共生菌（secondaryendosymbiont）是内共生菌的两种类型（Rainaetal.,2015）。其中，初级内共生菌存在于可以集合寄主体内细菌的菌胞体中，主要为寄主提供生长发育所需的各种必需物质（Douglas,1998;Moranetal.,2003;Thaoetal.,2004）。而次级内共生菌在寄主昆虫体内的位置不明确，不是寄主生长发育过程中所必需的（Douglas,1998;Thaoetal.,2004）。根据已有文献发现，次级内共生菌可以在提高寄主昆虫的耐热能力（Montlloretal.,2002），协助寄主昆虫抵御天敌（Ferrarietal.,2004;Vorburgeretal.,2010），提高寄主昆虫的耐药性（Kikuchietal.,2012），调控寄主昆虫生殖能力（Baldoetal.,2005）等方面发挥作用。沃尔巴克氏体Cardinium、Wolbachia及杀雄菌Arsenophonus是目前研究较多的共生菌，也是与寄主昆虫关系密切的次级内共生菌（Chieletal.,2007;Bressanetal.,2012;Sebastienetal.,2012）。就褐飞虱的研究而言，本实验室前期工作发现，内生共生菌Arsenophonus可显著降低黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染能力（陈宇等,2014），下文围绕Arsenophonus的研究情况进行介绍。1.3.1.1Arsenophonus的概述Arsenophonus首次在丽蝇蛹集金小蜂（Nasoniavitripennis）体内发现（Skinner,1985;Ghernaetal.,1991）。Arsenophonus进一步被命名为Arsenophonusnasonia（Ghernaetal.,1991）。Arsenophonus属细菌为革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）肠杆菌科(Enterobacteriaceae)（Trowbridgeetal.,2006）。A.nasoniae可进行体外培养，最佳温度为30℃，其培养基中加入1%胰胨后，呈现出圆、灰白菌落（Ghernaetal.,1991）。Arsenophonus可分布于多种昆虫的体内，包括白蜡虫(Ericeruspela)（刘魏魏等,2012）、烟粉虱(Bemisiatabaci)（Moutonetal.,2012）、丽蝇蛹集金小蜂（N.vitripennis）（Ghernaetal.,1991）、螺旋粉虱(Aleurodicusdisperses)（Zchori-Feinetal.,2002）、体虱(Pediculushumanus)（Allenetal.,2007）和褐飞虱（王渭霞等,2010）等昆虫体内。Arsenophonus的传播方式主要分为垂直卵传（Ghernaetal.,1991;刘魏魏等,2012）和水平传播（Zhouetal.,1998;Tayloretal.,2011;Ahmedetal.,2013;Jousselinetal.,2013）。5 1.3.1.2Arsenophonus的基因组及系统分析如表1.1所示，A.nasoniae基因组大小约为3.5Mbp，含有3332个编码基因，GC含量为37%，富含AT。相对于进化关系最接近的Proteusmirabilis（Pearsonetal.,2008）和Photorhabdusluminescens（Duchaudetal.,2003），其染色体大小最小。将褐飞虱的Arsenophonus16SrDNA基因与其它物种感染的Arsenophonus16SrDNA基因进行序列比对，并构建系统发育树，发现木虱科Diaphorinacitri，Glycaspicbrimblecombei和粉虱科Dialeurodeshongkongensis，Tetraleurodesacaciae体内的Arsenophonus与褐飞虱体内的Arsenophonus亲缘关系较近（王渭霞等,2010）。表1.1A.nasoniae基因组一般统计学特征表（Darbyetal.,2010）Table.1.1GeneralstatisticsandfeaturesfortheA.nasoniaegenomeFeaturesforA.nasoniaegenomeLengthCurrentgenomeassembly3567128bpContigs665(mediansize4Kbp,maximum43Kbp)Scaffolds143(mediansize7Kbp,maximum212Kbp)261sequencinggapsinscaffoldGCcontentofgenome37.37PredictedCDS3332Assignedfunction2495Conservedhypothetical441Hypothetical483(including120hypotheticalphageproteins)Transposons38Phagerelated410Plasmidrelated50Virulencerelated>400tRNAgene52RibosomalDNAEstimatedof8–10copiesnumberofthe16S,23S,5sGeneswithanerror1351.3.1.3Arsenophonus属共生菌的功能研究Arsenophonus主要通过影响寄主昆虫的生殖、抵抗力和免疫力等方面起重要作用。Arsenophonus被称为杀雄菌，其通过杀雄作用来调控寄主生殖，进而引起寄主昆虫的性比异常（Werrenetal.,2008;Engelstadteretal,2009），如丽蝇蛹集金小蜂（Skinner,1985;Ghernaetal.,1991）。但是，白蜡虫、骚扰锥蝽Triatomainfestans、卡纳尔鸽虱蝇Pseudolynchiacanariensis和美洲钝眼蜱Amblyommaamericanum中的Arsenophonus均不改变其性比（Hypsaetal.,1997;Daleetal.,2006;Clayetal.,2008;刘魏魏等,2012）。Arsenophonus对宿主抵抗力或免疫力的影响是一个值得关注的功能。研究发现，存在于欧洲狼蜂Philanthustriangulum触角中的Streptomyces可避免幼虫被真菌侵害（徐红星等,2009）。陈宇等（2014）推测褐飞虱体内的Arsenophonus在褐飞虱的免疫反应中起重要作用。此外，孙佳音等（2009）和王渭霞等（2010）研究发现，相较于Mudgo种群和ASD7种群，6 褐飞虱TN1种群体中感染Arsenophonus的试虫比例相对较高，推测Arsenophonus可能影响褐飞虱和不同抗性水稻品种之间的关系。1.3.2水稻品种对绿僵菌致病力的影响目前为止，抗性水稻品种的使用仍是作为主要的手段来减少褐飞虱的危害。水稻品种可通过抗生性、耐害性和不选择性阻止褐飞虱对其致害（弓少龙等,2017）。其中，抗生性主要指水稻品种对褐飞虱的取食量、寿命、成虫的产卵量和卵孵化率等方面产生影响进而影响其生长、发育和繁殖能力（刘光杰等,2003）。如，褐飞虱在TN1上的存活率显著高于抗性水稻品种RHT上的，表明抗性水稻品种是通过影响褐飞虱的寿命来对褐飞虱起防治作用的（刘玉坤等,2011）；褐飞虱在抗虫水稻Mudgo和IR56上的取食量和寿命显著低于TN1，这进一步验证了抗性水稻品种的抗生机制（周亦红等,2003a;郑瑜等,2016）。抗性水稻品种通过影响褐飞虱生长、发育和繁殖能力，是否会进而影响绿僵菌对褐飞虱的侵染能力，这是一个待研究的新问题。1.3.3环境温度对绿僵菌致病力的影响绿僵菌菌丝的生长，以及绿僵菌后期孢子的萌发都离不开适宜的环境条件。其中，温度通过影响绿僵菌的菌丝生长、孢子萌发和致病率等来影响其致病力（常金梅等,2010;岳梅等,2010;朱彬洲等,2010）。绿僵菌在15℃~35℃下均能正常生长，其中20℃~30℃为适宜生长的温度范围，25℃为最佳培养温度。汪敏捷等（2014）研究发现，温度高于或低于28℃条件时，绿僵菌对红缘天牛幼虫致死率都会减弱。朱彬洲等（2010）测定了3个温度条件下绿僵菌LA菌株对东亚飞蝗5龄蝗蝻的感染能力，发现30℃下该菌株的毒力最强。关于绿僵菌对稻飞虱的侵染致病温度条件的研究较少。杜光祖等（2015）指出24℃~30℃下，黄绿绿僵菌对灰飞虱3龄若虫均有致病力，其中27℃和30℃下的致病力较强。1.4寄主昆虫对绿僵菌的防御机制绿僵菌入侵的同时，寄主昆虫会利用自身的天然屏障来阻止绿僵菌的侵染，这些天然的屏障依次是寄主昆虫的体壁、消化道、血细胞和体液（蒲蛰龙,1996）。1.4.1体壁防御体壁作为第一道屏障，对防御病原菌的侵染起着关键作用。寄主昆虫体壁含有辛酸和癸酸等化学物质，这些物质均可以对孢子萌发起抑制作用。短链脂肪酸可对分生孢子膜的选择性产生有效的破坏作用，使分生孢子的代谢活动发生紊乱，从而起到抵御病原菌入侵的目的（翟锦彬等,1995）。此外，由于寄主昆虫体壁存在许多促进分生孢子萌发的中高链脂肪酸，导致短链脂肪酸7 的抑制作用有限（蒲蛰龙,1996）。1.4.2消化道防御寄主昆虫消化道中肠内侧有一层由几丁质、蛋白质和粘多糖组成的围食膜，是抵抗病原菌侵入体内的一道屏障。此外，消化道内存在一些植物性抗生素，可以抵抗病原菌和细菌的侵入（Glinskietal.,2003）。1.4.3细胞防御当绿僵菌突破寄主昆虫的体壁时，细胞防御具有重要作用。细胞防御反应主要依靠血腔内的各种血细胞对病原菌进行吞噬、结节形成和包囊作用（Hillyeretal.,2002;Hillyeretal.,2003）。吞噬作用主要是浆血胞和粒血胞等血细胞对小剂量微生物或颗粒进行吞噬（Blandinetal.,2007;Williams,2007）。例如，在黑腹果蝇中，主要是浆血胞参与吞噬过程（Williams,2007）。亚洲玉米螟中，粒血胞完成对病原菌的吞噬过程（梁子才等,1991）。结节形成是大剂量病原菌侵入寄主昆虫体内时所作出的防御反应，表现为血细胞结合到病原菌的集合体上，最终形成一个“鞘”将病原菌包围住（Lingetal.,2003;Hillyeretal.,2003;Costaetal.,2005）。此外，黑化现象伴随着结节形成。一般病原菌会在黑化的过程中死亡，但若黑化产生的醌的毒性不高，部分病原菌可能会从结节中脱离，再次进入血淋巴（Lavineetal.,2002;赵华福,2007）。包囊作用主要由原酚氧化酶级联产物、凝集素等物质参与反应。与结节形成的过程类似，也是结合到绿僵菌表面，最终将绿僵菌围成一个“鞘”，并阻碍绿僵菌的生长，进而杀死绿僵菌（蔡峻等,2000;吴姗等,2009）。1.4.4体液防御昆虫通过体液免疫来进行防御时，抗菌肽、凝集素及黑化反应在整个过程中均起主要作用。抗菌肽为碱性肽类物质，可有效地保护寄主虫体免受外源微生物的侵染。凝集素是一类促使细胞凝集的糖蛋白，其糖链为寡聚糖，其能识别病原物并与之结合，促进血细胞对病原物的包囊和黑化反应（蒋芸芸,2006;赵华福,2007）。黑化反应产生的黑化物质能杀死病原微生物，也能杀死寄主昆虫血细胞（蔡峻等,2000）。黑化反应是体液免疫中关键的组成部分，其中PO在整个过程中起重要作用，proPO是其在寄主昆虫表皮、血淋巴和血细胞中常见的存在形式。当病原微生物对血腔产生侵染时，proPO就会被特异性丝氨酸蛋白酶的级联反应激活，进一步裂解形成PO，导致醌类物质的产生。8 1.5本研究的目的与意义褐飞虱作为我国及多数亚洲产稻国水稻上的主要害虫，针对其进行的防治不可小觑。害虫的抗药性不断加强，抗性水稻品种防治害虫的能力降低，生物防治就显得尤为重要。黄绿绿僵菌作为重要的昆虫病原菌而备受关注。本实验室前期研究发现，褐飞虱内共生菌Arsenophonus可抑制黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力。已有研究表明，影响黄绿绿僵菌毒力的因素较多，除病原菌自身毒力外，还有环境温度、菌株保存方法等因素。此外，水稻品种抗性不利于宿主昆虫——褐飞虱的生长发育，是否进而影响黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力也值得关注。为此，本研究在筛选黄绿绿僵菌菌株和探索其保存方法的基础上，就Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与环境温度、水稻品种的关系进行了研究，并通过褐飞虱血细胞类型与数量的观察初步探讨了共生菌Arsenophonus影响黄绿绿僵菌毒力的机制。本研究在筛选对褐飞虱高毒力黄绿绿僵菌菌株以及探索其保存方法的基础上，针对前期研究发现的内生共生菌Arsenophonus可能抑制黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力的现象，进一步就共生菌Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与环境温度、水稻品种的关系进行了研究，并通过褐飞虱体内血细胞类型与数量的观察初步探讨了共生菌Arsenophonus影响黄绿绿僵菌毒力的机制。研究结果将为进一步揭示Arsenophonus在黄绿绿僵菌致病褐飞虱过程中作用和机制，探明影响黄绿绿僵菌毒力的关键因素，并进而为利用黄绿绿僵菌控制褐飞虱提供重要的基础资料。9 第二章黄绿绿僵菌的分离鉴定、毒力测定及保存方法比较黄绿绿僵菌隶属于绿僵菌属，是一类重要的昆虫病原菌。筛选高毒力黄绿绿僵菌菌株至关重要，然而菌株毒力退化又会影响黄绿绿僵菌在生物防治中的效果。本实验室曾筛选一株黄绿绿僵菌菌株，在实验室保存不久后丧失了毒力，因此探索和选用合适的保存方法保存菌株亦尤为重要。斜面移植法、蒸馏水保存法、矿物油保存法、液氮保存法和冷冻干燥法等是较为常见的保存真菌的方法（顾金刚等,2007;吴婧等,2011）。其中，斜面移植法和蒸馏水保存法每隔一段时间就需要移植一次，容易造成菌株的生物学特性的变异；矿物油保存法占用空间大，并且不易携带；液氮和冷冻干燥法操作方法复杂，耗时较长。本实验室前期筛选出黄绿绿僵菌ARSEF1764菌株，采用上述斜面移植法，继代移植次数超过10次，菌株毒力退化严重，试虫发病率不超过20%（未发表资料）。基于此，本实验通过形态观察和分子手段重新从富阳田间的感染绿僵菌的褐飞虱虫体上重新分离并鉴定出黄绿绿僵菌ARSEF1764菌株，测定了其毒力；同时优化了干菌丝保存方法（本文命名为滤纸片保存法）（杨水英等,2006），并测试了PDA平板和滤纸片两种保存法对菌株保存的效果。2.1材料与方法2.1.1供试材料供试虫源：褐飞虱采自浙江富阳田间，病虫为2015年采集的试虫；毒力测定用虫用TN1稻苗在无虫稻苗室内饲养20代以上。供试水稻：感虫品种TN1，种植于无虫网室中，待其长至分蘖期至拔节期即可使用。PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其成分包括马铃薯（去皮）400g、葡萄糖40g、琼脂粉40g，加蒸馏水至2000mL。配制好的培养基在121℃灭菌25min备用（方中达,1998）。2.1.2黄绿绿僵菌的分离与纯化2.1.2.1黄绿绿僵菌的分离纯化与DNA的提取病原菌采自富阳稻田的褐飞虱罹病虫体，用75%酒精体表消毒。用灭过菌的玻璃棒对罹病虫体进行研磨，用ddH2O配制孢子悬浮液，在载玻片上滴一滴孢子悬浮液，并在显微镜下观察孢子悬浮液中的孢子数，待一滴孢子悬浮液中有20~30个孢子时，用枪头吸一滴孢子悬浮液放至事先配好并已灭菌的PDA平板上，用接种环以顺时针的方向对孢子悬浮液进行均匀地涂布。涂布完成后，用封口膜将PDA平板封严，放至25℃人工智能培养箱中培养48h，挑取单菌落于PDA平10 板上培养纯化，所有操作在超净工作台上操作（吴发红等,2009）。用灭菌的接种环将纯化后的菌丝刮掉，放入灭菌的研钵中。采用真菌基因组DNA提取试剂盒（D2300,北京索莱宝科技有限公司）提取黄绿绿僵菌菌丝的DNA。具体步骤：1)用天平称取60mg菌丝放入事先已灭过菌的研钵中，并加入200μL溶液A，用研磨棒顺时针充分研磨菌丝，直至研磨的样品呈现半液体状态。将匀浆液倒入新的EP管中。2)取出事先在冰上解冻的RNaseA，向上述EP管中加入20μL，混匀。3)再加入事先在冰上解冻的蛋白酶K20μL，混匀，放入55℃水浴锅中消化，30min。4)用离心机12000rpm离心2min。用枪头小心地将上述溶液中的上清液转移至新的EP管中。将200μL溶液B加入上清中，混匀。5)再加入200μL无水乙醇，用1000mL的枪头反复吸打直至混匀，再用1000mL枪头将溶液加入吸附柱中，放置2min，12000rpm离心1min。用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。6)用枪头将700μL漂洗液小心地加入到吸附柱中，12000rpm离心1min。用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。7)用枪头再次吸取500μL漂洗液加入吸附柱中，12000rpm离心1min。用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。8)12000rpm空离2min，从离心机中拿出吸附柱，放置室温下晾干，大约10min，待吸附柱中残留的漂洗液挥发掉，即可进行下步实验。9)将吸附柱放入一个事先准备好的干净的EP管中，对准吸附膜底部（最好全部打到吸附柱的底部，不要在吸附柱的壁上残留），小心滴加50μL洗脱液（经65℃水浴预热），室温静置5min，12000rpm离心1min。10)将离心之后的洗脱液从收集管中取出，再转移至吸附膜中，室温静置2min，12000rpm离心2min。将所得DNA放入-20℃冰箱备用。2.1.2.2PCR扩增，，，采用ITS4/ITS5引物（ITS5-F:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3,ITS4-R:5-，TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）对上述病原菌的DNA进行PCR扩增，目标片段约为700bp（Whiteetal.,1990）。反应体系如下：Buffer2.5μLdNTP2.0μL正向引物0.5μL反向引物0.5μLrTaq酶0.125μLH2O18.375μLDNA模板1.0μL总体积25μL11 反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。采用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。2.1.2.3PCR产物回收将上述PCR产物电泳后得到的目标扩增带小心割下，并使用天根生物技术有限公司的DNA纯化试剂盒（DP214离心柱型）进行纯化，具体步骤如下：1)将目的DNA条带从电泳样板上小心切下，放入新的已称重的EP管中并编号，用天平对目的DNA条带进行称重。2)向上述EP管中加入PC，每0.1g溶胶块加入100μL的溶液。将溶胶块放入事先预热的50℃水浴锅中进行熔解。溶解的过程中可上下摇晃EP管，溶解时间大约10min。3)在溶胶块熔解期间，可进行柱平衡。向吸附柱中加入500μLBL，12000rpm离心1min，用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。4)将上述所得溶液加入已进行柱平衡的吸附柱中，12000rpm，离心1min，用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。5)用1000mL枪头将600μLPW加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，用枪头将上述收集管底部的液体吸出并丢掉，将吸附柱再次放入收集管中（注意吸附柱的底部最好不要碰到收集管的管口）。6)重复步骤5的操作过程。7)将吸附柱再次放入收集管中，12000rpm空离2min。从离心机中拿出吸附柱，放置室温下晾干，大约10min，待吸附柱中残留的漂洗液挥发掉，即可进行下步实验。8)将吸附柱放入一个干净的EP管中，并对准吸附膜底部（最好全部打到吸附柱的底部，不要在吸附柱的壁上残留）滴加30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min。所得溶液即为DNA溶液。2.1.2.4连接、转化1)连接：产物回收之后，最好即可进行连接反应，在新的1.5mLEP管，加入下表反应体系中的溶液pEASY-T3CloningVector1μL回收DNA片段4μL总体积5μL将上述反应体系轻轻混匀并稍微离心，室温反应10min(若所要连接的片段大于1Kb，反应时间可适当延长，但最长反应时间不要超过30min)。2)转化：12 在上述体系反应期间，将感受态细胞从-80℃冰箱取出，放置于冰上冻融；将感受态细胞加入上述反应体系中（此操作在冰上进行），每管反应体系加50μL，用手指轻弹混匀，即可置于冰上，冰浴30min；在42℃水浴锅中热击30s，立刻放置于冰上2min；在无菌操作台中，每管加入300μLSOC培养基，盖紧盖子，37℃下，200转摇床摇菌1h；在无菌操作台中，将70μLX-gal、20μLIPTG用酒精灭菌的涂布棒均匀地涂布在含Amp的LB固体培养基上；向事先摇好的菌液中加入200μL含Amp的LB液体培养基，用1000mL移液枪吸打混匀后，取出200μL，用酒精灭菌的涂布棒均匀地涂布在上述固体培养基上并做好标记；将涂布好的培养基放到37℃的培养箱中培养，先正面朝上30min，再颠倒过来，过夜培养12h。2.1.2.5ITS4/ITS5克隆筛选及测序在超净台中，吸取700μL含Amp的LB液体培养基于2mLEP管中，用已灭菌的小号白枪头挑取上述过夜培养的LB平板上的白斑（注意观察白斑是否在枪头上），将挑选的白斑放到上述EP管中，每个平板挑选3~5个白斑；37℃培养箱内，200转摇床摇菌4~6h；孵育2h时，进行菌液PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶检测目的片段是否为假阳性；孵育4h后，可将上述检测含有目的条带的菌液依次分别吸取200μL并编号，送至铂尚公司进行测序；待测序完成，用GeneDoc软件与原序列进行比对，分析序列的正确性，再在NCBI中进行Blast分析，最终确定所测菌株的种类。菌液PCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μLMg2+(25mol/L)2μLdNTPMixture(2.5mM)2μLM13-F(10mM)0.5μLM13-R(10mM)0.5μLrTaq0.25μL菌液1.0μLddH2O17.25μL总体积25μL菌液PCR反应程序：94℃10min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环，72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳对菌液PCR产物进行检测。2.1.3黄绿绿僵菌的培养及保存2.1.3.1黄绿绿僵菌的培养将“2.1.2”中分离及鉴定出来的黄绿绿僵菌菌株作为原始菌株F0代，将黄绿绿僵菌F0代接（平行划线）到PDA培养基平板上进行继代培养，每代均在25±1℃下黑暗培养10d。2.1.3.2黄绿绿僵菌的保存13 本研究主要采用滤纸片保存法进行菌种的保存，具体方法：1)将PDA培养基倒在灭菌的培养皿上，待其凝固，在其周围围一圈滤纸（2×2cm），大概7~8个；2)用接种针挑取少许绿僵菌菌丝接在用滤纸围成的圆圈的中央；3)用封口膜将平板的四周封严，在25℃人工智能培养箱中培养；4)大概2周后，待菌丝长到滤纸上，将滤纸放到灭菌的牛皮纸中，用胶带对牛皮纸进行封口，放在30℃烘箱中，烘1d；5)将烘干后的牛皮纸放在塑料封袋中，并用封口机封口，放在有硅胶的塑料盒中，用透明胶带将塑料盒的四周封严，-20℃冰箱中保存2d，再放在-80℃冰箱中，备用。2.1.4黄绿绿僵菌的活化及孢子悬浮液的配制前述保存的黄绿绿僵菌用于昆虫接种前，需活化并制备成孢子悬浮液。具体方法：在紫外灭菌的超净台中，将冰箱中取出的黄绿绿僵菌放置至室温后，接到PDA培养基平板上，并用封口膜将平板的四周封严，在25±1℃的人工智能培养箱中黑暗培养10d。待菌株充分产孢后，用灭菌的5mL枪头吸取5mL含0.05%Tween-20ddH2O，充分击打PDA平板上无杂菌的黄绿绿僵菌孢子，将黄绿绿僵菌孢子悬浮液放入50mL的螺纹口收集瓶中，再放入搅拌子，放到搅拌器上充分搅拌30min，将所得孢子悬浮液放到灭过菌的纱布上进行过滤，所得溶液即为孢子悬浮液母液。在光学显微镜下用血球计数板对分生孢子进行计数，并用血球计数板的计算公式计算每毫升孢子悬浮液母液的分生孢子含量，然后将孢子悬浮液的母液配制成1.0×108个孢子/mL的含量，备用。2.1.5黄绿绿僵菌的毒力测定设置2个实验组：处理组1个，即取24h内初羽化的雌成虫，喷施5mL黄绿绿僵菌F2代菌株孢子悬浮液，随后转移至TN1稻苗上笼罩饲养；对照组1个，取类似的初羽化雌成虫，均喷施5mL0.05%Tween-20，不喷施黄绿绿僵菌F2代菌株孢子悬浮液；每个实验组重复3次，每个重复接40头试虫。黄绿绿僵菌孢子悬浮液或Tween-20均匀喷至稻苗与试虫体表。处理后置于温度（25±1℃）、RH（85±5%）和光周期14L:10D的培养箱中饲养。去除喷菌后第1d死虫（推测为机械损伤引起的非正常死亡），将余下活虫作为基数，喷菌后第3d开始观察褐飞虱的死亡情况，隔日观察至处理后第9d。每次检查后移出僵虫（体表长出黄绿绿僵菌菌丝的僵虫）和死虫（体表未长出黄绿绿僵菌菌丝的死虫），并将死虫转移至培养皿中继续保湿培养，3d后记录各重复的发病虫数（包括：体表长出黄绿绿僵菌菌丝的僵虫及经PCR检测呈阳性的未长出菌丝的死虫），计算各处理的发病率。若未喷绿僵菌的试虫出现病虫，则以同次观察的同一品种上同类试虫的Tween-20对照为参照计算校正发病率。为检测体表未长出黄绿绿僵菌的死亡个体中是否感染黄绿绿僵菌，采用PCR方法予以确认。上述所有死亡个体参照“2.1.2.1”和“2.1.2.2”的方法完成黄绿绿僵菌的基因组DNA的提取和PCR的扩增，其中随机挑选20%死亡个体的PCR扩增产物参照“2.1.2.3”、“2.1.2.4”和“2.1.2.5”14 的方法测序。利用Genedoc进行多序列比对，分析测序结果，并通过与本文鉴定的黄绿绿僵菌ARSEF1764的目的序列（ITS4/ITS5）的一致性进行判断。2.1.6两种保存方法对黄绿绿僵菌毒力的影响为比较两种保存方法的保存效果，对“2.1.3.2”所述的滤纸片保存法和PDA平板保存法进行了比较。其中PDA平板保存法操作方法为：将黄绿绿僵菌F0代接（平行划线）到PDA培养基平板上进行继代培养，每代均在25±1℃下黑暗培养10d。并从中选取菌丝长势好、产孢量多且无杂菌的黄绿绿僵菌PDA平板放到4℃冰箱中保存。取通过上述两种方法保存的F4代菌株，按“2.1.4”进行孢子悬浮液制备后开展以下实验：处理组2个，即取24h内初羽化的雌成虫，分别喷施5mL采用PDA平板和滤纸片两种保存法保存的黄绿绿僵菌F4代菌株孢子悬浮液，随后转移至TN1稻苗上笼罩饲养；对照组2个，取类似的初羽化雌成虫，均喷施5mL0.05%Tween-20，不喷施黄绿绿僵菌F4代菌株孢子悬浮液；每个实验组重复3次，每个重复接40头试虫。黄绿绿僵菌孢子悬浮液或Tween-20均匀喷至稻苗与试虫体表。处理后置于温度（25±1℃）、RH（85±5%）和光周期14L:10D的培养箱中饲养。病虫观察及校正发病率的计算同“2.1.5”。2.1.7统计分析方法测得的序列之间进行相互比对，检查测序结果的一致性，再用NCBI的BLAST软件进行相似性搜索，确定所得序列对应的菌株种类。利用DPS数据处理软件（V14.10）（唐启义,2013）的方差分析模块进行单因素方差分析，百分数数据进行分析前进行反正弦平方根转换。2.2结果与分析2.2.1黄绿绿僵菌的分离鉴定结果病原菌用ITS4/ITS5引物序列扩增克隆，序列长626bp，在NCBI比对得出所分离到的病原菌（1-626bp）与黄绿绿僵菌ARSEF1764菌株（87-711bp）高度同源，相似性99%。此外，褐飞虱基因库中无该条序列，推测供试病原菌菌株是黄绿绿僵菌ARSEF1764。另外，上文“2.1.5”、“2.1.6”及下文的“3.1.2.1”、“3.1.2.2”中挑选的20%死亡个体的PCR扩增产物的序列与供试菌株的ITS4/ITS5序列一致。15 图2.1不同绿僵菌菌株的序列比对图Fig.2.1SequencealignmentgraphofdifferentstrainsofMetarhizium注：L：实验所得菌株的5.8SrDNA序列；A：田间所得菌株的5.8SrDNA序列；H：NCBI中黄绿绿僵菌ARSEF1764菌株的5.8SrDNA序列。Note:L:The5.8SrDNAsequenceofthestraininourlaboratory;F:The5.8SrDNAsequenceofthestraininourpaddyfield;N:The5.8SrDNAsequenceofM.flavoviridevar.minusstrainARSEF1764inNCBI.2.2.2黄绿绿僵菌的毒力测定结果从图2.2中可以看出，处理后第3d的累计发病率较低，之后迅速上升，至第9d褐飞虱累积发病率达到73.5%；而9d内对照组褐飞虱累积发病率仅为3.03%。并且同一时间内处理组褐飞虱累积发病率均极显著高于对照组的。此外，黄绿绿僵菌处理后，褐飞虱发病效果好于本实验室16 前期筛选的黄绿绿僵菌菌株（最高发病率仅55.2%，见陈宇等，2014）。图2.2不同处理时间下褐飞虱成虫的累积发病率（平均值±标准误）Fig.2.2TheaccumulateincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersadultunderdifferenttreatedtime（Mean±SE）注：同一时间不同处理柱图上方具*、**分别表示在显著水平0.05、0.01时有显著差异，ns表示无显著差异（p>0.05）；下同。Thebarwith*、**forasameobservation-dayshowedsignificantdifferenceatthelevelof0.05,0.01,nsshowednosignificantdifference（p>0.05）.Thesameasinthefollowing.2.2.3两种保存方法对黄绿绿僵菌毒力的影响结果从图2.3中可以看出，采用滤纸片保存法保存的F4代菌株喷施至褐飞虱后的第5d和7d，褐飞虱校正发病率分别为45%和63%，均显著（p<0.05）高于采用PDA平板保存法保存的校正发病率（分别为11%和23%）。此外，尽管第1d和9d两者之间没有显著差异，但前者的校正发病率（分别为7%和70%）亦高于后者（分别为2%和50%）。此外，采用PDA平板保存法保存的菌株的后代易感染杂菌，不利于菌株的纯化。因此，本文认为采用滤纸片保存法保存菌株效果较好。17 图2.3两种保存方法下的黄绿绿僵菌处理后褐飞虱校正发病率的比较（平均值±标准误）Fig.2.3ThecorrectedincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersunderdifferentpreservationmethods(Mean±SE）2.3讨论本实验从田间的褐飞虱罹病虫体上分离纯化了一株绿僵菌菌株，通过形态特征和分子手段鉴定为黄绿绿僵菌ARSEF1764。黄绿绿僵菌处理后，褐飞虱发病率超过70%，效果好于陈宇等（2014）筛选出的黄绿绿僵菌菌株（褐飞虱发病率最高为55.2%），说明该菌株的致病力较好。随着菌株继代次数的增加，黄绿绿僵菌菌株出现退化现象，其毒力也随之降低，大大减弱了黄绿绿僵菌在害虫生物防治中的作用。本实验室分离到的黄绿绿僵菌菌株曾因保存不善而失活。因此，选择合适的菌株保存方法至关重要。常见的斜面移植法和蒸馏水保存法易引起菌株的生物学特性变异，矿物油保存法占用空间大，液氮保存法和冷冻干燥法不易操作，而干菌丝保存法操18 作简单，易保存。因此，本实验进一步优化干菌丝保存法（滤纸片保存法），并针对PDA平板和滤纸片两种保存方法条件下的黄绿绿僵菌菌株的毒力进行了研究，发现采用滤纸片保存的菌株的毒力较好，无污染。而采用PDA平板保存的菌株易感染杂菌。因此，该实验采用滤纸片保存法对黄绿绿僵菌ARSEF1764菌株进行保存。19 第三章Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和温度的关系Arsenophonus是褐飞虱体内一类常见的内生共生菌，本实验室前期的研究发现Arsenophonus可显著降低黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染能力（陈宇等,2014）。环境温度是影响绿僵菌毒力的重要因素。研究表明，环境温度主要对黄绿绿僵菌菌株的生长、发育和孢子萌发等方面产生影响。常金梅等（2010）研究发现，绿僵菌MC3在23℃~26℃时，随着温度的升高，生长速度显著增长；岳梅等（2010）报道绿僵菌LA菌株在前12h孢子萌发速率从高到低为30℃>35℃>25℃>20℃>40℃，LA菌株孢子在20℃~35℃下24h内孢子萌发率达到90%以上，而40℃下无萌发现象；李佳颖等（2013）研究发现黄绿绿僵菌SM076在17℃~32℃温度范围内均可生长和产孢，26℃下菌落生长速度最快，孢子萌发率最高，而23℃左右则最适产孢。关于绿僵菌对稻飞虱的侵染致病温度条件的研究较少。杜光祖等（2015）指出24℃~30℃下，黄绿绿僵菌对灰飞虱3龄若虫均有致病力，其中27℃和30℃下的致病力较强。水稻品种抗性不利于褐飞虱的生长发育或繁殖（Wangetal.,2015），其是否会进而影响Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的作用？亦是一个值得关注的重要问题。为此，本研究拟通过两个双因素实验开展两方面的研究：1）共生菌Arsenophonus（含、不含）与水稻品种（TN1、IR56和Mudgo）对黄绿绿僵菌致病褐飞虱的影响；2）Arsenophonus（含、不含）和温度（21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和31℃）对黄绿绿僵菌致病褐飞虱的影响，拟进一步明确Arsenophonus对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的影响及其与水稻品种和温度的关系。主要结果如下。3.1材料与方法3.1.1供试材料3.1.1.1供试昆虫按下述方法分离鉴定得到的含Arsenophonus的褐飞虱（下文称为：BPH++）和不含Arsenophonus的褐飞虱（下文称为：BPH--），用TN1稻苗室内饲养。3.1.1.1.1褐飞虱种群配对饲养各取60头褐飞虱富阳室内种群的雌雄成虫（羽化24h内），按照1:1配对，饲养于TN1稻苗上，10d后取出雌雄虫并且编号存于-80℃冰箱中备用。配对期间，若雌虫在5d内死亡，则该笼试虫无效；若雄虫在3d内死亡，则需要另选初羽化的雄成虫继续配对。若雌虫在5~10d内死20 亡，则取出死虫，记录死亡日期并对其进行编号，存于-80℃冰箱中备用。3.1.1.1.2褐飞虱DNA的提取采用王渭霞等（2010）提取褐飞虱DNA的方法对上述褐飞虱进行DNA的提取，步骤如下：1)将试虫置于1.5mLEP管。2)将150μL提取液加入上述EP管中，用灭菌的玻璃棒充分研磨（注意充分研磨样品，待液体中没有固体样品残留方可使用），放到65℃水浴锅中温浴30min。3)加入28μL8.0mol/LKAc(pH9.0)，冰浴30min。4)加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）振荡混匀后，12000r/min离心15min。5)小心吸取200μL上清液并放置于新的EP管中（注意溶液的分界线），用200μL预冷的无水乙醇在室温下沉淀1h，12000r/min离心15min。6)用70%酒精洗涤沉淀。7)沉淀洗涤完成后，室温下管口朝下放置10min，待沉淀充分，加入40μLddH2O溶解，放入4℃冰箱，备用。3.1.1.1.3PCR扩增，，，采用23S-F/R特异引物（23S-F:5-CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA-3,23S-R:5-，GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC-3）对上述褐飞虱的DNA进行PCR扩增（Thaoetal.,2004;Ghanimetal.,2009）。反应体系：参照“2.1.2.2”的反应体系反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，38个循环，72℃延伸7min。采用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。3.1.1.1.4BPH++、BPH--种群的获得与保持琼脂糖凝胶电泳后，将检测出目的条带的褐飞虱雌虫后代和未检测出目的条带的褐飞虱雌成虫后代分别单独进行饲养。待其后代长至3~4龄，每笼分别取出30头再进行PCR检测，挑选全部检测出目的条带的后代，即为BPH++种群；挑选全部未检测出目的条带的后代，即为BPH--种群。分别饲养于TN1稻苗上，取羽化24h内的雌成虫用于后续试验。3.1.1.2供试菌株第二章分离鉴定得到的黄绿绿僵菌ARSEF1764。将黄绿绿僵菌接到PDA培养基平板上，在25±1℃的人工智能培养箱中黑暗培养10d。3.1.1.3供试水稻21 感虫品种TN1、抗虫品种IR56（含抗虫基因Bph3）和Mudgo（含抗虫基因Bph1），均种植于无虫网室中，取分蘖期至拔节期水稻备用。3.1.2试验设计3.1.2.1Arsenophonus和水稻品种对黄绿绿僵菌毒力的影响设置12个实验组：处理组6个，即分别取2个家系（BPH++和BPH--）中24h内初羽化的雌成虫，喷施5mL黄绿绿僵菌孢子悬浮液，分别转移至TN1、Mudgo和IR56稻苗上笼罩饲养；对照组6个，取类似的初羽化雌成虫，均喷施5mL0.05%Tween-20，不喷施黄绿绿僵菌孢子悬浮液；每个实验组重复5次，每个重复接40头试虫。黄绿绿僵菌孢子悬浮液或Tween-20均匀喷至稻苗与试虫体表。处理后置于温度（25±1℃）、RH（85±5%）和光周期14L:10D的培养箱中饲养。病虫观察及校正发病率的计算同“2.1.5”。3.1.2.2Arsenophonus和温度对黄绿绿僵菌毒力的影响设置24个实验组：处理组6个，即分别取2个家系（BPH++和BPH--）中24h内初羽化的雌成虫，喷施5mL黄绿绿僵菌孢子悬浮液，分别转移至TN1稻苗上笼罩饲养；对照组6个，取类似的初羽化雌成虫，均喷施5mL0.05%Tween-20，不喷施黄绿绿僵菌孢子悬浮液。试验在不同温度（21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和31℃）的恒温培养箱（RH85±5%、光周期14L:10D）中进行。每个实验组重复3次，每个重复接40头试虫。处理后第2d开始，每日观察褐飞虱的死亡情况直至试虫全部死亡，喷菌方法、病虫观察及校正发病率的计算同“2.1.5”。3.1.3统计分析方法利用DPS数据处理软件（V14.10）（唐启义,2013）进行统计分析。处理后各个时间同一品种或同一温度下BPH++和BPH--试虫发病率间的单因素比较采用两处理率差别测验法进行。Arsenophonus与水稻品种或环境温度的双因素方差分析则采用二因素完全随机区组模块，百分数数据进行分析前进行反正弦平方根转换；各因素内不同处理间采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。不同温度处理下的致死中时间（LT50）计算则采用死亡率-时间机率值分析模块进行。3.2结果与分析3.2.1Arsenophonus和水稻品种对黄绿绿僵菌毒力的影响结果黄绿绿僵菌处理后，各水稻品种上BPH++和BPH--雌成虫的发病率均以含Arsenophonus的试虫为低，无一例外，且除TN1上处理后9d未达p=0.10显著水平，TN1上处理后3d和Mudgo22 上处理后7d仅达p=0.10显著水平外，其余均达到了p=0.05显著水平或p=0.01极显著水平（图3.1）。不喷菌试虫的发病率均为0，直接以喷菌试虫的发病率进行共生菌Arsenophonus与水稻品种的双因素方差分析，结果表明：处理后3-9d，Arsenophonus对褐飞虱发病率有显著影响（p<0.05，表3.1-4），且均以BPH++的试虫发病率显著低于BPH--的（图3.2）；而水稻品种及其与共生菌的交互作用对发病率均无显著影响（p>0.05）。显然，Arsenophonus降低了褐飞虱对黄绿绿僵菌的感染率，而水稻品种的抗性及其与Arsenophonus的交互作用对褐飞虱黄绿绿僵菌感染率无显著影响。图3.1黄绿绿僵菌处理后三个水稻品种上含Arsenophonus与不含Arsenophonus褐飞虱发病率的比较（平均值±标准误）Fig.3.1TheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersinfectedwithandwithoutArsenophonusrearedonthreericevarieties(Mean±SE)注：1)BPH++：含Arsenophonus的褐飞虱；BPH--：不含Arsenophonus的褐飞虱；下同。2）同一品种不同试虫间具(*)、*、**分别表示在显著水平0.10、0.05、0.01时有显著差异，ns表示无显著差异（p>0.10）。Note:1)BPH++:BrownplanthopperinfectedwithArsenophonus;BPH--:BrownplanthopperinfectedwithoutArsenophonus.Thesameasinthefollowing.2）Thebarwith(*)、*、**abovedifferenttestinsectsrearedonthesamericevarietyafterinoculationshowedsignificantdifferenceatthelevelof0.10,0.05,0.01,nsshowednosignificantdifference（p>0.10）.表3.1喷菌后3d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.1Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandricevarietieswithin3daysafterexposure喷菌后3d变异来源（Variationsource）(3dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况304.16161304.16165.3940.029(Arsenophonusinfection)水稻品种92.7723246.38610.8230.4513(Ricevarieties)23 Arsenophonus×水稻品种71.9521235.9760.6380.5371(Arsenophonus×Ricevarieties)误差1353.30632456.3878(Error)总变异1822.192329(Totalvariation)表3.2喷菌后5d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.2Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandricevarietieswithin5daysafterexposure喷菌后5d变异来源（Variationsource）(5dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况1492.706811492.706818.0010.0003(Arsenophonusinfection)水稻品种28.8829214.44140.1740.8412(Ricevarieties)Arsenophonus×水稻品种505.16812252.58413.0460.0662(Arsenophonus×Ricevarieties)误差1990.17632482.924(Error)总变异4016.934129(Totalvariation)表3.3喷菌后7d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.3Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandricevarietieswithin7daysafterexposure喷菌后7d变异来源（Variationsource）(7dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况895.76691895.766910.9570.0029(Arsenophonusinfection)水稻品种286.2652143.13251.7510.1951(Ricevarieties)Arsenophonus×水稻品种79.2551239.62750.4850.6218(Arsenophonus×Ricevarieties)误差1962.05912481.7525(Error)总变异3223.346129(Totalvariation)24 表3.4喷菌后9d内Arsenophonus和水稻品种的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.4Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandricevarietieswithin9daysafterexposure喷菌后9d变异来源（Variationsource）(9dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况542.19021542.19026.140.0206(Arsenophonusinfection)水稻品种156.9093278.45470.8880.4244(Ricevarieties)Arsenophonus×水稻品种19.370829.68540.110.8966(Arsenophonus×Ricevarieties)误差2119.47892488.3116(Error)总变异2837.949129(Totalvariation)图3.2共生菌Arsenophonus（左）和水稻品种（右）对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的影响（平均值±标准误）Fig.3.2TheeffectsofArsenophonus(left)andricevarieties(right)ontheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthopper(Mean±SE)注：同一时间不同处理柱图上方具相同字母者示经Duncan氏新复极差法在5％水平下无显著差异；下同。Note:Thebarswithasameletterforasameobservation-dayshowednosignificantdifference(p>0.05).Thesameasinthefollowing.从图3.2还可以看出黄绿绿僵菌处理后褐飞虱发病率的时间动态，处理后第3d发病率较低，25 之后迅速上升，至第7d趋于稳定。3.2.2Arsenophonus和温度对黄绿绿僵菌毒力的影响结果黄绿绿僵菌喷菌处理后，六个温度条件下，BPH++和BPH--雌成虫发病率的差异在21℃、23℃、31℃时各观察时间均不显著（p>0.10）；而在25℃、27℃和29℃时，仅喷菌处理后第3d和5d时差异显著（p<0.05）或极显著（p<0.01），且均以BPH++的试虫发病率较低，但第7d、9d这种差异缩小，未达到显著水平（p>0.10）（图3.3），表明Arsenophonus对褐飞虱发病率有抑制作用，且该作用受到温度的显著影响。不喷黄绿绿僵菌时有超过半数的对照（56.3%）出现0.8%~4.9%不等的发病率，因此以校正发病率为指标进行Arsenophonus共生菌与温度的双因素方差分析，结果表明，Arsenophonus对褐飞虱校正发病率的影响仅在处理后3d、5d显著（p<0.05，表3.5-8），其中以BPH++试虫的校正发病率较低；而处理后7d、9d不显著（p>0.05,表3.5-8）。温度对褐飞虱校正发病率的影响则在处理后4个时间均有显著差异（p<0.05），温度显著影响褐飞虱的黄绿绿僵菌发病率。其中，处理后3d，21℃~29℃间的校正发病率无显著差异，且高于31℃，但只有25℃、27℃与31℃差异显著；处理后5d，27℃的校正发病率显著高于其他5个温度，而其他5个温度间无显著差异；处理后第7d、9d，25℃、29℃的校正发病率与27℃无显著差异，23℃则显著高于21℃和31℃，但显著低于27℃，其中处理后第7d还显著低于25℃和29℃（图3.4）。总体上，6个温度下的校正发病率由高到低依次为：27℃、25℃、29℃、23℃、21℃、31℃。图3.3黄绿绿僵菌处理后在不同温度条件下含Arsenophonus与不含Arsenophonus褐飞虱发病率的比较（平均值±标准误）Fig.3.3TheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthopperswithandwithoutArsenophonusunderdifferenttemperatures,respectively(Mean±SE)注：同一温度不同试虫间具(*)、*、**分别表示在显著水平0.10、0.05、0.01时有显著差异，ns表示无显著差异（p>0.10）。Note：Thebarwith(*)、*、**abovedifferenttestinsectsunderthesametemperatureafterinoculationshowedsignificantdifferenceatthelevelof0.10,0.05,0.01,nsshowednosignificantdifference（p>0.10）.26 表3.5喷菌后3d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.5Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandtemperatureswithin3daysafterexposure喷菌后3d变异来源（Variationsource）(3dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况357.06571357.06578.9680.0063(Arsenophonusinfection)温度404.0304580.80612.0290.1105(Temperatures)Arsenophonus×环境温度403.6759580.73522.0280.1108(Arsenophonus×Temperatures)误差955.58512439.816(Error)总变异2120.357135(Totalvariation)表3.6喷菌后5d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.6Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandtemperatureswithin5daysafterexposure喷菌后5d变异来源（Variationsource）(5dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况386.88941386.88944.740.0395(Arsenophonusinfection)温度1336.45555267.29113.2740.0215(Temperatures)Arsenophonus×环境温度790.38295158.07661.9360.1254(Arsenophonus×Temperatures)误差1959.12742481.6303(Error)总变异4472.855235(Totalvariation)27 表3.7喷菌后7d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.7Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandtemperatureswithin7daysafterexposure喷菌后7d变异来源（Variationsource）(7dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况3.060113.06010.0490.8269(Arsenophonusinfection)温度5723.457951144.691618.2740(Temperatures)Arsenophonus×环境温度98.6255519.72510.3150.8991(Arsenophonus×Temperatures)误差1503.35572462.6398(Error)总变异7328.499335(Totalvariation)表3.8喷菌后9d内Arsenophonus和温度的褐飞虱发病率双因素方差分析结果Tab.3.8Thetwo-wayANOVAoftheincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthoppersofArsenophonusandtemperatureswithin9daysafterexposure喷菌后9d变异来源（Variationsource）(9dafterexposure)平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况17.0594117.05940.2180.6445(Arsenophonusinfection)温度5293.055851058.611213.5480(Temperatures)Arsenophonus×环境温度62.1309512.42620.1590.9751(Arsenophonus×Temperatures)误差1875.28932478.1371(Error)总变异7247.535435(Totalvariation)28 图3.4共生菌Arsenophonus（左）和温度（右）对褐飞虱黄绿绿僵菌校正发病率的影响（平均值±标准误）Fig.3.4TheeffectsofArsenophonus(left)andtemperatures(right)onthecorrectedincidencerateofM.flavoviride-infectedbrownplanthopper(Mean±SE)进一步分析不同温度条件下褐飞虱试虫的致死中时间（LT50）（表3.9）发现，23℃~29℃条件下LT50较短（4.7~7.6d），且27℃时最短（4.7~5.3d）；21℃、31℃时均较长，其中BPH--的试虫超过10.2d，BPH++的试虫在8.8d以上。结合前文不同温度下试虫校正发病率的排序结果，可以认为23℃~29℃是黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的适宜温度范围，且以27℃最为适宜，温度过高（31℃）或过低（21℃）均不利于黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染。BPH++于BPH--试虫的LT50相比，27℃、29℃时均以BPH++试虫较长，但25℃时两类试虫相同，且21℃、23℃、31℃三个温度下均以BPH++试虫的LT50较短，进一步说明环境温度影响Arsenophonus对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的抑制作用。表3.9不同温度下黄绿绿僵菌处理后褐飞虱的致死中时间LT50（d）Tab.3.9Themedianlethaltime(LT50,d)ofthebrownplanthopperafterM.flavovirideinfestationatdifferenttemperatures褐飞虱种群21℃23℃25℃27℃29℃31℃Brownplanthopperpopulation不含Arsenophonus11.47.65.64.75.3>13.0WithoutArsenophonus含Arsenophonus10.27.05.65.36.48.8WithArsenophonus3.3讨论黄绿绿僵菌作为一种稻飞虱病原真菌而倍受关注（耿博闻等,2004;Jinetal.,2008;李茂业等,29 2012），但迄今尚未在生产上大面积应用。探明黄绿绿僵菌侵染稻飞虱的重要影响因子是推进其应用的重要基础。绿僵菌对昆虫的侵染，除取决于绿僵菌菌株自身因素（如菌株的生化特性（樊美珍等,1990）、菌株继代次数（张正坤等,2012）之外，寄主昆虫体内的共生菌和水稻品种抗性是重要因素。本文Arsenophonus与水稻品种、Arsenophonus与温度两个双因素实验的方差分析中，处理后7d、9d时Arsenophonus对黄绿绿僵菌的致病力的影响并不一致，即前者影响显著（图3.2，左）而后者不显著（图3.4，左），这与前者体现不同水稻品种的综合影响而后者体现不同温度的综合影响有关。如前所述，不同温度下Arsenophonus对黄绿绿僵菌的致病力有不同的影响，而水稻品种无明显影响，在处理后第7d、9dBPH++和BPH--雌成虫发病率的差值较第5d时有所收窄的前提下，可能导致Arsenophonus与温度双因素实验中Arsenophonus的影响达不到显著水平。水稻品种抗性是控制稻飞虱的第一道屏障，含Bph1抗虫基因的水稻品种曾在东南亚及我国水稻生产中得到大面应用，近年来含Bph3抗虫基因的水稻品种的选育亦在我国得到重视（傅强等,2015）。本研究明确水稻品种[TN1、IR56（含Bph3）和Mudgo（含Bph1）]对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率无显著影响，且与褐飞虱Arsenophonus共生菌无交互作用，似表明水稻抗性品种尽管不适合褐飞虱的生长发育和繁殖，但并未影响褐飞虱对黄绿绿僵菌的免疫力。不过，本文研究的水稻品种有限，该现象是否适合于其它抗性水稻品种尚不清楚。温度是影响黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染的重要因素，这与前人（汪敏捷等,2014;杜广祖等,2015）的结果类似。温度对黄绿绿僵菌的作用可体现在对产孢能力和致病力两个方面的影响（常金梅等,2010;岳梅等,2010;朱彬洲等,2010）。黄绿绿僵菌可以产生蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶，这些酶可以用来溶解寄主表皮，这是黄绿绿僵菌侵染寄主昆虫的过程中必要的一步，而黄绿绿僵菌的蛋白酶活性决定了其毒力的强弱（St.Legeretal.,1988;冯明光,1998;林海萍等,2008），温度通过对酶活的影响进而影响黄绿绿僵菌孢子的侵染和毒力。对东亚飞蝗的研究表明，在最适生长温度时，LA菌株的毒力也随之增强；温度过高或过低，绿僵菌的胞外蛋白酶产量减少，而其对飞蝗的毒力也随之降低（岳梅等,2010）。在温度的具体影响方面，本研究发现23℃~29℃是黄绿绿僵菌ARSEF1764致病褐飞虱的适温范围，27℃为最适宜温度，温度为31℃或21℃时绿僵菌致病力显著降低，这与李佳颖等（2013）的黄绿绿僵菌SM076在26℃下菌落生长速度最快、孢子萌发率最高，以及杜光祖等（2015）的黄绿绿僵菌对灰飞虱3龄若虫在27℃下致病力较强的结果基本一致；但与李佳颖等（2013）报道的23℃最适黄绿绿僵菌SM076产孢的结果相差较大，推测黄绿绿僵菌产孢与菌落生长、孢子萌发的适宜温度有所不同。此外，杜光祖等（2015）还发现黄绿绿僵菌在30℃下对灰飞虱3龄若虫亦有较强致病力，岳梅等（2010）则报道绿僵菌LA菌株在30℃、35℃孢子萌发速率最快，结果与本文有所不同，究其原因可能有：1）绿僵菌菌株不同，不同菌株对温度的反应可能存在一定的差异；2）宿主昆虫不同，也可能造成温度反应的差异。本研究中，尽管褐飞虱含菌状况与温度对黄绿绿僵菌发病率无显著的交互作用，但温度可能影响Arsenophonus对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的抑制作用，表现在两方面：1）不同温度条件下BPH++和BPH--试虫的发病率仅在25℃、27℃、29℃时有显著差异，而21℃、23℃、31℃时各观察时间均无显著差异；2）不同温度下BPH++和BPH--雌成虫的致死中时间（LT50）27℃、29℃30 时以BPH++的试虫相对较长，与Arsenophonus降低黄绿绿僵菌对褐飞虱侵染能力的结果不一致，其他温度下BPH++的试虫则相同甚至较短，与Arsenophonus降低黄绿绿僵菌对褐飞虱侵染能力的结果一致。推测Arsenophonus对黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的抑制作用可能局限在一定的温度范围之内。因Arsenophonus抑制黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的机制还不清楚，这种温度影响机制亦需进一步研究。31 第四章Arsenophonus对黄绿绿僵菌处理的褐飞虱血细胞的影响昆虫中的细胞免疫作用主要包括吞噬、集结、包囊等，体液免疫作用主要包括凝结、黑化和诱导合成抗菌肽等（Hillyeretal.,2002;Hillyeretal.,2003）。其中，昆虫体内的血细胞通过漂浮或附着等形式存在于昆虫的血腔和器官中（魏丽芳等,2011）。昆虫血细胞类型多种，原血胞、浆血胞和粒血胞是较为常见的血细胞类型，而珠血胞、类绛色血胞、囊血胞和脂血胞亦是昆虫的主要血细胞类型（田俊策等,2006;张锡林等,2009;晏容等,2010;贾雷坡等,2011;谈娟等,2011;魏丽芳等,2011）。不同类型的血细胞功能亦有所不同，其中浆血胞和粒血胞主要起防卫作用（王荫长,1994）。病原菌进入寄主昆虫血腔内，血细胞的数量、形态和种类会发生变化（晏容等,2010）。前文及前期的实验均证实Arsenophonus可显著降低黄绿绿僵菌对褐飞虱的侵染能力，Arsenophonus是否通过影响褐飞虱的细胞防御来提高褐飞虱对黄绿绿僵菌的抵抗力？目前尚不清楚。为此，本实验以BPH++和BPH--雌成虫为研究对象，研究其受到黄绿绿僵菌侵染时，两个褐飞虱种群体内主要血细胞种类构成和数量的变化，以期初步明确褐飞虱血细胞与Arsenophonus对黄绿绿僵菌的褐飞虱毒力影响的关系。4.1材料与方法4.1.1供试材料供试昆虫、供试菌株：均同“3.1.1”。供试水稻：感虫水稻品种TN1。姬姆萨染色液：取姬姆萨浓缩液1mL，姬姆萨稀释液9mL充分混匀，即可使用（姬姆萨染色液，G1010，北京索莱宝有限公司）。4.1.2试验设计4.1.2.1褐飞虱体内血细胞的种类和数量取BPH++和BPH--试虫各半，采集血淋巴，将1μL血淋巴加入9μL姬姆萨稀释液中,稀释10倍，混匀，染色5min。按昆虫血细胞类型对血细胞分类(傅贻玲,1982;陈长琨,1996)，主要血细胞形态特征见表4.1。同时，采用血球计数板在光学显微镜下对各类血细胞数量进行计数，计算单位体积血淋巴内32 的血细胞数量。表4.1不同类型血细胞的形态特征Tab.4.1Morphologicalcharacterofdifferenttypesofhemocytesininsect形状(Shape)染色(Giesmastained)细胞质(Cytoplasm)原血胞(Prohemocyte)圆或卵圆形强嗜碱性（深蓝色）N/C较大浆血胞(Plamatocyte)多态且大小不一嗜碱性（淡蓝至深蓝）N/C较小粒血胞(Granulocyte)圆或卵圆形嗜酸性（淡蓝）N/C较大脂血胞(Adipocyte)圆或椭圆形不易被Giemsa染色内含大量脂肪体4.1.2.2BPH++、BPH--经黄绿绿僵菌处理后的血细胞的种类和数量的变化设置4个实验组：处理组2个，即分别取2个家系（BPH++和BPH--）中24h内初羽化的雌成虫，喷施5mL黄绿绿僵菌孢子悬浮液，随后转移至TN1稻苗上笼罩饲养；对照组2个，取类似的初羽化雌成虫，均喷施5mL0.05%Tween-20，不喷施黄绿绿僵菌孢子悬浮液；每个实验组重复7次，每个重复接200头试虫。黄绿绿僵菌孢子悬浮液或Tween-20均匀喷至稻苗与试虫体表。处理后置于温度（27±1℃）、RH（85±5%）和光周期14L:10D的培养箱中饲养。处理后第0、1、2、3和5d进行取样，每个重复取20头，在解剖镜下用镊子剪断试虫的腹足，用血淋巴取样器取血淋巴。血细胞种类和数量观察同“4.1.2.1”。4.1.3统计分析方法利用DPS数据处理软件（V14.10）（唐启义,2013）的单因素方差分析模块比较不同类型血细胞的数量，采用其三因素方差分析模块进行Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的血细胞数量三因素方差分析，各因素内不同处理间采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。4.2结果与分析4.2.1血细胞类型与数量在倒置荧光显微镜下观察褐飞虱体内的血细胞类型，两个种群的细胞类型主要有3种：浆血胞、粒血胞和脂血胞。浆血胞多为椭圆形，核内含有丰富的染色体，经姬姆萨染色液染色后呈蓝紫色，核质比N/C较小，一般聚集在一起，会延展。粒血胞在光学显微镜下易于辨识，圆或卵圆形，细胞核较大，高的N/C比，经姬姆萨染色液染色后呈蓝色。脂血胞呈椭圆形，一般体型较大，内含大量的脂肪体颗粒，经姬姆萨染色液染色后呈蓝色（图4.1）。褐飞虱体内3种主要血细胞的数量如图4.2所示，不同血细胞的数量有显著差异，其中浆血胞最多，粒血胞次之，脂血胞再次之。33 图4.1褐飞虱雌成虫血细胞类型.A-1：浆血胞（未染色），A-2：浆血胞（染色）；B-1：粒血胞（未染色），B-2：粒血胞（染色）；C-1：脂血胞（未染色），C-2：脂血胞（染色）Fig.4.1HemocytesoffemaleadultofNilaparvatalugensA-1:Plamatocyte(Unstained),A-2:Plamatocyte(Stained);B-1:Granulocyte(Unstained),B-2:Granulocyte(Stained);C-1:Adipocyte(Unstained);C-2:Adipocyte(Stained)图4.2褐飞虱雌成虫不同血细胞的数量比较Fig.4.2ThenumbersofdifferenttypesofhemocytesoffemaleadultofNilaparvatalugens注：同一褐飞虱种群不同处理柱图上方具相同字母者示经Duncan氏新复极差法在1％水平下无显著差异。Note:ThebarswithasameletterforasameBrownplanthopperpopulationshowednosignificantdifference(p>0.01).4.2.2BPH++、BPH--试虫黄绿绿僵菌处理后不同时间的血细胞数量（DHC）通过Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间对血细胞数量影响的三因素方差分析（表34 4.2-4），有如下结果：1）从单个因素的影响来看，Arsenophonus感染情况（BPH++、BPH--）以及黄绿绿僵菌喷菌后不同时间（0、1、2、3、5d）均显著影响浆细胞、粒细胞和脂细胞的数量，而黄绿绿僵菌喷菌处理（喷、不喷）仅显著影响浆细胞的数量，对粒细胞和脂细胞的数量则无显著影响。2）两两互作效应结果显示，Arsenophonus和黄绿绿僵菌喷菌后不同时间对三种血细胞均有显著的交互作用；黄绿绿僵菌喷菌处理与喷菌后不同时间对浆血胞和脂血胞有显著的交互作用，而对粒血胞无显著的交互作用；Arsenophonus和黄绿绿僵菌喷菌处理对三种血细胞均无显著的交互作用。3）三因素交互作用则显示，其对三种血细胞的数量均有显著作用。从各因素的具体影响而言：1）BPH++试虫与BPH--试虫相比，浆细胞的数量处理后不同时间均以BPH++试虫高于BPH--试虫，且黄绿绿僵菌处理后第2d有显著差异（以BPH++试虫显著较高）；粒细胞和脂细胞则除处理0、1d时差异显著外（均以BPH++试虫显著较低），处理后2~5d均无显著差异；表明感染Arsenophonus对不同血细胞的影响明显不同（图4.3）。2）黄绿绿僵菌处理与不处理相比，浆细胞除第2d外不同时间均有显著差异，但处理当天以喷菌处理显著较低，而处理后1~5d均以喷菌处理显著较高；粒细胞在不同时间均无显著差异。脂细胞则仅在处理0和3d有显著差异，但处理当天以喷菌处理显著较低，而处理后3d则以喷菌处理显著较高（图4.3）。3）黄绿绿僵菌处理后不同时间，无论是黄绿绿僵菌处理还是不处理，浆细胞和粒细胞均随处理后时间的延长而呈上升趋势，且至第5d跳跃式上升，但脂细胞这种趋势不明显（图4.4）。35 表4.2Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的浆血胞数量三因素方差分析结果Tab.4.2Thethree-wayANOVAofthenumbersofPlamatocytesofArsenophonus、M.flavoviridetreatmentanddaysafterM.flavoviride-treatment浆细胞(Plamatocyte)变异来源（Variationsource）平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况1253.4311253.4330.9510(Arsenophonusinfection)黄绿绿僵菌喷菌处理3581.432513581.432588.43650(SpraytreatmentofM.flavoviride)喷菌后不同天数17591.3444397.835108.5960(Daysafterexposure)Arsenophonus×喷菌31.9721131.97210.78950.376(Arsenophonus×Spraytreatment)Arsenophonus×天数423.02834105.75712.61150.0388(Arsenophonus×Days)喷菌×天数2175.58274543.895713.43040(Spraytreatment×Days)Arsenophonus×喷菌×天数504.3114126.07783.11320.0178(Arsenophonus×Spraytreatment×Days)误差4859.665312040.4972(Error)总变异30420.762139(Totalvariation)36 表4.3Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的粒血胞数量三因素方差分析结果Tab.4.3Thethree-wayANOVAofthenumbersofGranulocytesofArsenophonus、M.flavoviridetreatmentanddaysafterM.flavoviride-treatment粒细胞(Granulocyte)变异来源（Variationsource）平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况53.4446153.44464.60920.0338（Arsenophonusinfection）黄绿绿僵菌喷菌处理22.0018122.00181.89750.1709（SpraytreatmentofM.flavoviride）喷菌后不同天数2523.31074630.827754.4040（Daysafterexposure）Arsenophonus×喷菌41.8018141.80183.60510.06（Arsenophonus×Spraytreatment）Arsenophonus×天数125.725431.43132.71070.0333（Arsenophonus×Days）喷菌×天数88.525422.13131.90860.1134（Spraytreatment×Days）Arsenophonus×喷菌×天数114.5107428.62772.46890.0484（Arsenophonus×Spraytreatment×Days）误差1391.428612011.5952(Error)总变异4360.7482139(Totalvariation)37 表4.4Arsenophonus、黄绿绿僵菌和喷菌后不同时间的脂血胞数量三因素方差分析结果Tab.4.4Thethree-wayANOVAofthenumbersofAdipocytesofArsenophonus、M.flavoviridetreatmentanddaysafterM.flavoviride-treatment脂细胞(Adipocyte)变异来源（Variationsource）平方和自由度均方F值p值Arsenophonus感染情况31.1143131.114319.18940（Arsenophonusinfection）黄绿绿僵菌喷菌处理0.114310.11430.07050.7911（SpraytreatmentofM.flavoviride）喷菌后不同天数22.203645.55093.42350.0109（Daysafterexposure）Arsenophonus×喷菌6.007116.00713.70480.0566（Arsenophonus×Spraytreatment）Arsenophonus×天数22.153645.53843.41570.0111（Arsenophonus×Days）喷菌×天数28.546447.13664.40140.0023（Spraytreatment×Days）Arsenophonus×喷菌×天数23.082145.77053.55890.0088（Arsenophonus×Spraytreatment×Days）误差194.57141201.6214(Error)总变异327.7929139(Totalvariation)38 图4.3不同时间BPH++、BPH--及喷菌与否的褐飞虱雌成虫血细胞数量的比较Fig.4.3ThecompositionsofthenumbersofhemocytesoffemalebrownplanthopperatdifferenttimesbetweenBPH++andBPH--andexposuretoM.flavovirideandnot图4.4不同时间褐飞虱雌成虫血细胞的数量比较Fig.4.4Thecomparisonofthenumbersofdifferenthemocytesoffemalebrownplanthopperatdifferenttimes注：同一血细胞不同处理柱图上方具相同字母者示经Duncan氏新复极差法在5％水平下无显著差异。Note:Thebarswithasameletterforasametypeofhemocteshowednosignificantdifference(p>0.05).39 4.3讨论当黄绿绿僵菌穿透寄主昆虫体表进入其血腔时，寄主昆虫血腔体内的血细胞会通过吞噬、结节形成和包囊作用对黄绿绿僵菌进行细胞防御（Hillyeretal.,2002），并且血细胞类型和数量也会发生变化。王音等（2005）研究发现，当绿僵菌LD65菌株侵染小菜蛾4龄幼虫36h后，浆血胞的数量逐渐上升，并在48h达到最高值；粒血胞数量在短时间内有下降的趋势，之后数量开始迅速增多。李会平等（2009）将白僵菌分生孢子接种到桑天牛幼虫体表，第2.5d后浆血胞和粒血胞数量均达到最大值，接着血细胞的数量开始下降。陶淑霞等（2011）将球孢白僵菌分生孢子注射到玉米螟幼虫体内，血细胞总数在0.25h达到最低值之后回升。血细胞总数和各类血细胞数量均在病原菌侵染过程中有所增长。本实验发现褐飞虱体内血细胞主要为浆血胞、粒血胞和脂血胞3种，其中浆血胞的数量较多，其次是粒血胞，再次为脂血胞。明确了Arsenophonus感染情况和黄绿绿僵菌对褐飞虱的血细胞数量的影响，其中黄绿绿僵菌处理后1~5d，浆细胞数量在喷菌处理的褐飞虱体内显著升高，且BPH++试虫高于BPH--试虫，并在第2d两者之间差异极显著，推测浆细胞在褐飞虱应对黄绿绿僵菌感染过程中有重要作用，而Arsenophonus能进一步激发该作用；粒细胞和脂细胞数量则仅在黄绿绿僵菌处理初期有显著差异，且第0d和1dBPH--试虫显著高于BPH++试虫。因此，初步确定褐飞虱血细胞中，与黄绿绿僵菌的褐飞虱毒力及Arsenophonus对该毒力影响密切相关的应是浆细胞，粒细胞和脂细胞的关系较不明显。40 第五章全文结论与展望5.1结论5.1.1黄绿绿僵菌菌株的分离鉴定、毒力测定及保存方法比较从田间病虫分离到一株褐飞虱黄绿绿僵菌菌株，经rDNA通用引物扩增序列的的克隆、测序和序列比对确定该菌株与黄绿绿僵菌ARSEF1764相关序列的相似性99%，可确定为ARSEF1764菌株。该菌株对褐飞虱有较强的毒力，处理后9d的褐飞虱发病率达73.5%。比较了滤纸片法、PDA平板法对黄绿绿僵菌的保存效果，发现保存的F4代菌株对褐飞虱的毒力有明显差异，褐飞虱喷菌处理后7d发病率分别为63%和23%，表明滤纸片法的保存效果明显较好。5.1.2Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和温度的关系本实验通过两个双因素试验，研究了共生菌Arsenophonus、不同水稻品种和不同温度三个因素对黄绿绿僵菌ARSEF1764侵染褐飞虱的影响并且进一步分析了Arsenophonus和不同水稻品种以及Arsenophonus和不同温度之间的交互作用。喷施黄绿绿僵菌孢子悬浮液后，不同水稻品种上黄绿绿僵菌发病率均以含Arsenophonus的褐飞虱（下文简称BPH++）较低，而不同温度下的黄绿绿僵菌发病率则仅在25℃、27℃和29℃时于喷菌后第3d和5d时BPH++的发病率显著较低，其它温度下无显著差异。双因素方差分析结果发现，Arsenophonus与水稻品种双因素试验中均以BPH++黄绿绿僵菌的发病率显著较低，而Arsenophonus与温度双因素试验中仅在喷菌处理后第3d、5d以BPH++黄绿绿僵菌的发病率显著较低。温度显著影响褐飞虱的发病率，23℃~29℃为黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的适温范围，其中27℃时最为适宜；31℃和21℃条件时黄绿绿僵菌对褐飞虱毒力相对较弱。温度还影响BPH++与BPH--（不含Arsenophonus）试虫LT50的相对大小，其中27℃、29℃时BPH++试虫的LT50长于BPH--，在其他温度条件下则相同甚至较短。由上可知：共生菌Arsenophonus显著抑制黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力，且该作用受到温度的显著影响；温度亦显著影响黄绿绿僵菌对褐飞虱的毒力，而水稻品种以及Arsenophonus和水稻品种间、Arsenophonus和环境温度间的交互作用均无显著影响。5.1.3Arsenophonus对黄绿绿僵菌处理的褐飞虱血细胞的影响本实验明确了褐飞虱的3种血细胞种类，即浆血胞、粒血胞和脂血胞，其中浆血胞最多，粒血胞次之，脂血胞最少。BPH++、BPH--试虫的血细胞构成种类一致，褐飞虱体内3种血细胞数量均以浆血胞最多，粒血胞次之，脂血胞最少。明确黄绿绿僵菌处理后1~5d，浆细胞数量在喷菌处理的褐飞虱体内显著升高，且BPH++试虫高于BPH--试虫，并在第2d两者之间差异极显著；粒细胞和脂细胞数量则仅在黄绿绿僵菌处理初期有显著差异，且第0d和1dBPH--试虫显著高于41 BPH++试虫。推测在褐飞虱血细胞中，浆细胞在褐飞虱应对黄绿绿僵菌感染过程中有重要作用，且Arsenophonus能进一步激发该作用；粒细胞和脂细胞的作用较不明显。5.2本论文的特色与创新之处1)本文优化了黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的实验条件，获得了对褐飞虱有较高毒力的黄绿绿僵菌菌株。2)明确了Arsenophonus对黄绿绿僵菌毒力的影响及其与水稻品种和环境温度的关系。3)揭示了血细胞与黄绿绿僵菌毒力和Arsenophonus影响该毒力的关系，初步明确浆细胞是其作用的重要血细胞种类。5.3展望1)Arsenophonus抑制黄绿绿僵菌致病褐飞虱的作用已经明确，初步研究了温度对Arsenophonus抑制黄绿绿僵菌毒力的抑制作用的影响，但Arsenophonus影响昆虫抵御病原菌的机制以及温度是如何影响Arsenophonus还不清楚，需进一步进行研究。2)TN1、TR56和Mudgo三个水稻品种并未影响褐飞虱对黄绿绿僵菌的敏感性，但其它抗性水稻品种是否会产生同样的效果还需进一步验证。42 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附录附表1主要试剂及来源Table1Themainreagentandsources试剂仪器公司葡萄糖（分析纯）国药集团化学试剂有限公司琼脂粉（分析纯）北京鼎国昌盛生物技术有限公司氯化钠（分析纯）国药集团化学试剂有限公司蔗糖（分析纯）国药集团化学试剂有限公司氯仿（分析纯）上海凌峰化学试剂有限公司异戊醇（分析纯）华东医药股份有限公司真菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司无水乙醇（BCGrade）南京凯基生物科技发展有限公司rTaq酶TarakadNTPTarakaBufferTarakaT3-Vector北京全式金生物技术有限公司DNAmarker2K北京全式金生物技术有限公司感受态细胞北京全式金生物技术有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）天根生化科技（北京）有限公司PCR引物合成华大基因菌液测序铂尚生物技术（上海）有限公司DEPC鼎国生物技术有限公司52 附表2主要仪器及来源Table2Themaininstrumentsandsources试剂仪器型号公司基因扩增仪EDC-810北京东胜创新生物科技有限公司纯水机Elix®10millipore公司超纯水机Milli-Q®Gradientmillipore公司离心机PPIC017Thermo智能荧光、化学发光成像系统SyngeneG:BOX英国Syngene紫外割胶仪UV-2000Tanon电泳仪DYY-7C北京市六一仪器厂立式超低温冰箱DW-86L386青岛海尔特种电器有限公司电热恒温水浴锅XMTD-8222上海精宏实验设备有限公司数显电热培养箱HPX-9082MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂细菌培养摇床HZ-2011KC太仓市华利达实验设备有限公司高压蒸汽灭菌锅MLS-3750SANYO电子天平PL3002-IC梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司台式高速冷冻离心机Allegra-64R美国贝克曼库尔特有限公司超声波清洗器XO25-12DT南京先欧生物科技有限公司分光光度计EppendorfBiophotometer德国Eppendorf公司制冰机SIM-F124日本SANYO公司台式低速离心机L530湖南湘仪实验室仪器开发有限公司双人单面净化工作台SW-CJ=1C苏州净化设备有限公司鼓风干燥箱XMTD-8222上海精宏实验设备有限公司解剖镜LEICAL2德国徕卡微系统有限公司倒置荧光显微镜LEICADMEL德国徕卡微系统有限公司正置荧光显微镜LEICADM2500德国徕卡微系统有限公司生化培养箱SPX-128宁波江南仪器厂恒温培养箱HPX-9082MBE宁波江南仪器厂53 致谢匆匆三年已过，转眼间研究生生涯已接近尾声。依稀记得拿到录取通知书时对研究生学习和生活的期待与憧憬。在这三年的时间里，有遇到困难时手足无措的慌张，也有解决问题后的成就感，更有实验室各位给予我的帮助。在这三年的时间里，我确实成长了很多，也很感谢这三年帮助我成长的人们。首先，我要诚挚地感谢我的导师--傅强研究员。傅老师给予了我很大的帮助和包容。从试验的设计、实验过程中存在的大大小小的问题、数据的分析和最后论文的撰写，傅老师都是亲力亲为。还记得傅老师认真地、一遍又一遍地修改我的试验设计；还记得傅老师反复地探讨试验过程中可能出现的各种问题；还记得傅老师凌晨4点还在修改我的论文；还记得⋯⋯实在是太多了。傅老师，谢谢您！其次，我还要诚挚地感谢我的指导老师也是我的好朋友--陈洋老师。陈老师在我的学习和生活上给予了很大的帮助。我还要诚挚地感谢万品俊老师，万老师对我的实验和论文的撰写都给予了很大的帮助。还有实验室的王渭霞老师、何佳春老师和赖凤香老师，谢谢你们在我的学习和生活中给予的温暖和帮助。还有实验室的曹国莲、孙燕群、洪利英、林晶晶、朱红妹、胡海燕和李世荣等叔叔大姐，谢谢你们在我的学习和生活中给予的各种关心和温暖。再次，我要特别地感谢袁三跃师兄。袁师兄在我的试验过程中提出了很多宝贵的意见，并改正我的各种错误的实验操作，大大地节省了实验时间。很多时候实验时间来不及，袁师兄会很热心地帮助我完成实验。很感谢袁师兄教会我--遇到问题就要积极面对，没有什么是过不去的坎儿。真的很感谢袁师兄。还有李波师兄、唐耀华师兄、陈龙飞师兄、李凯龙师兄、郑瑜师姐、陈旭、韩金波、沈新兰师妹、王艳威师弟和高子航师弟以及2014级硕士17班的同学们，非常感谢你们在我的学习和生活上给予的帮助。最后，我要感谢我的父母、弟弟和宋先生一直在我的身后默默地支持着我，让我毫无压力地度过了三年美好的研究生生活。衷心感谢参与本论文审阅和答辩的老师们！54 作者简历姓名：朱欢欢性别：女民族：汉籍贯：河南平顶山出生日期：1990年4月农学硕士：2014年9月-2017年7月毕业院校：中国农业科学院研究方向：昆虫生理与分子生物学专业：农业昆虫与害虫防治获奖情况：1、2014年7月，获得中国水稻研究所转基因生态组举办的2014年度稻飞虱识别技能比赛一等奖；2、2014年8月，获得中国水稻研究所转基因生态组举办的2014年度稻飞虱解剖技能比赛三等奖。论文发表情况：1、朱欢欢,陈洋,万品俊,等.共生菌Arsenophonus、水稻品种和温度对褐飞虱黄绿绿僵菌发病率的影响.中国水稻科学（已接收）。55
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