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ＴＶ３１１１０７５８分类号：学校代码：密级：公开学号：３２０１３５０９１工程硕士专业学位论文苹果树腐烂病生防菌的筛选鉴定及生防菌对苹果腐烂抑制作用研究ａｎｄｅｎｆｉｃａｔ－ＴｈｅＳｃｒｅｅｎｉｎＩｄｔｉｉｏｎｏｆＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌＡｃｔｉｎｏｍｃｅｔｅｓｇｙａｎｄｔｈｅＳｔｕｄｙｏｆＩｔｓＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｏｔｈｅＰａｔｈｏｅｎｏｆＡｌｅＴｒｅｅｇｐｐＣａｎｋｅｒ研究生姓名李阳校内导师姓名及职称王静副教授校外导师姓名及职称宋素琴副研究员＿＿＿专业学位类别工程硕士领域名称食品工程研究方向农产品贮藏与加工＿＿所在学院食品科学与药学学院新疆·乌鲁木齐二○一六年六月Ｉ 苹果树腐烂：病生防菌筛选鉴定及生防菌对苹果腐烂抑制作用研究独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：Ｉ３时间：年広月Ｓ日ｆｒ关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：时间：年＆月３日■导师签名：立时间：年月Ｓ日 苹果树腐烂病生防菌的筛选鉴定及生防菌对苹果腐烂抑制作用研究摘要近年来，苹果树腐烂病（ValsamaliMiyabeetYamada）病势逐年严重，已成为制约苹果产业快速发展的重要因素之一。化学杀菌剂作为传统的方法已造成环境污染、农药残留、危害健康等一系列问题，随着人们健康环保意识的不断加强,探索苹果树腐烂病高效生物防治技术已成为生产上的亟待研究解决的重要课题。鉴于此，本试验对拮抗菌鉴定、抑制作用进行了研究，探讨了生物防治研究机理及抗性研究，同时探讨了拮抗菌对采后苹果贮藏品质的影响，取得的结果如下：（1）采用传统的对峙培养法进行初筛、复筛，筛选出四株对苹果树腐烂病具有拮抗作用的菌株，将其命名为CH10,CH4-A2,Be44-A(1),Be3-B6(A),其中CH10的拮抗效果最佳，经16SrDNA鉴定属于链霉菌属（streptomyces），选取该菌株进行更深一步研究。（2）用CH10菌株对果蔬常见8种病原菌进行了抑制作用，对新疆阿克苏苹果树腐烂病菌致病菌ValsamaliAkesu抑制效果最好。（3）通过平板试验证实CH10发酵液对苹果树腐烂病有显著的抑制作用，研究证明其分泌的拮抗物质对苹果树腐烂病菌ValsamaliAkesu的抑菌作用效果良好，拮抗圈直径达到3.46cm,抑菌率为62.50%。（4）经过菌株CH10防治的采后苹果贮藏天10后,测定硬度、固形物含量、总酸，抗坏血酸含量，这些品质指标与对照差异不明显。（5）另外通过体内实验证实CH10能够促进CHT、β-1，3葡聚糖酶、PPO均呈现先升高后降低的趋势，提高自身的抗病能力。关键词：生防菌：生物防治；16SrDNA鉴定；防治机理；贮藏品质III TheScreeningandIdentificationofBio-controlActinomycetesandtheStudyofitsInhibitiontothePathogenofAppleTreeCankerAbstractAppletreevalsacankeroccursseriouslyyearbyyear,andithasbecomeoneoftheimportantfactorswhichrestricttherapiddevelopmentofappleindustry.Asatraditionalmethod,chemicalfungicideshavecausedaseriesofproblemssuchasenvironmentalpollution,pesticideresiduesandhealthhazards.Withthehealthofpeopleincreasingawarenessofenvironmentalprotection,efficientexplorationofAppletreecankerbiologicalcontroltechnologyhasbecomeanimportantsubjecttoresearchandsolvetheproduction.Inviewofthis,thetestofantagonisticinhibitionwerestudiedandthemechanismofidentificationwerediscussed,researchestheresistanceofbiologicalcontrolanddiscussestheinfluenceofAntagonisticBacteriaonpostharveststoragequalityofapple,theresultsareasfollows:Firstly,Fourstrainsofantagonisticstrainsagainstappletreerotwerescreenedbytraditionalconfrontationculturemethodscreening.ThestrainsnamedCH10,CH4-A2,Be44-A(1),Be3-B6(A),ofwhichtheantagonisticeffectofCH10wasthebest,anditwasidentifiedasStreptomycesby16SrDNAanditwasselectedforfurtherstudy.Secondly,Theinhibitioneffectof8strainsofpathogensonfruitsandvegetableswereinhibitedbyCH10strain,andtheinhibitioneffectionofValsamaliAkesuamongthepathogensofAkesuappletreewasthebest.Thirdly,ThetreadmilltestprovedthatCH10fermentationliquidhadsignificantinhibitoryeffectiononAppletreecanker,theresultsshowedthattheantagonisticsubstancehadgoodantibacterialeffectonappletreerottingpathogenValsamaliAkesu.Theantagonisticcirclediameterwas3.46cm,theinhibitionrateof62.50%.Finally,Thehardness,solidcontent,totalacidandascorbicacidweremeasuredafter10daysofharvestedstorageapplebythestrainCH10.Thedifferencebetweentheseindexesandthecontrolwasnotobvious.Fifthly,Inaddition,invivoexperimentsconfirmedCH10canpromoteCHT,β-1,3-glucanase,PPOwereshowedfirstincreasedandthendecreasedthetrendtoimprovetheirdiseaseresistance.Keywords:antagonisticactinomycetes;biologicalcontrol;16SrDNAidentification;preventionandtreatmentmechanism;storagequalityIV 本文是新疆科技援疆资助项目“新疆苹果树腐烂病生物和化学协同防控技术开发”的部分研究成果（项目编号：201491150）课题主持人：宋素琴副研究员（新疆农业科学院）V 目录第1章引言..............................................................................................11.1苹果树腐烂病的研究概况........................................................................11.1.1新疆苹果产业发展现状...................................................................11.1.2苹果树腐烂病的症状和危害............................................................11.2苹果树腐烂病病原研究............................................................................31.2.1病原菌种类及其来源......................................................................31.2.2病原菌的致病物质研究...................................................................31.2.3苹果树腐烂病侵染循环...................................................................31.3流行因素................................................................................................41.3.1树势与病害流行的关系...................................................................41.3.2气象因素与病害流行的关系............................................................51.3.3栽植密度与病害流行的关系............................................................51.4苹果树腐烂病的综合防治........................................................................51.4.1栽培管理........................................................................................51.4.2物理防治........................................................................................61.4.3化学防治........................................................................................61.4.4生物防治........................................................................................71.4.5植物源农药防治.............................................................................71.5苹果树腐烂病防治技术展望.....................................................................81.6研究目的和意义......................................................................................81.7研究目标及内容.......................................................................................9VI 1.7.1研究目标........................................................................................91.7.2研究内容........................................................................................9第2章生防菌的筛选鉴定..........................................................................102.1材料与方法...........................................................................................102.1.1材料.............................................................................................102.1.2方法.............................................................................................102.2结果与分析...........................................................................................142.2.1苹果树腐烂病拮抗放线菌菌株的筛选............................................142.2.2拮抗菌株对8种常见病原菌的抑制作用.........................................152.2.3菌株CH10对离体苹果枝的防治效果.............................................162.2.4拮抗菌株CH10的鉴定................................................................172.3讨论.....................................................................................................202.4结论......................................................................................................20第3章生防菌对苹果树及果实腐烂病菌抑制效果研究...........223.1材料与方法...........................................................................................223.1.1材料.............................................................................................223.1.2方法.............................................................................................223.2结果与分析...........................................................................................243.2.1拮抗菌CH10对病原菌抑制效果研究.............................................243.2.2果实内部抑菌...............................................................................273.3讨论.....................................................................................................293.4结论.....................................................................................................29VII 第4章CH10菌株对苹果品质和生理活性的影响....................................314.1材料与方法...........................................................................................314.1.1材料.............................................................................................314.1.2方法.............................................................................................314.1.3主要仪器......................................................................................324.1.4主要试剂及药品............................................................................324.1.5品质指标测定...............................................................................324.1.6生理指标测定方法.........................................................................344.2结果与分析...........................................................................................374.2.1生防菌CH10菌悬液对苹果发病率的影响......................................374.2.2生防菌CH10菌悬液对苹果硬度的影响.........................................384.2.3生防菌CH10菌悬液对苹果可溶性固形物含量的影响.....................384.2.4生防菌CH10菌悬液对苹果可滴定酸含量的影响...........................394.2.5生防菌CH10菌悬液对苹果抗坏血酸含量的影响...........................394.2.6生防菌CH10对苯丙氨酸解氨酶活性的影响...................................404.2.7生防菌CH10对β-1，3-葡聚糖酶活性的影响................................414.2.8生防菌CH10对几丁质酶活性的影响.............................................424.3讨论.....................................................................................................444.4结论.....................................................................................................45第5章结论及展望......................................................................................465.1结论.....................................................................................................465.2展望.....................................................................................................46VIII 参考文献........................................................................................................47致谢................................................................................................................53作者简历........................................................................................................54IX 第1章引言1.1苹果树腐烂病的研究概况1.1.1新疆苹果产业发展现状苹果在我国约有2000余年种植历史，其产区主要分布在西北黄土高原、黄河故道和秦岭北麓、西南冷凉高地和渤海湾、新疆阿克苏和伊犁等地。2012年我国栽种2[1]面积为257万hm，产量为3960万t，比2011年产量提高了350万t。中国苹果产业在[2]出口创汇、农业产业结构调整和增加农民收入等方面发挥了重要的战略作用。新疆地区苹果种植地主要分布在阿克苏地区、昌吉地区、博尔塔拉蒙古自治州、克孜勒苏柯尔克孜自治州、哈密地区、喀什地区、巴音郭勒盟自治州、和田地区、伊犁哈萨克自治自治州、和兵团。据统计2011年新疆苹果种植面积和产量共达到83326hm2和715136t。其中阿克苏地区的种植面积和产量分别占总面积和总产量的17.12%和34.02%，为14268hm2和243308t；伊犁哈萨克自治州的面积和产量分别占总面积和总产量的53.81%和20.30%，为44838hm2和145173t；兵团近年来成为新疆苹果的新兴产业区，2011年兵团种植面积和产量分别占自治区总面积和总产量的18.45%2[3]和28.60%，为15365hm和204545t。享誉疆内外的阿克苏红富士苹果，由于当地昼夜温差大的地理环境的影响，糖分在果核部慢慢积累堆积成独特的“冰糖心”苹果。“红旗坡苹果”与“阿克苏核桃”“阿克苏红枣等品牌获“中华名果”金奖、“新[4]疆著名商标”、“2008北京奥运会推荐果品”。1.1.2苹果树腐烂病的症状和危害苹果树腐烂病（ValsamaliMiyabeetYamada）俗称烂皮病、臭皮病、串湿病等，是由苹果腐皮壳被病原菌侵染引发的一种病害，该病症状常见的有枝枯型和溃疡型。在新疆阿克苏地区以干腐型为主。苹果树腐烂病菌也能侵染果实,被侵染的果实表面产生近圆形或不规则形、暗红褐色病斑，病斑组织易腐烂软化，有酒糟味。病斑表1 面中部散生或集生略呈轮纹状排列的黑色分生孢子器。在潮湿的情况下，分生孢子[5-12]器上溢出橘黄色卷须状的分生孢子角。日本于1903年第一次发现该病并进行报道。1928年华盛顿爆发该病，面积达90%，造成巨大的经济损失。1972年北海道苹果树腐烂病大面积爆发，达94.3%，大量果园被毁。而在我国，该病发病区域广泛，遍布了全国各产区，北部各产地尤其[13]严重。1916年在我国辽宁省南部区域发现苹果树腐烂病，1948-1949年及1960年曾[14]两度在辽南地区大肆横行，使大批果树死亡。1975年后该病在河南省的发病程度[15]逐年加重，发病率明显上升，发病面积逐渐扩大。1998年青海省民和县苹果树腐烂病的发病面积达到了375hm2，一般果园的发病率达12%，严重的达到了45%，死[16]亡率达到了3.0%～5.0%。众所周知，陕西省是我国苹果产业的优生态区之一，[17]1988年陕西省政府在渭北22个县市建成百万亩苹果生产基地。2007年，陕西苹果出口80多个国家和地区，苹果产业的发展在一定程度上提高了农民收入和生活水平，同时对陕西经济的发展起着举足轻重的作用，陕西苹果已成为陕西经济发展中的亮[18-20]点。但近年来陕西苹果树腐烂病病势逐年严重，制约了陕西苹果产业的迅速发展。2002年对苹果树腐烂病严重发生的陕西渭北旱塬进行调查，调查中发现，管理一般的果园患病率达到10%，管理粗放的果园则是一片狼藉，患病率高达30%。陕西省关中地区也是苹果树种植优生态区之一，2005年对苹果树腐烂病的调查结果显示：该区腐烂病发病率最高的达到92%，几乎全园毁灭，给果农造成了重大的经济损失[21]。2007年，渭北地区盛果期13a生红富士苹果树腐烂病发病率平均56.14％，其中永[22,23]寿县部分果园发病率达73.8％。2008年，河南省三门峡市和商丘市苹果园腐烂[24,25]病普遍发生，严重的果园发病率达70％。曹克强等对我国10个苹果主产省市的[26]147个苹果园进行了调查，在所调查的苹果树中发病率达52.7％。该病害在新疆阿克苏局部地区发生严重，特别是库克瓦什林管站和红旗坡6队发生严重，主要原因是2007和2008年冬季干旱少雪，发生冻害，再加上当年负载量过大，造成腐烂病严重发生。2 1.2苹果树腐烂病病原研究1.2.1病原菌种类及其来源1903年日本第一次发现该病，并命名为苹果树腐烂病。1909年宫布、山前证实[27]是该病真菌病害引起的，并将病原菌定名为ValsamaliMiyabeetYamada。据报道，[28][29][30]Cytosporasp、苹果壳囊孢C.mandshurica、仁果壳囊孢C.microspora、核果[31][32][33]壳囊孢C.leucostoma、梨壳囊孢C.carphosperma、桃干枯壳囊孢C.cincta等均可[34]侵染苹果树，为常见的病原菌。而Sakuma等研究认为中国、韩国和日本苹果树腐烂病的主要病原菌为C.sacculus。由于该病菌主要通过无性繁殖进行危害，国内外对苹果树腐烂病的病原菌种属划分还没有统一的意见。国内有将我国腐烂病菌定为[35][15]C.sacculus，但樊民周等认为梨壳囊孢和苹果壳囊孢2个种是陕西省苹果树腐烂病病原菌。不同的见解影响了人们对病害发生机理和流行周期的深度认识，制约了对病害预防、防治和寄主抗病性强弱的研究，致使该病害防治缺乏根本、快速的防[6]治方法。关于中国苹果树腐烂病菌的侵染来源，李美娜等研究认为有2种途径：一是从日本引进的苹果树苗携带病菌；二是原产在中国的野生苹果属的某些种的果树本身就携带病原菌。1.2.2病原菌的致病物质研究[36]苹果树腐烂病病原菌致病研究，目前有三种共识：一是刘福昌等认为的果胶[37]酶。Gairola等研究表明酶在病原菌侵染病斑过程中扮演着重要的角色；二是[38][39][40]Koganezawa等、Defago、Svircev等认为的由病原菌所分泌的有机酸（主要为[41][42]草酸）和一些小分子物质（多肽）。三是Chatteriee等、Jayasankar等通过研究认为的植物毒素，但该说法没有合理的解释。1.2.3苹果树腐烂病侵染循环1.2.3.1侵染来源及传播介质苹果树腐烂病初侵染源可以是分生孢子器、分生孢子、越冬的菌丝，或者是子囊壳及子囊孢子。冬天一般寄生在病斑皮层、病死组织、幼树的死芽剪口、附近的3 病变残枝等场所，春天便进入侵染生长期。该病原菌每月生成的分生孢子器是苹果树腐烂病的再侵染源，主要形成部位为往年遗留的病斑，其次为2年剪口、3年剪口或多年剪口。在合适的条件下，这些分生孢子器可以在不同时期侵染苹果树不同部[43]位而致病。病菌孢子的传播介质主要有昆虫、雨水、气流等。1.2.3.2侵染特点[36]刘福昌等研究了苹果树腐烂病的病原菌侵染特点，结果发现其能长期潜伏在树皮上的不健康组织或细胞团中。还发现：病原菌存在着入侵容易扩展难的特点，只有当寄主苹果树抗性减弱或失去抗性时，它才表现出强烈的致病性，导致病害。而对苹果树来说，存在着抵抗病原菌入侵难扩散易的特点。鉴于苹果树腐烂病病原菌的潜伏特性，可以从增强树势、提高植株抗病力这两个方面着手来预防该病的大[44]发生及危害。同时，药剂筛选研究重点在于能保护、防治、彻底杀菌。1.2.3.3侵染周期苹果腐烂病病原菌的寄生性相对较弱，常见的侵入介质有已经死亡的皮层组织、果柄痕、叶痕、皮孔，长期潜伏。当树体或局部组织衰弱、抵抗力下降时，潜伏菌丝就进一步扩展，表现腐烂病症状。所以，果树受冻害或负载量超荷以后，树势极弱，腐烂病就大肆横行。腐烂病一般1年有2次高峰期，早春3-4月，天气渐暖，病斑扩展迅速，进入病原菌生长旺盛期。5月果树进入茂盛生长期，树体抵抗力增加，发病率急剧下降，病斑扩展逐步变慢。9-11月，树体停止生长，抗病能力下降，病斑[45]又迅速增加和发展。因此，治疗苹果树腐烂病的最佳时期是2-4月和9-11月。1.3流行因素1.3.1树势与病害流行的关系苹果腐烂病的流行与树势的强弱有着密切的关系。各种导致树势衰弱的因素都[21，12，26]可以诱发腐烂病的发生，常见的主要因素有树龄的增加、树体的负载量过大[46]等，前者树龄的增加、后者树体贮存营养物质减少，都会降低苹果树的抗病力。据调查，大年的园片或单株较果树小年腐烂病发生多、发病期长，为害大；不疏花4 蔬果的大年树，在糖、氮、碳的总含量较蔬果的小年树低。1.3.2气象因素与病害流行的关系苹果树腐烂病的流行与气象因素温度、降雨量、冻害都有着密切的关系。温度是影响腐烂病病情消长的最重要的因素，在适温范围内，发病情况随着温度的升高[47]而加重；由于该病菌靠雨水传播，降雨量也对病害的流行产生重要的影响。张王斌根据陕西省洛川县1999-2004年5年间气温、湿度和降雨量的资料，调查得出苹果树腐烂病的流行程度与3月份、12月份的月平均温度和和7月份的降雨量密切相关，[12，48]其中3月份的月平均温度对腐烂病菌的流行影响最大；很多资料表明腐烂病菌的[49-51]大面积发生与冻害也有关系，春季、晚秋、冬季的突然降温会使树皮冻裂或与[52]木质部分离。以上三个因素都会降低树势，为病菌的入侵创造条件。1.3.3栽植密度与病害流行的关系果园内苹果树栽植密度与苹果树腐烂病的发生也有很大的关系。腐烂病随着果树栽植密度越大越易发生，据报道，株距为5m×3m的果园的病株率、病斑数以及病[32]情指数，明显的比株距为3m×2m的果园小的多。通过调查推断产生这种结果的原因可能是由于密度大的果园湿度较大、通风透光的条件比较差，适宜于腐烂病菌分[48]生子的萌发和侵染。1.4苹果树腐烂病的综合防治国内外对于苹果树腐烂病防治研究的报道很多，但由于苹果树腐烂病的复杂性，效果并不十分理想，而日益严重的病害已经影响到我国苹果生产的发展和出口。因此，急需探索出简单、高效、环保的方法防治苹果树腐烂病的发生。目前，防治该病害的办法主要有以下几种。1.4.1栽培管理加强果园栽培管理，增强树势能从根本上降低、防治苹果树腐烂病的发生。田5 间常见的栽培管理主要有以下措施：合理施肥；适当负裁；合理灌溉；保持果园卫生。1.4.2物理防治在实际生产中，物理防治对苹果树腐烂病也起到了一定的作用。根据病原菌的潜伏侵染特性，例如通过糊泥浆法、扩刮法、病疤桥接法和伤疤大补皮法增强树势，[53]提高苹果树抗病能力。1.4.3化学防治化学防治是苹果树腐烂病防治的主要方法之一，随着科技的进步，化学防治药剂的种类和数量不断扩增。从50年代早期开始探索研究保护性杀菌剂；60年代初发现苹果树腐烂病具有侵染特性，开始研究新的杀菌剂；70年代常用的化学药剂主要有石硫合剂、硫酸铜液或升汞等；80年代使用的药剂越来越多，主要有福美砷可湿[54]性粉剂、腐殖酸钠等；90年代，化学药剂以安索菌毒清，苯扬粉好力克为主。到目前为止，对该病的药剂防治研究报道很多，主要有戊唑醇、烯唑醇、菌毒清、瑞[55-59]拉菌素、青霉素、0.6％苦小檗碱等。表1-1化学防治方法Table1-1chemicalmethodsofcontrolling年代方法特点效果50喷保护性杀菌剂杜绝病菌侵染效果不理想60开始研究筛选具铲除效能的杜绝病菌潜伏侵染效果理想杀菌剂或内吸杀菌70主要药剂:石硫合剂、铜制杜绝病菌潜伏侵染，效果较好剂、甲基托布津、多菌灵等保护病变组织杜绝病化学单剂或混剂菌潜伏侵染，保护病变组织80福美砷可湿性粉剂、腐殖酸病变组织形成新的树效果良好钠、黄腐酸和843康复剂等。皮90安索菌毒清，苯扬粉杀灭腐烂病菌孢子效果良好好力克6 1.4.4生物防治1.4.4.1微生物防治微生物防治是拮抗菌与病原菌在营养和空间上竞争时占优势，同时分泌拮抗物质，使原生质浓缩解体、菌丝畸形而消除病原菌。目前的研究主要集中在放线菌、[60][61][62][63]生防真菌和其它微生物。国内高克祥等、茆振川、王东昌等、郜佐鹏、辛[64]雅芬等研究的哈茨木霉菌株（Trichodermaharzianum）T88、木霉菌的培养滤液、拮抗菌种AT9706、植物内生放线菌BAR1-5的无菌发酵滤液、ND35菌对苹果树腐烂[62]病菌均有一定的抑制作用。其中王东昌等研究得到的AT9706，室内经过验证其对苹果树腐烂病菌的抑制作用达到100％，田间采用AT9706效果达到99.5％；国外奥野[65]智旦研究的类似体4-乙酰氧基-植物内生菌酮及植物内生菌酮（Cycloheximide）均能抑制腐烂病菌孢子萌发，还研究证明Fusarium属菌（F.solanif.sp.radicidola）对腐烂病有很强的拮抗作用。并且某些Fusarium属的种类还可以产生和Trichodermapolyspore(Linkexpers)产生的由11个氨基酸组成的环状肽CyclosporinsA，但是[66]Cyclosporins和植物内生菌酮对苹果树上病斑的扩大却没有良好的阻止效果。1.4.4.2抗生素防治当今抗生素防治主要研究高效、低毒、持效期长、彻底杀菌、能促进伤疤愈合的生物农药。常用的抗生素有以下几种：农用抗生素—S-921，是河北生物所研制的一种新型农药抗生素，治愈率高达95%以上，病斑的复发率在5％以下；发酵液，程[66]廉用11371发酵液防治腐烂病，田间试验治愈率达到100％，该发酵液还能促进病[67]疤周围组织愈合，并且杀菌效果、速度和浓度成正比；抗生素－K-76，Abe等从菌株672－AV2的滤液中分离得到的，通过拮抗筛选表明其对病原菌有较强的抑制作用。1.4.5植物源农药防治植物源防治是在植物中寻找生物活性物质进行杀菌或抑菌，是农药研究范畴的热点之一。我国当前已查明的、可用的植物共有213科1957属10027种，其中研究发[68]现具有杀菌或抑菌作用的有1000多种，资源非常丰富。柯杨等发现的臭氧油防治苹果树腐烂病效果明显，经过120d的治愈，康复率达到96.8％，复发率极小，仅为7 [69][70]3.2％；关丽杰等发现的补骨脂提取物和杨燕等发现的植物提取物多羟基双萘醛(WCT)对苹果树腐烂病菌均具有一定的抑制作用，后者还能诱导寄主产生抗性，增强树势，并且浓度越高，抑制作用越强。1.5苹果树腐烂病防治技术展望苹果树腐烂病是一种潜在侵染性病害，强化果园的种植管理制度，改进果园的卫生条件，提高寄主的抗病能力，是综合防治的基础。我们传统上多用于化学防治，虽然有一定成效，但也存在着弊端，长期使用对人畜健康和环境构成威胁，因此，除了培育抗病新品种是最根本、最有效的途径外；在生物技术日新月异发展的今天，一定能研究出高效的生物制剂防治病害，从根本上解决问题。1.6研究目的和意义新疆的苹果栽培历史悠久，具有鲜明的地域特色，如阿克苏所产的冰糖心红富士苹果早已驰名中外。2013年11月至2014年10月，在阿克苏地区库克瓦什林管站、阿克苏红旗坡6队、依干其乡三大队三小队等地共选择6个苹果园，通过实地调查、与果农访谈相结合的方式，在苹果树落叶休眠期、开花期和坐果期进行3次调查。调查结果表明，新疆阿克苏地区苹果园主要病害有苹果树腐烂病、苹果小叶病和苹果锈果病等，主要害虫有苹果全爪螨、梨小食心虫和苹果蠹蛾等。病害以苹果树腐烂病为主，其中库克瓦什林管站地区苹果树腐烂病发生较重，并且出现苹果树腐烂病和苹果小叶病混合发生的现象，严重影响该地区的苹果和产量。苹果树腐烂病是目前影响我国苹果高产、稳产和优质生产的主要因素之一。目前对于该病害的防治主要采用化学方法，在不断研究新化学药剂的基础上，人们一直在寻找一种安全、有效、无污染的药剂防治该类病害。苹果生产是新疆林果产业的重要组成部分，提升其产业发展水平对提高果区农民经济收入、丰富市场供应、出口创汇具有极为重要的社会经济意义。大量的研究报道表明，生防菌菌能够产生大量的活性成分，可有效防治多种植物病害，且无污染、对人畜安全。生物防控技术的研究将明确新疆苹果主产区腐烂病分布与危害，解析苹果树腐烂病菌种群组成，8 构建分子检测技术，筛选苹果树腐烂病生物防治因子。对提升新疆林果业生产中重大病害的绿色化学防控技术水平、推动新疆苹果产业稳步健康发展和确保果品安全、促进果农增产增收等具有重要意义。1.7研究目标及内容1.7.1研究目标本研究明确新疆苹果主产区腐烂病分布与危害，分离获得新疆苹果树腐烂病的病原菌及鉴定菌群组成，筛选具有拮抗苹果树腐烂病的拮抗菌株及其菌悬液、发酵液、发酵滤液的抑菌作用，研究生防菌对苹果采后腐烂病抑制效果，为新疆苹果树腐烂病的生物防治、综合防治及苹果采后贮藏提供依据。1.7.2研究内容（1）拮抗菌株筛选：从辐射资源库筛选对苹果树腐烂病具有拮抗效果的拮抗菌株。（2）生防菌进行鉴定：以16SrDNA序列分析，对筛选出菌株进行鉴定。（3）生防菌CH10菌悬液、发酵液、发酵滤液对苹果树及果实腐烂病抑制效果。（4）生防菌对苹果品质指标和生理指标的影响。9 第2章生防菌的筛选鉴定20世纪80年代以来，生物防治作为一种安全有效的防治方法越发到人们的关［71］注。我国在生防菌研究方面主要有以下成果：郜佐鹏等研究证明很多植物内生的［72］［73］［74］放线菌可以抑制苹果树腐烂病。邓振山等、Xin＆Shang、高克祥等、先后报道Chaetomiumspirale、Trichodermaatroviride和Trichodermaharzianum对苹［75］果树腐烂病主要病原菌具有重寄生或抑制效果；展丽然等筛选到放线菌Z-6，对腐烂病有拮抗作用，鉴定为金色类群Aureus，属于链霉菌属Streptomyces。本研究采自新疆高放射土壤的放线菌进行探究，放线菌中的许多属例如链霉菌的生物防治[76]已有大量报道。近千种的抗生素及其衍生物来源于放线菌，已投入到生产与生活[77][78]应用中的有90种左右。目前已经发掘的抗生素80%是由放线菌产生的，该生物资源有着广泛的应用前景。本章对70株放线菌进行初筛复筛，筛选出4株拮抗性较好的菌株，对其中拮抗性最好的菌株CH10进行鉴定。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1供试菌种供试病原菌：苹果树腐烂菌-ValsamaliAkesu，苹果茎点霉-PhomaPomi，拟分枝孢链孢霉-FusariumSporotrichioides，大丽轮枝菌-VerticilliumdahliaShihezi，色二孢属真菌-Diplodiaseriata，立枯丝核-Solani，链格孢-Alternariaalternata，苹果树腐烂病菌-ValsamaliQingdao。供试放线菌：从新疆高放射土壤分离纯化所得。2.1.2方法2.1.2.1培养基配制PDA培养基，用于培养病原菌。配制方法：称200g马铃薯切成小块，加1000mL水煮沸30min，用双层纱布过滤，加水至1000mL，然后加入20g葡萄糖完全溶解，10 加琼脂20g，pH自然。高氏培养基，用于培养放线菌。配制方法：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调PH=7.2-7.4。2.1.2.2放线菌菌株的分离与拮抗菌株的筛选（1）放线菌菌株的分离与纯化土样来自新疆高放射区土壤，经风干后筛滤保存。电子天平上称取样品10.0g放入装有90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30min后样品与无菌水充分混合均匀制得样品悬液。然后在无菌条件下用移液枪吸取1000μl注入无菌水中，稀释至10ml溶液，然后按比例制成10：2、10：3、10：4、10：5、10：6样品稀释液。分别吸取100μl上述处理液于高氏培养基上，通过稀释涂布法分离菌株，［65］28℃培养24h，然后挑取单菌落在平板上划线纯化、培养并编号，4℃存放。（2）苹果树腐烂病菌拮抗菌株的初筛［80］初筛通过对峙培养法，将新鲜的8株常见作物病菌制成直径约5mm的菌饼，依次用灭菌的镊子接种在倒有PDA培养基的中央，然后将活化好的放线菌菌株，以菌饼接于距病原菌相同距离的4个角上，为了减小实验中出现的误差及污染情况，每皿重复三次，以只接种病原菌的平板作为对照，28℃培养箱培养5d，记录对照平板菌落直径，观察记录处理试验有无抑菌圈并测量病原菌菌落直径。（3）苹果树腐烂病菌拮抗菌株的复筛挑取病原菌丝放入5ml无菌水中，移取200μl病原菌悬浮液于PDA培养基中，用刮铲铺匀，对称接种直径一定的放线菌菌饼，以加入等体积无菌病原菌培养液的处理作为对照，每皿重复三次，28℃恒温培养3d，测量处理菌落直径并计算其抑菌率。选取初筛中拮抗抗性较好的CH10、CH4-A2,、Be44-A(1)、Be3-B6(A)，按上述方法对8种供试病原菌进行拮抗率测定，每皿重复三次，28℃恒温培养测量拮抗圈直径并计算抑菌率，选出拮抗效果最好的菌株。()d0−d抑菌率（%）=×100%()d0−5（2-1）式中，d0为对照病原菌直径（mm），d为处理病原菌直径（mm），5为菌饼直径（mm）11 （4）菌株CH10对离体苹果枝腐烂病的致病性研究从新疆阿克苏库克瓦什林管站苹果园剪取冰糖心苹果枝条，枝条为苹果树中上部位，树龄8-9年。剪成50cm长、粗细相近的枝段，75%酒精消毒后多次用无菌水6冲洗。用打孔器在枝条上打孔，接种15μL病原菌孢子悬浮液(10CFU/mL),2h后分别接种30μL拮抗菌CH10的悬浮液(109CFU/mL)和不同稀释倍数的发酵滤液，用保鲜膜和沾有无菌水的脱脂棉保湿。每个枝条相同距离接3个点，每组试验平行三次，以接种相同体积无菌水作为空白试验。培养7d、14d后分别测量病斑大小，［81］按照椭圆面积公式计算防治效果。s0−s（2-2）生防效果（%）=×100%s0式中，s2)，s为处理病原菌面积（mm2）。0为对照病原菌面积(mm（5）菌株CH10的鉴定［82］取适量菌丝于载玻片上涂匀,微火固定,然后菌丝处滴一滴草酸结晶紫染色,30s后水洗,用滤纸轻轻擦去周围的余液,放在显微镜下观察。形态及生理生化特[83]征鉴定:根据《放线菌的分离与鉴定》进行。通过rDNA的16S序列进行菌株鉴定，实验过程如下：1）试验主要仪器耗材表2-1仪器耗材Table2-1Instrumentconsumables名称型号厂家规格备注PCR仪DL9700东林昌盛96孔PCR扩增恒温孵育器鼎国昌盛切胶回收溶胶16S引物鼎国合成PAGEPCR扩增2XMix鼎国昌盛2U/ulDNA聚合酶回收试剂盒NEP025-1鼎国昌盛50T片段回收纯化2）试验流程放线菌基因组提取a2ml沉菌，加入800μlCTAB抽提液，65℃水浴40min。b加入800μl氯仿异戊醇，混匀，12000rpm离心10minc取上清，加600μl氯仿异戊醇，12000rpm，离心10min12 d取上清，加入1mlCTAB沉淀液，12000rpm，离心10mine倒掉上清，10min挥发晾干，加200μlH2O，吸打混匀f加入400μl无水乙醇，20μlNaAC，20℃沉淀30min。g4℃，12000rpm，10min离心h加入500μl80%乙醇洗2次，12000rpm，10min离心i到上清，溶70μl水。目的片段扩增：引物合成：F16S-27:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGR16S-1492:CGGTTACCTTGTTACGACTTC表2-2反应体系Table2-2Reactionsystem组成体积V/μl2XMix2527F(10μM)11492R(10μM)1DNA模板2ddH2O21反应条件：预变性945min℃变性94℃30s退火54℃30s35cycles延伸72℃1min30s延伸72℃10min回收PCR产物a2.0％琼脂糖凝胶电泳，切取目的片断。b加入回收试剂溶液A300μl/0.1g，60℃水浴至胶完全溶化。c加入50μl回收试剂溶液B，混匀。d将溶液置于离心柱中，静置5min，12000rpm，1min，弃去液体。e加入500μl80%乙醇,12000rpm，离心1min，弃液体，重复一次。f12000rpm，离心5min，甩干余液，弃液体，晾干5-8min。g将离心柱置于新的离心管中，加入30μl灭菌双蒸水，静置10min。13 h13000rpm，离心3min，管底即为纯化产物，取3μl电泳检测。将测序得到的序列采用NCBI数据库中的BLAST软件与GenBank中的核酸序列进行比对分析，检索同源性高的菌株用于系统发育分析。2.2结果与分析2.2.1苹果树腐烂病拮抗放线菌菌株的筛选供试土壤样品中共分离70株放线菌菌株，经初筛和复筛获得拮抗性较好的有4株：CH10、P4-A7、BE44-B1(A)、BE3-B6(A)。在PDA平板对峙试验中，这4株放线菌对腐烂病菌菌丝产生较好的抑菌作用，拮抗菌边缘的病原菌生长速度减缓或停止，形成一个明显的抑菌圈。其中菌株CH10对8种常见作物病原菌的拮抗效果最好。因此，选取拮抗菌CH10作进一步研究。如图2-1。abcdef2-1拮抗菌筛选图Fig.2-1Thescreeningofantagonisticactinomycetes注：a图为拮抗菌CH10、P4-A7、BE44-B1(A)、BE3-B6(A)对VerticilliumdahliaShihezi的拮抗初筛；b图为拮抗菌CH10、P4-A7、14 BE44-B1(A)、BE3-B6(A)对Alternariaalternata的拮抗初筛；c图为拮抗菌CH10、P4-A7、BE44-B1(A)、BE3-B6(A)对PhomaPomi的拮抗初筛；d图为拮抗菌CH10PhomaPomi的拮抗复筛；e图为拮抗菌CH10对Alternariaalternata的拮抗复筛；f图为拮抗菌CH10对ValsamaliAkesu的拮抗复筛。2.2.2拮抗菌株对8种常见病原菌的抑制作用以上筛选出四种菌株对供试8种病原菌均有不同程度的抑制作用，以编号CH10菌株对ValsamaliAkesu病斑直径最低，的抑制效果最好，与其它菌株的差异也达到较明显的程度，见图2-2和2-3。被选定作为进一步试验的目标菌株。图2-2不同筛选菌株对病原菌ValsamaliAkesu的病斑直径的拮抗效果Fig.2-2InhibitioneffectionofdifferentscreeningstrainsonleisondiameterincidentofValsamaliAkesu15 图2-3不同筛选菌株对病原菌ValsamaliAkesu的拮抗效果Fig.2-3InhibitioneffectofdifferentscreeningstrainsondiseaseincidentofValsamaliAkesu2.2.3菌株CH10对离体苹果枝的防治效果菌株CH10对离体苹果枝处理如图2-4，处理第7d发现菌悬液和不同稀释倍数的发酵滤液对ValsamaliAkesu都有良好的抑制作用，病斑长度和病斑面积远远低于对照处理，菌悬液比发酵虑液的防治效果略高。从研究可以发现拮抗菌菌株对腐烂病的抑制作用随着发酵滤液稀释倍数的增大逐渐降低，当发酵滤液稀释80倍时防治效果只有59.34%。各处理组接种第14d的病斑长度和病斑面积比接种7d时都有所提高,但防治效果并没有降低（表2-3）。16 ab图2-4菌株CH10对离体苹果枝的处理Fig.2-4TreatmentsofisolatedapplebranchesbystrainCH10表2-3菌株CH10对离体苹果枝致病性的防治效果效果Table2-3ControlefficiencyofantagonisticactinomyceteCH10ondeachedtwigsinoculatedwithValsamaliAkesu处理病斑长度（l/cm）病斑面积（s/cm2）防治效果（%）接种后7d接种后14d接种后7d接种后14d接种后7d接种后14d菌悬液0.32±0.02f0.69±0.07f0.08±0.03e0.25±0.02f93.10±0.11a94.50±0.7a发酵滤液原液0.38±0.04e0.73±0.13e0.09±0.14e0.28±0.04e92.24±0.47b93.8±0.87b滤液稀释10×0.42±0.01d0.91±0.29d0.12±0.02d0.48±0.02d89.66±0.22c89.45±0.19c滤液稀释40×0.97±0.13c1.51±0.08c0.38±0.21c1.19±0.15c67.24±0.05d73.85±0.23d滤液稀释80×1.18±0.14b1.99±0.11b0.52±0.18b1.85±0.07b55.17±0.03e59.34±0.04eCK1.52±0.09a3.97±0.27a1.16±0.05a4.55±0.17a0f0f2.2.4拮抗菌株CH10的鉴定2.2.4.1形态特征及生理生化特性在高氏培养基上CH10菌落呈白色或浅紫色，菌落卵圆形且紧贴培养基，不透明，菌体呈线状。菌株在高氏一号培养基上28℃培养7d后，气生菌丝为白色，产孢后变为淡灰色，表面粗糙干燥。基内菌丝色泽不定，呈灰白色或浅紫色，没有色素产生。菌落表面凸起，疏松多孔。在其它培养基上培养特征如表2-4。在培养基上培养7d及显微镜100倍油镜下观察如图2-5。17 ab图2-5CH10的形态特征Fig.2-5MorphologicalcharacterofCH10表2-4菌株CH10在6种不同鉴别培养基上的培养特征Table2-4CulturalcharacteristicsofCH10on6differentmedia培养基气生菌丝基内菌丝可溶性色素生长状况高氏培养基白色转死灰色灰白色无良好无PDA培养基白色棕黄色一般无察氏培养基浅灰色灰白色一般无燕麦粉琼脂浅灰色灰白色一般无葡萄糖天冬素琼脂白色浅黄色良好酪氨酸琼脂白色酪黄色一般无2.2.4.216SrDNA序列分析18 ab图2-6DNA电泳图片a和PCR电泳检测图bFig.2-6ElectrophoreticpatternofDNAandElectrophoresisdetectionofPCR注：maker为2000,1600,1000,750,500,250,100bp测序比对测序结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST比对,利用MEGA5.1软件构建系统发育树(图2-7)。结果显示，在以16SrDNA序列构建的系统发育树中菌株CH10与娄彻氏链霉菌(StreptomycesrocheiNBRC12908T)、淡紫褐链霉菌(StreptomycesenissocaesilisNRRLB-16365T)和褶皱链霉菌(StreptomycesplicatusNBIC13071T)位于系统进化树上同一分支，其序列的同源性都高达99%，表明它们的亲缘关系较近。结合形态特征、培养特征及生理生化特性比较，因此将菌株CH10初步鉴定属于链霉菌属。19 CH10S.plicatusNBRC13071T(AB184291)60S.rocheiNBRC12908T(AB184237)S.vinaceusdrappusNRRL2363T(AY999929)S.enissocaesilisNRRLB-16365T(DQ026641)86S.ghanaensisKCTC9882T(AY999851)S.geysiriensisNBRC15413T(AB184661)65S.mutabilisNBRC12800T(AB184156)S.djakartensisNBRC15409T(AB184657)S.zinciresistensK42T(AGBF01000432)S.griseoviridisNBRC12874T(AB184210)99S.pilosusNBRC12807T(AB184161)S.arenaeNBRC13016T(AB249977)66S.africanusCPJVR-HT(AY208912)7697S.afghaniensisNBRC12831T(AB184847)0.001图2-7依据16SrDNA序列构建的菌株CH10与相关菌株的系统发育树Fig.2-7PhylogenetictreeofstainCH10andrelatedstrainsbasedon16SrDNA2.3讨论目前生物防治技术已成为人们探讨的热点，存在与植物内部、植物根部土壤的微生物在长期的生物进化中，与植物和病原菌有着密切关系，其中有些对致病菌产[84]［85］［86］［87］生拮抗作用。例如刘琴、柳成宾、张丽分别分离出的链霉菌SR-1102、链霉菌TRM42561、娄彻氏链霉菌YL-2粗提取液，分别对黄瓜枯萎病(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)、棉花黄萎病(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)都有较好的抑菌作用。本实验通过简单、直观、快速的对峙培养法，通过观察拮抗圈的大小，在一定时间内就可以对很多放线菌菌株进行筛选，以期为该病害的防治提供参考。2.4结论本章试验通过70株放线菌的菌株的初筛和复筛以及16SrDNA的鉴定，得到以下结论：（1）本研究从新疆高放射土壤中共分离到70株放线菌，对8种常见果蔬病原菌20 为进行抑制研究，通过初筛、复筛，获得了一株对苹果树腐烂病菌ValsamaliAkesu具有显著抑制作用的菌株CH10。（2）根据生理生化测定和16SrDNA序列分析，将该菌鉴定链霉菌属。21 第3章生防菌对苹果树及果实腐烂病菌抑制效果研究苹果树腐烂病已成为制约苹果产业快速发展的重要因素之一，化学杀菌剂仍是抑制苹果树腐烂病的主要手段，但易造成环境污染、农药残留、危害健康等一系列问题。目前生物防治是用来代替化学杀菌剂抑制苹果树腐烂病研究热点之一等，尤其是以放线菌为代表的微生物植物源农药，在其使用过程中低毒、高效、环境兼容[88-89]性好等优点受到关注。山东省山亭区果业中心研究表明，对苹果树腐烂病菌很好的有抑制作用。浓度在125-250µg·mL-1范围内可抑制菌丝生长，当浓度提高到-1[90][91]1000-2000µg·mL时可杀死菌丝。崔云龙研究得出，金色链霉菌(Streptomycesaureus)S-921分泌的拮抗物质可以溶解病原菌，将发酵滤液涂抹在祛除病斑的部位，治愈苹果树腐烂病的效果达到100%。本章以筛选和分离的CH10为生物防治拮抗菌，研究了该菌株对主要要致病菌ValsamaliAkesu、VerticilliumdahliaShihezi、ValsamaliQingdao、Fusrariumsporotrichioides的抑制试验。然后根据拮抗菌发酵液、菌悬液、发酵滤液不同浓度的处理，探讨了对拮抗菌CH10体外抑菌、体内抑菌以及对苹果采后病斑直径、发病率的影响。3.1材料与方法3.1.1材料试验所用苹果为阿克苏冰糖心，2015年11月采办自新疆乌鲁木齐市北园春瓜果市场。选取的果实无病虫害、无机械损伤、外观大小基本一致、单果质量均重180g。3.1.2方法3.1.2.1培养基见第二章2.1.2。3.1.2.2拮抗菌及其培养拮抗菌发酵液制备方法：移取高氏液体培养基50mL装入250mL锥形瓶，121℃下灭菌20min,冷却后用灭菌竹签接种活化的CH10，28℃下200r/min培养48小时,即得。22 拮抗菌菌悬液的制备方法：将CH10发酵液在5000r/min下离心20min分离菌体,对其用无菌水反复洗涤处理,然后用无菌水洗CH10菌体制得菌悬液,通过血球计数板计数法求出菌悬液浓度，最后调至所需浓度。拮抗菌发酵滤液制备方法：将拮抗菌发酵液放于离心管中5000r/min反复离心取得上清液,通过滤膜（0.45μm）过滤的液体即为发酵滤液。3.1.2.3病原菌培养和孢子悬液制备病原菌见第二章2.1.1。病原菌的培养与保存：灭菌竹签挑取致病菌丝,接入试管培养基中,然后放入培养箱中28℃培养3d，待用。病原菌菌悬液的制备：灭菌竹签在试管斜面上挑取适量病原菌孢子至无菌水中,通过血球计数板计数法求出菌悬液的浓度，然后调至所需浓度。3.1.2.4体外抑菌将CH10菌悬液、发酵液、发酵滤液均以比例1：4注入灭菌培养基，以不加CH10处理液的培养基作为对照，分别将5mm病原菌菌饼放到培养基中央，在28℃培养箱中培养5d，培养结束测量病原菌生长直径,计算抑菌率。比较拮抗菌CH10菌悬液、发酵液、发酵滤液对病原菌ValsamaliAkesu的拮抗效果。3.1.2.5果实内抑菌用75%酒精擦拭苹果表皮晾干，在苹果赤道处用灭过菌的接种针刺4mm×5mm的孔,然后用移液枪将浓度为108CFU/mL的菌悬液、发酵液、发酵滤液30μl分别注入孔内,2h后分别注入15μl病原菌ValsamaliAkesu菌悬液，脱脂棉沾无菌水保鲜膜密封。将水果放于25℃培养箱贮藏10d，第10d记录病斑直径，计算发病率。每组处理10个果实，共计三个重复。通过病斑直径、发病率等指标，比较拮抗菌CH10菌悬液、发酵液、发酵滤液对苹果树腐烂病菌ValsamaliAkesu的拮抗效果。通过以上比较发现CH10菌悬液和发酵液抑菌效果较好，分别配制不同浓度的CH10菌悬液和发酵液对苹果进行接种，比较其抑菌效果。用75%酒精擦拭苹果表皮晾干，在苹果赤道处用灭过菌的接种针刺4mm×5mm的孔，然后用移液枪将浓度为109CFU/mL，108CFU/mL，107CFU/mL，106CFU/mL23 的发酵稀释液30μl分别注入孔内，2h后分别注入15μl病原菌ValsamaliAkesu菌悬液；将109CFU/mL，108CFU/mL，107CFU/mL，106CFU/mL的菌悬液30μl分别注入孔内，2h后分别注入15μl病原菌ValsamaliAkesu菌悬液，脱脂棉沾无菌水保鲜膜密封。将水果放于25℃培养箱贮藏10d，第10d记录病斑直径，计算发病率,每组处理10个果实，共计三个重复。通过病斑直径、发病率比较不同浓度菌悬液、发酵液对苹果树腐烂病菌ValsamaliAkesu的拮抗效果。3.2结果与分析3.2.1拮抗菌CH10对病原菌抑制效果研究3.2.1.1拮抗菌CH10对苹果树腐烂菌ValsamaliAkesu的抑菌效果表3-1拮抗菌CH10第5d对苹果树腐烂病菌ValsamaliAkesu的抑菌效果Table3-1InvitroinhibitioneffectsofCH10onValsamaliAkesuatdifferenttreatments处理液种类抑菌圈直径（d/mm）抑菌率(%)菌悬液34.6±2.90a62.50±3.40a发酵液33.0±0.82b57.89±0.94b发酵滤液18.5±1.17c25.87±2.02cCK0d0d注：表中所列数据是二个重复的平均值,括号中“士”号后数据为三个重复的标准筹。表中所列的字母不同时,说明两组数据之间通过软件进行邓肯氏多重分析,差异显著。下同。abc图3-1拮抗菌不同处理对ValsamaliAkesu的抑制作用Fig.3-1TheinhibitoryefficiencyofdifferenttreatmentsofCH10againstValsamaliAkesu.注：a为菌悬液处理和对照处理，b为发酵液处理和对照处理，c为发酵滤液处理和对照处理。从表3-1可以看出，相同浓度的菌悬液、发酵液、发酵滤液对病原菌Valsamali24 Akesu的拮抗效果不一样，菌悬液拮抗效果最好，拮抗圈直径达到34.6mm，抑菌率达到62.50%，发酵液滤液对ValsaMaliAkesu的抑菌圈达到18.5mm，说明CH10代谢产物中有拮抗物质，由此判断该拮抗菌拮抗作用机理之一可能是拮抗成分的存在。因为ValsaMaliAkesu是新疆阿克苏苹果树腐烂病最主要的病害之一的致病菌。所以，拮抗菌CH10对该地苹果树腐烂病生物防治有着很好的使用前景。3.2.1.2拮抗菌CH10对大丽轮枝菌VerticilliumdahliaShihezi的抑菌效果表3-2拮抗菌CH10第5d对大丽轮枝菌VerticilliumdahliaShihezi的抑菌效果Table3-2InvitroinhibitioneffectsofCH10onAlternarianlternatadifferenttreatments处理液种类抑菌圈直径（d/mm）抑菌率(%)菌悬液30.50±0.33a51.25±0.82a发酵液28.98±1.64b47.50±3.92b发酵滤液16.85±0.86c23.05±1.43cCK0d0dabc图3-2拮抗菌不同处理对VerticilliumdahliaShihezi的抑制作用Fig.3-2TheinhibitoryefficiencyofdifferenttreatmentsofCH10againstVerticilliumdahliaShihezi注：a为菌悬液处理和对照处理，b为发酵液处理和对照处理，c为发酵滤液处理和对照处理。从表3-2可以看出，相同浓度的菌悬液、发酵液、发酵滤液对病原菌VerticilliumdahliaShihezi的拮抗效果不一样，菌悬液拮抗效果最好，拮抗圈直径达到30.50mm，抑菌率达到51.25%，发酵液滤液对ValsaMaliAkesu的抑菌圈达到16.85mm。VerticilliumdahliaShihezi是新疆石河子棉花黄萎病最主要的病害之一的致病菌。所以，拮抗菌CH10对该地棉花黄萎病的防治有着潜在的使用前景。3.2.1.3拮抗菌CH10对拟分枝孢镰孢菌Fusrariumsporotrichioides的抑菌效果25 表3-3拮抗菌CH10第5d对拟分枝孢镰孢菌Fusrariumsporotrichioides的抑菌效果Table3-3InvitroinhibitioneffectsofCH10onFusrariumsporotrichioidesatdifferenttreatments处理液种类抑菌圈直径（d/mm）抑菌率(%)菌悬液23.55±2.49a35.47±5.06a发酵液21.30±1.22b31.02±2.33b发酵滤液18.54±0.61c25.94±1.10cCK0d0dabc图3-3拮抗菌不同处理对Fusrariumsporotrichioides的抑制作用Fig.3-3TheinhibitoryefficiencyofdifferenttreatmentsofCH10againstFusrariumsporotrichioides注：a为菌悬液处理和对照处理，b为发酵液处理和对照处理，c为发酵滤液处理和对照处理。从表3-3可以看出,相同浓度的菌悬液、发酵液、发酵滤液对病原菌Fusrariumsporotrichioides的拮抗效果不一样，菌悬液拮抗效果最好，拮抗圈直径达到23.55mm，抑菌率达到35.47%，发酵液滤液对ValsaMaliAkesu的抑菌圈达到16.85mm。Fusrariumsporotrichioides是梨腐烂的主要致病菌，所以，拮抗菌CH10对梨腐烂防治有着潜在的使用前景。除了上述几种病原菌外，还对采自青岛的苹果树腐烂病病原菌ValsaMaliQingdao做了抑试验，但效果不理想，如图3-4。26 abc图3-4拮抗菌不同处理对苹果树弗兰病菌的抑制作用Fig.3-4TheinhibitoryefficiencyofdifferenttreatmentsofCH10againstValsamaliQingdao注：a为菌悬液处理和对照处理，b为发酵液处理和对照处理，c为发酵滤液处理和对照处理。3.2.2果实内部抑菌3.2.2.1CH10菌悬液、发酵液和发酵滤液对苹果采后发病率的影响图3-5不同处理的拮抗菌CH10对苹果采后腐烂病ValsamaliAkesu发病率的影响Fig.3-5InhibitioneffectsofCH10onthediseaseincidenceofValsamaliAkesuatdifferenttreatments注：CK:无菌水空白对照A：菌悬液B：发酵液C：发酵滤液，图中所列数据是三个重复的平均值,箭头表示三个重复的标准差。柱形图上边所列的字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析差异显著。对苹果采后主要腐烂病害ValsaMaliAkesu进行体内抑菌实验，从图3-5可以得出经过CH10相同浓度菌悬液、发酵液、发酵滤液处理的果实的发病率分别为11.11%、20.25%、40.95%，相比于对照发病率分别降低了88.89%、79.75%和59.05%，27 菌悬液对苹果采后腐烂病的发生有较好的抑制效果。3.2.2.1CH10菌悬液、发酵液和发酵滤液对苹果采后病斑直径的影响图3-6不同处理的拮抗菌CH10对苹果采后腐烂病ValsamaliAkesu病斑直径的影响Fig.3-6InhibitioneffectsofCH10ontheleisondiameterofValsamaliAkesuatdifferenttreatments注：CK:无菌水空白对照A：菌悬液B：发酵液C：发酵滤液，图中所列数据是三个重复的平均值,箭头表示三个重复的标准差。柱形图上边所列的字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析差异显著。从图3-6可以得出，经过CH10相同浓度菌悬液、发酵液、发酵滤液处理的果实的病斑直径分别为10.02mm，20.05mm，30.00mm，相比于对照病斑直径分别减小了81.82%，63.55%和45.45%，菌悬液拮抗效果较好。病斑直径大小趋势和上述发病率是相同的。3.2.2.3不同浓度拮抗菌CH10发酵液和菌悬液对苹果采后病斑直径的抑制效果研究表3-4不同浓度拮抗菌CH10对苹果采后ValsamaliAkesu的抑制效果Table3-4InfluenceofdifferentconcentrationofCH10oninhibitingactivityofValsamaliAkesu处理液浓度病斑直径（d/mm）发病率(%)(CFU/mL)发酵液菌悬液发酵液菌悬液10537.5±0.74b33.0±2.09b99.8±0.12a89.9±0.73a10631.8±1.51c30.5±1.14c87.9±5.67c72.5±1.69c10729.2±0.65d28.5±1.53d67.8±1.47d54.6±1.76d10825.9±0.68e18.8±1.47e35.7±0.78e28.6±1.55e28 10916.4±1.87f13.7±2.49f28.8±1.46f20.5±0.54f045.2±1.82a45.2±1.82a88.7±1.29b88.7±1.29b注：表中所列数据是三个重复的平均值,括号中“士”号后数据为三个重复的标准差字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析,差异显著从表3-4中可以看出,拮抗菌浓度与病斑直径和发病率大小紧密相关。无论是发酵液还是菌悬液，当浓度大于106CFU/mL时,浓度越大，抑制效果越好。但当用浓度为105CFU/mL的发酵稀释液和菌悬液处理时,苹果的发病率却高于对照,对ValsamaliAkesu没有抑制效果，原因可能是由于低浓度的拮抗菌在营养和空间竞争中不占优势,尽管发酵液中有拮抗成分,但浓度太低对病原菌产生不了抑制作用,同时病原菌易吸收发酵液中残留的营养物质，反而能促进其生长。从该结果可以得出空间和营养物质的争夺是拮抗菌作用的的重要机理之一。3.3讨论目前,对链霉菌属产生的抑菌物质成分分析的研究很多,这些研究为链霉菌属在生物防治方面奠定了理论基础。从本章试验结果来看,菌悬液抑菌效果最好，其次为发酵液和发酵滤液。菌悬液效果最好可能是在制备的过程中无菌水反复冲洗洗掉了能被病原菌利用的营养物质，并且随着生防菌浓度的升高,其病斑直径和发病率逐渐降低,这证明该生防菌作用的主要机理是空间和营养竞争上的优势，这与其他一些属种例如毕赤酵母用于防治各种采后病害的有关报道相符，例如Hissam[92]、Guetsky[93]、Lahlali[94]、Santos[95]等在近几年分别报道的Pichiaanomala对苹果采后真菌病害的防治、Pichiaguilermondii对田间草莓灰霉病的防治、P.guillermondi对苹果储藏期病害的防治、P.mebranefaciens对储藏期葡萄及番茄的灰霉病的防治。3.4结论从上述体外试验菌悬液、发酵液、发酵滤液的拮抗作用，以及果实体内菌悬液、发酵液试验证明拮抗菌均产生了抑菌圈,这说明生防菌CH10分泌的拮抗物质其生防29 机理之一。得到以下结论：（1）通过拮抗菌株CH10相同浓度菌悬液、发酵液、发酵滤液对病原菌ValsamaliAkesu、VerticilliumdahliaShihezi、Fusrariumsporotrichioides和ValsaMaliQingdao的抑制研究得出，拮抗菌CH10菌悬液、发酵液、发酵滤液对4个病原菌都有抑制作用，其中其菌悬液对ValsamaliAkesu拮抗效果最好。（2）通过拮抗菌株CH10相同浓度菌悬液、发酵液、发酵滤液对苹果采后腐烂病发病率、发病直径研究得出，菌悬液效果最好，发病率为11.11%，病斑直径为10.01mm。（3）通过不同浓度CH10菌悬液、发酵液对苹果采后病斑直径、发病率的研究得出拮抗菌浓度与病斑直径和发病率大小紧密相关。30 第4章CH10菌株对苹果品质和生理活性的影响苹果在采后贮藏过程中主要以苹果腐烂病,炭疽病和轮纹病为重要病害,这些病原真菌对采后水果的危害不仅在于其将导致水果在有营养价值上造成的严重损失,而且很多病原真菌分泌产的次生代谢产物，有时可能对食品安全存在着威胁：如曲霉菌（Aspergillusflavus和Aspergillusparasiticus等）等产生的黄曲霉毒素、扩展青[96-99][100]霉（P.expansum）产生的棒曲霉素（Patulin）等。目前化学杀菌剂是控制果实采后病害的主要方法之一，但长期化学杀菌剂的使用，既导致病菌的抗药性[101]，也对人们健康造成威胁和环境污染。因此，研究者们都在致力探索能取代农药的新方法，生物控制的方法近年来被认为是取代化学农药最有希望的方法之一[102]。本章试验研究了经过拮抗菌CH10处理后硬度、可溶性固形物含量、总酸含量、抗坏血酸含量的影响以及PAL、β-1，3-葡聚糖酶、CHT、PPO的变化。4.1材料与方法4.1.1材料见第三章材料中3.1.1.14.1.2方法4.1.2.1菌体及培养见第三章3.1.2.2、3.1.2.3。4.1.2.2接种方法在果实表面的赤道处打一个直径为4mm×5mm的孔，10个一组。试验分4个不同处理：A、打孔后注入30μlCH10菌悬液(109CFU/mL)；B、打孔后注入15μl病原菌孢子悬浮液(106CFU/mL)；C、打孔后先注入30μlCH10菌悬液(109CFU/mL),2小时后再注入15μl病原菌孢子悬浮液(109CFU/mL)。CK作为对照，只加入30μl无菌水。每组处理均放在20℃培养箱贮藏，每隔2d取样，样品液氮冷冻。每个处理10个果实，共计三个重复。31 4.1.3主要仪器LDZX-50KBS全自动高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂SPX-288生化培养箱宁波江南仪器厂FA2204电子天平上海菁海仪器有限公司PHS-3C酸度计上海雷磁仪器厂THZ-98A回转式恒温调速摇床上海恒-科学仪器有限公司H-1650型高速冷冻离心机上海利鑫坚离心机有现公司GY-1型硬度计上海托普仪器有限公司HH-S2数显恒温水浴锅金坛市医疗仪器WAY-2S型阿贝折光仪上海申光仪器仪表有限司公司H1850型高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司T6型分光光度计上海恒-科学仪器有限公司4.1.4主要试剂及药品氢氧化钠,邻苯二甲酸氢钾,草酸,抗坏血酸,2,6-二氯酚靛酚，邻苯二酚，聚乙二醇,聚乙烯吡咯烷酮，TritonX-100，硼酸，硼砂，β-巯基乙醇，乙二胺四乙酸二钠，L-苯丙氨酸，盐酸，咔唑，浓硫酸，冰乙酸，乙酸钠，3,5-二硝基水杨酸，葡萄糖几丁质（Sigma），丙酮，脱盐蜗牛酶，四硼酸钾，对二甲氨基苯甲醛，昆布多糖N-乙酰葡萄糖胺。4.1.5品质指标测定4.1.5.1发病率苹果三组处理，一组对照，每组30个果实，处理后放于20℃存放10d，水果表面产生病斑为发病果。发病果实数量发病率(%)=×100%（4-1）果实总数量4.1.5.2硬度32 参考曹健康[102]的方法。采用GY-1硬度计进行测定。在果实赤道间隔相等距离的三个部位，分别削去一小块薄薄的果皮,将探头截面直径为4mm的探头压入果实内，记录此时指针所指的读数，即水果的硬度，以Kg/cm2表示。4.1.5.3可溶性固形物含量测定参考曹健康[103]的方法。取少量混合均匀果实样品放入研钵中研碎，经过10000r/min离心20min。用胶头滴管吸取上清液于折射棱镜表面，盖上进光棱镜时能听到压紧的咔嚓声。从目镜中调节视度至能观察到清晰的十字线成相，此时旋转仪器右侧的手轮在目镜中找到位于十字线的中心的明暗分界线，再旋转位于目镜下的色散调节轮使分界线上没有任何颜色。此时按BX-TC键，显示的值即为样品液中可溶性固形物的含量，用质量分数（％)表示，重复测定三次。4.1.5.4苹果中可滴定酸含量的测定[103]参考曹健康的方法。称取混合均匀的果实样品10.0g于研钵中，研碎后转移到l00mL容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗研钵，将残余液一起转入容量瓶，蒸馏水定容至l00mL刻度线，摇匀。放置30min后用四层纱布过滤,记录样品提取液总体积。用吸量管吸取20.0mL滤液于锥形瓶中，用已标定的NaOH（C=0.098mol/L）溶液进行电位滴定。滴定至酸度计上显示pH在8.1-8.3范围时停止滴定,记录NaOH标液的体积，平行试验测定三次，同时做空白试验。()（4-2）V×c×V−V×f10可滴定酸含量=×100%V×ms式中，V为样品提取液总体积，mL；V0－空白滴定消耗NaOH体积，mL；Vs为滴定时所取样液体积，mL；C为NaOH滴定液的浓度，mol/L；V1-滴定所取液消耗NaOH的体积，mL；m-样品质量，g；f-折算系数，g/mmol。4.1.5.5抗坏血酸含量测定[103]参考曹健康的方法。称取混合均匀的果实样品10.0g于预冷的研钵中，立即加入少量草酸溶液（20g/L）研磨，研至匀浆状后转移至l00mL容量瓶中，用草酸反复冲洗研钵三至四次，将残余液一起转入容量瓶，草酸定容至刻度，摇匀。放置l0min后用四层纱布过滤,记录样品提取液总体积。用吸量管吸取10.0mL滤液于l00mL的33 锥形瓶中，用已标定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色、且15s不褪色，停止滴定，记下2，6-二氯酚靛酚标液的体积，平行试验测定三次，同时做空白试验。以mg/100g表示。V×()V−V×ρ（4-3）10抗坏血酸含量=×100V×ms式中，V1－样品滴定消耗的燃料体积，mL；V0－空白滴定消耗的燃料体积，mL；ρ－1mL燃料相当于抗坏血酸的质量，mg/mL；Vs－滴定时所取样液体积，mL；m－样品质量，g。4.1.6生理指标测定方法4.1.6.1苯丙氨酸解氨酶活性测定[103]参考曹健康的方法。酶液提取：称取5.0g混合均匀苹果样品于预冷的研钵中，加入5.0mL提取缓冲液（PVP+EDTA+β-巯基乙醇）研磨成匀浆，置于冷冻离心机中4℃、12000×g离心30min，收集上清液低温保存。酶活性测定：向两支标记好的试管中分别加入3.0mL硼酸缓冲液（50mnol/L、pH=8.8）和0.5mLL-苯丙氨酸溶液（20mmol/L）。然后试管1、试管2中分别加入0.5mL粗酶提取液和相同体积煮沸失活的酶液，同时于37℃水浴锅中保温60min，保温结束时快速移取0.lmLHCl（6mol/L）于2支试管中终止反应。在波长290nm处测定两者反应液的吸光度A，平行测定三次。结果以U.h-1.g-1表示。(OD−OD)×VU=10（4-4）0.01×Vs×t×m式中，OD1为样品管反应溶液的吸光度，A；OD0为对照管反应液的吸光度，A；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；t为酶促反应时间，h；m为样品质量，g。4.1.6.2β-1，3葡聚糖酶活性测定34 [103]参考曹健康的方法，标准曲线的制作：取7支比色管(50mL)，编号，按表4-1所示的量，分别加入浓度为lg/L的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线。表4-1吸光度测定Table4-1Absorbancemeasurement管号项目0123456lg/L葡萄糖标准液00.20.40.60.81.01.2蒸馏水/mL2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水杨酸1.51.51.51.51.51.51.5相当于葡萄糖质量00.20.40.60.81.01.2吸光度（A）00.1390.2770.4300.5220.6290.769酶液提取：称取10.0g混合均匀苹果样品于预冷的研钵中，加入10mL经预冷的提取缓冲液（EDTA+β-巯基乙醇+L-抗坏血酸）研磨成匀浆，置于冷冻离心机中4℃、12000×g离心30min，收集上清液低温保存。酶活性测定：向两支标记好的试管中分别加入l00μl的昆布多糖溶液（4g/L）。试管1、试管2中分别加入0.5mL粗酶提取液和相同体积煮沸失活的酶液，同时于37℃保温40min，保温结束时向试管中分别加入1.8mL蒸馏水和1.5mLDNS试剂，于100℃水中加热3min，最后用蒸馏水稀释至25mL摇匀。在波长540nm处测定两者反应液的吸光度A，平行测定三次。结果以U.s-1.g-1表示。6m'×V×10U=（4-5）V×t×m×180s式中，m’为从标准曲线查的葡萄糖的质量，mg；V-样品提取液总体积，mL；Vs-测定时所取样品提取液体积，mL；t-酶促反映时间，h；m-样品质量，g。180-葡萄糖相对分子量。4.1.6.3几丁质酶活性测定[103]参考曹健康的方法。酶液提取：称取10.0g混合均匀苹果样品于预冷的研钵中，加入10.0mL经预冷的提取缓冲液（EDTA+β-巯基乙醇）研磨成匀浆,置于冷冻离心机中4℃、12000×g离心30min,收集上清液低温保存。35 酶活性测定：向两支标记好的试管中分别加入0.5mL乙酸-乙酸钠缓冲液（50mmol/L、PH=5.2）和0.5mL胶状几丁质悬浮液（10g/L）。试管1、试管2中分别加入0.5mL粗酶提取液和相同体积煮沸失活的酶液，同时于37℃水浴中保温60min，保温结束时加入0.lmL的脱盐蜗牛酶（30g/L）摇匀，为释放生成N-乙酰葡萄糖胺单体继续在37℃水浴中保温60min，保温结束时立即加入0.2mL的四硼酸钾溶液（0.6mol/L），并在100℃水中煮沸3min。在波长585nm处测定两者反应液的吸光度A，平行测定三次。结果以U.s-1.g-1表示。U=n×V×1000（4-6）V×t×ms式中，n为从标准曲线查的N-乙酰葡萄糖胺物质的量，μmol；V-样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；t-酶促反映时间，s；m为样品质量，g。4.1.6.4多酚氧化酶活性测定[103]参考曹健康的方法。酶液制备：称取5.0g混合均匀苹果样品于预冷的研钵中，加入5.0mL提取缓冲液（MPEG、PVPP、TritonX-100）研磨成匀浆，置于冷冻离心机中4℃、12000×g离心30min,收集上清液低温保存。酶活性测定：取一支试管，加入4.0mL的乙酸-乙酸钠缓冲液（50mmol/L、pH=5.5）和1.0mL邻苯二酚溶液（50mmol/L），然后加入l00ml酶提取液的同时开始计时，将反应液快速倒入比色皿中，反应15s时记录在波长420nm处的吸光度作为初始值，然后每隔lmin记一次数据，至少连续记录6次，平行测定三次。结果以U.min-1.g-1表示。OD'−OD420420ΔOD=420t−t（4-7）0式中，ΔOD420-每分钟反映混合液吸光度变化值，A；OD’420-反应混合液吸光度终止值,A；OD420-反应混合液吸光度初始值,A；t’-反应终止时间,min；t0-反应初始时间,min。36 ΔOD420×V（4-8）U=V×mS式中，V为样品提取液总体积，mL；VS为测定时所取样品提取液体积，mL；m-样品质量，g。4.2结果与分析4.2.1生防菌CH10菌悬液对苹果发病率的影响图4-1不同处理对贮藏第10d接菌果实发病率的影响Fig.4-1EffectsofCH10ontheinfectionrateatdifferenttreatments注：A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。图中所列数据是三个重复的平均值,箭头表示三个重复的标准差。柱形图上边所列的字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析差异显著。从图4-1中可以得到果实经过的不同处理的第10d，注入15μl病原菌孢子悬浮液(106CFU/mL)处理的果实致病率80.95%，先注入30μlCH10菌悬液(109CFU/mL),2小时后再注入15μl病原菌孢子悬浮液(109CFU/mL)的处理对果实腐烂病的发生具有明显的抑制效果，发病率为11.11%，加入30μl无菌水和加入30μlCH10菌悬液(109CFU/mL)处理果实发病率分别为1.45%和1.52%，两者相差0.07%，没有显著差异(P＞0.05)，从试验结果可以看出，拮抗菌对苹果整果腐烂病的发生有着很好的拮抗作用,这表明了该菌株在苹果采后生物防治的方面存在着潜力。37 4.2.2生防菌CH10菌悬液对苹果硬度的影响表4-2拮抗菌CH10不同处理对苹果采后硬度的影响Table4-2EffectsofCH10onfirmnessatdifferenttreatments贮藏天数处理（d）CKABC硬度（N/Kg/cm2）07.9±0.79a7.9±0.79a7.9±0.79a7.9±0.79a27.7±0.52b7.8±0.92a7.2±0.82b7.8±1.08a46.8±0.59c7.3±0.89b6.8±0.78d7.4±1.12b67.8±0.75b7.0±0.97c7.0±1.08c6.7±0.37c86.8±0.59c6.4±0.48d6.0±0.87e5.6±0.50e106.8±1.15c6.0±0.89e5.5±0.81f6.2±0.71d注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。图中所列数据是三个重复的平均值,括号中“士”号后数据为三个重复的标准差。所列的字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析,差异显著。从表4-2可以看出贮藏10d后，对照组和所有处理组硬度较0d时均有下降，在第10d处理组A的硬度为6.0Kg/cm2，相比对照组均降低了11.76%，B组硬度为5.5Kg/cm2相比对照组降低了19.12%，C组处理硬度为6.2Kg/cm2、相比对照组仅降低了8.82%，有此可知拮抗菌对病原菌的抑制作用，可能抑制了硬度的降低。4.2.3生防菌CH10菌悬液对苹果可溶性固形物含量的影响表4-3拮抗菌CH10不同处理对苹果采后固形物含量的影响Table4-3EffectsofCH10onsolublesolidscontentatdifferenttreatments贮藏天数处理（d）CKABC固形物含量（%）010.9±0.08d10.9±0.08b10.9±0.08a10.9±0.08c211.2±0.12c11.1±0.05a9.9±0.08c10.8±0.04c412.7±0a10.7±0c10.4±0.14b12.7±0.14a610.4±0e11.2±0.09a9.4±0.09d10.4±0.12c811.7±0.08b9.3±0.14e8.6±0.09e11.7±0b109.9±0.09f10.3±0.14d9.4±0.4d9.8±0.09d注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。图中所列数据是三个重复的平均值,括号中“士”号后数据为三个重复的标准差。所列的字母不同时,说明两组数据之间通过邓肯氏多重分析,差异显著。从表4-3可以看出贮藏10d过程中，对照组和处理组固形物含量变化不明显，38 说明拮抗菌的处理不会对固形物含量产生不良的影响。4.2.4生防菌CH10菌悬液对苹果可滴定酸含量的影响图4-2不同处理对苹果采后可滴定酸酸含量的影响Fig.4-2EffectsofCH10onthetitratableacidatdifferenttreatments注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。从图4-2可以看出贮藏10d后，对照组CK和处理组A、B、C可滴定酸含量较0d时均有下降，在第10d，可滴定酸含量分别为0.26%、0.25%、0.25%、0.28%，较0d时分别下降了54.38%、56.14%、56.14%、50.87%。贮藏第10d处理组相比对照组差异不显著（P＞0.05）。4.2.5生防菌CH10菌悬液对苹果抗坏血酸含量的影响39 图4-3拮抗菌CH10不同处理对苹果采后抗坏血酸含量的影响Fig.4-3EffectsofCH10ontheascorbateatdifferenttreatments注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。从图4-3可以看出贮藏10d后，对照组CK和处理组A、B、C抗坏血酸含量较0d时均有下降，分别为2.78mg/100g、2.30mg/100g、3.42mg/100g、3.48mg/100g,较0d时分别降低了36.81%、47.72%、22.27%和20.90%，贮藏第10d处理组相比对照组差异不显著（P＞0.05），从数据上的得出拮抗菌处理不会对果实品质产生不良影响。对于生物防治，人们往往研究其代谢产物拮抗成分,并分析其种类和作用，而从生防菌诱导果实抗性的方向研究的较少，但许多研究证明果蔬受到病原菌侵染后表现出的抗性反应与PAL、β-1，3葡聚糖糖酶、CHT、PPO等的活性有关，说明这些酶与果蔬抗病性有关。为明确生防菌对这些酶活性的影响,本试验对果实的诱导抗性进行了初步的探讨，其结果如下：4.2.6生防菌CH10对苯丙氨酸解氨酶活性的影响40 图4-4不同处理下生防菌CH10对苹果采后PAL活性的影响Fig.4-4ChangesofPALactivityafterinoculationbyCH10注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。从图4-4可以看出，贮藏1-4d，A组和CK组PAL变化不明显，且两者酶活性差异不大。第6-8d，B组和C组的PAL均呈现明显上升趋势，贮藏第8d，B组和C组的PAL酶活性达到最高值，分别是64.87U/h.g、54.21U/h.g，为对照组的2.18倍和1.5倍，较对照组比较差异性较显著（P＜0.05）。第8天至贮藏结束所有处理的酶活性均有所降低，其原因可能是病菌侵染过程中拮抗菌分泌了使这种酶的表达受阻的抑制物。4.2.7生防菌CH10对β-1，3-葡聚糖酶活性的影响41 图4-5不同处理下生防菌CH10对苹果采后β-1，3-葡聚糖酶活性的影响Fig.4-5Changesofβ-1，3-glucanaseactivityafterinoculationbyCH10注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。从图4-5可以看出，拮抗菌和病原菌侵染果实后，β-1,3-葡聚糖酶活性有不同程度的上升。对照组CK的β-1,3-葡聚糖酶活性在整个贮藏过程中变化不明显，且在第6-8d其活性明显低于其他处理组。贮藏第8d，A组β-1,3-葡聚糖酶活性最高为3.81U/s.g，其次是C组和B组处理，分别为3.51U/s.g、3.05U/s.g，相比对照分别提高了55.26%、51.42%和44.26%，差异性较显著（P＜0.05）。第8d到贮藏结束，所有处理的酶活性开始下降，但与原始点相比，其活性还是比较高。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁主要成分，β-1，3-葡聚糖的水解酶、β-1，3-葡聚糖酶与几丁质酶一起共同抑制病原菌的生长。从上述结论可见，在苹果果实中β-1，3-葡聚糖酶活性增加与植物的腐烂病病抗性密切相关。4.2.8生防菌CH10对几丁质酶活性的影响42 图4-6不同处理下生防菌CH10对苹果采后几丁质酶活性的影响Fig.4-6ChangesofCHTactivityafterinoculationbyCH10注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。由图4-6可以看出，所有处理的CHT活性自第2-4d活性有大幅度上升，其中由高到底的顺序依次为A、C、B和CK组，分别为2.85U/s.g、1.55U/s.g、2.05U/s.g和0.99U/s.g。自第4d至贮藏结束，均出现下降趋势，但是A组的CHT活性与处理差异较显著（P＜0.05）。几丁质酶是植物病程相关蛋白（PR蛋白）之一，在植物受到病原菌侵染后，几丁质酶活性升高，可以降解霉菌菌丝的几丁质结构，使真菌芽管和附属胞解体，抵御霉菌的侵染。试验结果证明拮抗菌的存在大大促进了几丁质酶的分泌，能够降解病原菌细胞壁主要成分几丁质，抑制病原菌的生长。从上述结论可见，在苹果果实中CHT活性增加与植物的腐烂病病抗性密切相关。4.2.9生防菌CH10对多酚氧化酶的影响43 图4-7不同处理下生防菌CH10对苹果采后PPO酶活性的影响Fig.4-7ChangesofPPOactivityafterinoculationbyCH10注:A：CH10B：病原菌C：病原菌+CH10CK：无菌水。大量PPO可以催化木质素、酚类氧化产物，而这些产物可以形成保护屏障，抵抗致病菌的侵入。由图4-7可以看出，自原始点到贮藏第6d，除CK组PPO活性变化不明显之外，其他三组的PPO活性呈明显升高趋势，贮藏第6d其活性达到值，其中A组的PPO活性最高，为140U/min.g，较对照组差异较显著（P＜0.05），其次是C组和B组分别为98U/min.g、121U/min.g，自第6d至贮藏结束，其活性均出现大幅度下降，但PPO活性高于原始点。对照CK的PPO活性趋势不明显，贮藏结束时PPO活性低于起始点。从上述结论可见，在苹果果实中PPO增加与植物的腐烂病病抗性密切相关，该结论与Bashon[104]研究一致。4.3讨论实际生产应用中，水果贮藏保鲜是对整果来说的，除致病菌外的多种因素对其贮藏保鲜有影响，因此生物防治的根本方向是对完整水果病害的控制。经贮藏保鲜后，其营养价值及可利用价值是衡量水果的贮藏品质的重要指标。水果的贮藏品质包括硬度、可滴定酸度、可溶性固形物、抗坏血酸含量等。一项好的水果采后病害44 防治措施，不仅能对病害进行控制，还要求对水果的贮藏品质尽可能产生小的不利影响。4.4结论（1）通过拮抗菌株CH10菌悬液对苹果采后发病率研究得出，拮抗菌CH10菌悬液对病原菌ValsamaliAkesu具有较好的生防作用。（2）通过拮抗菌株CH10菌悬液对苹果采后品质指标，如硬度、可溶性固形物含量、可滴定总酸含量、抗坏血酸含量测定得出，拮抗菌菌悬液对苹果品质没有产生不良影响（3）通过拮抗菌株CH10菌悬液对苹果采后生理指标，如PAL、β-1,3葡聚糖酶、CHT、PPO的测定研究得出这4种酶均参与了苹果果实抵御苹果树腐烂病菌的侵染过程，并且在侵染前期迅速启动响应反应，其中PAL、β-1,3-葡聚糖酶在侵染第8d起着重要的防御作用；CHT、PPO分别在病原菌侵染第4d、6d活性达到最高峰，在抵抗病原菌过程中发挥着重要作用。45 第5章结论及展望5.1结论（1）通过筛选、鉴定得到一株对苹果树腐烂病及苹果采后腐烂病害具有拮抗效果的菌株CH10，经16SrDNA序列分析鉴定，初步证实该菌株为链霉菌属。（2）用CH10菌株对常见的8种农作物病原菌行了防治试验,证实了该菌株对苹果树腐烂病害有显著的抑制作用。（3）通过CH10菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液在培养基上对病原菌的抑菌试验得出，拮抗菌的浓度越高对苹果树腐烂病的抑制效果越好。（4）通过菌株体内试验对采后苹果腐烂病的抑制效果实验表明,该拮抗菌抑菌的主要机理是空间与营养的竞争。（5）经过CH10菌株防治的苹果贮藏10d后,其品质与对照处理相比,没有明显差异,证实了该拮抗菌菌株不会影响苹果营养价值。有人研究证明植物受到病原菌侵染后表现出的抗性反应与相关酶的活性有关。该试验测定了PAL、PPO、CHT、β-1,3葡聚糖酶的活性，结果表明拮抗菌通过促进PAL、CHT、β-1,3葡聚糖酶、PPO的分泌来提高自身的抵抗能力。因此,抑制病原菌的另一机理是提高果实本身的抵抗能力。5.2展望经国内外研究证明拮抗菌在采后水果抑制病害方面有着良好的生防效果，并且有安全、保护环境等优点，未来可能取代农药成为“活的生防剂”。本研究测定了体内、体外拮抗菌CH10对苹果树腐烂病ValsamaliAkesu的抑菌作用，证明其有良好的抑制效果，但在试验中仍然促在很多不足，例如该拮抗菌对于苹果上其他病原菌和其它果实上病原菌是否有抑制作用、但是对于该菌株在田间防治苹果树腐烂病的效果是否理想有待进一步研究，且对其抗真菌活性物质的成分、结构及理化性质尚不清楚，也需进行更深入的研究。进一步研究拮抗菌CH10的分离技术、拮抗菌剂的研制和保存，在分子水平和蛋白水平上进一步研究拮抗菌的抑病机理,为今后生物基因改造提供一定的理论基础。46 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作者简历李阳，女，1985年3月出生。中共党员，河南郑州人。2009年6月毕业于河南师范大学化学与环境科学学院，获学士学位；同年就职于新疆轻工职业技术学院食品与生物技术分院，2013年考入新疆农业大学食品与药学学院食品工程专业攻读硕士学位，2016年9月完成硕士论文《苹果树腐烂病生防菌的筛选鉴定及生防菌对苹果抑制作用研究》。已发表论文：1.李阳，宋素琴，王静，楚敏，等.苹果树腐烂病防治研究进展[J].北方园艺，2015，(13):194-197.2.宋素琴，楚敏，李阳，曹焕，等.新疆阿克苏地区苹果园主要病害发生现状调查[J].中国果树，2015，（3）：74-75.3.李阳，王静，宋素琴，等.高放射土壤中拮抗放线菌菌株CH10的筛选及鉴定[J].新疆农业科学，录用函已收到。54
