携带不同NA基因的H5亚型禽流感病毒生物学特性研究

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学校代码：10564学号：2013202841分类号：S855.3密级：硕士学位论文携带不同NA基因的H5亚型禽流感病毒生物学特性研究张灶月指导教师：廖明教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：王贵平研究员中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要为了解NA基因对H5Nx亚型AIV（Avianinfluenzavirus）生物学特性的影响，以一株鹅源的H5N1亚型禽流感病毒A/goose/Guangdong/SH7/2013（H5N1），简称SH7株为载体，利用反向遗传操作技术，分别替换A/chicken/Hebei/LZF/2014（H5N2）、A/duck/Guangdong/673/2014（H5N6）、A/goose/Guangdong/674/2014（H5N6）和A/goose/Guangdong/Js1306/2014（H5N8）等毒株NA，拯救获得亲本株rSH7（H5N1）和4株具有不同NA的H5亚型重组AIVs，分别为rSH7-LZFNA（H5N2）、rSH7-673NA（H5N6）、rSH7-674NA（H5N6）和rSH7-Js1306NA（H5N8）。其中，SH7毒株HA来自2.3.4.4分支，rSH7-674NA毒株NA茎部第58-68位缺失11个氨基酸，是短茎N6，而5rSH7-673NA毒株NA则不存在上述现象，是长茎N6。分别以10EID50剂量的病毒感染BALB/c小鼠，结果表明替换不同NA的H5亚型禽流感病毒对小鼠的致病性差异显著，rSH7、rSH7-Js1306NA和rSH7-673NA为高致病性，均能在低剂量水平致死小鼠，MLD50分别是2.5、2.5和2.68lgEID50；rSH7-674NA为中等致病性，可在较中等剂量致死小鼠，MLD50为3.16lgEID50；rSH7-LZFNA呈现低致病性，只能在最高剂量致死小鼠，MLD50为3.3lgEID50。而对SPF鸡致病性试验证实不同NA的H5亚型AIV接触传播能力差异显5著，10EID50剂量攻毒，各组同居动物死亡率分别为rSH7（100%）、rSH7-673NA（100%）、rSH7-674NA（85.7%）、rSH7-Js1306NA（71%）和rSH7-LZFNA（57%），由大到小依次是N1、N6、N8和N2，与1996-2015年我国各地区H5亚型AIV毒株分布统计数据相符：H5N1亚型AIV在全国范围分布广泛，H5N2亚型AIV分布局限，新近采集的临床样品中H5N6亚型AIV分离率高且具有感染人的威胁，H5N8亚型AIV对家禽存在极大的潜在风险。结合体内试验结果，本研究探索NA影响H5亚型AIV生物学特性的分子机制。首先，测定了5株重组病毒在CEF、DF1和MDCK中的增殖情况，发现CEF中各病毒滴度差异不显著，DF1中N2亚型的病毒滴度低，MDCK中病毒滴度由高到低依次是N8、短茎N6、N1、长茎N6和N2。上述结果与测定的小鼠MLD50基本吻合，说明NA可能通过增强病毒在哺乳动物细胞中复制能力从而增强对哺乳动物模型小鼠的致病力。其次，针对NA的功能，测定了病毒NA酶活性，从高到低依次是N8、N2、N1、短茎N6和长茎N6，而病毒对豚鼠红细胞的解凝能力结果表明长茎N6、N8与本研究中选取的2.3.4.4分支HA匹配性最强。为了更直观的观测NA对病毒复制能力的影响，还测定了病毒在MDCK中形成蚀斑的大小，由大到小依次是N8、短茎N6、I 长茎N6、N1和N2，综合上述结果，NA功能的发挥可能与NA酶活性有关，但NA酶活性不是其决定因素；短茎NA能增强在哺乳动物细胞上的复制能力；此外，NA发挥作用还与HA的匹配性有关。关键词：H5亚型禽流感病毒；致病性；传播能力；反向遗传操作技术；不同NA基因II GenerationofRecombinedH5SubtypeAIVwithDifferentNAandtheStudyofBiologicalCharacteristicofRecombinedVirusesZhangZaoyue(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:TounderstandtheinfluenceofNAgeneofH5NxsubtypeAIV(Avianinfluenzavirus)thebiologicalcharacteristics,withagoosesourceofH5N1subtypeofavianinfluenzavirusA/goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1),referredtoSH7strainasthecarrier,usingreversegenetictechnologytoreplaceNAgenesegmentofA/chicken/Hebei/LZF/2014(H5N2),A/duck/Guangdong/673/2014(H5N6),A/goose/Guangdong/674/2014(H5N6)andA/goose/Guangdong/Js1306/2014(H5N8)strainsrespectively,wesavedfortheparentalstrainrSH7(H5N1)and4strainswithdifferentNAH5subtyperecombinantAIVs,namedrSH7-LZFNA(H5N2),rSH7-673NA(H5N6),rSH7-674(H5N6)andrSH7-Js1306NA(H5N8)respectively.HAgenesegmentofSH7strainsbelongsto2.3.4.4clade.TheNAstem(58-68)siteofrSH7-674NAstrainmisses11aminoacids,N6isshortstalks,whereastheNAofrSH7-673NAstraindoesnot5existstheabovephenomenon,whoseNAisalongstemN6.10EID50dosesofthevirusinfectedBALB/cmicerespectively,andtheresultsshowthatthepathogenicityinmiceofdifferentreplacementNAofH5subtypeavianinfluenzavirusisvariantsignificantly.rSH7,rSH7-Js1306NAandrSH7-673NAAIVsarehighlypathogenic,andcanmakemicedeathatlowdoselevels,andtheMLD50are2.5,2.5and2.5lgEID50;rSH7-674NAAIVismediumpathogenicity,canmakemicedeathinrelativelymoderatedose,andtheMLD50is3.16lgEID50;rSH7-LZFNApresentslowpathogenicity,onlyatthehighestdosetomakemicedeath,andtheMLD50is3.3lgEID50.SPFchickenpathogenictestdemonstratedthatcontactingtransmissionabilityofdifferentNAH5subtypeAIVsarevariantsignificantly,5andwiththe10EID50doseofinoculation,groupsofcohabitationanimalmortalityarefollowsrespectively:rSH7(100%),rSH7-673NA(100%),rSH7-674NA(85.7%),rSH7-Js1306NA(71%)andrSH7-LZFNA(57%),andthepathogenicityofvirusfrombigtosmallinturnisN1,N6,theN8andN2subtypeNA,whichismatchedwiththestatisticsoftheH5subtypeAIVstraindistributionfrom1996to2015variousareasinChina.thestatisticsdemonstrates:H5N1subtypeAIVsarewidelydistributedalloverthecountry;H5N2subtypeAIVsaredistributedlimitedly;thenewlycollectedH5N6subtypeAIVsinIII clinicalsamplesarehighseparationrate,andthissubtupeviruseshaveathreattoinfectpeople,H5N8subtypeAIVsexistgreatpotentialriskstopoultry.Combiningwiththeresultsinvivoexperiment,thisstudyexploresinfluenceofNAtoH5subtypeAIVbiologicalcharacteristicsmolecularmechanism.First,wedeterminedthe5strainsofrecombinantvirusproliferationinCEFandDF1andMDCKcells,andfoundthatinCEFcellthevirustiterwasnotdifferentsignificantly,andinDF1celltheN2subtypesvirustiterislow,andinMDCKcellvirustiterfromhightolowinturnistheN8,short-stemmedN6,N1,long-stemmedN6andN2subtypeNA.TheaboveresultsmatcheswithMLD50resultsofmice,andthisillustratespotentiallythatNAgenesegmentwhichthrougthenhancingvirusreplicationabilityinmammaliancellsincreasesvirulencetomice.Secondly,inviewofthefunctionoftheNA,wedeterminedNAenzymeactivityofthevirus,NAenzymeactivityfromhightolowinturnistheN8,N2,short-stemmedN6andlong-stemmedN6subtypeNA,andvirusesonguineapigRBCdeflocculationabilityresultsshowthatthelong-stemmedN6andN8NAmatchwith2.3.4.4cladeofHAinthisresearchmost.InordertoobserveNAeffectsonvirusreplicationabilitymoreintuitively,wealsodeterminedthesizeofthevirustoformplaqueinMDCKcell,andthesizeofthevirusplaquefrombigtosmallinturnistheN8,short-stemmedN6,long-stemmedN6,N1,andN2subtypeNA.Fromtheaboveresults,wecangetaconclusionthatthefunctionofNAmaybeassociatedwithNAenzymeactivity,butNAenzymeactivityisnotthedecisivefactor;Short-stemmedNAcanenhanceabilityofproliferationinmammaliancells;NAfunctionisalsoassociatedwiththesuitabilityoftheHA.Keywords:H5avaininfluenzavirus;Pathogenicity;Transmissioncapacity;Reversegeneticstechnique;DifferentNAgenesIV 常用缩略词（Abbreviation）缩写词英文全称中文全称AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒AmpAmpicillin氨苄青霉素cDNAComplementaryDNA（与RNA）互补的DNADEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯EID5050%Embryoinfectivedose鸡胚半数感染量EBEthidiumbromide溴化乙锭HAHemagglutinin血凝素HPAIHighlypathogenicavianinfluenza高致病性禽流感LBLauriabrothLB肉汤MMatrixprotein基质蛋白NANeuraminidase神经氨酸酶NPNucleoprotein核蛋白ntnucleotide核苷酸PAPolymeraseA聚合酶APB1PolymeraseB1聚合酶B1PB2PolymeraseB2聚合酶B2PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RNPRNAribonucleoproteinparticle核糖核蛋白颗粒r/minRoundperminute转速/分钟SPFSpecificpathogenfree无特定病原µgMicrogram微克µLMicroliter微升V 目录1前言.....................................................................................................................................11.1研究背景.........................................................................................................................11.1.1流感病毒概述..............................................................................................................11.1.2流感病毒的结构..........................................................................................................11.22014-2015年2.3.4.4进化分支H5Nx亚型AIV感染情况概述..................................31.2.1H5N2亚型AIV感染情况...........................................................................................31.2.2H5N6亚型AIV感染情况...........................................................................................31.2.3H5N8亚型AIV感染情况...........................................................................................41.3NA在AIV传播中的角色..............................................................................................41.4本研究的目的及意义.....................................................................................................52材料与方法.........................................................................................................................72.1毒株.................................................................................................................................72.2鸡胚及实验动物.............................................................................................................72.3细胞.................................................................................................................................72.4主要试剂.........................................................................................................................82.5主要仪器.........................................................................................................................82.6SH7株反向遗传系统及部分毒株NA片段的构建......................................................82.6.1目的基因片段的扩增..................................................................................................82.6.1.1目的基因片段扩增所需引物...................................................................................92.6.1.2病毒的RNA提取.....................................................................................................92.6.1.3病毒基因组的反转录...............................................................................................92.6.1.4病毒cDNA的PCR扩增.......................................................................................102.6.1.5目的基因片段的纯化.............................................................................................102.6.1.6目的基因片段与pJET平端载体的连接...............................................................102.6.1.7重组质粒的转化.....................................................................................................112.6.1.8阳性重组质粒的筛选.............................................................................................112.6.1.9阳性菌的扩大培养以及质粒的抽提.....................................................................122.6.1.10含目的基因片段的pJET1.2平端载体的酶切....................................................132.6.1.11目的基因片段与双向表达载体pHW2000连接................................................13VI 2.6.2H5Nx重组病毒的拯救..............................................................................................142.6.2.1H5Nx重组病毒的拯救...........................................................................................142.6.2.2H5Nx重组病毒的传代...........................................................................................152.6.2.3H5Nx重组病毒RNA的抽提和反转录.................................................................152.6.2.4H5Nx重组病毒基因的扩增以及序列的测定.......................................................152.7H5Nx重组病毒体外试验.............................................................................................152.7.1H5Nx重组病毒蚀斑大小测定..................................................................................152.7.2H5Nx重组病毒豚鼠红细胞解凝试验......................................................................162.7.3H5Nx重组病毒NA酶活性测定..............................................................................162.7.4H5Nx重组病毒CEF、DF1、MDCK增殖曲线测定..............................................172.7.4.1MOI计算方法.........................................................................................................172.7.4.2TCID50测定方法.....................................................................................................172.7.4.3细胞数测定方法.....................................................................................................182.7.4.4鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备..........................................................................182.7.4.5H5Nx重组病毒CEF、DF1和MDCK增殖曲线测定.........................................182.8病毒对SPF鸡的致病性..............................................................................................182.8.15株H5Nx亚型AIVs鸡胚半数感染量（EID50）测定..........................................182.8.2病毒对SPF鸡的致病性...........................................................................................182.8.3病毒在SPF鸡拭子中病毒滴度测定.......................................................................192.8.4病毒在SPF鸡体内脏器中复制水平测定...............................................................192.9病毒对SPFBALB/c小鼠的致病性............................................................................192.9.1病毒在SPFBALB/c小鼠体内脏器中复制水平测定.............................................202.9.25株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定........................................203结果与分析.......................................................................................................................203.15株H5Nx亚型AIVs的拯救与传代结果...................................................................203.25株H5Nx亚型AIVs蚀斑大小测定情况...................................................................203.35株H5Nx亚型AIVs豚鼠红细胞解凝试验结果.......................................................223.45株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定结果...........................................................223.55株H5Nx亚型AIVs在CEF、DF1和MDCK生长曲线测定................................233.6病毒对SPF鸡致病性测定..........................................................................................25VII 3.6.15株H5Nx亚型AIVs鸡胚半数感染量（EID50）测定结果..................................253.6.2病毒感染SPF鸡后死亡率.......................................................................................253.6.3病毒感染SPF鸡后脏器复制水平...........................................................................263.6.4病毒感染SPF鸡后咽/泄殖腔拭子检测结果..........................................................293.6.5血清抗体转阳情况测定结果....................................................................................313.7病毒对SPFBALB/c小鼠的致病性测定....................................................................313.7.1SPFBALB/c小鼠感染后体重变化情况...................................................................313.7.2SPFBALB/c小鼠感染后死亡率...............................................................................313.7.3SPFBALB/c小鼠感染后脏器病毒量检测结果.......................................................323.7.45株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定结果................................334讨论..................................................................................................................................344.15株H5Nx亚型AIVs在体外试验讨论.......................................................................344.1.15株H5Nx亚型AIVs蚀斑大小测定讨论................................................................344.1.25株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性讨论................................................................354.1.35株H5Nx亚型AIVs的豚鼠红细胞解凝讨论........................................................354.1.45株H5Nx亚型AIVs在CEF、DF1和MDCK生长曲线测定讨论.....................354.25株H5Nx亚型AIVs在体内试验讨论.......................................................................364.2.15株H5Nx亚型AIVs在SPF鸡体内试验讨论.......................................................364.2.25株H5Nx亚型AIVs在SPFBALB/c小鼠体内试验讨论....................................37全文总结...............................................................................................................................39致谢...............................................................................................................................40参考文献.........................................................................................................................41附录A...................................................................................................................................45附录B...................................................................................................................................47VIII 1前言1.1研究背景1.1.1流感病毒概述正黏病毒科包括五个属，只有其中两个与人类相关，即A和B型流感病毒。A型流感病毒根据病毒表面的两个主要抗原按凝集素Hemagglutinin（HA）和神经氨酸酶Neuraminidase（NA）抗原性进一步分为多种亚型（甘孟侯等，2002；殷震，1997）。野生水禽被认为是A型流感病毒H1-H16HA和N1-N9NA亚型的宿主。H17N10和H18N11亚型仅仅在蝙蝠中检测到（Tongetal.,2013；Tongetal.,2012）。A型流感病毒可以从天然宿主传播至多个物种，主要是家禽、猪和人类等。目前，只有H1N1、H2N2和H3N2亚型流感病毒能在人群中长期传播。AIV根据致病性高低可以分为高致病性禽流感病毒（HPAIV，High）和低致病性禽流感病毒（LPAIV，Low），其中H5和H7亚型为高致病性禽流感病毒。H5N1和H7N9亚型禽流感病毒分别自1997年和2013年首次报道感染人以来，已累计感染数多达数百人。此外，还存在其他亚型流感病毒感染人的病例，包括H9N2、H6N1、H7N7、H10N8、H7N2和H7N3等（Arzeyetal.,2012；Peirisetal.,1999；Yuanetal.,2013；Chenetal.,2014；Ostrowskyetal.,2012；Lopez-Martinezetal.,2013；Fouchieretal.,2004；Koopmansetal.,2004）。流感病毒生活周期是从流感病毒HA吸附至宿主细胞的受体开始的（Skeheletal.,2000）。入胞后，HA介导病毒和宿主细胞膜融合，病毒的核蛋白复合体被释放到胞质中转运细胞核，通过病毒的聚合酶复合体进行复制和转录，新合成的病毒核蛋白复合体和结构蛋白被转运到胞浆膜，形成新的病毒并且出胞。当前对于流感病毒传播、流行和新型流感病毒家系形成的因素和机理尚不完全清楚。流感病毒进化由两个机制驱动：病毒基因突变和基因重组。基因重组是一个细胞至少感染两个不同的流感病毒，在细胞内八个RNA（vRNA）发生重新组合的过程（谭伟等，2014）。1.1.2流感病毒的结构流感病毒粒子呈多形性，大体是球形，直径80-100nm。A型流感病毒具有脂质双分子层结构的囊膜，囊膜来自宿主细胞的细胞膜（McAuleyetal.,2010；贺番等，2007）。在囊膜上镶嵌着3种病毒跨膜蛋白：HA、NA和M2。病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物由病毒RNA（vRNA）节段1-3编码PB2、PB1和PA3个蛋白并结合核糖核蛋白复合物（RNP）构成。1 HA约占总膜蛋白的80%，是最丰富的包膜蛋白；NA占病毒包膜蛋白的17%；M2蛋白含量很少，每个病毒粒子上只含有16-20分子的M2蛋白。基质蛋白(matrixprotein)M1位于囊膜底面形成一个基质层包裹着病毒的核心；病毒核心是病毒的8个核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP）复合体，每个RNP复合体是由构成病毒RNA聚合酶的PB2(polymerasebasic2)、PBl(polymerasebasic1)和PA(polymeraseacid)三个亚基蛋白与病毒核蛋白NP结合病毒基因组RNA组成；核蛋白（NP），做为RNP的主要组成部分，由节段5编码，病毒vRNA缠绕NP形成RNP。A型流感病毒包含8个节段，编码16个蛋白。但并非所有流感病毒可以编码这16个蛋白，其中包括9个结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、ML、M2和NEP)和4个非结构蛋白(NS、PB1-F2、PA-X、N40)，N40功能未知，PA-X抑制细胞基因表达，N40和PA-X蛋白分别被PB1和PA片段编码；PB1-F2，由某些病毒表达的促凋亡蛋白，是PB1片段的第二个ORF编码的；PA-N155和PA-N182，是PA的另外两种形式（氨基末端被截断）可能对A型流感病毒的复制周期有重要的功能。病毒表面糖蛋白血凝素HA（受体结合）和神经氨酸酶NA（可以从细胞表面裂解唾液酸）分别由vRNA的节段4和6编码。vRNA中最小的2个节段分别各编码2个蛋白。基质蛋白（M1）是病毒蛋白中丰度最大的蛋白，由节段7线性编码。节段7同时编码M2蛋白，是一种跨膜蛋白，形成离子通道，在HA合成过程中控制高尔基体内的pH值，并在病毒脱壳过程中酸化病毒粒子的内部环境。与节段7相似，节段8也编码了2个蛋白，分别是非结构蛋白1（NS1）和核输出蛋白（NEP）。NS1拮抗宿主抗病毒反应，而NEP参与RNP复合物的核输出（图1.1）。图1.1A型流感病毒结构图（Medinaetal.,2011）2 1.22014-2015年2.3.4.4进化分支H5Nx亚型AIV感染情况概述1996年，H5N1亚型高致病性AIV首次在我国广东省水禽中被发现（Xuetal.,1999）。此后，H5N1亚型高致病性AIV在世界多个国家和地区广泛传播，给家禽行业造成巨大的经济损失，严重威胁人类健康（Shimonetal.,2010；Smithetal.,2006）。近年来，H5N1与H9N2、H6N6、H12N8及其他亚型流感病毒重组，产生了新重组基因型的H5亚型AIV(H5N2、H5N6和H5N8)，部分毒株表现高致病性特征，并在全球广泛流行（Guetal.,2010；Zhaoetal.,2012）。1.2.1H5N2亚型AIV感染情况H5N2亚型AIV存在高低两种致病性，在野鸟中通常呈低致病性，但感染家禽后可能变异为HPAIV（Snoecketal.,2011）。临床检测发现H5N2亚型AIV的HA和NA基因分别与H5N1和H9N2亚型AIV相同，存在基因重组现象。2012年从我国西藏鸡群中分离到一株野生型H9N2与H5N1重组的H5N2亚型AIV（Zhaoetal.,2012）。相关研究显示，在家禽市场中，H5N2亚型AIV出现持续的重组变异（Mietal.,2013）。对水禽长期使用某种药物会导致H5N2亚型AIV突变进而更易于感染人类（Achenbachetal.,2013）。此外，H5N2亚型高致病性AIV对家禽业造成了巨大的经济损失。1983年，美国宾夕法尼亚洲暴发H5N2亚型高致病性禽流感，扑杀1700万只鸡，直接经济损失达6000万美元（Hinshawetal.,1986）。H5N2亚型低致病性禽流感病毒虽不如高致病性毒株危害大，但一旦发病也会对养禽业造成一定程度的影响，出现蛋鸡产蛋量下降，严重时将会停止产蛋；种禽受精困难；一周龄雏禽死亡增多，易感大肠杆菌，治疗困难。1.2.2H5N6亚型AIV感染情况2014年5月，我国四川省南充市首次分离到H5N6亚型AIV，遗传分析表明，该分离株NA基因来自于H6N6亚型AIV，其他基因来自于2.3.4.4分支的H5N1亚型AIV，是一种新重组基因型AIV（Qietal.,2014）。研究表明，H6亚型AIV可在家禽体内通过基因重排，为H5亚型高致病性AIV提供内部基因（丁晴微等，2011）。动物试验证实，H5N6亚型AIV感染家禽后，可导致心脏、肺脏、肾脏等器官的广泛性出血，而且心脏、脑、肝脏、肺脏等脏器组织病理学变化明显，呈典型性感染，说明H5N6亚型AIV对鸡、鸭和小鼠有很强的致病力和致死率。四川省和江西省的活禽交易市场分离的8株H5N6亚型AIV已经进化成两个不同的分系—四川系和江西系。人感染的H5N6亚型AIV与四川系的H5N6亚型AIV具有较高的同源性。值得注意3 的是，H5N6亚型AIVHA蛋白160位氨基酸由T突变为A，NA蛋白茎部发生11个氨基酸的缺失，可能增强病毒对哺乳动物的亲和力（刘永法等，2015；Bietal.,2015）。自2014年以来，中国云南省、四川省、广东省、黑龙江省以及老挝和越南均从家禽体内分离到H5N6亚型AIV（郑艳等，2015）。目前，全球已有多例人感染H5N6亚型禽流感的病例，呈现散发，尚未发现有效的人传人证据。1.2.3H5N8亚型AIV感染情况2014年初，韩国暴发H5N8亚型禽流感疫情，超过1200万只家禽被扑杀（Leeetal.,2014）。此后，德国、荷兰、英国等欧洲国家、日本以及我国台湾相继出现H5N8亚型禽流感疫情，造成了巨大经济损失。H5N8亚型禽流感疫情通常局部暴发，持续时间短，疫情传播被认为与候鸟迁移有关（Hilletal.,2015；Dalbyetal.,2015）。H5N8亚型AIV可以导致鸡和其他家禽的死亡，但感染鸭子后不会引起发病和死亡（Songetal.,2015）。H5N8亚型AIV感染雪貂后显示低毒力，无法气溶胶传播（Pulit-Penalozaetal.,2015；Richardetal.,2015）。截止目前，尚无人感染H5N8亚型AIV的报道。1.3NA在AIV传播中的角色NA是AIV囊膜纤突的主要蛋白，以四聚体形式存在，属于Ⅱ型糖蛋白，具有免疫原性，能够诱发机体产生保护性抗体。NA蛋白呈蘑菇状，由头部和茎部组成，头部和茎部中间由一根长约10nm的杆相连。NA蛋白主要在病毒出芽时发挥作用，它能够将血凝素与细胞表面的唾液酸（sialicacid,SA）受体断开连接，同时防止病毒粒子之间发生聚集，对于AIV在周围细胞中的扩散能力有很大影响（Castruccietal.,1993；Elsetal.,1985）。流感病毒通过其表面血凝素与宿主细胞表面唾液酸（sialicacid,SA）受体受体特异性结合而感染宿主。AIV与唾液酸α-2,3半乳糖（sialicacid-2,3-galactose,SAα-2,3Gal）受体结合，而人流感病毒与SAα-2,6Gal受体结合。有研究报道，NA蛋白结合SAα-2,3Gal的酶活性高于结合SAα-2,6Gal（Baumetal.,1991；Kobasaetal.,1999；Garciaetal.,2014）。不同亚型AIV茎部氨基酸的数量和序列存在较大的差异，许多分离株NA茎部发生氨基酸缺失（Matrosovichetal.,1999）。迄今为止，NA蛋白茎部氨基酸缺失模式大致有5种：1）在49-68位缺失20个氨基酸；2）在54-72位缺失19个氨基酸；3）在54-75位缺失22个氨基酸；4）在57-72位缺失16个氨基酸；5）在63-77位缺失15个氨基酸（Zhouetal.,2006）。对不同茎部缺失模式与病毒毒力的关系研究，发现NA茎部49-68位缺失20个氨基酸的重组AIV对鸡和小鼠都是高致病性，而其他茎部4 缺失模式的重组病毒毒力相对较弱，表明NA茎部49-68位缺失20个氨基酸可能与2000年以来H5N1亚型AIV毒力増强存在一定关系。NA茎部缺失11-16个氨基酸后，降低AIV从红细胞的解脱能力，影响AIV在鸡胚中的繁殖能力（Matsuokaetal.,2009）。王曲直等应用反向遗传技术证实NA茎部长短会影响病毒的解凝能力，长茎病毒的红细胞解脱能力比短茎病毒强；NA茎部15或20个氨基酸的缺失突变会提高重组AIV在MDCK细胞中的繁殖能力，短茎病毒释放出的病毒粒子数量是长茎病毒的10-100倍，释放时间提前6-10h，而且短茎病毒在MDCK细胞形成的蚀斑也明显比长茎病毒的蚀斑大（王曲直等，2008）。现有的NA茎部缺失研究多集中于非H5亚型流感病毒，而NA茎部缺失对H5亚型禽流感病毒毒力和生物学特性影响的研究较少。1.4本研究的目的及意义禽流感病毒感染宿主广泛，能感染野鸟、家禽在内多种宿主。H5N1亚型高致病性禽流感病毒等对我国家禽养殖业的发展构成了严重威胁，同时作为人畜共患病，给人类公共卫生健康带来巨大威胁。流感病毒的NA（神经氨酸酶）基因，是流感病毒囊膜上一种重要糖蛋白，NA的受体解离特性与HA的受体结合特性是一个动态平衡，影响病毒对靶细胞的吸附和释放，进一步影响病毒的致病性和传播特性（Wardetal.,2013）。面对不断出现的H5Nx亚型AIVs（H5N2、H5N6、H5N8），想了解这些新的H5Nx亚型AIVs出现的原因是什么？不同NA亚型的作用又是什么？本研究将构建一株2.3.4.4进化分支的A/goose/Guangdong/SH7/2013（H5N1）简称SH7反向遗传操作系统，同时构建携带不同NA亚型（N1、N2、N6、N8）感染性克隆，利用反向遗传技术，以SH7为载体，选取7+1组合方式，拯救获得5株具有不NA的H5Nx亚型重组AIVs，分别命名为rSH7（H5N1）、rSH7-673NA（H5N6）、rSH7-674NA（H5N6）、rSH7-LZFNA（H5N2）、rSH7-Js1306NA（H5N8）。对这5株H5Nx亚型AIVs进行生物学特性研究，主要分为体外和体内两部分试验。体内包含研究重组病毒对SPF鸡的致病性及接触传播能力，测定病毒对BALB/c小鼠的致病性试验；体外包含重组病毒在MDCK、DF1、CEF增殖曲线，蚀斑大小，重组病毒NA酶活性测定和病毒解凝试验。了解H5Nx亚型AIVs（H5N1、H5N2、H5N6、H5N8）的分子生物学特性及不同NA亚型对病毒的作用。不断新现的H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多种亚型AIVs未来可能在家禽中造成全球性暴发，对家禽和人类构成严重的公共健康威胁，通5 过研究不同NA基因的H5亚型AIVs致病力，推动流感病毒感染与致病等机制研究，以及为预防和治疗流感感染提供理论依据，减少对动物和人类的危害。6 2材料与方法2.1毒株本研究中各毒株背景信息见表2.1，由人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室分离鉴定并保存。表2.1本研究的病毒株名称及简称毒株名称简称分离年份宿主来源分支A/goose/Guangdong/SH7/2013（H5N1）SH72013goose2.3.4.4A/duck/Guangdong/673/2014（H5N6）6732014duck2.3.4.4A/goose/Guangdong/674/2014（H5N6）6742014goose2.3.4.4A/chicken/Hebei/LZF/2014（H5N2）LZF2014chicken7.2A/goose/Guangdong/Js1306/2014（H5N8）Js13062014goose2.3.4.4rSH7-673NA（H5N6）与rSH7-674NA（H5N6）毒株NA分别来自2014年广东鸭和鹅中分离2.3.4.4分支的H5N6亚型AIV673和674毒株，其最显著的差别是病毒NA的茎部，rSH7-674NA毒株在NA的茎部58-68位存在11个氨基酸缺失，是短茎N6，与之对应的rSH7-673NA毒株，是长茎N6。rSH7-LZFNA（H5N2）毒株的NA来自河北鸡中分离的7.2分支的H5N2亚型AIVLZF毒株，与北方地区流行7.2分支的H5N2亚型AIV关系密切，rSH7-Js1306NA（H5N8）毒株的NA来自广东鹅中分离的2.3.4.4分支的H5N8亚型AIVJs1306毒株，与我国东部地区分离的H5N8亚型AIV关系密切。2.2鸡胚及实验动物9-10日龄SPF鸡胚由广东新兴大华农公司提供；4周龄SPF级BALB/c小鼠，由广东省实验动物中心提供；5周龄SPF鸡由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。涉及活病毒的试验均在华南农业大学动物生物安全三级（Animalbiosafetylevel3，ABSL-3）实验室中操作完成。2.3细胞本实验所用MDCK细胞系和DF1细胞系均为人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。7 2.4主要试剂1%鸡红细胞：采集隔离饲养的成年SPF公鸡自行制备；PBS缓冲液：Na2HPO41.15g、KH2PO40.2g、NaCl8g、KCl0.2g，加水定容至1L，调节pH值为7.4，高压灭菌后备用，放4℃冰箱保存；总RNA极速抽提试剂盒为上海飞捷生物技术有限公司产品；琼脂糖凝胶回收试剂盒；E.Z.N.A.Endo-freePlasmidMiniKitⅡ质粒提取试剂盒均为OMEGABIO-TEK公司产品；高保真DNA聚合酶Pfu为Agilent公司产品；Ex-TaqDNA聚合酶；DNAMarker：DL2000，250bpmarker；dNTPMixture；反转录酶M-MLV和RNA酶抑制剂为大连宝生生物工程有限公司产品；Lipofectamine®3000Reagent；Na-FluoarTMInfluenzaNeuraminidaseAssayKit(PN4457091)；Black,96-well,flatbottomplateswith®plasticlids(cat.No.237105)；Opti-MEMIReducedSerumMedium均为Thermal公司产品；4-MethylumbelliferoneSodiumSalt简称4-MU(SS），为Sigma-Aldrich公司产品；克隆载体CloneJETPCRCloningKit，T4DNA连接酶，限制性内切酶AarⅠ，为Thermal公司产品；细菌琼脂糖为OXOID公司产品；转染试剂Lipofectamine2000，无血清培养基Opti-MEM，高糖DMEM培养基，0.25%含EDTA的胰酶，2×MEM均为Invitrogen公司产品；TPCK-treatedtrypsin为Sigma-Aldrich公司产品；限制性内切酶BsmBI、BsaI均为NEB公司产品；其他试剂均为国产分析纯产品。双向转录载体pHW2000，由美国St.Jude儿童研究医院RobertWebster博士惠赠。2.5主要仪器ZHJH-C1214C超净工作台：苏州净化设备有限公司；HHVE-50高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；RT-50型旋转混合仪；Taiyo公司；DYCP-31C型电泳槽和电泳凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；TGL-18C台式高速离心机：德国Eppendorf公司；FV1200倒置显微镜：日本Olympas公司；MG108PCR扩增仪：杭州博日生物工程公司；Milli-QIntegral纯水仪：德国Millipore公司产品；双通道激光扫膜仪为Li-cor公司产品；AS60/220.Y电子分析天平：欧洲瑞德威公司；Synergy2多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。2.6SH7株反向遗传系统及部分毒株NA片段的构建2.6.1目的基因片段的扩增本研究所需扩增的序列有SH7的8个全基因片段、673、674、LZF、Js1306的8 NA基因片段。2.6.1.1目的基因片段扩增所需引物表2.2本研究所用8个基因片段扩增所需的引物基因上游引物下游引物PB2Ba-PB2-1：Ba-PB2-2341R：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAPB1Bm-PB1-1：Bm-PB1-2341R：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAPABm-PA-1：Bm-PA-2233R：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAHABm-HA-1：Bm-NS-890R：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAANPBm-NP-1：Bm-NP-1565R：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAANABa-NA-1：Ba-NA-1413R：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAMBm-M-1：Bm-M-1027R：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAANSBm-NS-1：Bm-NS-890R：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAA2.6.1.2病毒的RNA提取参照总RNA极速抽提试剂盒的说明书进行。具体操作如下：取病毒尿囊液100μL加入RA2液500μL，充分颠倒混匀5-10次，静止1min。将样本裂解物全部吸入内套管（已插在外套管中），12000r/min离心1min。取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，加入500μL洗液，12000r/min离心1min。重复上一步骤，再洗一次。取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，不加洗液，12000r/min离心1min。将内套管移入新的1.5mLEP管，在膜中央加入RNasefreeddH2O25-50μL。室温静置1min后，12000r/min离心1min，获得总RNA。置-80℃保存备用。2.6.1.3病毒基因组的反转录参照Takara公司反转录酶（M-MLV）说明书，将各试剂、模板依次加入0.5mLRNasefreeEP管中，在60µL反转录体系中依次加入以下组分：MLV(50U/µL)1μL，9 5×MLV-Buffer12μL，dNTP（10mmol）12μL，RRI(40U/µL)2μL，Uni12primer1.5µL(10pmol)，溶于RNasefreeddH2O中的禽流感病毒RNA模板30µL，混匀后置水浴锅上42℃60min进行反转录反应，反应产物直接用于PCR或-20℃保存备用，Uni12primer序列为5’-AGCAAAAGCAGG-3’。2.6.1.4病毒cDNA的PCR扩增在PCR反应管中加入反转录产物2µL，PfuDNA聚合酶（5U/µL）1µL，10×buffer5µL，dNTPMixture（10mmol）5µL，各基因的上下游引物(20pmol)各1µL，最后用超纯水将终体积调至50µL，混匀后于PCR仪上进行扩增。PCR扩增程序为预变性94℃5min，变性94℃20s，退火58℃30s，延伸72℃3min，运行25个循环，最后于72℃后延伸10min。同时设无模板的阴性对照。2.6.1.5目的基因片段的纯化向PCR产物内加入10µLLoadingBuffer，瞬时离心后，在含有EB的1%琼脂糖凝胶中，在120V的恒压下进行电泳。之后在凝胶成像仪中观察，从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，按琼脂糖凝胶回收试剂盒中的说明书进行PCR产物的纯化回收。具体方法如下：切下目的DNA回收片段，放入无菌的1.5mL的EP管中，加入500-750µLBindingBuffer，于50-60℃水浴5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至回收柱，于室温静置2min，12000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用500µLWashingsolution12000r/min，离心1min，洗两次；最后12000r/min离心15s，将回收柱转至干净的1.5mLEP管中，加25-50µL超纯水洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心1min，收集管中即为回收的DNA片段，可直接用于DNA连接，也可于-20℃保存备用。将纯化后的片段送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序；若序列正确则进行下一步操作。2.6.1.6目的基因片段与pJET平端载体的连接连接反应体系见表2.3，将配制好的连接反应体系加入0.5mLEP管中，瞬时离心之后，16℃连接仪反应15min，便可直接用于转化。10 表2.3连接反应体系成分反应体积（μL）DNA片段5超纯水2pJET载体1T4连接酶110×Buffer1总体积102.6.1.7重组质粒的转化将10µL连接产物加入到含50µL的感受态细胞（DH5α菌种）的EP管中，混合后在冰上孵育30min；冰浴后，42℃水浴热应激90s，然后迅速放在冰上孵育2min；向管内加入500µL的无抗LB液体培养基，然后置于震荡培养箱中，37℃，180r/min摇动45min；取出EP管在室温下4500r/min，离心2min，在超净台中将管内上清弃去至200µL，+剩余液体混匀；将菌液均匀涂布在含AMP的LB固体培养基平皿上，待菌液完全吸收后倒放在37℃培养箱内，培养12-16h。2.6.1.8阳性重组质粒的筛选+挑取平皿上的单个菌落置于500µL含AMP的LB液体培养基的EP管中，置于震荡培养箱中，37℃，200r/min摇动培养6-12h。重组质粒中目的基因片段经菌液PCR扩增检测，菌液PCR反应体系见表2.4，反应所需引物序列见表2.2，PCR产物经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测，出现与目的基因片段条带相符的的菌液可能含阳性重组质粒，将鉴定出来的阳性菌液送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。11 表2.4菌液PCR反应体系成分反应体积（μL）2×rTaqPCRMix10超纯水8.5上游引物(20pmol)0.5下游引物(20pmol)0.5菌液0.5总体积202.6.1.9阳性菌的扩大培养以及质粒的抽提++将测序正确的阳性菌液接种于无菌含AMP的LB培养基，菌种量与含AMP的LB培养基的比例为1:500-1:1000，在37℃摇床以200r/min的转速培养14-16h。之后按照E.Z.N.A.Endo-freePlasmidMiniKitⅡ中的说明书进行去内毒素质粒抽提，操作步骤如下：取10-15mL菌液，室温条件下5000r/min，离心10min。弃掉LB液体培养基，加入500µL的含有RNaseA的SolutionⅠ，重悬菌液。将重悬的菌液转移到新的2mLEP管中，加入500µLSolutionⅡ，颠倒7-10次EP管内液体，充分混匀，室温静置裂解2min，注意裂解时间不可过长，避免破坏质粒的完整性。加入250µL冰上预冷的BufferN3，缓慢颠倒EP管，混匀，直至管内形成白色均一絮状物，之后，室温条件下12000r/min，离心10min。小心将离心后的上清转移到新的1.5mLEP管中，加入0.1倍体积的ETRSolution，之后，放在冰上孵育10min，在孵育期间不时的颠倒EP管。42℃水浴5min后，发现管内液体变浑浊；室温条件下12000r/min，离心3min，ETRSolution全部被离心到离心管底部。将管内上清装移到新的2mLEP管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，缓慢颠倒6-7次，使溶液混匀，室温静置1-2min。转移上述操作中的液体700µL到TMHiBindDNAMiniColumnⅡ中，室温条件下10000r/min，离心1min，弃掉EP管内的流出液。重复步骤，直至所有液体均经过离心，过柱。加入500µL的BufferHB，室温条件下10000r/min，离心1min。弃掉管内液体，加入700µL的DNAWashBuffer，室温条件下10000r/min，离心1min，弃掉管内液体，重复此操作一遍。弃掉管内液体，柱子以最大速度12000r/min，空离3min，干燥柱基质。将柱子转移到新的1.5mLEP管中，在柱基质中央加入80-100µL超纯水；室温静置2min后，以12000r/min，离心112 min，从柱基质中洗脱DNA。2.6.1.10含目的基因片段的pJET1.2平端载体的酶切由于扩增的片段上下游均被引入了BsmBI或者BsaI的酶切位点，分别用BsmBI或者BsaI酶切所扩增得到的DNA片段。用BsaI酶切pJET1.2平端载体，反应体系见表2.5，37℃水浴6h后，回收片段。表2.5BsaI酶切反应体系成分反应体积（μL）内切酶BsaI110×Buffer5DNA1超纯水43总体积50用BsmBI酶切pJET1.2平端载体，反应体系见表2.6，55℃水浴1h后，回收片段。表2.6BsmBI酶切反应体系成分反应体积（μL）内切酶BsmBI110×Buffer5超纯水43DNA1总体积50含目的片段的连pJET平端载体阳性克隆，测序完毕，即可查找片段中间有无扩增此片段上下游引物所携带的酶切位点，若无，则直接用此引物上所携带的酶切位点进行酶切，具体详见引物表2.2，引物名称前Bm、Ba分别代表上下游引物两端携带BsmBI、BsaI酶切位点。2.6.1.11目的基因片段与双向表达载体pHW2000连接通过2.6.1.10步骤，目的片段两端含有黏性末端，连接反应体系见表2.7，在这个13 连接反应体系中用片段-1表示含黏性末端的目的片段，使用2.6.1.10中描述的方法将双向表达载体pHW2000用BsmBI酶切，将酶切后经纯化的pHW2000载体表示为pHW2000载体-1。依次加入上述试剂到0.5mLEP管中，瞬时离心之后，16℃连接仪反应15min，便可转化。重组质粒的转化、阳性重组质粒的筛选方法同2.6.1.7、2.6.1.8。将获得的重组质粒命名为pHW2000-SH7-PB2、pHW2000-SH7-PB1、pHW2000-SH7-PA、pHW2000-SH7-HA、pHW2000-SH7-NP、pHW2000-SH7-NA、pHW2000-SH7-M、pHW2000-SH7-NS、pHW2000-673-NA、pHW2000-674-NA、pHW2000-LZF-NA、pHW2000-Js1306-NA。表2.7连接体系成分反应体积（μL）片段-15超纯水2pHW2000载体-11T4连接酶110×Buffer1总体积102.6.2H5Nx重组病毒的拯救2.6.2.1H5Nx重组病毒的拯救细胞瓶内293T细胞生长至约90%时，弃掉瓶内培养基，用无菌PBS洗一遍，洗掉残余血清以及老化和死亡的细胞。弃掉PBS之后，加入0.25%含EDTA的胰酶，室温静置，消化30s，发现瓶壁上细胞开始脱落，吸掉瓶内胰酶。之后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，轻轻吹落瓶壁上的细胞，12孔板内每孔加1mL。待12孔板内的293T细胞贴壁约80%-90%时，弃掉孔内DMEM，并用PBS洗两遍，每孔加800μLOpti-MEM，按照Lipofectamine3000的操作说明进行转染。取两个无菌1.5mL离心管，一管内加入100μLOpti-MEM、3.5μLLipofectamineP3000和8个禽流感病毒双向表达pHW2000质粒共2.4μg，采用7+1组合方式重组，rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA5个重组毒NA片段分别来自相应的pHW2000-SH7-NA、pHW2000-673-NA、pHW2000-674-NA、pHW2000-LZF-NA、14 pHW2000-Js1306-NA双向表达质粒，另外7个基因片段来自SH7株反向遗传系统。另一管加入100μLOpti-MEM和4μLLipofectamine3000，静置5min之后将两管内液体混匀，再静置15min。将混匀的之后的脂质体和质粒加入到细胞板内，37℃温箱内孵育。4-6h后，加入TPCK胰酶，终浓度为1μg/mL。37℃温箱内孵育，48h后收样。将细胞板放置于-80℃冰箱反复冻融两遍，收取细胞悬液，接种于9-10日龄SPF鸡胚，37℃孵育48h后，选取HA呈阳性鸡胚的尿囊液，分装保存于-80℃冰箱备用，此代病毒命名为P0。2.6.2.2H5Nx重组病毒的传代将上一代获得rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒的尿囊液用无菌PBS稀释1000倍后，再次接种9-10日龄的SPF胚，37℃培养48h后，收集HA结果为阳性的尿囊液，分装-80℃保存。重复此操作3次，获得的病毒代次按顺序分别命名为P1-P3。2.6.2.3H5Nx重组病毒RNA的抽提和反转录抽取P3代次rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒尿囊液的总RNA，按M-MLV试剂盒说明书操作，得到5株重组病毒反转录产物cDNA，方法同2.6.1.2和2.6.1.3。2.6.2.4H5Nx重组病毒基因的扩增以及序列的测定以5株重组病毒反转录产物cDNA为模板，对目的片段（HA、NA、M片段）扩增及纯化，方法同2.6.1.4和2.6.1.5。将纯化PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。2.7H5Nx重组病毒体外试验2.7.1H5Nx重组病毒蚀斑大小测定将消化后的MDCK细胞接种于6孔细胞培养板中。第2天细胞融合度达100%时，将细胞上清弃掉，并用无菌PBS洗细胞两次。以DMEM将rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒10倍稀释，后接到MDCK细胞中，每孔接种400µL。感染2h后，将感染上清弃掉，并用无菌PBS洗细胞两次后，将细菌琼脂糖（1×MEM，100U/mL双抗，1µg/mLTPCK胰酶）铺在细胞表面，使细胞完全被覆盖，倒置放于5%CO2培养中培养。72h后，将琼脂糖胶揭掉，用含0.5%结晶紫的10%甲醛固定5min后，将染色液吸干后，对蚀斑大小评价。每个病毒稀释度做3个复孔。15 2.7.2H5Nx重组病毒豚鼠红细胞解凝试验取rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒50μL在96孔板PBS上倍比稀释，再加0.8%的豚鼠红细胞，在4℃，75min后读取HA值，之后再置37℃，2h后再读取HA值；两次孔数HA值减少大的病毒，HA与NA蛋白匹配性好；数值变化小的病毒，则匹配性差，每个样品做两个重复（Casalegnoetal.,2014）。2.7.3H5Nx重组病毒NA酶活性测定NA的活力：在标准实验条件下（60min、37℃），4-MU的产量。通过比较相对荧光单位（RFU）来测定。RFU值：通过4-MU的浓度值与标绘的RFU之间的标准曲线获得。一个仪器第一次做NA酶活性实验之前，制作标准曲线的目的是：测定这台仪器荧光量与浓度之间的线性范围；选择一个RFU范围，依据酶活来定量病毒。病毒的准备：rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒尿囊液。试剂准备：底物粉末注射入5mL超纯水，得到2.5mmol的储存液；把2.5mmol的储存液，500µL避光分装，存放于-20℃冰箱。配制20mL1X的实验buffer。用2X的实验buffer与等体积的超纯水，1X实验buffer用于稀释病毒和配制底物工作浓度；底物的工作浓度是200µmol，1个96孔板480µL的2.5mmol底物加5.52mL1X实验buffer。稀释方法：在black，96-well，flatbottomplate中稀释，在不同稀释度之间换枪头。在1-12孔加50µL1Xbuffer；在1孔中加入50µL未稀释的病毒储存液；将病毒二倍稀释，吸50µL液体从第1孔到第2孔，再从第2孔吸50µL到第3孔，以此类推，直到第11孔；弃去11孔中的50µL，12孔没有病毒。实验中每块板都需要做无病毒对照。NA活性试验方法：加50µL200µmol底物工作液加到每一个孔中。盖好盖子，37℃、60min，避光。（时间可以放置30min到2h，比较两个样品之间的NA活性，要放置相同时间。）加入100µL终止液到每个孔中。NA活性的定量：1-12孔中，无病毒对照的RFU的平均值。1-11孔中，每个病毒的RFU值减去12孔中RFU的平均值，这样就得到了减去背景之后的RFU值，RFU-minus-background值。做出一个病毒稀释度与RFU-minus-background值的表。对于每个病毒，选择利用标准曲线表就可以知道病毒酶活的定量。4-MU（SS）标准-3曲线的制作：准备100mmol；4-MU（SS）198.1mg加到10mL的超纯水，使用前10稀释至工作浓度100µmol；将4-MU（SS）工作浓度，二倍稀释，如表2.8所示。整个实验需要避光。在black,96-well,flatbottomplate中，加入200µL稀释液，做两个重16 复。荧光酶标仪读数波长：350nm-365nmexcitationwavelength；440nm-460nmemissionwavelength。表2.84MU（SS）稀释方法DilutionCombineConcentration①②1(1:1000)1µLWS+1000µLSS100µmol2(1:2)500µLDil1+500µLSS50µmol3(1:2)500µLDil2+500µLSS25µmol4(1:2)500µLDil3+500µLSS12.5µmol5(1:2)500µLDil4+500µLSS6.25µmol6(1:2)500µLDil5+500µLSS3.12µmol7(1:2)500µLDil6+500µLSS1.56µmol8(1:2)500µLDil7+500µLSS0.78µmol9(1:2)500µLDil8+500µLSS0.39µmol10(1:2)500µLDil9+500µLSS0.2µmol11(1:2)500µLDil10+500µLSS0.1µmol12(1:2)500µLSSN/ATM注：①表示WorkingStock(WS)=100mmol4-MU（SS），②表示Na-FluorStopSolution(SS)。2.7.4H5Nx重组病毒CEF、DF1、MDCK增殖曲线测定2.7.4.1MOI计算方法首先测定病毒在MDCK上的TCID50值和接毒前单孔细胞个数，使用细胞计数仪测定，利用公式MOI=TCID50/细胞数，计算。2.7.4.2TCID50测定方法MDCK细胞接96孔细胞板，待细胞长成单层后即可进行实验。在1.5mL离心管-1-10中将病毒从10-10作连续10倍的稀释。将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µL，并设正常细胞对照。逐日观察并记录细胞病变结果，一般需观察48h后，通过测定每孔上清HA确定病毒感染。用Reed-Muench两氏法计算结果。距离比值=（高于50%感染数-50%）/（高于50%感染数-低于50%感染数）LogEID50=高于50%的稀释度的对数+距离比值×稀释因数17 2.7.4.3细胞数测定方法接毒前，将单孔细胞用加1mL胰酶消化，待细胞消化完毕，用枪头吹匀细胞，取50µL到细胞计数板上，在细胞计数仪上读出细胞数密度，计算出单孔中细胞的总数目。2.7.4.4鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备将眼科剪、镊子、漏斗、小烧杯、平皿和纱布等器材高压蒸汽灭菌；选择12-14日龄发育良好的SPF鸡胚，碘酒和酒精棉球仔细消毒蛋壳，在无菌操作下打开气室，剥离壳膜，取出鸡胚置于平皿中，去除头、四肢、骨头和内脏，无血清高糖DMEM培养液清洗2遍；处理后鸡胚放于小烧杯中，用眼科剪将其尽可能地剪碎。加入细胞消化液消化组织团块，上下颠倒后，37℃水浴锅放置30min，每间隔5min摇匀一次。细胞生长液终止消化，1500r/min，离心3-5min，弃上清。下层细胞加入适量细胞生长液，用力吹打后吸取上清加到铺有纱布的漏斗中过滤；将滤液分装在细胞培养瓶中，置39℃5%CO2条件下培养，直至生长成良好的单层致密细胞。2.7.4.5H5Nx重组病毒CEF、DF1和MDCK增殖曲线测定将CEF、DF1和MDCK分别均匀铺于6孔细胞培养板培养，病毒采用0.0001个MOI（muLtiplicityofinfection）剂量接种CEF细胞，0.001个MOI剂量接种DF1和MDCK细胞，同时设未接种病毒的细胞对照孔。将稀释好的rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒液加入细胞培养板中，37℃吸附1h后弃去病毒液，加含2%BSA的高糖DMEM培养液，CEF和DF1细胞置39℃，5%CO2条件下培养；MDCK细胞置37℃，5%CO2条件下培养。2.8病毒对SPF鸡的致病性2.8.15株H5Nx亚型AIVs鸡胚半数感染量（EID50）测定将rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒，-5-10按照10-10稀释度接胚，每个稀释度各接5枚9-11日龄非免疫胚，0.2mL/枚，37℃培养，弃去12h内死亡鸡胚，测定所有感染鸡胚的尿囊液血凝活性，来判断该鸡胚是否被感染，通过Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。2.8.2病毒对SPF鸡的致病性rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒和5SH7毒株用灭菌PBS稀释至10EID50/200μL，置于冰上，采用点眼和滴鼻途径人工感染SPF鸡，病毒感染7只SPF鸡，攻毒当天记为0d，24h放入7只SPF鸡作为同18 居组，SH7毒株组不放同居组，连续观察14d，详细地记录SPF鸡的临床症状和死亡情况，攻毒后于3d、5d、7d采集SPF鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子，分装到不同离心管中；攻毒后3d，随机选取攻毒组鸡3只，经颈静脉放血剖杀，分别取心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器置于-80℃保存，用于后续病毒滴度测定；如果攻毒组SPF鸡在攻毒后2d全部死亡，则只采2d的的咽喉拭子和泄殖腔拭子和取3只2d死亡的SPF鸡用于后续病毒滴度测定。如果攻毒组SPF鸡在攻毒后2-3d死亡，死亡的SPF鸡数目大于或等于3只，则取3只2-3d死亡的SPF鸡用于后续病毒脏器滴度测定；同居组SPF鸡，从开始死亡到死亡的SPF鸡数目大于或等于3只期间中，选取3只死亡的SPF鸡，用于后续病毒脏器滴度测定。2.8.3病毒在SPF鸡拭子中病毒滴度测定-1-5将采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子用含有10000U/mL双抗PBS震荡，按照10-10稀释度稀释，不同稀释度各接3枚9-11日龄的非免疫胚，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。2.8.4病毒在SPF鸡体内脏器中复制水平测定测定各组织脏器病毒滴度时，先将留取的各个不同组织进行称重、研磨，充分研磨后按照1mL/g加入相应量含有10000U/mL双抗PBS，4℃，4000-8000r/min，离心-1-910min，吸取上清液，按照10-10稀释度接胚，各稀释度接3枚，每枚0.2mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此用来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算各被测样品中病毒滴度。2.9病毒对SPFBALB/c小鼠的致病性rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒和5SH7毒株用灭菌PBS稀释至10EID50/50μL，置于冰上，将4周龄雌性BALB/c小鼠（体重12g-13g）用干冰麻醉，每只小鼠经鼻腔感染50μL病毒的稀释液，5个重组病毒感染8只小鼠；SH7毒株感染11只小鼠；另取5只同批次BALB/c小鼠分别经鼻腔接种无菌PBS，作为对照组。攻毒当天记为0d，连续观察14d，每天观察小鼠的状态并每天称重。5个重组病毒感染组，在病毒感染后4d，每组取3只小鼠，取肺、脑和鼻甲骨置于-80℃保存，用于后续病毒滴度测定；SH7毒株感染组，在病毒感染后4d，每组取3只小鼠，取肺、脑置于-80℃保存，用于后续病毒滴度测定。19 2.9.1病毒在SPFBALB/c小鼠体内脏器中复制水平测定取出采集的小鼠脏器，在无菌条件下，充分研磨后按照1mL/g加入相应量含有-1-910000U/mL双抗PBS，4℃，4000-8000r/min，离心10min，吸取上清液，按照10-10稀释度接胚，各稀释度接3枚，每枚0.2mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此用来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算各被测样品中病毒滴度。2.9.25株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定将体重为12g-13g重的SPFBALB/c雌性小鼠随机分成26组，分别编号，攻毒前对每组的小鼠进行分组、编号，实验组中每只小鼠分别用干冰麻醉后以滴鼻方式接种，将rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组毒株15分别稀释10-10EID50/50μL剂量，每个稀释度感染5只小鼠，另取5只同批次SPFBALB/c小鼠分别鼻腔接种无菌PBS，作为对照组，连续观察14天，每天对其小鼠进行体重称量、记录死亡情况。3结果与分析3.15株H5Nx亚型AIVs的拯救与传代结果rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA重组病毒在SPF鸡胚中传代，从P0到P3每代次的HA效价如表3.1所示，重组毒能够在SPF鸡胚中传代。表3.1重组病毒不同代次血凝效价重组病毒代次病毒名称P0P1P2P3rSH78887rSH7-673NA7978rSH7-674NA610109rSH7-LZFNA11177rSH7-Js1306NA711893.25株H5Nx亚型AIVs蚀斑大小测定情况20 图3.15株H5Nx亚型AIVs蚀斑形态注：a、b、c、d、e分别表示rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA病毒蚀斑形态。表3.2重组病毒在MDCK细胞上的蚀斑大小VirusesPlaqueSize(mm.)rSH70.5mmrSH7-673NA0.5-1mmrSH7-674NA1-2mmrSH7-LZFNA0.5mmrSH7-Js1306NA1-2mm5株H5Nx亚型AIVs感染MDCK细胞，通过蚀斑技术测定病毒的感染力，结果如图3.1所示，rSH7和rSH7-LZFNA毒株只能形成肉眼可见的针尖大小蚀斑，直径约在0.5mm；rSH7-674NA毒株的蚀斑大于rSH7-673NA毒株，直径约在1-2mm之间；rSH7-Js1306NA毒株形成肉眼可见的大蚀斑，直径约在1-2mm之间。21 3.35株H5Nx亚型AIVs豚鼠红细胞解凝试验结果876℃543210-1HAtiterlossat37-2for2h7AHNANANrS737-674HrSH7-6rSrSH7-LZFNA7-Js1306HrS图3.25株H5Nx亚型AIVs豚鼠红细胞解凝情况表3.35株H5Nx亚型AIVs豚鼠红细胞解凝试验数据4℃75min37℃2h①②③毒株HAHA相差值rSH755550rSH7-673NA88226rSH7-674NA8899-1rSH7-LZFNA4455-1rSH7-Js1306NA88335注：①表示病毒置4℃，75min后读取HA值，②表示置37℃，2h后再读取HA值，③表示②值减去①值。5株H5Nx亚型AIVs通过豚鼠红细胞测定解凝试验中有明显差异。rSH7-673NA、rSH7-Js1306NA重组病毒相差值分别为6孔和5孔，rSH7重组病毒相差值为0孔，rSH7-674NA、rSH7-LZFNA重组病毒相差值为-1，根据HA相差值，减少大的病毒，HA与NA蛋白匹配性好，数值变化小的病毒，则匹配性差，结果表明rSH7-673NA、rSH7-Js1306NA重组病毒NA与HA匹配性好，见图3.2。3.45株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定结果如图3.3，5株H5Nx亚型AIVs，重组病毒起始含量是HA值为3，经过在96孔板二倍稀释，测定各个病毒NA酶活性，在底物荧光RFU值一定时，对应病毒稀释值log2越大，单位病毒含量的NA酶活性越高。22 图3.35株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定结果表3.45株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定数据相对荧光单位（RFU）值稀释度（log2）rSH7rSH7-673NArSH7-674NArSH7-LZFNArSH7-Js1306NA541107.545228.515670.515456.533792.533236.549384.6748088.6743766.6746486.67619133.516162.56833.57875.515824.515633.522905.6722440.6723211.6721321.6778455.58807.53177.53412.58257.57175.510368.6710567.6712756.6711714.6784203.53721.51709.51436.53604.53235.55134.675041.676845.676075.6791603.51637.5826.5805.51618.51787.52066.672007.673175.672855.67101101.51046.5-134.5905.5883.5988.51219.671107.672005.671928.6711417.5404.5576.5445.5685.5179.5528.67368.67913.67899.67NA酶活性测定，其他四个毒株与rSH7毒株相比：rSH7-673NA毒株，在稀释度8为log2时，NA酶活性比rSH7毒株低（P<0.05），之后随病毒稀释度增大，差异不5明显；rSH7-674NA毒株，在稀释度为log2时，NA酶活性比rSH7毒株低，之后随6病毒稀释度增大，差异不明显；rSH7-LZFNA毒株，在稀释度为log2时，NA酶活性高于rSH7毒株，之后随病毒稀释度增大，差异不明显；rSH7-Js1306NA毒株，在稀5678释度为log2时（P>0.05）、在稀释度为log2、log2（P<0.001）和在log2时（P<0.05），NA酶活性高于rSH7毒株，之后随病毒稀释度增大，差异不明显。3.55株H5Nx亚型AIVs在CEF、DF1和MDCK生长曲线测定图3.4a、图3.4b和图3.4c分别是5株H5Nx亚型AIVs在MDCK、DF1、CEF23 上的生长曲线情况，5株H5Nx亚型AIVs在三种细胞上表现出显著差异。从细胞病变情况观察，五株重组病毒在12h时就开始出现零星的细胞变圆现象，在18h左右可观察到细胞病变；至36h时，五株重组病毒感染细胞脱落和裂解比较明显，rSH7-Js1306NA则出现时间要迟，细胞病变情况相对比较轻微；至48h时，细胞脱落和裂解情况更加明显；从细胞的角度来看，病毒感染后，禽类细胞DF1、CEF相对哺乳动物细胞MDCK，细胞出现病变、脱落、裂解更加明显，出现的时间也更早。abMDCK-MOI0.001DF1-MOI0.001）8）8LLμrSH7μrSH7rSH7-673NArSH7-673NA66rSH7-674NArSH7-674NArSH7-LZFNArSH7-LZFNA4rSH7-Js1306NA4rSH7-Js1306NAlogTCID50/100logTCID50/100（（2200Virustiter012243648Virustiter012243648HourspostinfectionHourspostinfectioncCEF-MOI0.0001）8LμrSH7rSH7-673NA6rSH7-674NArSH7-LZFNA4rSH7-Js1306NAlogTCID50/100（20Virustiter012243648Hourspostinfection图3.45株H5Nx亚型AIVs生长曲线测定结果表3.5病毒感染CEF、DF1和MDCK细胞检测的最高病毒滴度（lgTCID50/100μL）VirusesCEFDF1MDCK75.596.25rSH71010107.55.675.75rSH7-673NA1010107.56.437rSH7-674NA1010106.333.675.6rSH7-LZFNA1010107.776.438.13rSH7-Js1306NA10101024 3.6病毒对SPF鸡致病性测定3.6.15株H5Nx亚型AIVs鸡胚半数感染量（EID50）测定结果测得rSH7、rSH7-673NA、rSH7-674NA、rSH7-LZFNA、rSH7-Js1306NA毒株的7.227.59.177.178.17EID50值分别为10/100µL、10/100µL、10/100µL、10/100µL、10/100µL。3.6.2病毒感染SPF鸡后死亡率图3.5a、图3.5c为5株H5Nx亚型AIVs感染组和同居组死亡率结果。rSH7病毒，感染组SPF鸡，2d死亡6只，3d死亡1只，死亡率100%，SPF鸡死亡急速，死亡前并没有观察到明显临床症状；同居组SPF鸡4d死亡2只，5d死亡2只，7d死亡3只，死亡率100%；SH7毒株感染SPF鸡后死亡率，如图3.5b所示，SH7毒株感染SPF鸡后，2d内死亡7只，死亡率100%。rSH7-673NA病毒，感染组SPF鸡，2d死亡7只，死亡率100%，SPF鸡死亡急速，死亡前并没有观察到明显临床症状，同居组SPF鸡4d死亡2只，6d死亡3只，8d死亡1只，10d死亡1只，死亡率100%；rSH7-674NA病毒，感染组SPF鸡2d死亡6只，4d死亡1只，死亡率100%，SPF鸡死亡急速，死亡前并没有观察到明显临床症状；同居组SPF鸡4d死亡2只，6d死亡1只，9d死亡1只，12d死亡2只，同居组还剩1只SPF鸡存活，死亡率85.7%；rSH7-LZFNA病毒，感染组SPF鸡2d死亡4只，3d死亡2只，4d死亡1只，死亡率100%，SPF鸡死亡急速，死亡前并没有观察到明显临床症状；同居组SPF鸡5d死亡1只，6d死亡2只，7d死亡1只，同居组还剩3只SPF鸡存活，死亡率57%；rSH7-Js1306NA病毒，攻毒组的SPF鸡2d死亡7只，死亡率100%，SPF鸡死亡急速，死亡前并没有观察到明显临床症状；同居组SPF鸡4d死亡2只，5d死亡2只，6d死亡1只，同居组还剩2只SPF鸡存活，死亡率71%。25 图3.5病毒感染SPF鸡后死亡率注：图3.5a、图3.5c为5株H5Nx亚型AIVs感染组和同居组死亡率；图3.5b为SH7毒株感染SPF鸡后的死亡率。3.6.3病毒感染SPF鸡后脏器复制水平SH7毒株感染SPF鸡后2d，鸡全部死亡，测定病毒在SPF鸡体内各脏器中病毒滴度，结果见表3.6。26 表3.6SH7毒株感染SPF鸡后各脏器滴度(lgEID50/mL)①心肝脾肺肾脑死亡/剖杀时间③2d-s3/33/33/3SH73/3（5.67±0.14）3/3（5.9±0.52）3/3（5.9±1.15）②（5.5±0）（6.5±1.7）（5.5±0）对照组0/3(0)0/3(0)0/3(0)0/3(0)0/3(0)0/3(0)3/3d-p注：①：用xd-s代表某天内或之前自然死亡累积大于等于3只，xd-p代表某天内剖杀。②：取3只鸡测定病毒在鸡体内脏器中复制水平，括号内分别表示样品病毒滴度的平均值和标准方差，③：x/3表示3个样品中有x个被检测出病毒。5株H5Nx亚型AIVs在鸡体内不同组织脏器中的复制能力及组织嗜性，见表3.7。rSH7病毒，感染组鸡检测的心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器中病毒滴度都较高，lgEID50/mL值在5.67-7.1范围内；同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，lgEID50/mL值在5.58-6.7范围内。rSH7-673NA病毒，感染组鸡检测的心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器中病毒滴度都较高，lgEID50/mL值在5.1-6.64范围内；同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，lgEID50/mL值在5.25-6.25范围内。rSH7-674NA病毒，感染组鸡检测的心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器中病毒滴度都较高，lgEID50/mL值在5.75-7.58范围内；同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，lgEID50/mL值在5.67-7.12范围内。rSH7-LZFNA病毒，感染组鸡检测的心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器中病毒滴度都较高，lgEID50/mL值在5.91-7.04范围内；同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，lgEID50/mL值在5.25-7.2范围内。rSH7-Js1306NA病毒，感染组鸡检测的心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器中病毒滴度都较高，lgEID50/mL值在5.25-6.83范围内；同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，lgEID50/mL值在5.67-7.19范围内。对照组没有检测到病毒滴度。组织脏器检测情况表明：病毒在鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑6个脏器中均能良好繁殖，且有较高的病毒滴度，同居组鸡被检测的6个脏器中病毒含量和感染组中病毒含量相差不大，说明重组病毒能够通过水平传播后得到良好复制表达，甚至造成严重危害。27 表3.7鸡的不同脏器组织病毒分离率及病毒滴度（lgEID50/200µL）病毒心肝脾肺肾脑死亡/剖杀时间①③②感染组3/3(5.67±1.16)3/3(5.75±0.71)3/3(7.1±0.28)3/3(5.9±0.42)3/3(7±0.89)3/3(5.75±0.4)2d-srSH7同居组3/3(5.85±0.28)3/3(6.0±0.41)3/3(6.67±1.17)3/3(5.8±0.51)3/3(6.7±0.69)3/3(5.58±0.62)5d-s感染组3/3(5.45±1.0)3/3(5.1±0.39)3/3(5.92±0.38)3/3(5.25±0.5)3/3(6.64±0.47)3/3(5.4±0.47)2d-srSH7-673NA同居组3/3(6.17±0.28)3/3(6.25±0.33)3/3(5.25±0.68)3/3(6.36±1.2)3/3(5.61±0.51)3/3(5.5±0.48)6d-s感染组2/2(5.75，7.55)3/3(6.5±0.57)3/3(6.57±0.29)3/3(6.69±0.8)3/3(7.58±0.39)3/3(6.58±0.2)2d-srSH7-674NA同居组3/3(6.49±0.65)3/3(6.5±0.57)3/3(6.8±0.87)3/3(6.8±0.94)3/3(7.12±0.75)3/3(5.67±0.1)6d-s感染组3/3(6.47±0.22)3/3(6.25±0)3/3(5.91±1.2)3/3(6.97±0.7)3/3(7.04±0.43)3/3(5.94±0.3)2d-srSH7-LZFNA同居组3/3(7.2±0.85)3/3(6.5±0)3/3(6.07±1.1)3/3(6.79±0.3)3/3(6.77±0.65)3/3(5.25±0.32)6d-s感染组3/3(5.64±0.69)3/3(5.25±0.5)3/3(5.97±0.48)3/3(5.8±0.96)3/3(6.83±0.76)3/3(5.9±0.2)2d-srSH7-Js1306NA同居组3/3(5.9±0.41)3/3(5.83±1.2)3/3(6.71±0.87)3/3(6.2±0.93)3/3(7.19±0.29)3/3(5.67±0.28)5d-s对照组0/3(0)0/3(0)0/3(0)0/3(0)0/5(0)0/3(0)3/3d-p注：①：用xd-s代表某天内或之前自然死亡累积大于等于3只，xd-p代表某天内剖杀。②：取3只鸡测定病毒在鸡体内脏器中复制水平，括号内分别表示样品病毒滴度的平均值和标准方差，③：x/3表示3个样品中有x个被检测出病毒。28 3.6.4病毒感染SPF鸡后咽/泄殖腔拭子检测结果SH7毒株感染SPF鸡后2d，鸡全部死亡，测定病毒在SPF鸡咽拭子和泄殖腔拭子，病毒滴度，结果见表3.8。表3.8SH7毒株感染SPF鸡2d咽拭子/泄殖腔拭子病毒滴度(lgEID50/mL）咽拭子泄殖腔拭子死亡/剖杀时间①SH73/3③②(3.9±0.45)3/3(2.85±1.06)2d-s对照组0/3(0)0/3(0)3/3d-p注：①：用xd-s代表某天内自然死亡，xd-p代表某天内剖杀。②：取3个拭子测定病毒复制水平，检测鸡排毒情况，括号内分别表示样品病毒滴度的平均值和标准方差，③：x/3表示3个样品中有x个被检测出病毒。5株H5Nx亚型AIVs在鸡体内不同组织脏器中的复制能力及组织嗜性，各组鸡的排毒情况，见表3.9。rSH7病毒，感染组2d死亡6只，3d死亡1只，排毒情况没有进行检测；同居组鸡在5d消化道和呼吸道检测到排毒，而在3d和7d消化道和呼吸道没有检测到排毒。rSH7-673NA病毒，感染组在2d全部死亡，排毒情况没有进行检测；同居组鸡在3d消化道和呼吸道检测到排毒，5d在消化道检测到排毒，但呼吸道没有检测到排毒；在7d消化道和呼吸道没有检测到排毒。rSH7-674NA病毒，感染组2d死亡6只，4d死亡1只，排毒情况没有进行检测；同居组鸡在3d和5d在消化道和呼吸道都检测到排毒，在7d消化道和呼吸道没有检测到排毒。rSH7-LZFNA病毒，感染组2d死亡4只，3d死亡2只，4d死亡1只，排毒情况没有进行检测；同居组鸡在3d呼吸道检测到排毒，消化道没有检测到排毒；5d在消化道和呼吸道检测到排毒，在7d消化道和呼吸道没有检测到排毒。rSH7-Js1306NA病毒，感染组在2d全部死亡，排毒情况没有进行检测；同居组鸡在3d和5d消化道和呼吸道检测都到排毒，在7d消化道和呼吸道没有检测到排毒。对照组没有检测到排毒。29 表3.9鸡咽喉拭子/泄殖腔拭子病毒分离率、病毒滴度（lgEID50/mL）病毒分组泄殖腔拭子咽喉拭子死亡数/各组总数14d后存活数3d5d7d3d5d7d2d3d4d5d6d7d8d9d10d12d①感染组------------------6/71/1------------------------0只rSH7②③同居组0/7(0)2/4(1.5,2.3)---0/6(0)1/6(3.5)---0/70/72/72/50/33/3------------0只感染组------------------7/7---------------------------0只rSH7-673NA同居组2/7(1.5,1.5)1/4(2.3)0/2(0)2/6(0.98,1.5)0/4(0)0/2(0)0/70/72/70/53/50/21/20/11/1---0只感染组------------------6/70/11/1---------------------0只rSH7-674NA同居组2/7(1.5,1.75)1/4(2.25)0/3(0)2/7(1.5,1.75)1/5(2.5)0/4(0)0/70/72/70/51/50/40/41/40/32/31只感染组------------------4/72/31/1---------------------0只rSH7-LZFNA同居组0/6(0)1/6(1.25)0/3(0)1/7(0.98)1/4(3.5)0/3(0)0/70/70/71/72/61/40/30/30/30/33只感染组------------------7/7---------------------------0只rSH7-Js1306NA同居组2/7(1.5,0.97)2/4(2.5,2.5)0/2(0)2/7(2.5,1.75)2/4(2.25,2.5)0/2(0)0/70/72/72/51/30/20/20/20/20/22只对照组0/7(0)0/4(0)0/4(0)0/7(0)0/4(0)0/4(0)0/73/70/40/40/40/40/40/40/40/44只注：①：---代表死后未检测，②：x/y表示y个样品中有x个被检测出病毒，③：取y个拭子样品测定病毒复制水平，检测鸡排毒情况。30 3.6.5血清抗体转阳情况测定结果攻毒14d后，rSH7-674NA毒株同居组存活1只，rSH7-LZFNA毒株同居组存活3只，rSH7-Js1306NA毒株同居组存活2只，对照组剩余4只，对存活鸡采血取血清，进行HI抗体转阳情况测定，结果显示：rSH7-674NA毒株同居组、rSH7-LZFNA毒株同居组、rSH7-Js1306NA毒株同居组存活的鸡不存在抗体转阳情况，全部未感染。3.7病毒对SPFBALB/c小鼠的致病性测定3.7.1SPFBALB/c小鼠感染后体重变化情况图3.6a和图3.6b，分别为5株H5Nx亚型AIVs和SH7毒株感染小鼠后体重曲线情况，均出现先升高后降低的变化趋势，病毒感染小鼠后，除rSH7-LZFNA毒株在感染小鼠后5d才出现体重下降趋势，在9d小鼠全部死亡，其他的H5Nx亚型AIV和SH7毒株在感染小鼠后2-3d就开始出现体重下降趋势，在7-8d小鼠全部死亡。图3.6SPFBALB/c小鼠感染后体重变化曲线注：图3.6a和图3.6b分别为5株H5Nx亚型AIV和SH7毒株感染小鼠后体重变化。3.7.2SPFBALB/c小鼠感染后死亡率见图3.7a，小鼠体重下降到攻毒前75%以下时判为死亡，rSH7感染组小鼠6d开始出现死亡并死亡2只，7d死亡2只，1d出现非正常死亡一只，死亡率达100%；如图3.7b所示，SH7毒株感染8只小鼠，6d开始出现死亡并死亡4只，7d死亡4只，死亡率达100%。rSH7-673NA感染组小鼠6d出现死亡并死亡3只，7d死亡2只，死亡率达100%；rSH7-674NA感染组小鼠6d出现死亡并死亡3只，8d死亡131 只，1d出现非正常死亡一只，死亡率达100%；rSH7-LZFNA感染组小鼠8d出现死亡并死亡3只，9d死亡2只，死亡率达100%；rSH7-Js1306NA感染组小鼠5d出现死亡并死亡2只，6d死亡2只，7d死亡1只，死亡率达100%。图3.7SPFBALB/c小鼠感染后死亡曲线注：图3.7a和图3.7b分别为5株H5Nx亚型AIV和SH7毒株感染小鼠后死亡率。3.7.3SPFBALB/c小鼠感染后脏器病毒量检测结果图3.8a、图3.8b和图3.8c分别为5株H5Nx亚型AIVs在小鼠体内肺脏、脑和鼻甲骨中的的病毒滴度结果，结果表明：5个重组病毒，在小鼠肺脏中有较高病毒滴度，lgEID50/mL值在4.5-7.5之间；在小鼠脑中病毒滴度差异显著，lgEID50/mL值在0-6.5之间。rSH7-674NA病毒组3个脑样品中有2脑样品病毒滴度是0，另1个脑样品病毒滴度低，lgEID50/mL值为2.25；rSH7-LZFNA病毒组3个脑样品中有2脑样品病毒滴度低，lgEID50/mL值为2.5和3.5，另1个脑样品病毒滴度是0；在小鼠鼻甲骨中病毒滴度差异显著，lgEID50/mL值在0-6.75之间。但rSH7-674NA病毒组3个鼻甲骨样品中有2病毒滴度是0，另1个鼻甲骨样品病毒滴度lgEID50/mL值为2.25；rSH7-LZFNA病毒组3个鼻甲骨样品中有低病毒滴度，lgEID50/mL在2.5-2.75之间；图3.8d为SH7毒株在小鼠体内肺脏、脑的病毒滴度结果，结果表明SH7毒株在小鼠肺脏中有较高滴度，lgEID50/mL值在5.5-7.5之间，在小鼠脑中有检测到病毒，32 lgEID50/mL值在2.5-3.0范围内。图3.8SPFBALB/c小鼠感染后各脏器病毒量检测结果注：图3.8a、图3.8b和图3.8c分别为5株H5Nx亚型AIVs在小鼠体内肺脏、脑和鼻甲骨中的复制水平，图3.8d为SH7毒株在小鼠体内肺脏、脑的复制水平。3.7.45株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定结果见图3.9，试验结果表明rSH7、rSH7-Js1306NA、rSH7-673NA对小鼠成高致病性，均能在低剂量将小鼠致死，其MLD50值分别是2.5、2.5、2.68lgEID50；rSH7-674NA对小鼠成中等致病性，在较中等剂量将小鼠致死，其MLD50值为3.16lgEID50；rSH7-LZFNA对小鼠成低致病性，在最高剂量将小鼠致死，其MLD50值为3.3lgEID50。33 图3.95株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定结果4讨论4.15株H5Nx亚型AIVs在体外试验讨论4.1.15株H5Nx亚型AIVs蚀斑大小测定讨论Daniel等证明，同一分离病毒不同蚀斑克隆具有不同的毒力、生物学特性和免疫原性。由于不同毒力的AIV在蚀斑形成能力上有着明显的差异，所以通过蚀斑纯化可以将混杂在一起的不同AIV毒株区分开来，有利于对疫病的诊断和病原的研究（Danieletal.,1968）。在蚀斑克隆实验中，病毒在MDCK细胞上的繁殖特性存在明显差异，短茎H5N6重组病毒rSH7-674NA比长茎H5N6重组病毒rSH7-673NA表现出更强的繁殖能力，感染破坏的细胞更多，在MDCK细胞上形成肉眼可见的蚀斑更大。MDCK作为一种哺乳动物细胞，在病毒的HA识别并吸附其表面受体时需更长时间。病毒NA活性的强弱影响病毒的感染。NA茎长的病毒对唾液酸的降解能力较强，当子代病毒吸附到新的宿主细胞时，NA很快降解宿主细胞上的唾液酸受体，使病毒的扩大感染受阻。短茎NA活性相对适中，只能暂时分解破坏子代病毒粒子和原宿主细胞之间的唾液酸受体，来不及分解新的宿主细胞上的唾液酸受体，当子代病毒粒子感染和破坏周围新的宿主细胞等时就不会影响。所以短茎重组病毒在MDCK细胞上的蚀斑直径比长茎病毒大。病毒在MDCK细胞内繁殖时，重组短茎病毒释放子代病毒的时间明显早于长茎病毒，释放出的子代病毒粒子数量也较多。34 4.1.25株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性讨论NA头部具有抗原结合位点和神经氨酸酶活性区，茎部位于头部和跨膜锚定区之间，茎部缺失不会影响NA抗原性和神经氨酸酶活性。5株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定结果中，当病毒浓度相同，均为稀释log27时，rSH7-674NA毒株RFU的均值为7716.5，rSH7-673NA毒株RFU的均值为3295，显示长茎部的H5N6亚rSH7-673NA毒株NA酶活性低于短茎部的H5N6亚型rSH7-674NA毒株。rSH7-673NA、rSH7-674NA毒株NA酶活性低于rSH7毒株，rSH7-LZFNA毒株、rSH7-Js1306NA毒株神NA酶活性均高于rSH7毒株。因此，根据测定病毒的NA酶活性，发现NA酶活性从高到低依次是N8、N2、N1、（短茎）N6和（长茎）N6亚型的NA蛋白。4.1.35株H5Nx亚型AIVs的豚鼠红细胞解凝讨论在豚鼠红细胞解凝试验中，病毒表面糖蛋白HA与红细胞表面的唾液酸糖蛋白受体结合，形成红细胞-病毒-红细胞复合体，引起红细胞凝集，经37℃孵育，NA分解破坏了红细胞表面唾液酸糖蛋白受体，病毒粒子又可迅速由红细胞表面释放下来从而引起红细胞沉积，因此红细胞解脱能力是衡量NA酶活性的指标之一（Baigentetal.,2001）。本研究证实NA茎部多11个氨基酸的重组H5N6流感病毒rSH7-673NA红细胞解凝能力明显强于茎部少11个氨基酸的重组病毒rSH7-674NA。NA头部具有抗原结合位点和神经氨酸酶活性位点，茎部位于头部和跨膜锚定区之间，茎部缺失不会影响NA抗原性和神经氨酸酶活性，只是缩短了茎部长度。可能是由于茎部较长的病毒其头部酶活性位点更容易接触到底物，所以能在较短的时间内完成解凝过程（Bloketal.,1982）。NA茎部长短可能与H5N6亚型AIV的细胞适应性密切相关，也有可能与病毒的宿主适应性有关。当前H5N6亚型AIV夸宿主感染人类，表现出对人类细胞的适应性，可能与NA茎部氨基酸缺失有关（冯肖肖等，2012）。重组H5N8流感病毒rSH7-Js1306NA红细胞解凝能力明显强于重组H5N1流感病毒rSH7，但是N8的茎部并没有缺失，因此除了NA茎部缺失这条途径，N8替代N1也可能是未来H5N1进化另一条优势途径。重组H5N2流感病rSH7-LZFNA与重组H5N1流感病毒rSH7相比，红细胞解凝能力差异不显著。这说明，N2替代N1作为未来H5N1进化途径优势不明显。4.1.45株H5Nx亚型AIVs在CEF、DF1和MDCK生长曲线测定讨论5株H5Nx亚型AIVs在MDCK细胞上的病毒滴度存在明显差异。短茎H5N6亚型rSH7-674NA毒株在MDCK的复制水平高于长茎H5N6亚型rSH7-673NA毒株，且存在显著性差异，这可能意味着短茎H5N6亚型rSH7-674NA毒株对哺乳动物细胞的35 感染能力要强于长茎H5N6亚型rSH7-673NA毒株；而在禽源细胞CEF上，在病毒感染后复制的12h和24h，rSH7-674NA滴度均高于rSH7-673NA，且存在显著性差异，但是在36h和48h，差异不显著（P>0.05），这可能意味着短茎H5N6亚型rSH7-674NA毒株对禽类宿主的早期感染能力强于长茎H5N6亚型rSH7-673NA毒株。H5N2亚型rSH7-LZFNA毒株，无论是在哺乳动物细胞MDCK上，还是在禽源细胞DF1、CEF上，复制能力均表现最低，这可能意味着N2基因片段替换H5N1的N1基因重组为H5N2禽流感病毒复制能力并不强，在禽类及哺乳类宿主中的传播能力存在局限性。H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株，与rSH7毒株相比，在DF1、CEF上两株病毒滴度差异小，而rSH7-Js1306NA感染细胞的脱落和裂解情况比rSH7的轻微，且较晚出现病变出现时间要迟，所以至48h，rSH7-Js1306NA复制滴度高于rSH7；值得一提的是，rSH7-Js1306NA在MDCK细胞上的增殖曲线极具特点，在复制早期（12h和24h），复制水平比较低，随着时间推移，复制滴度显著提高，H5N8亚型重组病毒rSH7-Js1306NA，无论是在哺乳动物细胞MDCK上，还是在禽源细胞DF1、CEF上，复制能力均表现比较强，这可能意味着N8基因片段替换H5N1的N1基因重组为H5N8禽流感病毒在复制能力上有显著优势，在禽类及哺乳类宿主存在潜在的传播能力，H5N8的生物学意义研究值得引起注意。4.25株H5Nx亚型AIVs在体内试验讨论4.2.15株H5Nx亚型AIVs在SPF鸡体内试验讨论本研究选取的5株H5Nx亚型AIVs感染SPF鸡后，H5N1亚型rSH7毒株、H5N2亚型rSH7-LZFNA毒株、H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株和H5N6亚型rSH7-673NA、rSH7-674NA毒株感染组均出现100%死亡，且死亡迅速，没有观察到明显临床症状，说明本研究所选取的5个病毒对SPF鸡均具有较强的致病性。前期研究证实，NA不同程度的缺失，对病毒的致病力有不同影响，NA茎部的缺失与AIV对小鼠的致病性有关，但对鸡的致病力无影响（Munieretal.,2010；Matrosovichetal.,1999）。在传播能力上长茎的H5N6亚型rSH7-673NA毒株表现较强的传播能力，从死亡时间角度来看，危害程度没有达到H5N1亚型rSH7毒株，表现为同居组SPF鸡死亡时间往后推迟，但是H5N6亚型AIV危害程度接近H5N1亚型AIV，所以对H5N6亚型AIV的防控仍然不能松懈。H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株对鸡的致病力上表现比较强，从感染组的数据来看，感染后2dSPF鸡全部死亡，致病力强度甚至高于H5N1亚型rSH7毒株，但是从传36 播能力来看，同居组SPF鸡死亡的时间甚至早于H5N1亚型rSH7毒株，4d开始出现死亡，到6d后不在出现新的SPF鸡死亡，H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株对鸡的致死性比较强，并且出现传播感染时间也比较早，可能由于H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株对SPF鸡还没有达到H5N1亚型rSH7毒株更强的适应能力，所以其传播能力并没有H5N1亚型毒株强，但是从H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株对SPF鸡的致死性和传播的时间来看，H5N8亚型AIV对家禽存在极大的潜在风险。H5N2亚型rSH7-LZFNA毒株，与上面H5N1、H5N6、H5N8亚型AIVs相比，在对SPF鸡的致病力和接触传播能力上，都表现最弱，H5N2亚型rSH7-LZFNA毒株感染SPF鸡后，4d全部死亡，对同居组SPF鸡，5d开始出现死亡，7d后SPF鸡不再死亡，并且同居组死亡率最低（57%），试验结果表明，H5N2亚型AIVs致病力相对较弱，并且传播能力比较局限，无法快速引起大范围的传播；这可能与N2亚型NA有关，因为这5株病毒，只有NA基因片段不同。上述试验结果表明，H5N1亚型AIVs对SPF鸡在致病力和接触传播能力上仍然表现较强，H5N6、H5N8亚型AIVs对SPF鸡的致病力和接触传播能力表现为接近H5N1亚型AIVs，因此，除了H5N1亚型AIVs外，未来禽流感防控的重点是不断出现H5N6、H5N8亚型AIVs，另一角度表明H5N1亚型AIVs的进化可以在NA基因片段上表现出型的不同，这或许是H5N1亚型AIVs的另一条进化途径。上述试验结果表明，N2亚型的NA基因片段替换H5N1亚型AIV，获得的病毒没有强的适应性。H5N2亚型AIVs对家禽危害风险低，本研究发现茎部缺失的长度不同，与AIV对鸡的致病性差异有关，短茎的H5N6亚型毒株对鸡的致病性弱于长茎的H5N6亚型毒株。5株H5Nx亚型AIVs对SPF鸡5致病性试验证实，不同NA的H5亚型AIV接触传播能力差异显著，10EID50剂量攻毒，各组同居动物死亡率分别为rSH7（100%）、rSH7-673NA（100%）、rSH7-674NA（85.7%）、rSH7-Js1306NA（71%）和rSH7-LZFNA（57%），发现NA基因片段对病毒在SPF鸡中接触传播能力的贡献从高到低依次是N1、N6、N8和N2亚型的NA。4.2.25株H5Nx亚型AIVs在SPFBALB/c小鼠体内试验讨论5株H5Nx亚型AIVs感染SPFBALB/c小鼠，发现5组小鼠在攻毒后体重曲线均出现先升高后降低的变化趋势，体重曲线结果显示，除rSH7-LZFNA毒株在感染小鼠后5d才出现体重下降趋势，在9d小鼠全部死亡，其他的H5Nx亚型AIVs和SH7毒株在感染小鼠后2-3d就开始出现体重下降趋势，在7-8d小鼠全部死亡。期间观察37 到小鼠出现身体消瘦、精神不振、神经等症状，各组死亡率达100%，攻毒后4d感染组小鼠，肺、脑、鼻甲骨3个脏器滴度测定结果表明，5个病毒在小鼠肺脏中均有较高滴度，5个病毒在小鼠脑中病毒滴度差异较大。但rSH7-674NA病毒组中有2只在小鼠脑中并没有检测到病毒；rSH7-LZFNA病毒组有2只在小鼠脑中检测到较低病毒滴度，另1只小鼠脑中没有检测到病毒；5个病毒在小鼠鼻甲骨中病毒滴度差异较大。5株H5Nx亚型AIVsSPFBALB/c小鼠MLD50的测定试验中，H5N1亚型rSH7毒株、H5N8亚型rSH7-Js1306NA毒株和H5N6亚型rSH7-673NA毒株对小鼠呈高致病性，低剂量（2.5-2.68lgEID50）可以引起小鼠死亡；H5N6亚型rSH7-674NA毒株对小鼠呈等致病性，中等剂量（3.16lgEID50）可以引起小鼠亡；H5N2亚型rSH7-LZFNA毒株对小鼠致病性最弱，高剂量（3.3lgEID50）才能引起小鼠死亡。38 全文总结1不同NA的H5亚型禽流感病毒对小鼠的致病性差异显著，发现NA片段对病毒在BALB/c小鼠中致病力的贡献从高到低依次是N1、N8、N6和N2亚型的NA片段。2本研究探索NA影响H5亚型AIV生物学特性的分子机制，5株H5Nx亚型AIVs在MDCK中病毒滴度由高到低依次是N8、短茎N6、N1、长茎N6和N2，与测定的小鼠MLD50基本吻合，说明NA可能通过增强病毒在哺乳动物细胞中复制能力从而增强对哺乳动物模型小鼠的致病力。3对SPF鸡致病性试验证实不同NA的H5亚型AIV接触传播能力差异显著，发现NA片段对病毒在SPF鸡中接触传播能力的贡献从高到低依次是N1、N6、N8和N2亚型的NA片段。39 致谢在本论文完成之际，首先向我的导师廖明教授致以崇高的敬意和衷心的感谢，感谢廖老师多年来在学业上对我的辛勤培养和教诲，在工作上和生活上对我的关心和帮助。感谢我的指导老师亓文宝教授在论文的立题、构思、技术路线、实验操作、论文撰写等各方面给予的精心指导。感谢华南农业大学兽医学院传染病研究室的焦培荣副研究员、张桂红教授、樊惠英教授、任涛教授、罗开健副教授、曹伟胜副教授、徐成刚高级实验师、贾伟新高级实验师老师和瞿孝云师姐以及禽病研究室技术人员谢淑敏、郭彩银、林丽芳、陈南猛在三年学习过程中给予的帮助。感谢本课题组的肖陈诚和李桦楠师兄，余远迪和黄丽红师姐在实验中的帮助和指点。感谢我们实验小组曾昭勇、孙娜、温毅骏、李倩、郑译、刘墅楷、胡平生、林一村、李波、邢金超、朱旭辉、张又月、梁佳琪等不能够一一列举的师弟和师妹陪伴和帮助。感谢叶昱、宋亚芬、崔进、曹振鹏、代曼曼、周琪、宋慧、李奇对我学习及生活上的帮助。本研究在华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室、广东普通高校人兽共患预防与控制重点实验室和家禽疫病防控与产品安全协同创新中心完成，并得到RLR信号通路在禽流感病毒逃逸水禽天然免疫反应中的作用机制，国家自然科学基金项目（U1501212）；国家肉鸡产业技术体系疾病控制研究室岗位科学家，国家肉鸡产业技术体系项目（CARS-42-G09）；农业科研杰出人才及其创新团队-重大动物疫病防控，现代农业人才支撑计划项目(农财发（2012）160号)；2014年广东省特支计划杰出人才E15237；广东省“三高”农业专项资金粤财农（2015）141号；珠三角地区家禽-野禽界面禽流感监测与流行病学调查(5500-C15065)，畜禽重要疫病流行病学调查（2012FY111000），H7N9流感联合攻关（粤农函【2014】1046号）；防治H7N9亚型禽流感科技攻关（20140224）等项目资助，特此表示感谢。40 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附录A1996-2015年我国H5Nx毒株各地区分布情况图11996-2015年我国H5Nx毒株在各地区所占比例分布图我国H5Nx毒株在各地区的分布情况见图1，饼状图用红、紫、绿、黑四个颜色表示H5N1、H5N2、H5N6、H5N8四个亚型AIV所占的比例。H5N1亚型AIV分布比较广泛，在各地区的比例高；其次是H5N6亚型AIV，在四川、广东、云南、湖北、吉林、江西、浙江、江苏、中国东部等都有分布；H5N8亚型AIV在江苏、浙江、广东、山东、上海、中国东部都有分布；H5N2亚型AIV在河北、浙江、山东、江西、西藏中国东部等都有分布。45 图21996-2015年我国H5Nx毒株时间分布图注：图2横坐标采用年份的简称表示，96即1996，97即1997，99即1999，00即2000，01即2001，02即2002，03即2003，04即2004，05即2005，06即2006，07即2007，08即2008，09即2009，10即2010，11即2011，12即2012，13即2013，14即2014，15即2015，数据来源于GenBank数据库。H5Nx毒株在时间分布情况见图2，H5N1亚型AIV，1996年开始出现，2005年达到高峰，长期持续存在；其他H5Nx亚型AIV在2013年之前呈零散分布，2000年开始出现H5N2亚型AIV，2010年开始出现H5N8亚型AIV，在2013-2015年，H5Nx型AIVs呈集中出现。46 附录B发表文章Xiao,C.,Ma,W.,Sun,N.,Huang,L.,Li,Y.,Zeng,Z.,Wen,Y.,Zhang,Z.,Li,H.,Li,Q.,Yu,Y.,Zheng,Y.,Liu,S.,Hu,P.,Zhang,X.,Ning,Z.,Qi,W.,&Liao,M.2016.PB2-588VpromotesthemammalianadaptationofH10N8,H7N9andH9N2avianinfluenzaviruses.ScientificReports,6:19474(IF=5.58)(第六作者)47