拟南芥抗病基因RIN4和RPM1的克隆及在大豆中的功能验证

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分类号：单位代码：10193密级：公开学号：20150018硕士学位论文拟南芥抗病基因RIN4和RPM1的克隆及在大豆中的功能验证CloningofarabidopsisresistancegeneRIN4andRPM1andfunctionalverificationinsoybean作者姓名：孟祥鹏学位类别：农学硕士专业名称：作物遗传育种研究方向：生物技术及其在作物遗传育种中的应用指导教师：王丕武所在学院：农学院2018年4月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要大豆作为我国重要的油料作物，被广泛的用于社会生活的各个领域。但近年来，大豆病害的频繁爆发和无节制的蔓延已成为影响大豆产量和品质的重要原因，尤其以大豆灰斑病所造成的损失尤为严重。利用传统的育种方法培育抗病基因品种是解决大豆抗灰斑病的有效途径，但存在基因局限性和抗性易退化等问题。而转基因技术能够有效的解决这类问题，成为培育大豆抗病新品种的一种新途径。研究发现，来源于拟南芥的抗病基因RIN4和RPM1能够通过一系列的信号传导使植物体产生过敏反应，激发植株的非专化抗病性即系统获得性抗性，造成病原菌感染区域及周围组织细胞程序性凋亡，使病原菌不会扩散到健康的组织器官中，从而达到抗病的目的，具有重要的应用价值。其中RIN4基因对灰斑病的抗性表现为负向调控，RPM1基因对灰斑病的抗性表现为正向调控。本试验以拟南芥基因组为模板，通过PCR扩增技术，从而得到序列长为458bp(RIN4基因)和2592bp(RPM1基因)的DNA片段，并将其连接到pMD18T克隆载体上。由于RIN4基因能够在大豆中检测到，RPM1基因不能够在大豆中检测到，因此利用无缝克隆技术，以pCAMBIA-3301为基础载体，构建含有筛选标记Bar的植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos，用以鉴定RIN4和RPM1抗病基因的功能。通过农杆菌介导法，将构建好的重组质粒转入到大豆受体品种‘JN28’中。通过PCR初步检测，将获得的阳性植株种子进行加代。对T1代转基因植株进行常规PCR、Southernblotting、荧光定量PCR检测和室内抗病性鉴定，并与转hrpZpsta抗病基因大豆植株进行抗病能力的比较，以鉴定两个目标基因在大豆中的抗病表现。试验结果如下:1.通过对目标基因RIN4和RPM1的PCR检测及对测序结果的同源性比较，表明已成功克隆出两种抗病基因并构建了含有抗草胺膦筛选标记的植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos。2.利用农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入到大豆受体品种‘JN28’中，经PCR检测得到含有RIN4抗病基因T0代阳性植株3株，T1代阳性植株有11株。含有RPM1抗病基因T0代阳性植株4株，T1代阳性植株有14株。3.T1代转化株系中均检测到了转化的目的基因的启动子35s、终止子Nos、目的条带和筛选标记Bar，表明目的基因得到了稳定的遗传。4.T1代转基因植株Southern杂交结果显示，转RIN4干扰表达载体的基因和转RPM1过表达载体的基因均是以单拷贝的形式整合到大豆基因组中，且整合位点不同。5.对Southern杂交出现信号的转基因植株进行荧光定量PCR检测，结果显示，转RPM1过表达载体的基因在植株的根、茎、叶中均得到表达，其中叶片中表达量最高，根和茎中I 表达量较低。转RIN4干扰表达载体的基因使大豆内源基因的表达受到了抑制，使根、茎、叶的表达量均下降，其中叶片中表达量下降最多，根和茎中的表达量下降较少。6.采用叶面噴施法鉴定转基因植株对大豆灰斑病的抗性，结果表明：①与对照植株相比，转RPM1过表达载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中抗水平。并通过对不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为-0.90096，呈显著负相关，即目的基因在叶片中的表达量越高，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低；②与对照植株相比，转RIN4干扰表达载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中感水平。并通过对不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为0.844375，呈显著正相关，即目的基因在叶片中的表达量越低，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低。关键词:大豆；RIN4和RPM1抗病基因；抗病能力II AbstractAsanimportantoilcropinChina,soybeaniswidelyusedinvariousfieldsofsociallife.However,inrecentyears,frequentoutbreaksofuncontrolledsoydiseaseanduncontrolledspreadhavebecomeanimportantcauseofsoybeanyieldandquality.Inparticular,lossescausedbysoybeangrayspotdiseaseareparticularlyserious.Theuseoftraditionalbreedingmethodstobreeddisease-resistantgenevarietiesisaneffectivewaytosolvethesoybeangrayspotdisease.butthereareproblemssuchasgeneticlimitationsandresistancetodegradation.Transgenictechnologycaneffectivelysolvesuchproblemsandbecomeanewwaytocultivatenewvarietiesofsoybeandiseaseresistance.ThestudyfoundthattheresistancegenesRIN4andRPM1derivedfromArabidopsisthalianacancauseallergicreactionsinplantsthroughaseriesofsignaltransductionandtostimulatethenon-specializeddiseaseresistanceofplants,thatis,systemicacquiredresistance,andcausingtheinfectionofthepathogenandthesurroundingtissuecellsprogrammedcelldeathsothatthepathogendoesnotspreadtohealthytissuesandorgans,andachievethepurposeofdiseaseresistance,ithasimportantapplicationvalue.Amongthem,theRIN4geneshowednegativeregulationongrayleafspotresistance,andtheRPM1geneshowedpositiveregulationongrayleafspotresistance.Inthisexperiment,ArabidopsisgenomeisusedasatemplatetoobtainaDNAfragmentwithasequencelengthof458bp(RIN4gene)and2592bp(RPM1gene)byPCRamplification,andisligatedintothepMD18Tcloningvector.BecauseofRIN4genecanbedetectedinsoybean,RPM1genecannotbedetectedinsoybean.Therefore,usingtheseamlesscloningtechnology,theplantinterferingexpressionvectorpCAMBIA-3301-35s-RIN4-nosandtheplantoverexpressionvectorpCAMBIA-3301-35s-RPM1-noscontainingtheselectionmarkerBarwereconstructedusingpCAMBIA-3301asthebasicvector.ToidentifythefunctionofRIN4andRPM1resistancegenes.TheconstructedrecombinantplasmidistransferredintosoybeanreceptorvarietyJN28byAgrobacterium-mediatedmethod.ThroughthepreliminarydetectionbyPCR,theobtainedpositiveplantseedsareadded.TheT1generationtransgenicplantsaresubjectedtoroutinePCR,Southernblotting,fluorescencequantitativePCRandindoordiseaseresistanceidentification.andtheresistanceofsoybeanplantstohrpZpstaresistancegeneiscomparedtoidentifytheresistanceofthetwotargetgenesinsoybean.Thetestresultsareasfollows:1.ThroughthePCRdetectionofthetargetgeneRIN4andRPM1andthecomparisonoftheIII homologyofthesequencingresults,ithasbeenshownthatthetworesistantgeneshavebeensuccessfullycloned,andplantinterferenceexpressionvectorspCAMBIA-3301-35s-RIN4-nosandplantoverexpressionvectorpCAMBIA-3301-35s-RPM1-noscontainingtheoxaphosphine-selectivemarkerareconstructed.2.DetectionobtainedbyPCRcontainingtheresistancegeneRIN4positiveT0generationplants3,T1-generation11havepositiveplants,andcontainingtheresistancegeneRPM1positiveT0generationplants5,T1-generation14havepositiveplants.3.Thepromoter35s,terminatorNos,targetband,andselectionmarkerBarofthetargetgeneofinterestaredetectedintheT1transformantlines,indicatingthatthetargetgeneisstablyinherited.4.TheresultsofSouthernhybridizationofT1transgenicplantsshowthatthegeneforRIN4interferingexpressionvectorandthegeneforRPM1overexpressionvectorareallintegratedintothesoybeangenomewithasinglecopy,andtheintegrationsitesweredifferent.5.FluorescentquantitativePCRdetectionoftransgenicplantswithsouthernhybridizationsignals,andtheresultsshowthatthegeneforRPM1overexpressionvectorisexpressedinroots,stemsandleavesoftheplants,ofwhichthehighestexpressionlevelsinleavesandthelowerexpressionlevelsinrootsandstems.ThegeneforRIN4interferingexpressionvectorinhibitedtheexpressionofsoybeanendogenousgenes,resultinginadecreaseintheexpressionofroots,stems,andleaves.Amongthem,theamountofexpressioninleavesdecreasedthemost,andtheexpressioninrootsandstemsdecreasedless.6.Thefoliarspraymethodisusedtoidentifytheresistanceofthetransgenicplantstosoybeangreyspot.Theresultsshowthat:①IncreaseresistancetoRPM1overexpressionvectorgeneplantscomparetocontrolplants,andtheresistanceincreasefromthesusceptibletothemiddleresistancelevel.Throughthecorrelationanalysisofdifferenttissuesitesandgrayspotdiseaseindex,theresultsshowthatthecorrelationcoefficientis-0.92096,showingasignificantpositivecorrelation.Thatis,thehighertheexpressionlevelofthetargetgeneintheleaves,thestrongertheresistanceoftheplantandthelowerthediseaseindex.②Comparewiththecontrolplants,theresistancetoRIN4interferenceexpressionvectorgeneplantsisenhanced.Andresistanceincreasefromthesensationtothemiddlelevel.Thecorrelationanalysisbetweendifferenttissuesitesandgrayspotdiseaseindexshowthatthecorrelationcoefficientis0.844375,showingasignificantnegativecorrelation.Thatis,thelowertheexpressionlevelofthetargetgeneintheleaves,thestrongerthediseaseresistanceoftheplantsandthelowerthediseaseindex.Keywords：Soybean;RIN4andRPM1resistancegenes;DiseaseresistanceIV 目录摘要...........................................................................................................................................IAbstract.......................................................................................................................................III前言..........................................................................................................................................1第一章文献综述..........................................................................................................................21.1大豆灰斑病的研究进展...................................................................................................21.1.1大豆灰斑病生理学特性及其危害.........................................................................21.1.2大豆灰斑病生理小种的研究进展.........................................................................21.1.3大豆灰斑病抗性基因的研究进展.........................................................................31.2植物抗病基因的作用机理及分类...................................................................................31.2.1抗性基因的作用机理.............................................................................................31.2.2抗性基因的分类.....................................................................................................41.2.3植物抗病基因的研究进展.....................................................................................51.3大豆转基因抗灰斑病育种的研究进展...........................................................................51.4研究的目的和意义...........................................................................................................6第二章RIN4和RPM1基因的克隆及表达载体的构建...........................................................72.1试验材料...........................................................................................................................72.2试验方法...........................................................................................................................72.3结果与分析.....................................................................................................................122.4讨论.................................................................................................................................162.5小结.................................................................................................................................17第三章RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体在大豆中的遗传转化及功能验证........183.1试验材料.........................................................................................................................183.2试验方法.........................................................................................................................203.3结果与分析.....................................................................................................................253.4讨论.................................................................................................................................383.5小结.................................................................................................................................39第四章结论................................................................................................................................40参考文献......................................................................................................................................41作者简介......................................................................................................................................45致谢........................................................................................................................................46 前言大豆原产于中国，是世界重要的油料作物和高蛋白作物，也是世界食用油和植物蛋白的主要来源之一[1]。上世纪50年代，我国曾是主要的大豆生产和出口国[2]，而现在随着我国对大豆消费需求量的增加，只能通过大量的进口大豆来维系供求平衡。大豆病害不仅对大豆的产量造成损失，而且还会导致大豆的品质下降，尤其以真菌类大豆灰斑病（Cercosporasojina）所造成的大豆减产尤为严重。据近年调查显示，在东北三省大豆灰斑病对大豆生产所造成的威胁首当其冲，可造成20%-30%的产量损失，最高可达50%以上[3-4]，品质和产量严重降低，经济损失可达上亿元。因此防治真菌类大豆病害来提升大豆产量已成为首要问题。面对大豆灰斑病对我国大豆产业在品质和产量上造成的损失，培育出多抗、高产、优质的作物新品种已然备受期待。随着转基因技术的发展，通过基因工程技术培育抗病大豆新品种成为一种新途径[5]。通过将生物技术与传统育种方法相结合，不仅能够有效的提高品种的抗病能力，而且能够保证品种的优良性状[6]。由于生物技术的不断进步和发展，与植物抗病直接相关的抗病基因逐渐成为研究的热点。研究发现，植物对病原体的抗性均与抗性基因(Resistancegene)有关[7]。这类基因主要通过一系列完整且复杂的抗病反应,来抵制病原菌的侵染及向健康组织的扩散。自90年代初第一个植物抗性基因Hml被克隆以来，已在多种植物中分离出40多个抗性基因[8]。其中分布最广和数量最大的基因家族是以富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点(LRR-NBS)类的抗病基因[9]，其作用已日益受到人们关注，包括来源于拟南芥的RIN4和RPM1基因，其反应模式为：病毒无毒的AvrRpm1对寄主RIN4进行修饰，从而激活了RPM1基因，激发机体防卫反应[10]。但其他的对于RIN4和RPM1基因的报道相对较少，故本实验克隆了这两个基因，并在大豆中进行了抗性功能的验证。1 第一章文献综述1.1大豆灰斑病的研究进展大豆灰斑病又称大豆蛙眼病，是一种由大豆短胖孢属引起的世界性真菌病害[11]。据统计，我国大豆主要产区—东北三省主要的大豆病害是大豆灰斑病[12]。1.1.1大豆灰斑病生理学特性及其危害该菌是由Hara在日本1915年首次发现的。病原菌的分生孢子成梭状,表面无色透明。其菌丝生长需要严格的控制好温度和湿度，一般最适温度为25～28℃,萌发的最适温度为28～30℃,而当温度为22～27℃时,孢子一般可存活为7天[13]。其孢子萌发最适相对湿度为80%-100%,当湿度低于50%时，则孢子处于不能萌发状态[13]。Veiga[14]等通过试验表明光暗交替比连续光照或黑暗更有利于菌丝扩展和延伸。钟兆西[15]等通过比较PDA培养基上各菌落的生长速度认为在持续的黑暗条件下灰斑病菌的菌丝生长速度最快。大豆灰斑病一般发生在高温多雨的季节，病菌主要以侵染大豆叶片、茎、荚、籽粒为主[16]，并在组织表面产生椭圆形病斑，其中以叶片危害最为严重。病害初期表现为褐绿色小圆斑[17]，然后中央灰色逐渐变褐，直至四周形成褐色蛙眼状斑点[18]，后期斑点布满叶片，影响叶片进行光合，致使叶片逐渐老化脱落[19]。此病害分布世界各地，而我国主要以黑龙江省和东北地区分布较广，危害较重，可造成20%-30%的产量损失，最高可达50%以上。大豆灰斑病不仅影响质粒的外观,而且还会使发芽率降低[20],百粒重降低4%-21%[21],含油量降低0.5%-7%,从而影响产量,使大豆品质下降,限制了出口[22]。1.1.2大豆灰斑病生理小种的研究进展根据大豆灰斑病对不同品种致病力的差异，进而将病原菌群体划分为不同类型的生理小种来进行研究[23]。1962年,Athow等[24]用16个鉴别品种构成一套鉴别寄主,共鉴别出了11个灰斑病生理小种。2003年，吴秀红等[25]通过对224份大豆材料进行人工接灰斑病菌的方法，并在生理小种水平上进行抗性筛选，从而得到了能够抗单个或多个生理小种的抗性品种。张丽娟等[26]通过对100份大豆材料中单抗或单感的大豆材料的选取,而建立了两套单小种鉴别体系,使得单个生理小种的鉴别变得更容易。1988年，霍虹等[27]通过采用自行筛选出的一套鉴别品种进行了大豆灰斑病菌生理小种的测定。并用已知的主要小种,对一些新品种进行了小种接种鉴定,明确了其对主要小种的抗性谱。贾鸿昌[28]利用张立娟等[26]2 建立的两套灰斑病鉴定体系,对黑河地区不同品种13份病菌标样进行了病菌生理小种变化监测，从而在北安等地发现了新的灰斑病生理小种。由此可以看出，大豆灰斑病菌的生理小种多变且复杂，这也为抗性育种的选育增添了难度和挑战。1.1.3大豆灰斑病抗性基因的研究进展早在1952年,Athow等[29]就对大豆灰斑病生理小种的抗性基因进行了细致的研究,认为两对显性基因RCS1和RCS2分别控制大豆灰斑病1号和2号生理小种的抗性。杨庆凯等[30]研究发现大豆灰斑病1号和7号生理小种抗性分别受两对显性基因HRCS1和HRCS2控制。Philips[31]等通过对美国5号生理小种的研究中发现了大豆灰斑病受另一对抗性基因RCS3控制。由此可以看出，不同的大豆灰斑病生理小种受不同的抗性基因控制。1.2植物抗病基因的作用机理及分类1.2.1抗性基因的作用机理长久以来，植物在于病原微生物的长期斗争中，逐渐形成了一系列复杂的抗病防卫反应机制[32]，其中主要的抗病反应机制有三种：基因对基因假说、激发子/受体模型、防卫假说。1.2.1.1基因对基因假说1971年，HarololFlor[33]首次通过对亚麻抗锈病的遗传机制以及亚麻锈病的真菌病理学揭示了这一假说，即病原菌与宿主的关系分为亲和和不亲和两种，亲和时病原体携带毒性基因VIR，不亲和是携带无毒基因Avr，当携带Avr的病原菌与携带抗性基因的宿主结合时，植物表现为抗病性，其他组合下植物体表现为感病。而Tang[34]等在1996年对Pto-avrPto的研究和Jia[35]在2000年对Pita-avrPita的研究均成为了这一理论的真实证据。1.2.1.2激发子/受体模型激发子/受体模型是从基因对基因假说发展的基础上得来的[36]。其认为对于植物来讲，每一个主效抗病基因，病原菌上就存在一个决定毒性的无毒基因（Avr）[37]，病原体的Avr基因能够直接或者间接的编码一种配体（激发子），使其与抗性基因编码的产物（受体）之间相互作用，从而触发受侵染部位细胞内的信号传递，激活相应的防卫基因表达，从而引发机体产生过敏反应[38]。1.2.1.3防卫假说最早是由Jones和VanderBiezen[39]提出的，假说认为:当病原体侵染植物并营造适合其生长的环境时，会把植物体内的一种蛋白-“卫兵”作为靶子加以改变，而抗病基因蛋白能够通过检测“卫兵”蛋白和病原体毒蛋白所形成的复合体来识别这种“卫兵”蛋白的3 改变，从而激发植物体的抗病性。研究发现，作为“卫兵”分子的RIN4蛋白能够在体外条件下与功能基因RPM1和其无毒基因AvrRPM1之间进行相互作用，AvrRPM1和AvrB(无毒激发子)编码的蛋白能够磷酸化RIN4蛋白，使细胞内环境对病原体的生长有利，当RPM1监测到这一反应后，就会引起细胞产生相应的抗性[40]。而RIN4蛋白的减少也会使细胞的抗性增强，并作为一个负调控因子积极的调整RPM1基因介导的抗性[41]。2002年Schneider等[42]通过研究间接证明了抗性基因不仅能够识别Avr蛋白，而且还能够监视一些病原体触发产生或修饰的植物蛋白和或蛋白复合体。McDowell和Woffenden[43]在2003年提出多抗基因编码的蛋白可能能够识别不同类型的病原体诱导和修饰的同一个卫兵蛋白。1.2.2抗性基因的分类1.2.2.1NBS-LRR类蛋白NBS-LRR类蛋白为最为主要的一类抗病基因，但并不是所有的NBS-LRR类蛋白均具有抗病性，根据有无TIR结构又分为：TIR-NBS-LRR型R蛋白，包括基因L6、RPP5等[44]；和没有TIR区域，即非TIR类NBS-LRR基因，包括RPS2、RPM1、Prf等[44]。NBS具有ATP或GTP的结合活性，且结构域保守性较高，所以在抗性基因发挥功能方面起着重要的作用[45-46]。LRR结构域能参与蛋白和蛋白互作或与配体之间进行结合，并在基因产物和参与防卫反应中信号传导的蛋白质识别和结合中起促进作用[46]。因此核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)被认为是识别病原菌和激活防卫反应的中心区域[47]。1.2.2.2胞外LRR-TM类蛋白此家族仅含有富亮氨酸重复（LRR）和跨膜区域TM，编码一个跨膜蛋白和细胞外LRR,如CF2、CF5、CF4等。1.2.2.3跨膜受体激酶类（LRR-TM-STK）蛋白如Xa2l基因，其能够编码一个跨膜受体，具有一个较大的LRR结构域和一个细胞内的蛋白激酶结构域[48]，较大的LRR结构域能够在细胞表面对病原物产生识别，随后激发蛋白激酶发起防御反应[49]。如番茄的抗叶斑病基因Pto，而此基因的结构域中含有保守的STK结构，担负着丁香假单胞菌的抗性。1.2.2.4灭活毒素类功能酶主要为Hm1、Hm2抗病基因,其可以介导对真菌病原Cochlioboluscarbonum小种1和小种2的抗性，并灭活病原真菌产生的毒素[50]。但Hm1却不同于以上所提及的抗性基因,不符合Flor的基因对基因假说。另外还有一些调控因子类的抗病基因包括：大麦抗白粉病基因Mlo就为此类[51]。4 1.2.3植物抗病基因的研究进展1.2.3.1NBS-LRR类抗病基因的研究进展Gore等[52]（2002）和Hayes等[53]（2000）等通过研究分别发现独立的单显性抗性基因RSV1和RSV4，并已被鉴定对大豆花叶病病毒具有抗性。2003年，Deslands等[54]研究发现拟南芥中RRS1-R阴性等位基因对于双子叶植物细菌性枯萎病的抗性有重要影响。2005年，VanDamme等[55]通过对抗寄生霜霉菌的拟南芥突变体的研究发现了抗性基因PR-1的表达。2015年，潘巧娜[56]通过对拟南芥抗性基因RTP1的研究发现，RTP1基因可以通过其负调控反应引起植物体对寄生疫霉菌的抗性，并通过接菌实验发现了拟南芥突变体rtp1-1对活体寄生性病原菌的抗性，包括丁香假单胞菌和拟南芥白粉菌等。由此可见NBS-LRR类抗病基因不仅能够对病毒和细菌产生抗性，而且也能对真菌产生抗性。1.2.3.2RIN4和RPM1基因的作用机制1962年，Athow[24]通过研究发现RPM1基因能够通过识别丁香假单胞菌从而引发植株的超敏反应，进而产生抗性。2003年，AxtellandStaskawica等[57]研究发现，RPS2蛋白在细胞质中以RPS2-RIN4的复合体形式存在，当丁香假单胞菌侵染拟南芥时，病原无毒的AvrRPS2蛋白进入细胞中，与RPS2-RIN4的复合体相互识别作用，使RIN4蛋白脱离，并经过一系列的信号传递，刺激机体发生防卫反应，使机体产生抗病性。1.2.3.3RIN4和RPM1抗病基因的应用由于大豆病害对作物产量和品质造成了巨大影响，利用转基因技术将抗病基因导入到作物中来已经得到了广泛的认可。国内目前应用RIN4、RPM1抗病基因来抵抗病害主要集中在马铃薯，茭白等上，而没有关于RIN4和RPM1抗病基因在大豆上应用的报道。李帅等[58]（2016）通过对茭白抗病基因Zl-RPM1和Zl-ADR的克隆及表达分析，结果表明，抗病基因的表达能直接影响茭白菰黑粉菌的生长分布。张柏顺等[59]（2010）通过对马铃薯RIN4-like基因全长cDNA的克隆与基因转化，验证其对马铃薯青枯病的影响。1.3大豆转基因抗灰斑病育种的研究进展转基因技术不仅能够打破物种局限，而且能够对基因定向改造和重组转移，成为抗病育种改良的有效技术手段[60]。张彪[1]通过转化转录因子BnERF104，从而提高了大豆灰斑病广谱抗病性。徐香玲等[61]通过花粉管通道法将几丁质酶基因导入到栽培大豆中获得再生植株，以此来提高大豆灰斑病的抗性。谷晓娜等[62]通过对高世代转hrpZpsta基因的大豆品系进行灰斑病的抗性鉴定，结果初步证明外源hrpZpsta基因的表达量与受体植株对灰斑病的抗性存在一定的相关性。5 1.4研究的目的和意义综上所述，RIN4和RPM1抗病基因能够通过一系列的信号转导从而激发植物体发生过敏反应，从而产生对病原菌的广谱抗病性，具有重要的应用价值，而关于RIN4和RPM1抗病基因在大豆上应用的报道相对较少。本试验利用同源PCR技术从拟南芥中克隆出RIN4和RPM1抗病基因，然后利用无缝克隆技术进行表达载体的构建，并将其转化到JN28大豆品种中，通过对获得的阳性植株进行分子检测和抗病性鉴定，来验证RIN4和RPM1抗病基因在大豆中的抗灰斑病能力。6 第二章RIN4和RPM1基因的克隆及表达载体的构建试验首先利用NCBI查找到RIN4和RPM1抗病基因的序列，并根据其开放阅读框设计特异性引物。以拟南芥基因组为模板，利用同源PCR技术对目的片段进行克隆，连接克隆载体，然后构建植物干扰表达载体和植物过表达载体，并对试验结果进行验证。2.1试验材料2.1.1菌株和载体大肠杆菌DH5α、植物表达载体pCAMBIA3301、克隆载体pMD18T均由吉林农业大学植物生物技术中心提供。2.1.2试验试剂和仪器试验试剂：植物DNA基因提取试剂盒，Fermentas公司出产的PCR分子检测试剂，长春威特公司凝胶回收试剂盒，SeamlessAssemblyCloningKit无缝克隆试剂盒购于中美泰、限制性内切酶BglII和BstEII等。仪器：PCR仪、电泳仪、孵育器、凝胶成像仪、台式高速离心机、pH酸度计等。2.2试验方法2.2.1目标基因的克隆2.2.1.1拟南芥基因组的提取利用植物DNA基因提取试剂盒对野生型拟南芥基因组进行提取，从而获得高浓度的基因组DNA。具体步骤如下：A.取野生型拟南芥植物叶片若干mg，在倒入液氮之后立即对其进行充分的研磨处理。B.将研磨后的拟南芥叶片粉末快速的收集到标格为2.0的离心管之中，然后在离心管中加入400μLBufferLP1和6μL的RNaseA（10mg/mL），并将其置于涡旋振荡器上振荡1min左右，置于室温静置10min，保证组织粉末能够充分裂解。C.加入130μL的BufferLP2，然后将其置于涡旋器上再振荡1分钟，以便其能够充分混匀。D.12300rpm离心4min，并用移液器将上清液转移到新的洁净的2.0mL离心管中。E.加入上清液1.5倍体积的BufferLP3（首先确保LP3已加入无水乙醇），然后将其进行充分混匀（如40μL的上清液加600μL的BufferLP3）。7 F.将上步管内溶液转移至试剂盒内所带有的收集管中的的吸附柱内，如溶液过多则可进行多次转移，12300rpm离心50s，取下吸附柱，并将管中废液丢弃，然后再将吸附柱放回原管内。G.向管中加入500μL的BufferGW，12300rpm离心60s后丢弃管中废液，将吸附柱放回管中。H.重复步骤G。I.12300rpm空甩离心3min，再次倒掉管中废液，并将吸附柱置于洁净的纸上，室温晾干数分。J.将晾干的吸附柱放入新的离心管中，并且慢慢地向吸附膜中间处悬滴50μLBufferGE（枪头切勿触到吸附膜，以免造成影响），室温静放5min，12100rpm离心60s，从而得到高浓度DNA溶液，然后将其置于-20℃保存。2.2.1.2引物设计及常规PCR扩增利用常规PCR技术对目的基因进行特异性扩增，其引物序列及反应条件参照表1、2，而后利用1%的琼脂糖凝胶电泳对所扩增目标产物进行分离检测。表1.引物序列Table1.Primersequence名称序列(5'-3')RIN4-sATGTTTTGTGGAAGGACRIN4-AsATCAGCTCTAAGGTTGGRPM1-sATGGCTTCGGCTACTGRPM1-AsCTCTAACCCTCTACAAGCCZRIN4-sACTCTTGACCATGGTAGATCTATGTTTTGTGGAAGGACZRIN4-AsACAATTCCACACATCAGCTCTAAGGTTGGFRIN4-sAGATGTTTTGTGGAAGGACFRIN4-ASGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCATCAGCTCTAAGGTTGGNRIN4-sTCAGTGGCGTGTGGAATTGTGAGCGGATAANRIN4-ASAAGAATCTGCAGTCACCGCTGGCGAAAGGGGGATGTBRPM1-sACTCTTGACCATGGTAGATCTATGGCTTCGGCTACTGBRPM1-AsGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCCTCTAACCCTCTACAAGCC8 表2PCR扩增条件Table2.PCRamplificationconditions基因预变性变性退火延伸循环数后延伸RPM194℃,5min94℃,40s52℃,40s72℃,40s3572℃,8minRIN494℃,5min94℃,40s54℃,40s72℃,40s3572℃,8min2.2.1.3凝胶回收及克隆载体的连接对凝胶电泳后准确无误的条带进行切胶回收，并将回收产物给予测序公司进行测序，将测序结果与起初基因序列进行比对，看是否已将目标基因成功克隆。其回收方法如下：（1）在紫外灯照射下将特异条带处的凝胶进行切割，并将切碎的凝胶块置于干净的2.0mL离心管中（提前记录好空管重量）,称取离心管中的凝胶重量，并将其作为一个凝胶体积。（2）然后将3倍胶重的BufferDE-A加入到称好的2.0mL离心管中，混合后置于75℃水浴锅中进行水浴加热（可以每1-2min间断混合），直至通过观察2.0mL离心管中没有胶块时停止（约5-8min）。（3）加入BufferDE-A的0.5倍体积的BufferDE-B，充分颠倒混匀，至溶液全部变为黄色为止，并将全部的混合液转移到新的离心柱内（如果溶液太多可多次转移），放入套管经12300rpm离心60s，如溶液过多，可多次进行溶液转移，然后倒掉废液，放回离心柱。（4）向离心柱内加入700μL的BufferW1，再于离心机中12100rpm离心3min后将离下的液体倒掉。（5）再次向其内部加入500μL的BufferW2洗涤一次，12100rpm离心2min后倒掉废液，重复步骤（5），然后再置于离心机空转离心2min之后，晾干离心柱。（6）将干燥的离心柱放入一个新离心管中，在制备膜中央加入15μL的ElutionBuffer，然后放于室温反应60s，再12100rpm离心2-3min充分洗脱DNA，所得溶液保存于-20℃备用。将测序结果无误的凝胶产物进行克隆载体的连接，分别取4μL浓度较高的凝胶产物、5μLslutionI和1μLpMD18T溶液，置于PCR管中混匀（此操作均在冰盒上进行），然后放于孵育器中16℃反应16h，并将反应液加入到大肠杆菌感受态中进行转化（其转化方法的具体试验步骤请参考韩丹[63]），然后将转化完的菌液用接菌环与LB+Ampicillin(100mg/L)固体培养基上划线，37℃恒温培养16个小时，挑取上述单菌落，置于装有5mlLB+5μLAmpicillin的洁净无菌玻璃管中，平稳固定并以37℃，200转/分钟，振荡培养9 15小时。2.2.1.4测序及同源性比较将连接完克隆载体的菌液送去测序公司进行测序，利用DNAMAN对取回的测序结果与起初基因序列进行序列结果比对，然后在对测序完的序列进行Blast同源性的比较，进行结果分析处理，以便于接下来的试验能够顺利开展。2.2.1.5质粒的提取对测序结果正确的克隆载体进行质粒提取，采用高纯度质粒小量提取试剂盒进行提取和操作，然后利用蛋白检测仪对提取好的质粒DNA溶液进行浓度的测定，将测完浓度合格的质粒溶液放置于-40℃冰箱里保存备用。2.2.2重组植物表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos的构建2.2.2.1DH5α感受态的制备[64-65]CaCl制备方法具体过程参照吴楠和林楠等2法进行操作。2.2.2.2pCAMBIA-3301载体线性化并回收大片段根据在线双酶切设计工具DoubleDigestCalculator推荐的双酶切体系，在PCR反应仪中进行双酶切反应，反应体系参照表3所示（注意关闭Heatlid）。其双酶切反应程序：37℃双酶切3h，65℃灭活15min。表3双酶切反应体系Tab.3Systemofdoubledigestreaction药品名称加入量pCAMBIA-33011mg10×Buffer02μLBglII1μLBstEII1μLddH2OUPto20μL10 待双酶切反应结束后，向反应液中加入一定量的10×核酸上样缓冲液，混合均匀后加入到0.8%琼脂糖凝胶点样孔空中，150V100A进行电泳，待20min左右停止电泳。然后对其进行凝胶产物的回收，具体操作参照2.2.1.3所示。2.2.2.3特异性片段的扩增以2.2.1.3提取的克隆载体的质粒为模板，并利用CEDesign引物设计软件分别设计植物RNAi表达载体和植物过表达载体的引物（序列参见表1），并进行特异性片段的扩增，反应体系如下：10×TaqBuffer2.5μL，25mMMgCl22.5μL，上,下游引物各1.5μL，dNTP0.8μL;Taq酶0.3μL，载体质粒1μL，无菌水14.9μL。反应程序参照表2所示。2.2.2.4特异性片段的纯化对扩增完的产物进行特异性片段的纯化，具体步骤参照康为世纪CW2301S说明书上的方法进行操作：A.向试剂盒提供的套管离心柱中加入400μL柱平衡液PS，12300转离心60s，并将离心下来的废液进行弃除。B.吸取全部的PCR产物于洁净的1.5mlEp管内，计算溶液体积后加入其5倍体积量的PB溶液，然后用250μLtip均匀混合。C.将上述步骤中的混合液加入到经A步骤平衡过的管内，先常温放置4min后12300转离心60s，并将废液弃除。D.将600μL清洗液PW加入到离心柱中，室温静止3min后12300转离心60s，并将废液弃除。E.12300转对上述空的离心管进行空甩2min，并将空甩后的离心柱取出，室温放置晒干处理。F.最后将晒干后的离心柱放于洁净的1.5mlEp管内，将20μL回溶液加入到洗膜的中心位置，静止3min后12300转离心60s，并将纯化产物置于-20℃冰箱里保存备用。2.2.2.5无缝克隆组装反应按照中美泰和上的说明进行操作，将纯化好的PCR产物重组到回收的pCAMBIA-3301载体大片段上。具体的反应程序为50℃同源重组15min，冰上放置2min，其反应体系参照表4所示。11 表4表达载体反应体系Tab.4Constructthereactionsystemofexpressionvector药品名称加入量线性载体和DNA片段0.5-5μL2×SeamlessMasterMix5μLddH2OUPto10μL2.2.2.6将重组质粒转化到DH5α感受态取10μL重组质粒到新制好的DH5α感受态中，试验具体的操作步骤，参照韩丹[63]。2.2.2.7重组植物表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos的验证对连接好的重组植物表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos进行验证，以其质粒为模板，参照各自相应的特异性引物，进行电泳试验。并对重组载体质粒使用BstEII和BglII进行双酶切验证，具体反应体系参照表3所示，并将验证正确的酶切条带回收并送去进行测序。2.3结果与分析2.3.1RIN4和RPM1基因的克隆及检测以拟南芥基因组为模板，通过同源PCR扩增技术对目标基因进行克隆，从而得到片段大小分别为458bp(RIN4基因)和2592bp(RPM1基因)基因序列，并对回收产物进行测序，将测序结果正确的回收产物连接到克隆载体pMD18T上，并对连接完的克隆载体pMD18T-RIN4和pMD18T-RPM1的菌液进行质粒的提取，以水为空白对照，进行克隆载体的PCR检测，结果如图1所示，2、3、4泳道均出现条带，且条带大小分别为458bp和2592bp。两种抗病基因均出现了与预期大小相同的条带，初步证明RIN4和RPM1基因已成功克隆。然后对相应条带进行凝胶回收，将凝胶回收产物送至长春酷美有限公司测序，并对结果进行比对，如图2、3所示，其一致性均达到99.78%，99.50%，最后将序列放于NCBI上进行Blast结果比对（如图4），其中RIN4基因的同源性达到了95%，RPM1基因的同源性达到了98%，说明已经成功的将RIN4、RPM1基因克隆了出来。12 M1234M1234259220001000750500458250100图1克隆载体的验证Fig.1Validationofcloningvectors注：M：DL2000DNAmarker；1：水；2-4：克隆载体A:pMD18T-RPM1B:pMD18T-RIN4Note:M：DL2000DNAmarker;1:Water；2-4：Cloningvectors图2RIN4基因测序结果比对Fig.2SequencingresultsofRIN4图3RPM1基因测序结果比对Fig.3SequencingresultsofRPM113 AB图4.Blast结果比对Fig.4Comparisonofblastresult注：A:RIN4基因，B：RPM1基因Note：A:RIN4gene，B：RPM1gene2.3.2植物表达载体的鉴定2.3.2.1RIN4基因RNAi表达载体的构建及检测将连接完的克隆载体pMD18T-RIN4进行表达载体的构建，利用CEDesign引物设计软件对抗病基因RIN4进行RNAi表达载体引物设计，从而得到特异性引物ZRIN4-s（正义458bp）、ZRIN4-As、NRIN4-s(内含子205bp)、NRIN4-As、FRIN4-s（反义458bp）、FRIN4-As的序列，通过无缝克隆技术将目的基因的正义、内含子、反义片段连接到植物表达载体pCAMBIA-3301上，绘制植物RNAi表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos的结构示意图如图5所示。利用BglII和BstEII两种酶进行双酶切试验，并进行凝胶电泳，以保证重组的质粒载体正确。如图7所示，植物RNAi表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos双酶切片段大小与预计片段大小1121bp（包含正、反义片段和内含子片段的总和）相一致，初步说明表达载体构建成功，然后进行PCR产物及测序结果验证。图5植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos结构图Fig.5PlantexpressionvectorpCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos2.3.2.2RPM1基因过表达载体的构建及检测将连接完的克隆载体pMD18T-RPM1进行表达载体的构建，利用CEDesign引物设计软件对抗病基因RPM1进行过表达载体引物设计，从而得到特异性引物BRPM1s（2592bp）、BRPM1as的序列，通过无缝克隆技术将目的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-3301上，14 绘制植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos的结构示意图如图6所示。利用BglII和BstEII两种酶进行双酶切试验，并进行凝胶电泳，以保证重组的质粒载体正确。如图7所示，植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos双酶切片段大小也与预计片段大小2592bp相一致，初步说明表达载体构建成功，然后进行PCR产物及测序结果验证。图6植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos结构图Fig.6PlantexpressionvectorpCAMBIA-3301-35s-RPM1-nosM123M123200011211000750200025925001000250750100500250100图7重组质粒验证Fig.7Validationofrecombinantplasmid注：M：DL2000DNAmarker；1-2:酶切产物；A:pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos;B:pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nosNote:M：DL2000DNAmarker;1-2:Restrictionproducts2.3.2.3PCR和测序结果验证以上述构建好的表达载体质粒为模板，进行常规PCR检测，结果如图8所示，其RIN4基因的正、反义片段和内含子片段均出现了和预期大小相同的片段，RPM1基因也出现了与预期大小相同的片段，并将其送至长春酷美有限公司进行测序，并利用DNAMAN对测序结果进行比对结果如图9、10所示，匹配率均达到99%左右，说明植物RNAi表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos构建成功。15 M1234567M123456789101112AB200025921000750500250100458205图8重组质粒PCR产物验证Fig.8RecombinantplasmidPCRproductvalidation.注：M：DL2000DNAmarker；A:1水；2-7pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nosPCR产物；B:1,5,9水；2-4正义片段；6-8反义片段；10-12内含子Note：M：DL2000DNAmarker；A：1Water；2-7DetectionofpCAMBIA-3301-35s-RPM1-nosbyPCRB：1,3,9water;2-4Fragmentsofjustice;6-8Fragmentsofantisense;10-12Intron图9RPM1基因测序结果比对Fig.9SequencingresultsofRPM1图10RIN4基因测序结果比对Fig.10SequencingresultsofRIN42.4讨论利用同源序列候选基因法克隆抗病基因是一种有效的克隆方法[66]。如1999年，Collin等[67]利用己知的抗性蛋白的保守序列进行特异性引物的设计，然后从玉米中克隆到一些片段，并进行数据处理和分析，从而筛选到玉米抗锈病基因rp1和rp3的候选基因。本试验通过NCBI查找已知的抗病基因序列，设计特异性引物，并通过常规PCR法将目的基因16 完整序列克隆出来，然后对目的基因进行测序，并对测序结果进行比对分析发现其匹配率均达到99%。通过Blast比对结果分析表明RIN4基因的同源性达到了95%，RPM1基因的同源性达到了98%。2.5小结通过对目标基因RIN4和RPM1的PCR检测及对测序结果的同源性比较，表明已成功克隆出两种抗病基因，并构建了含有抗草胺膦筛选标记的植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos。17 第三章RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体在大豆中的遗传转化及功能验证利用农杆菌介导法，将构建好的重组质粒转入到大豆受体品种‘JN28’中，并对T1代转基因植株进行常规PCR、Southernblotting、荧光定量PCR检测和室内抗病性鉴定。为了比较转RIN4、RPM1基因和转hrpZpsta基因植株的抗病能力，我们以实验室前期工作中获得的稳定的转hrpZpsta抗病基因植株为比较对象，进行抗病能力的比较。3.1试验材料3.1.1植物材料和菌株植物材料：“吉农-28”由吉林农业大学植物生物技术中心提供。菌株：灰斑菌株CsJ-1由吉林农业大学农学院病理教研室提供；大肠杆菌DH5α、农杆菌菌株EHA105由吉林农业大学植物生物技术中心提供。3.1.2试验试剂和仪器试验试剂：Roche公司出产的DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit、TaKaRa公司出产RNAisoPlus试剂盒、Prime-ScriptTMRTMasterMix、GeneCopoeiainc公司生产的反转录试剂盒等。仪器：PCR仪、qRT-PCR仪、孵育器、杂交炉、台式高速离心机、电泳仪、凝胶成像仪、磁力搅拌器、制冰机、恒温摇床、烘箱、恒温培养箱、水浴锅、pH酸度计、紫外分光光度计、冷冻混合研磨机等。3.1.3主要培养基菌类培养基：LB培养基和YEP培养基LB培养基（固体）：2.5gSodiumChloride+2.5gCaseinTryptone+1.25gYeastextract+3gAar,pH=7,upto250μLLB培养基（液体）：2.5gSodiumChloride+2.5gCaseinTryptone+1.25gYeastextract,pH=7,upto250μLYEP培养基（固体）：1.25gSodiumChloride+2.5gCaseinTryptone+2.5gYeastextract+3gAar,pH=7,upto250μLYEP培养基（液体）：1.25gSodiumChloride+2.5gCaseinTryptone+2.5gYeast18 extract,pH=7,upto250μL植物培养基：萌发培养基；预培养培养；共培养培养基；筛选培养基；伸长培养基；生根培养基。萌发培养基:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉，pH=5.8预培养培养:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉+6-BA+IBA，pH=5.8共培养培养基:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉+6-BA+IBA+AS，pH=5.8筛选培养基:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉+Bar+Carb+IBA+头孢，pH=5.8伸长培养基:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉+GA+Carb+头孢+IBA，pH=5.8生根培养基:20×MS大量+100×MS微量+10×B5有机+100×铁盐+MES+蔗糖+琼脂粉+Carb+头孢+IBA，pH=5.83.1.4试验引物和反应条件表5.引物序列Table5.Primersequence名称序列(5'-3')rin4-sATGTTTTGTGGAAGGACrin4-AsATCAGCTCTAAGGTTGGrpm1-sATGGCTTCGGCTACTGrpm1-AsCTCTAACCCTCTACAAGCCQrin4-sCTCCTCCTCATCCTCCTTCTTQrin4-AsCTGTTTCAACTCGCTCTCTTCTQrpm1-sGTGCTTTGTGCTCCCAATTCQrpm1-AsCACTGGTCTATGGAGGGAGATAQhrpZpsta-sGGTGAACGAACTCAAGGAAGAQhrpZpsta-AsTTGACCCATTAGTCGTCTCACβ-action–sATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCCβ-action–AsCCTCTGTCGGTCCTGGTCGhrpZpsta–sGGGAGATCTATGCAGAGTCTCAGTCTTAAChrpZpsta-AsCGTTGGTCCGACGACGGACTCCATTGGGTT35s-sTAGAGGACCTAACAGAAC35s-AsCCGTGTTCTCTCCAAATGNos-sGAATCCTGTTGCCGGTCTTTGNos-AsTTATCCTAGTTTGCGCGCTABar-sTCAAATCTCGGTGACGGGCBar-AsATGAGCCCAGAACGACGC19 表6PCR扩增条件Table.6PCRamplificationconditions基因预变性变性退火延伸循环数后延伸hrpZpsta94℃,5min94℃,40s55℃,40s72℃,40s3572℃,8min35s94℃,5min94℃,30s55℃,30s72℃,30s4072℃,8minNos94℃,5min94℃,30s50℃,30s72℃,30s3072℃,8minBar94℃,5min94℃,40s60℃,40s72℃,40s3572℃,8minRPM194℃,5min94℃,40s52℃,40s72℃,40s3572℃,8minRIN494℃,5min94℃,40s54℃,40s72℃,40s3572℃,8min3.2试验方法3.2.1大豆的遗传转化将构建好的重组质粒通过液氮冻融法转化到农杆菌EH105感受态中，并选取在相应的培养基和抗性筛选中长出的单菌落，进行质粒的回收处理，并对其进行结果的验证，正确的菌种用于大豆JN28子叶节的侵染，具体的方法参照高嵩等[68]（注：培养基请参照上述所示）。3.2.1.1EHA105CompetentCell的制备方法同大肠杆菌感受态相似上，需注意培养基转变为YEP，温度需控制在28℃，活化菌落的同时需要进行OD值的测定约为0.5-0.7左右。具体操作步骤，参照韩丹等[63]。3.2.1.2CAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos质粒转化EHA105感受态具体操作步骤请参考吴楠等[64]。3.2.1.3工程菌的验证在超净工作台里，挑取试验3.2.1.2中长出的单菌落，小摇扩繁16h后，进行质粒的提取，并将提取完的质粒作为模板，使用相应的上下游引物进行PCR验证（引物及反应体系参照表7和表8），并对正确的工程菌进行保存，以便后续步骤的使用。3.2.1.4农杆菌介导法对受体品种进行遗传转化使用农杆菌介导法对受体品种JN28进行遗传转化，其具体步骤如下：大豆种子的灭菌将挑选好的大豆种子置于培养皿内，加入浓盐酸5ml和安替福民25ml，待反应产生20 氯气时迅速盖上培养皿的盖，然后灭菌12h即可。种子萌发将已灭菌的种子置于萌发培养基上（过程中避免污染培养基）,并用记号笔记号日期，放置于遮光处暗培养培养3天。子叶节预培养去除子叶节点以下约2-3mm处的下胚轴以及根部,并用刀片纵向于胚轴方向切开胚轴，然后将其置于预培养培养基中，遮光暗培养3天。工程菌侵染大豆子叶节3天后对子叶节点间的叶芽组织进行去除，用刀片沿着切面方向分生组织进行划伤，而后得到两个外植体。在侵染前一晚，先将保存的转化农杆菌从-80℃冰箱中取出,取200μL菌液，置于5mlYEP+5μLKanamycin的玻璃试管中，恒温振荡16h。第二天，取出工程菌置于50mlYEP+50μLKanamycin的锥形瓶中，恒温振荡2h，测OD约为0.5-0.7之间即可，并将其倒入50ml离心管中，对其进行6000rpm离心5min后弃液体，按照1mlAS乙酰丁香酮+1L侵染液的比例进行工程菌的重悬后备用，侵染时间为20min。具体侵染细节参考韩丹等[63]。共培养将已侵染完的大豆外植体置于干燥的滤纸上，吸取多余的侵染液，然后将外植体的轴切面朝下平铺入共培养培养基中。最后将培养基用封口膜密封好,在黑暗条件下暗培养3天。筛选培养每14天对其进行一次筛选,共进行2次，筛选培养基光培养。具体方法参考韩丹[63]。伸长培养对筛选后生长状态优异的外植体进行处理，切去子叶，保留重生芽部分，并置于伸长培养盒中，光培养直至高度月3.5-4cm为止。生根培养当伸长组织过高时,将其从外植体上切除,置于生根培养基中,使其继续在培养基中生长。待长出4-5根以上的主根时即可。移栽成苗用无菌水进行炼苗处理，一般不超过4d，然后小心的将苗从培养基中取出，移栽到比例为营养土:蛭石=5:1的花盆中去，并置于人工气候室，促进苗茁壮成长。3.2.2转基因大豆分子检测提取受体大豆和转化植株大豆的叶片基因组，利用软件PrimerPremier5.0对目的基21 因RIN4（458bp）和RPM1（2592bp）、hrpZPsta（1026bp）、标记基因Bar(552bp)、启动子35S(500bp)和终止子Nos（192bp）进行特异性引物设计（其引物与扩增反应条件参照表7、8），然后进行PCR扩增，将含有RIN4和RPM1基因的植株置于人工气候室，并对其进行加代，然后对得到的T1代转基因大豆及T5、T6代转hrpZPsta抗病基因大豆进行Southern杂交及qRT-PCR技术进行整合及转录水平上的检测。3.2.2.1对转基因大豆后代进行初步PCR检测利用特异性引物对大豆基因组进行PCR扩增，扩增体系详见表1。取10μLPCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳试验并对试验结果记录。3.2.2.2T1代植株的Southernblotting检测提取上述PCR阳性植株，非转化受体JN28和JN-hrpZpsta-2004-30-384的基因组，用于Southernblotting试验。主要包括：药品的配制，探针的制备与纯化，提取基因组，基因组酶切试验，电泳分离，变性与中和处理，搭建盐桥，转膜，预杂交，杂交，洗膜及显色等步骤[69]。①药品的配制：变性液，中和液，20×SSC溶液，6×SSC溶液，Maleicacidbuffer，Washingbuffer，Detectionbuffer，洗膜液I，洗膜液II，抗体液等，具体配方参考吴楠等[64]。②探针的制备与纯化：分别以目的基因RPM1和筛选标记Bar作为转RPM1和转RIN4基因植株的探针。以重组质粒pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，然后纯化PCR产物（方法同上2.2.2.4），并加入800ngPCR回收产物至无核酸酶的PCR管中，沸水煮沸15min后冰浴2min，加入4μL瓶1，混匀后放入孵育器中，37℃孵育24h。然后往探针中加入2μL乙二胺四乙酸（pH=8.0）终止反应，纯化探针其具体步骤参考吴楠等[64]。③提取基因组：提取大豆基因组叶片，方法同2.2.1.1相似。④基因组酶切试验：根据Southernblot原理选择限制性内切酶HindⅢ参与酶切反应，使用限制性内切酶HindⅢ4μL；10×HindⅢBuffer4μL；剩余用无菌水补齐至40μL；置于37℃条件下酶切反应过夜。⑤电泳分离：分别制备不含EB的0.8%琼脂糖凝胶电泳（0.24g+40mL0.5×TBE）和含EB的1%琼脂糖凝胶电泳（0.24g+24mL0.5×TBE），待凝胶凝固后，依次将酶切产物加入到样空内，保持电压20V，电流15mA，电泳5h左右，结束电泳。⑥变性与中和处理：将结束后的0.8%琼脂糖凝胶，轻轻的放入搪瓷盘中，并倒入500mL的变性液，使液体没过凝胶，打开摇床进行摇晃并记时。当脱色摇床摇晃2h后（期间一小时更换一次变性液），小心的将变性液倒出，并用无菌水洗涤凝胶，再倒入500mL的中和液，摇床摇晃并记时，1h后(期间半小时更换一次中和液）将中和液倒出。22 ⑦搭建盐桥：取一组新的搪瓷盘，并在内部导入20×SSC溶液，将洁净的长方形玻璃板放在中间，上端平铺与搪瓷盘宽度略窄的两张长方形滤纸，并将滤纸两端置入搪瓷盘底部，使其和20×SSC溶液充分接触浸湿，注意纸中间如有气泡先将气泡赶出。⑧转膜：用无菌水反复洗涤凝胶，并将胶孔中的沙子洗出，以免影响后续试验。将凝胶倒扣在双层滤纸上，用事先剪好的大小适中保鲜膜，封好胶块的四周，并将多余的气泡进行排除。戴好手套裁剪与凝胶一致的硝酸纤维素膜，先将其置于蒸馏水中浸湿5min，然后将其转入20×SSC溶液中去，浸泡5min，用镊子小心取出并覆盖在凝胶之上，并将气泡排除，注意此时不应再移动硝酸纤维素膜。将裁剪好的大小与凝胶一致的二张滤纸，置于20×SSC中浸湿，用镊子夹出覆盖于硝酸纤维素膜上，并放上一定高度的吸水纸，搪瓷盘两侧放置大小规格一样的书，摞成与吸水纸一样的高度，然后将一组新的长方形玻璃板放上，两边分别压上重量在0.8kg的砝码。室温放置，18-20h，早晚各更换一次吸水纸。[64]⑨预杂交、杂交、洗膜及显色等步骤具体操作方法参照吴楠等。3.2.2.3T1代植株的荧光定量分析提取上述试验中出现杂交信号的转基因植株，以及非转化受体大豆的RNA，并利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA,并以cDNA为模板，选择β-action（Genbank登录号:NM001252731.2）基因为qRT-PCR实验的内参基因，设计RIN4、RPM1、hrpZPsta和β-action的荧光引物序列，并进行荧光定量PCR。RNA提取：其步骤按照TaKaRa公司出产RNAisoPlus试剂盒操作步骤进行。RNA的纯化和检测均参考韩丹等[63]。qPCR反应：按照GeneCopoeia生产的qRT-PCRmix说明书中的操作进行，其反应的体系(20μL):2×All-in-oneqRT-PCRmix10μL;相应引物（20umol/L）各1.0μL;cDNA2.0μL;Nuclease-freewater6.0μL;每个样本及对照受体的mRNA检测均重复3次,其扩增条件为95℃3min；95℃40s；55℃40s；35个循环，从而得到相应的Ct值，代反应程序结束后，输出数据并对其进行保存，然后通过相对定量中的2-△△Ct法进行定量结果的计算。最终计算公式：①ΔΔCt＝（Ct靶基因－Ct内参）实验组－（Ct靶基因－Ct内参）对照组[70-72]。3.2.3室内抗病性鉴定在人工接种棚中进行灰斑病接菌试验，首先要对所用菌种进行培养扩繁，到接菌时期采用叶面喷湿法的接菌方法，在大豆开花期前至初花期进行灰斑菌的侵染，并在接菌期间严格控制湿度（80%-90%）和温度（20-25℃）[73]，观察分析后进行数据统计。具体操作如下：①菌种的培养选择土豆培养基培养大豆灰斑病的病原物接种体，培养基配制方法：葡萄糖30g，土豆200g，琼脂18g；定容至1000mL，用玻璃平皿倒板，待培养基彻底凝23 固且干燥后，可用于接种，并在接种的整个操作过程中需均在超净工作台中完成，以确保大豆灰斑病菌不会被其他君污染。接种结束后，置于室温培养，两周左右后观察病菌的长势情况，从而根据菌丝生长状况确定适当的接菌时间。②接菌方法选用饱满的试验材料种子，每盆8株，每个材料种5盆，3次重复，并采用叶面喷施法对大豆进行灰斑病接菌鉴定，在大豆植株开花前期至初花期进行接菌。接菌前3天，需要先对菌斑板进行保湿处理，促进其产生新鲜的孢子，并用无菌水小心洗下孢子体，将菌体用纱布进行过滤，然后向过滤后的孢子溶液中加入3%的蔗糖，配制成孢子悬浮液，即可将其用于对大豆叶面接菌试验[74]。接菌时为保证菌液浓度均匀，要使用统一的喷壶，对接菌植株的叶片进行全方位的喷洒，避免漏喷和喷洒不均等现象的发生，以免影响试验结果。大豆植株接菌大豆灰斑病菌后，对接菌的植株进行保湿（RH为80%-90%）处理36h，每天都需保持光照12h左右，晚上则继续保湿（RH为80%-90%）处理，并将温度控制在20-25℃左右。具体的操作方法参照谷晓娜等[75]。③病情调查与统计分析在接菌15天后开始调查，并根据NY/T495-2002《大豆灰斑病鉴定技术规范》进行病情评价，鉴定病情级别，并对其进行划分，同时计算病情指数（DI）所示和平均严重度，对比表7数据，从而确定植株对灰斑病的抗性水平，然后利用DPS数据分析软件对大豆不同组织部位相对表达量的多少和灰斑病病情指数进行相关性分析。④病情级别划分：0级，叶面无病斑；1级，病斑面积在1%以下；3级，病斑面积1%-5%；5级，病斑面积达6%-20%；7级，病斑面积达21%-50%；9级，病斑面积达50%以上。表7.大豆对灰斑病抗性评价标准Tab.7.Standardofsoybeanresistantevaluationforgrayleafspot病情指数抗性评价0免疫（IM）≤2.0高抗(HR)2.1～15.0抗(R)15.1～40.0中抗（MR）40.1～60.0中感（MS）60.1～80.0感（S）≥80.1高感（HS）病情指数计算公式（1.1）：Σ（发病级别代表值×该级别病株数）病情指数=（1.1）调查总株数×发病最高级别代表值Σ：代表各级乘积数值的总和24 3.3结果与分析3.3.1.PCR检测3.3.1.1转RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体T0代植株的PCR检测提取T0代转化植株的基因组DNA，以非转化受体JN28和无菌水分别作为阴性对照和空白对照，并以植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos质粒DNA为阳性对照，对目的基因RIN4、RPM1、筛选标记Bar、启动子35s和终止子Nos进行PCR检测（反应体系同上），结果表明：得到T0代转RIN4干扰表达载体基因植株3株，转RPM1过表达载体基因植株4株，并将其种子置于人工气候室进行加代。M1234567M1234567BA200010002592552750500250100CD20001000750500500250192100注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:RPM1基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图11转RPM1过表达载体基因的PCR检测Fig.11DetectionofRPM1overexpressionvectorgenebyPCR25 M1234567M123456BA5522000100075050025045810020001000750500500250192100注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:RIN4基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图12转RIN4干扰表达载体基因的PCR检测Fig.12DetectionofRIN4interferenceexpressionvectorgenebyPCR3.3.1.2转RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体T1代植株的PCR检测对经人工气候室进行扩繁的T1代转化植株的叶片进行基因组DNA的提取，并以植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos质粒DNA为阳性对照，未转化植株为阴性对照，对目的基因RIN4和RPM1、筛选标记Bar、启动子35s和终止子Nos进行PCR检测，结果如图13、14所示转化的功能片段RIN4（458bp）和RPM1（2592bp）均出现与质粒相同的条带且阴性对照与空白对照均无条带产生，初步证明RIN4和RPM1基因已成功存在于转化植株中。26 M1234567M1234567AB259220001000750500250100552CD20001000750500500192250100注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:RPM1基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图13转RPM1过表达载体基因的PCR检测Fig.13DetectionofRPM1overexpressionvectorgenebyPCRM1234567M1234567AB2000100075050045855225010027 CD20001000750500500250100192注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:RIN4基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图14转RIN4干扰表达载体基因的PCR检测Fig.14DetectionofRIN4interferenceexpressionvectorgenebyPCR3.3.1.3转hrpZpsta基因株系的PCR检测以稳定的转基因植株基因组DNA为模板，植物表达载体pCAMBIA3301-hrpZpsta质粒DNA为阳性对照，无菌水为空白对照，未转化植株为阴性对照，对目的基因hrpZpsta、抗除草剂基因Bar、启动子35s和终止子Nos进行PCR检测,结果如图15和图16所示，转化的功能片段hrpZpsta均出现与阳性对照位置相同的条带（目的片段：1026bp；筛选标记Bar：552bp；启动子35s：500bp；终止子Nos：192bp），且阴性对照与空白对照无条带产生，由此证明hrpZpsta基因已存在于T5、T6代转化植株中，并且能够稳定的遗传。M1234567M1234567AB55220001000102675050025010028 CD20001000750500500250192100注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:hrpZpsta基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图15T5代转hrpZpsta基因植株PCR检测Fig.15DetectionoftransgenicplantswithT5generationhrpZpstagenebyPCRM1234567M1234567AB552200010261000750500250100CD20001000750500250500100192注：M：DL2000DNAmarker;1:质粒;2:阴性对照;3:水;4-7：转化植株A:hrpZpsta基因；B:Bar；C:启动子35s；D:终止子Nos；Note:M：DL2000DNAmarker;1:Plasmid；2：Negativecontrol；3：water；4-7：Transformedplants图16T6代转hrpZpsta基因植株PCR检测Fig.16DetectionoftransgenicplantswithT6generationhrpZpstagenebyPCR3.3.2Southernblot验证29 3.3.2.1转RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体T1代植株的Southernblot检测对检测到阳性的T1代转化植株进行Southernblot检测。以干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos重组质粒为阳性对照，非转化受体为阴性对照，利用限制性内切酶HindIII对基因组DNA进行酶切，通过Southernblot分析RIN4和RPM1基因在植物基因组中的整合情况。如图17、18所示，4、5、6条带均出现单个杂交信号，而非转化受体没有出现杂交信号，由此证明RIN4和RPM1基因均是以单拷贝形式存在于大豆基因组中，且整合位点均不同。M12345672313094166557436123222027564125图17转RPM1过表达载体基因植株的Southernblot检测Fig.17DetectionofRPM1overexpressionvectorgeneplantsbysouthernblot注：M：SouthernDNAmarker;1:质粒;2:受体对照;3-7：转化植株Note:M：SouthernDNAmarker;1:Plasmid；2：receptorcontrol;3-7:TransformedplantsM12345672313094166557436123222027564125图18转RIN4干扰表达载体基因植株的Southernblot检测Fig.18DetectionofRIN4interferingexpressionvectorplantsbysouthernblot注：M：SouthernDNAmarker;1:质粒;2:受体对照;3-7：转化植株Note:M：SouthernDNAmarker;1:Plasmid；2：receptorcontrol;3-7:Transformedplants30 3.3.2.2转hrpZpsta基因株系的Southernblot检测对经PCR检测为阳性的转基因植株进行Southernblot检测。以pCAMBIA3301-hrpZpsta重组质粒为阳性对照，非转化受体为阴性对照，利用限制性内切酶HindIII对基因组DNA进行酶切，通过Southernblot分析hrpZpsta基因在植物基因组中的整合情况。如图19、20所示，在3、4、5号泳道均产生多个杂交信号，而非转化植株没有出现杂交信号，证明hrpZpsta基因以多拷贝的形式整合到T5、T6代植物基因组中，且整合的位点不同。M1234562313094166557436123222027564125图19T5代转hrpZpsta基因植株Southern杂交检测Fig.19SouthernblotanalysisofT5transgenichrpZpstageneplants注：M：SouthernDNAmarker;1:质粒;2:受体对照;3-6：转化植株Note:M：SouthernDNAmarker;1:Plasmid；2：receptorcontrol;3-6:TransformedplantsM123452313094166557436123222027564125图20T6代转hrpZpsta基因植株Southern杂交检测Fig.20SouthernblotanalysisofT6transgenichrpZpstageneplants注：M：SouthernDNAmarker;1:质粒;2:受体对照;3-5：转化植株Note:M：SouthernDNAmarker;1:Plasmid；2：receptorcontrol;3-5:Transformedplants31 3.3.3qRT-PCR检测3.3.3.1转RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体T1代植株的qRT-PCR检测对Southern杂交检测出现杂交信号的转基因株系进行qRT-PCR检测，分别对RIN4和RPM1基因在T1代转化植株和未转化植株的表达情况进行分析。结果图21、22所示：①RPM1过表达载体基因在T1代植株中的根、茎、叶中均有表达，且叶片中相对表达量最高其均值为3.325；根和茎的相对表达量较低，分别为1.375和0.625。②RIN4干扰表达载体基因转化的植株其根、茎、叶中的相对表达量的均值分别为0.596、0.659、0.499；受体植株根、茎、叶中的相对表达量的均值分别为1.084、0.883、1.114。结果表明RPM1过表达载体基因能够在不同组织部位中进行表达，且表达量也存在差异；RIN4干扰表达载体基因能够起到干扰RIN4基因表达的作用，且不同部位的表达量有差异，可能与基因整合的位置有关。432JN28转化体JN28受体1相对表达量0根茎叶图21.转RPM1过表达载体基因的qRT-PCR鉴定Fig.21.IdentificationofRPM1overexpressionvectorgenebyqRT-PCR1.210.8JN28转化体JN28受体0.6相对表达量0.40.20根茎叶图22.转RIN4干扰表达载体基因的qRT-PCR鉴定Fig.22.IdentificationofRIN4interferingexpressionvectorbyqRT-PCR3.3.3.2转hrpZpsta基因株系的qRT-PCR检测将Southern杂交检测出现杂交信号的转基因株系，进行qRT-PCR检测，并对hrpZpsta32 基因在转化植株和未转化植株的表达情况进行分析。结果如图23所示，hrpZpsta基因在T5、T6代株系的根、茎、叶中均有表达，且在叶片中表量最高，茎中表达量最低，其中T5代转化植株在叶中相对表达量最高为9.190，最低为6.727，平均值为7.743；在根中的相对表达量最高为3.580，最低为2.144，平均值为2.871；在茎中的相对表达量最高为1.717，最低为0.847，平均值为1.363；T6代转化植株在叶中的相对表达量最高为9.781，最低为7.413，平均值为8.589；在根中的相对表达量最高为4.469，最低为2.990，平均值为3.577，在茎中的相对表达量最高为1.986，最低为1.404，平均值为1.664。结果表明，目的基因在不同组织中表达量存在明显差异，且在不同世代中都能够稳定的表达。108相T5代转化体对6T5代未转化受体表T6代转化体达4量T6代未转化受体20根茎叶图23.转hrpZpsta基因大豆品系目标基因的qRT-PCR鉴定Fig.23IdentificationoftargetgenesintransgenichrpZpstagenesoybeanlinesbyqRT-PCR3.3.4转RIN4、RPM1、hrpZpsta基因植株室内抗病性鉴定3.3.4.1转RIN4干扰表达载体和RPM1过表达载体植株的室内抗病性鉴定根据《大豆灰斑病鉴定技术规范》中的接菌方法对转RIN4、RPM1基因大豆株系进行抗病性接种试验，并将所得数据进行统计整理，结果如表8所示。通过图24可知，相比于JN28受体，转RPM1过表达载体植株的抗病能力明显增强，病斑数较少，病害相对较轻。转RIN4干扰表达载体植株的抗病能力相对不明显，而RIN4基因介导的大豆抗病性不明显，可能原因是由于其为防卫型调节基因，间接的参与植物抗病反应体系中。结合表8数据可知，在人工接菌的条件下，JN28转化体的病情指数较未转化受体病情指数明显下降：转RPM1过表达载体株系病情指数由60.57%下降到39.6%；转RIN4干扰表达载体株系病情指数由60.57%下降到44.0%，抗病能力均得到了提高，且转RPM1过表达载体株系的抗病等级由感病提升到中抗水平，转RIN4干扰表达载体株系的抗病等级由感病提升到中感水平,而RIN4基因抗病能力不强可能与其为调控基因，并不是直接参与抗病反应机制中有关。综上可知，RPM1基因的抗性优于RIN4基因。结合数据对转RIN4和RPM1抗病基因大豆的不同组织部位与灰斑病病情指数进行相33 关性分析。结果如表9所示，转RPM1过表达载体植株叶片中相对表达量与灰斑病的病情指数的相关系数为-0.90096，呈显著负相关（P<0.05），即目的基因在叶片中的表达量越高，植株的抗病能力越强，病情指数越低。转RIN4干扰表达载体植株叶片中相对表达量与灰斑病的病情指数的相关系数为0.844375，呈显著正相关，即目的基因在叶片中的表达量越低，植株的抗病能力越强，病情指数越低。表8转RIN4干扰表达载体基因植株和转RPM1过表达载体基因植株的抗灰斑病鉴定结果Tab.8IdentificationresultsontheresistancetograyleafspotdiseaseofRIN4interferingexpressionvectorgeneofplantandRPM1overexpressionvectorgeneofplant.病情级别品种调查总数病情指数抗病评价013579JN28（转RIN4基因）508152070044.00%MSJN28（转RPM1基因）5011122430039.60%MRJN28受体500810257060.57%SABCD34 EF图24转RIN4基因和转RPM1基因植株的抗病性鉴定Fig.24IdentificationofdiseaseresistanceoftransgenicRIN4geneandtransgenicRPM1geneplantsA:转RPM1基因植株；B,D：受体植株；C：转RIN4基因植株；E：转RPM1基因植株与受体植株对比；F：转RIN4基因植株与受体植株对比A:TransgenicRPM1geneofplant;B,D:Recipientplant;C:TransgenicRIN4geneofplant;E:ComparisonbetweentransgenicRPM1geneandreceptorplants;F:ComparisonbetweentransgenicRIN4geneandreceptorplants表9转RIN4、RPM1基因植株不同组织部位表达量与病情指数的相关性分析Tab.9CorrelationanalysisbetweendifferenttissuelocianddiseaseindexintransgenicRIN4andRPM1geneofplant叶根茎病情指数转RPM1基因株系叶1根-0.188521茎0.705354-0.38839981＊病情指数-0.900958-0.1982470.7332381转RIN4基因株系叶1根-0.126821茎0.49584-0.782641＊病情指数0.8443750.4530020.3322681＊＊＊注：表示不同处理在0.05水平上差异显著（P<0.05）；表示不同处理在0.01水平上差异显著（P<0.01）＊＊＊Note：Indicatingthatthedifferenttreatmentshavesignificantdifferencesat0.05level（P<0.05）；Indicatingthatthedifferenttreatmentshavesignificantdifferencesat0.01level.3.3.4.2转hrpZpsta基因大豆的室内抗病性鉴定根据《大豆灰斑病鉴定技术规范》中的接菌方法对稳定的转hrpZpsta基因植株进行抗35 病性鉴定试验，并对所得数据进行统计，结果如表10所示。表10转hrpZpsta基因植株抗灰斑病鉴定结果Tab.12IdentificationofgrayspotresistanceoftransgenichrpZpstaplants病情级别品种调查总数病情指数抗病评价0135792004-30-384CK（T5453122280052.40%MS代）2004-30-384（T5代）456172020038.70%MR2004-30-384CK（T6503814241050.60%MS代））2004-30-384（T6代）508182130038.40%MR由图25、图26可知，受体植株叶片上能够明显看出大量病斑，而转化植株病斑数相对较少，病害相对较轻，由此可以看出，相比于受体植株转化植株的抗性明显增强。而结合表10数据可知，在人工接菌的条件下，2004-30-384转化体的病情指数较未转化受体病情指数明显下降：T5代株系病情指数由52.40%下降到38.70%；T6代株系病情指数由50.60%下降到38.40%，抗病能力得到了显著提高，并且抗病等级也由中感提升到中抗水平，说明hrpZpsta基因的转入对提高植物抗灰斑病能力有着重要的作用，而连续两个世代的结果进一步说明了hrpZpsta基因对灰斑病的抗性能力能够稳定的遗传。其次，对转hrpZpsta基因植株的不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析。如表11所示，hrpZpsta基因在T5代植株叶片中相对表达量与灰斑病的病情指数的相关系数为-0.98282，呈显著负相关（P<0.05）；在T6代植株叶片中相对表达量与灰斑病的病情指数的相关系数为-0.98755，呈显著负相关（P<0.05）。结果表明，目的基因在叶片中的表达量越高，植株的抗病能力越强，病情指数越低。AB36 CDE图25T5代转hrpZpsta基因植株接菌鉴定实验Fig.25T5generationtransgenichrpZpstageneplantswithinoculationexperimentalidentification注：A、C:2004-30-384转化体；B、E:未转化受体；D：2004-30-384转化体和未转化受体对照Note：A、C:2004-30-384transformant；B、E:Unconvertedreceptor；D：2004-30-384transformantandunconvertedreceptorcontrolABCDE图26T6代转hrpZpsta基因植株接菌鉴定实验Fig.26T6generationtransgenichrpZpstageneplantswithinoculationexperimentalidentification注：A、C:2004-30-384转化体；B、E:未转化受体；D：2004-30-384转化体和未转化受体对照Note：A、C:2004-30-384transformant；B、E:Unconvertedreceptor；D：2004-30-384transformantandunconvertedreceptorcontrol37 表11转hrpZpsta基因植株不同组织部位表达量与病情指数的相关性分析Tab.11CorrelationanalysisbetweendifferenttissuelocianddiseaseindexintransgenichrpZpstageneplants叶根茎病情指数T5代转化株系叶1根0.4699761茎0.519599-0.019631＊病情指数-0.98282-0.45547-0.596571T6代转化株系叶1根0.6964381茎0.7366290.4153731＊病情指数-0.98755-0.71852-0.753171＊＊＊注：表示不同处理在0.05水平上差异显著（P<0.05）；表示不同处理在0.01水平上差异显著（P<0.01）。＊＊＊Note：Indicatingthatthedifferenttreatmentshavesignificantdifferencesat0.05level（P<0.05）；Indicatingthatthedifferenttreatmentshavesignificantdifferencesat0.01level.3.4讨论抗病性检测是筛选出抗病基因的重要方法，对基因的功能及抗病能力的分析具有着重要的意义[76]。然而接菌后植株没有发病，会严重影响抗病性检测的进程，从而难以对转基因抗病植株的抗病能力进行分析。本试验研究发现，想要使植株发病不仅要在接菌后控制好湿度和温度，而且病原菌的活性必须要保证新鲜，在接菌前做好加湿处理，一般10-12天大豆就可发病，经验表明：温度、湿度和病原菌活力对接菌效率影响巨大。本试验中，转RIN4干扰表达载体的基因对大豆灰斑病的抗性达到了中感水平，转RPM1过表达载体的基因对大豆灰斑病的抗性达到了中抗水平，而RIN4基因的抗病能力较RPM1基因低，可能与RIN4基因的功能有关。由于其为一种“卫兵分子”[7]，位于细胞膜上，当发现病原菌分泌蛋白AvrRpm1和AvrB时，RIN4蛋白只是作为一种负调控因子积极地调节RPM1产生的抗性，并不是直接参与抗病反应。通过对转基因株系的抗病能力进行分析，发现同种基因不同株系之间抗病能力不同，可能与目的基因的表达量有关，还可能与目的基因的插入位点及转录后调控等使得目的基因的表达受到了抑制[77-79]。因此对检测的转基因后代进行严格的筛选是提高其抗性能力的重要方式。通过抗病比较鉴定，可知转RPM1过表达载体植株和转hrpZpsta基因植株对灰斑病的抗病水平相同。Southern杂交结果表明hrpZpsta基因在植株体内是以多拷贝形式存在，RPM138 基因在植株体内是以单拷贝形式存在，而抗性结果相同可能与多拷贝基因之间相互抑制而不表达有关。唐微[80]以转基因水稻为试验材料，研究转基因拷贝数对农艺性状的影响，结果表明拷贝数越多，农艺性状改变越大，目标基因越容易受到抑制而不表达。Yang等[81]在研究所得的转基因花生植株中的核壳体蛋白的整合与表达时发现，当目的基因以多拷贝存在与宿主中时，能导致基因沉默。3.5小结1.利用农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入到大豆受体品种‘JN28’中，经PCR检测得到含有RIN4抗病基因T0代阳性植株3株，T1代阳性植株有11株。含有RPM1抗病基因T0代阳性植株4株，T1代阳性植株有14株。2.T1代转化株系中均检测到了转化的目的基因的启动子35s、终止子Nos、目的条带和筛选标记Bar，表明目的基因得到了稳定的遗传。3.T1代转基因植株Southern杂交结果显示，转RIN4干扰表达载体的基因和转RPM1过表达载体的基因均是以单拷贝的形式整合到大豆基因组中，且整合位点不同。4.对Southern杂交出现信号的转基因植株进行荧光定量PCR检测，结果显示，转RPM1过表达载体的基因在植株的根、茎、叶中均得到表达，其中叶片中表达量最高，根和茎中表达量较低。转RIN4干扰表达载体的基因使大豆内源基因的表达受到了抑制，使根、茎、叶的表达量均下降，其中叶片中表达量下降最多，根和茎中的表达量下降较少。5.采用叶面噴施法鉴定转基因植株对大豆灰斑病的抗性，结果表明：①与对照植株相比，转RPM1过表达载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中抗水平。并通过对不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为-0.90096，呈显著负相关，即目的基因在叶片中的表达量越高，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低；②与对照植株相比，转RIN4干扰RNAi载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中感水平。并通过对不同组织部位与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为0.844375，呈显著正相关，即目的基因在叶片中的表达量越低，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低。39 第四章结论1.通过对目标基因RIN4和RPM1的PCR检测及对测序结果的同源性比较，表明已成功克隆出两种抗病基因并构建了含有抗草胺膦筛选标记的植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-35s-RIN4-nos和植物过表达载体pCAMBIA-3301-35s-RPM1-nos。2.利用农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入到大豆受体品种‘JN28’中，经PCR检测得到含有RIN4抗病基因T0代阳性植株3株，T1代阳性植株有11株。含有RPM1抗病基因T0代阳性植株4株，T1代阳性植株有14株。3.T1代转化株系中均检测到了转化的目的基因的启动子35s、终止子Nos、目的条带和筛选标记Bar，表明目的基因得到了稳定的遗传。4.T1代转基因植株Southern杂交结果显示，转RIN4干扰表达载体的基因和转RPM1过表达载体的基因均是以单拷贝的形式整合到大豆基因组中，且整合位点不同。5.对Southern杂交出现信号的转基因植株进行荧光定量PCR检测，结果显示，转RPM1过表达载体的基因在植株的根、茎、叶中均得到表达，其中叶片中表达量最高，根和茎中表达量较低。转RIN4干扰表达载体的基因使大豆内源基因的表达受到了抑制，使根、茎、叶的表达量均下降，其中叶片中表达量下降最多，根和茎中的表达量下降较少。6.采用叶面噴施法鉴定转基因植株对大豆灰斑病的抗性，结果表明：①与对照植株相比，转RPM1过表达载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中抗水平。并通过对不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为-0.90096，呈显著负相关，即目的基因在叶片中的表达量越高，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低；②与对照植株相比，转RIN4干扰RNAi载体基因植株的抗病能力得到了增强，且抗性从感病提升到中感水平。并通过对不同组织部位表达量与灰斑病病情指数进行相关性分析，结果显示其相关系数为0.844375，呈显著正相关，即目的基因在叶片中的表达量越低，植株的抗灰斑病能力越强，病情指数越低。40 参考文献[1]张彪.大豆灰斑病抗性鉴定方法及转BnERF104大豆的灰斑病抗性研究[M].中国农业科学院.2011.1(6).[2]杨振华.黑龙江省大豆生产影响因素分析及预测研究[M].东北农业大学.2012.2(4).[3]顾鑫,丁俊杰.大豆灰斑病的研究现状[J].中国农业通报,2010,26(9):303-306.[4]尹俊琦,王楠,周莹,卢实,吴楠,曲静,张卓,王丕武.两个大豆品种转hrpZPsta基因后代对大豆灰斑病的抗性分析[J].大豆科学,2013,25(4):238-241.[5]史冬平.生物技术在作物育种上的应用[J].农业与技术,2007,25(05):62-65.[6]王娟,刘淼,王志坤,李文滨.大豆抗病、虫转基因研究进展[J].大豆科学,2011,30(05):865-868+873.[7]王友红,张鹏飞,陈建群.植物抗病基因及其作用机理[J].植物学通报,2005(01):92-99.[8]HulbertSH,WebbCA,SmithSM,etal.Resistancegenecomplexes:evolutionandutilization[J].AnnualReviewofPhytopathology,2001(01):285-312.[9]李美玲,严成其,王栩鸣,杨勇,余初浪,周洁,程晔,陈剑平.同源序列法克隆植物抗病基因研究进展及其在野生稻中的应用[J].生物技术通讯,2010,21(01):126-130.[10]葛小佳.籼稻组织培养体系的优化及水稻抗病相关基因22E6EI14的功能鉴定[D].华中农业大学.2005.[11]程伟,常芳国,赵团结,孔杰杰.大豆灰斑病发生特点及抗病遗传育种研究进展[J].安徽农业科学,2015,43(30):22-25+50.[12]陆相敏,张军.大豆主要病虫害的防治措施[J].吉林农业,2010(09):65.[13]刘艳平,林佩力,霍虹.大豆灰斑病菌(CercosporasojinaHara)分生孢子萌发条件研究简报[J].大豆科学,1989(01):64.[14]VeigaP,KimatH.EffectofculturemediaandlightonsporulationofCercosporasojina[J].SoybeanAbstr,1979.21(02).[15]钟兆西,王伟,张桂荣.大豆灰斑病菌生物学特性的研究[J].大豆科学,1989(03):288-294.[16]许艳丽,战丽莉,李春杰,孟洁.大豆病害发生特点和综合防治技术[J].大豆科技,2009(03):15-17.[17]郑秀艳.大豆根腐病和灰斑病的危害及防治[J].现代农业科技,2007(22):88.[18]任有科,于宝泉.大豆灰斑病研究进展[J].现代农业科技,2010,03:164-165+169.[19]宋阳.NPR1和HrpZpsg12双价抗病基因植物表达载体的构建及在大豆中的遗传转化[D].吉林农业大学,2014.[20]丁克非.浅谈大豆病害与苗期管理和建议[J].黑龙江科技信息,2012(21):212.[21]张欣,张丽彤.大豆灰斑病的症状及防治方法[J].河南农业,2015(01):32.41 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作者简介姓名孟祥鹏性别男民族汉族2015.09.籍贯通化政治面貌团员入学时间01申请学位类农学硕士论文答辩日期2018.05.23授予学位年月2018.06别就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2015-2018：吉林农业大学硕士作物遗传育种专业2011-2015：吉林农业大学本科农学专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况题目刊物名称（级别）署名单位次序(刊出时间/录用)转hrpZpsta广谱抗病发表吉林农业基因大豆对灰斑病吉林农业大学学报12018年5月13日学术大学的抗病性鉴定论文署名获奖名称成果级别署名单位发表情况次序项目及专利45 致谢时光飞逝，我的硕士生涯已接近尾声，短短的几年时光使我收获了很多也成长了许多。这几年来，感谢陪我一起度过美好时光的每位老师和家人以及朋友，正是你们的帮助，才使得我冲破各种难关，也正是每位的指导和帮助才能让我的学业生涯顺利完成。首先，我要感谢一直谆谆教导我的导师王丕武教授，从选题到论文的撰写王老师都倾注了许多的心血。三年来,王老师无论在学习、工作和生活中都给予了我无微不至的关怀和帮助,导师渊博的知识,对学科前沿敏锐的洞察力以及他严谨的作风，开阔的视野，精益求精的工作态度深深的鼓舞和激励了我。老师不仅传授我做学问的技巧，还传授我做人和做事的准则，这些都使我受益匪浅、感触颇多。其次感谢曲静老师、关淑艳老师、刘思言老师和张卓老师对我实验和生活上给予的关心和帮助。感谢宋阳、吴楠、卢实、秦迪和已经毕业的林楠等师哥、师姐的支持和帮助，他们无私的精神、宽以待人的友好品德都深深的打动了我，特别是宋阳、吴楠师姐和林楠师哥在我实验和写论文的过程中倾注了许多精力，并给我提供了许多宝贵的意见，使我能够克服一个又一个的困难和疑惑。感谢金羽琨、张林和施婷婷等在我实验过程及论文的撰写上提供的帮助，没有他们的无私帮助，很难有这篇文章的顺利完成，在这里请接受我真挚的谢意。最后我要感谢所有关心和爱护我的人，是他们的关心和爱戴使得我更加坚定了自己的信念。硕士的生活即将结束，这段时间在我的心中也有许多挥之不去的记忆，我也一定会谨记老师和各位师哥师姐的教诲，努力的学习不辜负长辈对我的希望。把最美好的祝愿送给你们每一个人，愿你们能够永远的健康、快乐。46