猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定

《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

单位代码１０４７６学号１５０４２８３０６９１分类号Ｑ８１—硕士学位论文（专业学位）猪繁殖与呼吸综合征病毒ＧＰ４蛋白原核表达与鉴定专业学位领域：生物工程专业学位类别：工程硕士申请人：王亚平导教师：王选年教授二〇一八年五月 独创性声明工作及取得的本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写的研宄成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书一所使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。Ｈ肀（作者签名：曰期：讀今关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名：Ｚ１ＤＬ今导师签名曰期： PROKARYOTICEXPRESSIONANDIDENTIFICATIONOFPRRSVGP4PROTEINADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringByWangYapingSupervisor:Prof.WangXuannianMay,2018 摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的病毒性传染病。1995年，我国第一次暴发PRRS在北京郊区，2006年，由PRRS经典毒株突变株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highpathogenicporcinereproductiveandrespiratorydisease，HP-PRRS)迅速蔓延全国。主要临床表现为育肥猪和仔猪感染后的呼吸道症状，妊娠母猪感染后出现流产、早产、死胎和流产后发情不规则等，严重危害生猪养殖业的发展。本实验通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV）的GP4基因进行原核表达，构建SUMO原核表达系统，诱导表达获得可溶性GP4蛋白。根据GenBank中PRRSVGP4基因设计特异性引物，酶切位点为BamHI、XhoI，片段大小约为537bp，从HN07-1株的细胞毒中提取病毒总RNA，反转录cDNA，将目的基因连接、转化至克隆载体pMD19-T，构建重组质粒pMD19-T-GP4。将测序正确的GP4基因和表达载体pET-28a-SUMO连接，构建重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4。把pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体转化到BL21(DE3)宿主菌中，在25℃0.6mmol/L的IPTG条件下，诱导6h，超声波破碎处理样品，对重组蛋白SUMO-GP4进行可溶性分析，经SDS-PAGE电泳检测分析，结果显示，重组蛋白SUMO-GP4以可溶性的形式表达，大小约为33kDa。利用Ni-NTA柱纯化重组蛋白SUMO-GP4，纯化后目的蛋白经SDS-PAGE电泳、Western-blot检测分析，在33kDa处有目的条带出现，且该重组蛋白能与猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清发生特异性反应。用SUMO蛋白酶水解纯化后的重组蛋白，去掉SUMO蛋白酶标签，获得目的蛋白GP4，通过Ni-NTA柱对目的蛋白GP4进行纯化，经SDS-PAGE电泳、WesternBlot检测分析，得到一条大小约为19kDa的目的条带，与预期结果相一致，该目的蛋白具有较好的特异性，为PRRSV的检测和预防奠定了一定的基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，GP4基因，原核表达I ABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndromeisaviralinfectiousdiseasecausedbytheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.ThefirstoutbreakofPRRSinourcountryoccurredinthesuburbsofBeijingin1995.In2006,thehighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromecausedbythemutantstrainsofPRRSwhichwasrapidlyspreadthroughoutthecountry.Themainclinicalmanifestationsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromearerespiratorysymptomsafterfinishingpigsandpigletsinfection,miscarriage,prematurebirth,stillbirth,andirregularestrusafterabortionaftergestationsowinfection,whichseriouslyharmstothedevelopmentofthepigbreedingindustry.Inthisexperiment,theprokaryoticexpressionoftheGP4geneofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruswasestablishedtoestablishanindirectELISAforthedetectionofPRRSVantibodies.ThetotalRNAwasextractedfromthecytotoxicityofstrainHN07-1，andthecDNAwasextractedbyreversetranscription.SpecificprimersweredesignedbasedonthegenefragmentofPRRSVGP4inGenBank，thattheenzymecuttingsitewasBamHI,XhoI,andthefragmentsizewasabout537bp.TheGP4genewasligatedandtransformedintothecloningvectorpMD-19-TtoconstructtherecombinantplasmidpMD-19-T-GP4.ThecorrectlysequencedGP4genewasligatedwiththeexpressionvectorpET-28a-SUMOtoconstructtherecombinantexpressionvectorpET-28a-SUMO-GP4.TherecombinantexpressionvectorofpET-28a-SUMO-GP4wastransformedintothehostbacteriaofBL21(DE3).ThesamplesweresonicatedandanalyzedforsolubleproteinSUMO-GP4,inwhich25℃and0.6mmol/LIPTGconditions，inductionof6h.AfterSDS-PAGEelectrophoresisanalysis,therecombinantproteinSUMO-GP4wasexpressedinasolubleformwithasizeof33kDa.Inaccordancewiththeoptimalcultureconditions,alargenumberofinducedexpressionoftherecombinantproteinSUMO-GP4wasperformed.TherecombinantproteinSUMO-GP4waspurifiedbyNi-NTAcolumn,purifiedexpressionproductsbySDS-PAGEelectrophoresisandWestern-blotanalysis,whichappearedatargetbandat33kDa.Anditwasabletobeinfectedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndrome.Theviruspositiveserumisrecognizedandhasgoodimmuneactivity.ThepurifiedrecombinantproteinwashydrolyzedwithSUMOproteasetoobtainthetargetproteinGP4.ThetargetproteinwaspurifiedbyNi-NTAcolumnandanalyzedbySDS-PAGEandIII Western-blottoobtainatargetbandwithasizeofabout19kDa，whichwasconsistentwiththeexpectedresultsandpurifiedthetargetproteinsuccessfully.Thetargetproteinhasacertainspecificity,whichlaysafoundationfortheestablishmentofindirectELISAdetectionmethod.KEYWORDS:PRRSV,GP4Gene,ProkaryoticExpressionIV 缩略词表英文缩写英文全称中文名称APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵AMPAmpicillin氨苄青霉素AmpTMAmpicilin氨苄青霉素aaAminoacid氨基酸bpBasepair碱基对DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ddH2ODoubledistilledwater双蒸水dDay天Dulbecco'smodificationofEagle'smediumDMEM基础培养基DulbeccoEBEthidiumbromide溴化乙锭EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒hHour小时HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HighpathogenicporcinereproductiveandHP-PRRS高致病性猪繁殖与呼吸综合征respiratorydiseaseIPTGIsopropylβ-D-1-Thiogala异丙基硫代-β-D-半乳糖ctopyranosidegGram克kDaKilodalton千道尔顿KanaTMKana卡纳抗生素LDVLactatedehydro-genase-elevatingvirus乳酸脱氢酶增高症病毒mLMilliliter毫升Marc-145MonkeyAfricangreencell非洲绿猴肾细胞MLVModifiedlivevirus修饰活病毒ntNucleotide核苷酸nmnanometer纳米V ODOpticaldensity吸光度ORFOpenreadingframe开放阅读框架PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PorcinereproductiveandrespiratoryPRRS猪繁殖与呼吸综合征syndromePorcinereproductiveandrespiratoryPRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusPVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphateBufferedSalineaddTween-20磷酸盐洗涤缓冲液r/minRevolutionsperminute转数/每分种rpmRevolutionsperminute每分钟转数SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SUMOsmallubiquitin-relatedmodifier3-氨基-9-乙基咔唑SDS-PAGESDS-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SHFVSimianhemorrhagicfevervirus猴出血热病毒TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TMB3,3’,5,5’-tetramethybenzidine3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TBSTrisbufferedsalineTris缓冲盐溶液TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷µLMicroliter微升WPDVWobblypossumdiseasevirus不稳定负鼠病毒VI 目录摘要...........................................................................................................................................IABSTRACT..............................................................................................................................III缩略词表....................................................................................................................................V目录.......................................................................................................................................VII第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展...............................................................................11.1流行病学..........................................................................................................................11.2PRRSV病原学特征.........................................................................................................21.2.1PRRSV的致病机制...................................................................................................21.2.2PRRSV编码的非结构蛋白.......................................................................................21.2.3PRRSV的结构蛋白...................................................................................................51.3PRRSV诊断检测技术的研究进展.................................................................................61.3.1病原学检测................................................................................................................61.3.2RT-PCR检测..............................................................................................................61.3.3酶联免疫吸附测定试验（ELISA）........................................................................61.3.4动物试验....................................................................................................................71.4PRRSV疫苗研究进展.....................................................................................................71.4.1常规疫苗....................................................................................................................71.4.2.重组亚单位疫苗.......................................................................................................81.4.3DNA疫苗...................................................................................................................81.4.4活载体重组疫苗........................................................................................................91.4.5基因缺失疫苗............................................................................................................91.4.6合成肽疫苗..............................................................................................................101.5选题的目的和意义........................................................................................................10第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化................................................112.1材料................................................................................................................................112.1.1主要仪器设备..........................................................................................................11VII 2.1.2主要试剂..................................................................................................................122.1.3菌株、质粒与血清..................................................................................................122.1.4主要溶液的配制......................................................................................................132.1.5引物设计..................................................................................................................152.2PRRSVGP4表达载体的构建.......................................................................................152.2.1细胞培养与病毒分离..............................................................................................152.2.2PRRSVGP4目的基因的扩增.................................................................................162.2.3PRRSVGP4重组克隆载体的构建.........................................................................192.2.4PRRSVGP4原核表达载体的构建.........................................................................212.3PRRSVGP4的诱导表达与纯化...................................................................................222.3.1pET-28a-SUMO-GP4的诱导表达...........................................................................222.3.2重组蛋白SUMO-GP4的SDS-PAGE分析...........................................................232.3.3重组蛋白SUMO-GP4的WesternBlot鉴定.........................................................242.3.4重组蛋白SUMO-GP4的可溶性分析.....................................................................252.3.5重组蛋白SUMO-GP4诱导条件的优化................................................................252.3.6可溶性重组蛋白的制备与纯化..............................................................................262.3.7目的蛋白GP4的纯化.............................................................................................272.4结果与分析....................................................................................................................282.4.1PRRSVGP4PCR结果............................................................................................282.4.2pMD19-T-GP4重组载体的构建.............................................................................282.4.3pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体的构建...........................................................302.4.4重组蛋白SUMO-GP4的SDS-PAGE初步鉴定...................................................312.4.5重组蛋白SUMO-GP4可溶性分析........................................................................312.4.6重组蛋白SUMO-GP4温度优化............................................................................322.4.7重组蛋白SUMO-GP4时间优化............................................................................332.4.8重组蛋白SUMO-GP4IPTG浓度优化..................................................................342.4.9重组蛋白SUMO-GP4纯化结果............................................................................352.4.10重组蛋白SUMO-GP4的WesternBlot鉴定.......................................................362.4.11目的蛋白GP4的SDS-PAGE分析......................................................................36VIII 2.4.12目的蛋白GP4纯化SDS-PAGE结果..................................................................372.4.13目的蛋白GP4的WesternBlot鉴定...................................................................382.5讨论................................................................................................................................382.5.1表达载体的选择......................................................................................................382.5.2原核表达载体的构建..............................................................................................382.5.3目的蛋白的诱导表达..............................................................................................392.5.4蛋白的检测..............................................................................................................402.5.5蛋白的纯化..............................................................................................................402.6小结................................................................................................................................41第三章结论.............................................................................................................................43参考文献...................................................................................................................................45致谢.........................................................................................................................................53攻读学位期间发表的学术论文目录.......................................................................................55独创性声明.......................................................................................................................57关于论文使用授权的说明.......................................................................................................57IX 第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展1.1流行病学PRRSV由荷兰学者Wensvoort等首次分离并鉴定[1]，国际病毒分类委员会第六分类报告将其列为尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviviridae）、动脉炎病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，此属成员的主要特征是具有巨噬细胞内复制的能力，并诱发自然宿主持续感染[2]。同一科属的病毒除PRRSV以外还有乳酸脱氢酶增高症病毒（Lactatedehydro-genase-elevatingvirus，LDV）、马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV）、猴出血热病毒（Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV）和新发现的不稳定负鼠病毒（wobblypossumdiseasevirus,WPDV）[3]。根据不同毒株之间的序列同源性，国际上将PRRSV分为两种基因型，即以LV株为代表的欧洲型(I型)和以VR-2332株为代表的美洲型(Ⅱ型)，我国目前流行的毒株以美洲型VR-2332株为主[4]。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在我国已经流行了30多年[5]，2006年，由PRRS经典毒株突变株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highpathogenicporcinereproductiveandrespiratorydisease，HP-PRRS)，迅速蔓延全国，其代表株有JXA1/HuN4和TJM等[6]，给我国的生猪养殖业以沉重打击。WangHM等通过分析重组NADC30样PRRSV（SC-d）的遗传特征，并检测其与非重组NADC30样PRRSV（SD-A19）和高致病性PRRSV（HuN4）相比的致病性，发现重组NADC30样PRRSVSC-d株显示出比非重组NADC30样PRRSVSD-A19株更高的致病性[7]。GuoZ等证明现在的PRRSV-1和PRRSV-2都在不断地循环着，大约80％以上的猪场中PRRSV血清都是阳性的；以PRRSV-2为例，经过临床研究发现了4种血统，分别为1、3、5、8；BJ-4与VR2332和RespPRRSMLV分别具有99.6％和99.8％的同一性[8]。PRRS具有感染的时间较长、发病率较高、传播速度较快的特点，一旦发病，将很快地传播给其它猪群。NeiraV等从2013年10月到2015年4月这段期间，通过应用贝叶斯系统和智利政府监测的数据，来分析本地有关PRRSV起源、传播问题，表明与2009年之前在该国流行的毒株不同[9]。2013年到2014年之间，在福建省有猪呼吸困难和生本研究获得2016年国家重点研发计划（2016YFD0500702）基金资助1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定殖障碍的仔猪和母猪中分离出了两种I型PRRSV毒株，分别命名为FJEU13和FJQEU14[10]。1.2PRRSV病原学特征1.2.1PRRSV的致病机制PRRSV主要致病机理是在巨噬细胞中增殖和侵染单核细胞[11]。LiL等利用猪CD163（pCD163）作为感染细胞受体，构建PRRSV易感小鼠肺泡巨噬细胞衍生的MH-S和腹膜巨噬细胞样RAW264.7细胞系，结果表明：PRRSV敏感的MH-SCD163细胞系能够使各种基因型PRRSV分离株的病毒复制，并显示出与在PAM中观察到的相似的细胞因子表达模式[12]。WangR等通过激活蛋白激酶C-delta（PKCδ）发现PRRSV能够诱导HMGB1的分泌，以及PRRSVE蛋白和pORF5a蛋白激活PKCδ和HMGB1的分泌，这些结果表明PRRSV激活PKCδ以通过E和pORF5a诱导HMGB1分泌来完成，这一发现为相关的PRRSV感染的炎症反应和发病机理提供了见解[13]。PröllMJ等研究揭示了品种特异性差异表达的免疫基因以及参与免疫相关途径的时间依赖性共表达基因组，确定了关键因子和通路，这有助于解释PRRSV感染后肺树突状细胞的生物学功能，也为调查猪的免疫特性、增强猪的健康提供了参考方向[14]。1.2.2PRRSV编码的非结构蛋白PRRSV的NSP1包括NSP1α和NSP1β，NSP1α在N-末端有一个C8-C10-C25-C28构成的锌指结构域。在此基础上，DuJ等研究发现NSP1α能够与SLA-1的两条链相互作用[15]。PRRSVNSP1β是一种多功能病毒蛋白，参与抑制宿主先天免疫反应，激活独特的-2/-1程序性核糖体移码（PRF）信号，HanM等研究证明了PRRSVNSP1β为核蛋白，在宿主蛋白质合成过程中，NSP1β在宿主mRNA的复制和突变中发挥作用。但是，NSP1β调控的天然靶细胞中基因表达过程机理还不十分清楚[16]。最新研究结果表明，NSP1β与I型IFN诱导有关的线粒体抗病毒信号（MAVS）蛋白和外膜复合物70（TOM70）的转位酶被下调，而蛋白磷酸酶1A（PPM1A）与抑制NF-κB途径激活有关，在NSP1β过度表达的PAM3D4/21细胞中上调[17]。PRRSVNSP2蛋白是目前变异最大的非结构蛋白，LiY等在PRRSV中鉴定出独特的-2/-1核糖体移码机制，能产生两种截短形式的变体，nsp2TF和nsp2N[18]。PRRSVNSP22 第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展蛋白是一个多功能的复制酶，对致病性具有应变依赖性[19]。PRRSVNSP2易发生缺失和突变，它的中间区域高度变异[20]，；在HP-PRRSV基因组中发现，NSP2的缺失区域包含B细胞表位（aa536-560）和潜在的T细胞表位[21]。另外，NSP2基因区域的高度变异和缺失可能是病毒逃避宿主免疫监督的一种机制，突变体也可能用于区分感染动物和接种疫苗的动物[22]。SpearA等利用NSP2中两个单独小框Δ23和Δ87内的缺失，产生针对PRRSV修饰活病毒疫苗的重组病毒，并且用相同的缺失来替代外来的标签（Δ23-V5，Δ23-FLAG，Δ23-S，Δ87-V5，Δ87-FLAG，Δ87-S）[23]，因此，NSP2有望成为PRRSV基因工程标记疫苗的主要候选者。PRRSV毒株之间的重组已被认为是PRRSV进化的重要分子机制之一，BianT等发现了两个位于NSP2编码区的nt1737和nt3506中的重组断点，它们与NADC30和NADC30样CHsx1401具有较高的核苷酸同源性[24]。PRRSVNSP2蛋白能刺激猪机体产生免疫反应，具有强烈的免疫原性，该蛋白在病毒复制和宿主免疫调节中发挥着关键的作用[25]。SongT等鉴定出PRRSVNSP1α、NSP1β和核衣壳蛋白都与NSP2直接相互作用[26]。目前，有关PRRSVNSP3蛋白的结构和功能不太清晰。WangX等在PRRSV感染的MARC-145细胞和具有限制因子IFITM1或Tetherin表达质粒的转染细胞中，把Tetherin部分地从细胞表面去除，结果显示，PRRSV的NSP3在PRRSV感染后，诱导IFITM1的蛋白酶体依赖性降解[27]。PRRSVNSP4蛋白是3C-样丝氨酸蛋白酶（3C-likeserineproteinase，3CLSP），含有B细胞表位，在PRRSV生命周期中起到关键的作用，但在临床样品中却检测不到针对NSP4的特异性抗体[28]。QiP等发现，Nsp4的结构域III与猪β2-微球蛋白基因（B2M）启动子的增强子元件，二者之间的相互作用在抑制B2M转录中发挥着不可替换的作用[29]，同时，在NSP4残基155处的氨基酸，通过改变其亚细胞分布来促进其在体外对IFN-β转录的抑制作用[30]。关于NSP5蛋白的功能尚不清楚。YangL等通过研究PRRSV感染对STAT3信号传导的影响，发现NSP5的C末端结构域是STAT3降解所需的，结果表明PRRSV的NSP5蛋白负责加速STAT3的降解[31]。NSP7蛋白是PRRSV中最为保守的非结构蛋白之一，在诱导宿主体液免疫反应中起重要作用，可作为PRRSV血清学基因分型检测的理想抗原。BrownE等试验表明，非结构蛋白中NSP7抗体可能是一个更好的标靶，因此，应用NSP7ELISA方法来检测猪3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定抗血清成为了一个新型的、高灵敏的鉴定猪是否感染的方法[32]。NSP7具有很强的免疫原性，当PRRSV被猪体感染14天以后，猪的体内就产生了针对NSP7的高水平的抗体[33]。JankováJ等编码NSP7蛋白的基因在大肠杆菌细胞中表达并通过IMAC纯化，并应用间接ELISA试验在一组猪血清上评估纯化蛋白质的血清反应性，证明了非结构蛋白具备作为接种灭活疫苗的猪后感染后和接种后抗体分化的抗原的潜力[34]。WangH等试验证明PRRSVNSP7的高亲和力肽具有模拟NSP7抗体作为病毒检测的诊断试剂的潜力，且该试验中选择的肽可以作为抑制PRRSV的潜在有效抗病毒候选物[35]。WangH等通过制备三种针对NSP7蛋白的单克隆抗体，并用它们通过噬菌体展示技术筛选PRRSVNSP7蛋白的表位分布特征，结果显示，在氨基酸153-162II型PRRSVNSP7β亚基上鉴定出了线性表位NAWGDEDRLN。这种新定义的表位显示出与PRSSV阳性血清样品的良好反应性，该结果为我们进一步解析了NSP7蛋白的抗原结构，并为PRRSV血清学试验提供了有效的试剂，因此，PRRSVNSP7被认为是开发血清学诊断测定的合适试剂[36]。NSP9蛋白主要作用是启动RNA的合成，是PRRSV的合理抗病毒靶标[37]。XuL等试验表明，NSP9的残基586和592在确定中国HP-PRRSV对仔猪的致命毒力方面的天然作用方面起着至关重要的作用[38]；ZhaoK等研究结果表明，NSP9中第519和544位的氨基酸参与HP-PRRSV的复制效率并有助于增强致病性[39]。NSP10在病毒复制中起着至关重要的作用，具有解旋酶活性，是PRRSV最保守的蛋白之一，因此构成PRRSV诊断的良好候选者。ZhangZ等试验结果表明，该研究产生的针对NSP10的单克隆抗体（mAb）4D9可能有助于建立区分PRRSVI型和PRRSVII型感染的诊断方法[40]。PRRSVNSP11含有内切核糖核酸酶的活性，该酶活性证明了在基因转染和过表达的情况下，对p65和IRF3的MAVS和RIG-1的底物特异性，这可能是NSP11抑制I型干扰素产生的机制[41]。研究表明，PRRSVNSP11在Marc-145细胞中促进PRRSV感染，靶向NSP11的siRNA可能是未来控制PRRSV的潜在治疗策略[42]。PRRSVNSP12蛋白具有较大的变异性，它仅存在于动脉炎病毒和冠状病毒中[43]。BiC等制备了针对HP-PRRSVHuN4菌株抗猪NSP12单克隆抗体1E5，1E5可用于建立一种有价值的工具，以区分感染与2型PRRSV的HP-PRRSV分离株与2型PRRSV和1型PRRSV的经典分离株的感染[44]。4 第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展1.2.3PRRSV的结构蛋白PRRSVGP2蛋白有两种基因型，它们都包含2个推导的N糖基化位点、2个明显的疏水峰[45]。已知在II型PRRSV毒株的猪肺泡巨噬细胞中分离出了一株GD1404菌株，该菌株GP2蛋白的C-末端具有氨基酸缺失[46]。WangC等在深入了解转录调节序列中发现，GP2、GP5、M和N基因使增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达高度增强，而不改变PRRSV的复制[47]。PRRSVGP4是由ORF4所编码的，是一个相对保守的高糖基化的结构蛋白[48]。现已证实不同亲本病毒的GP4或M基因的DNA改组，可扩大嵌合病毒对异源PRRSV毒株的交叉中和抗体诱导能力[49]。Kimpston-BurkgrenK等研究结果表明，II型PRRSV的GP2、GP3和GP4蛋白能够诱导保护性免疫[50]。LeeDU等对10个覆盖ORF4的ORF4的代表性序列，以及韩国基因1型PRRSV的每个单个ORF都进行了分子分析，发现在系统发育分析中，与GenBank中可用的基因型1PRRSV毒株相比，韩国毒株序列与奥地利和德国毒株形成了一个独特的群集；在氨基酸分析中，GP4的推定抗原性区域高度可变，非同义和同义替换分析表明，与其他的ORF相比对，ORF4推测具有更高的免疫原性压力。由此可知，韩国的基因型1PRRSV在韩国已经多样化和本土化，并且这些菌株可能具有多种免疫学和遗传学性质，同时该研究为在地理偏远地区的基因1型PRRSV提供了新的见解，并有助于进一步研究朝鲜半岛1型PRRSV进化的信息[51]。RobinsonSR等以PRRSV感染模型包括GP2，GP3和GP4在内的轻微包膜糖蛋白（GP）复合体为研究对象，用中和抗体对被纯化的免疫球蛋白进行被动施用，诱导广泛中和抗体的免疫学方法可以充分增强针对PRRSV的免疫保护，进一步证实了，天然存在的病毒分离株能够诱导针对无关PRRSV攻击的保护性体液免疫，因此消除了疫苗开发的主要概念障碍[52]。PRRSVGP5蛋白具有能诱导产生中和抗体的抗原决定簇[53]。GP5a蛋白是最近被鉴定为PRRSV中的新型结构蛋白，该蛋白在第II型PRRSV中的第29和30位具有高度保守的两个半胱氨酸[54]。PRRSVGP5含有亲水区域、2-4个糖基化位点以及由31个氨基酸构成的信号肽，且与受体识别相关的初级中和表位存在于N-端胞外区，在PRRSV引起猪机体免疫中发挥着重要的作用[55]。相关的研究表明，PRRSV在猪的体内或者Marc-145细胞内的中和作用，与GP5中氨基酸残基102和104的中和抗体作用与对抗HP-PRRSV密切相关[56]。因此，PRRSVGP5蛋白有望作为分析PRRSV基因多样性主要5 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定的氨基酸位点，且在免疫学的研究方面具有极大的意义，是主要的亚单位疫苗的候选蛋白之一[57]。M蛋白由ORF6编码，具有较强的免疫原性[58]。有研究证明，M蛋白对感染猪10d后就能产生可检测到的抗体应答，具备一定程度的良好免疫原性[59]。N蛋白具备抗原结构域和一定强度的免疫原性[60]。PRRSV毒株I型、II型的N蛋白含有不同的线性表位，一个位于N蛋白的第50-66个氨基酸位点[61]，另一个位于N蛋白的第25-30个氨基酸位点[62]。因此，N蛋白常用于检测PRRSV的特异性抗体。1.3PRRSV诊断检测技术的研究进展1.3.1病原学检测一般情况下，对于病毒的分离检测，病料组织中肺脏、扁桃体、脾脏等病毒含量较高[63]，最常见的就是在非洲绿猴肾细胞（Marc-145等）、猪肺泡巨噬细胞（PAMS）中进行细胞的分离[64]。虽然病原分离试验消耗的时间比较长、操作比较复杂，不适合大规模的快速检测，但它的特异性强，一旦分离到PRRS病原，将会在接下来对PRRSV的深入研究提供材料。因此，该方法是PRRSV检测中最为真实、确切的一种方法。1.3.2RT-PCR检测反转录聚合酶链式核酸扩增技术（RT-PCR）是以病毒RNA为模板反转录成cDNA，再以cDNA为模板大量扩增核酸片段来检测PRRSV的一种方法[65]。有报道指出，RT-PCR检测技术的方法具有高度的特异性和敏感性，能从基因水平对血清型进行区分鉴定[66]。蔡家利等通过GenBank中PRRSV基因，来设计合成一对酶切位点，利用RT-PCR检测方法，扩增目的片段，证明了所设计的引物在RT-PCR中应用是可行的[67]。因此，它是目前检测PRRSV最常用的一种方法。1.3.3酶联免疫吸附测定试验（ELISA）酶联免疫吸附测定试验（ELISA）是利用抗原与抗体特异性结合并辅以化学发光或荧光技术将病原或抗体可视化的一种技术，是目前发展最快、应用最广的免疫学方法，可用于对PRRSV感染猪血清抗体和抗原的检测与分析[68]。该方法具有操作简单，诊断迅速、灵敏度高等优点，已成为规模化养猪场猪繁殖与呼吸综合征监测最常用的方法。间接ELISA是目前检测PRRSV抗体最常用的方法，由于灵敏度高，技术比较成熟，6 第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展操作快捷等优点，在我国基层和实验室得到全面推广。WangXX等以改性活疫苗菌株TJM-F92的NSP2区中连续缺失120个氨基酸得到的重组蛋白GST-d120aa为包被抗原，初步建立间接ELISA检测方法d120-ELISA，用于区分感染了野生型PRRSV菌株的猪与接种疫苗的猪的准确ELISA方法是否有助于监测PRRSV疫苗接种的顺应性[69]。阻断ELISA也是利用抗体与抗原之间特异性结合建立的一种检测PRRSV的方法，但是与间接ELISA不同的是，阻断ELISA的酶标抗体是针对包埋蛋白的单克隆抗体，只能与包埋蛋白发生特异性结合[70]。如果血清中含有猪繁殖与呼吸综合征抗体，那么PRRSV抗体将先于酶标抗体与包被蛋白结合，继而减少酶标二抗与包被蛋白的结合，血清中PRRSV抗体的含量将会与显色结果呈负相关，已经被多数国家当作诊断标准用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测[71]。CaoS等开发了一种NSP4包被的iELISA，并将其有效性与N蛋白包被的iELISA相比较。结果发现，NSP4包被的和N包覆的iELISAs之间的协定是92.2％，同时对于50份血清样本的选取，大部分来自用HP-PRRSV活疫苗株接种的猪，对于涂有NSP4的iELISA的PRRSV抗体测试呈阳性，但对于涂覆有N涂层的iELISA为阴性，表明开发的NSP4包被的iELISA是区分假阴性的有用工具，对HP-PRRSV疫苗能产生真正的阴性反应[72]。1.3.4动物试验动物试验是将分离到的PRRSV接种到健康的动物身上，观察健康动物是否表现出该病的明显特征，并以此来确诊PRRS疫情[73]。由于猪是PRRSV唯一的易感动物，所以将其作为试验动物来诊断PRRS是最可靠的方法。将病料组织研磨液接种健康的兔子，一周后注射PRRS兔化弱毒苗，如果病料含有PRRSV，则兔体能产生抗体中和弱毒疫苗，兔体温度不发生变化，反之兔体将发生定型热[74]。因此，动物试验诊断结果准确可靠，但耗时长，成本高，不利于快速检测。1.4PRRSV疫苗研究进展1.4.1常规疫苗PRRS灭活疫苗具有安全性好、免疫效果较好、便于贮存等优点，但不适用于仔猪免疫[75]。改良的减毒活疫苗免疫后具有抗体产生快、免疫周期长和保护猪群免受变异毒株攻击等优点，因此被广泛用于控制PRRS。但由于中国流行的野毒株与疫苗株之间的7 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定遗传多样性尚未完全阐明，导致该疫苗不能提供针对PRRSV的完全保护，如修饰活病毒（Modifiedlivevirus，MLV）的脱落，毒力逆转，野毒株与MLV重组以及不能诱导针对异源病毒的保护性免疫[76]。1.4.2重组亚单位疫苗重组亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗，是一类将通过受体菌或细胞高效表达得到的病原微生物保护性抗原蛋白与佐剂联合制成的疫苗。HuJZ等试验证明转基因玉米植物是有效的亚单位疫苗生产和用于产生针对PRRSV的系统和粘膜免疫应答的口服递送系统[77]。AnC.H等在GP4D和GP5D免疫猪中，免疫猪IFN-γ+产生细胞数量较高，调节性T细胞的数量较少[78]。为了提高PRRSV亚单位疫苗的功效，PengJ等比较了四种天然佐剂的免疫增强作用，从免疫反应和针对PRRSV的免疫保护的角度观察，黄芪/芽孢杆菌佐剂显示出对PRRSVGP5亚基的免疫增强作用最为有效，因此，黄芪/芽孢杆菌佐剂有希望作为预防和控制PRRS的候选免疫佐剂[79]。PengJ等从泰山的马尾松花粉多糖（TPPPS）、弗氏佐剂中进行研究，证明了中等剂量的TPPPS作为GP5佐剂有望成为PRRSV亚单位疫苗有效预防和控制PRRSV的候选物[80]。从长远来看，PRRSV亚单位疫苗在PRRS的防控上拥有广阔的应用前景，但免疫力持续时间是有限的，需要与佐剂配合才可以使用[81]。因此，效果良好的佐剂将会为猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗的研发提供助力。1.4.3DNA疫苗DNA疫苗是指将含有病原微生物特定抗原的真核表达载体直接导入动物内，刺激机体产生特异性免疫应答的一类基因疫苗。Kwang等试验证明了该DNA疫苗具有诱导产生体液免疫、细胞免疫的作用[82]。SirisereewanC等研究发现，DNA疫苗可通过DNA-MLV(ModifiedLive-virusVaccine，MLV)初免-加强免疫获得改善的免疫应答，该研究强调了使用异源初免-加强免疫接种方案，DNA与其他疫苗候选物一起用于改善抗PRRSV免疫性，其可能最终导致诱导完整的PRRSV保护[83]。“自杀性”DNA疫苗（SuicidalDNAvaccine）是一种新型出现的DNA疫苗。JiangY等通过构建GP5m和PRRSVM蛋白共表达“自杀性”DNA疫苗pSFV-ORF5m/ORF6，诱导pSFV-ORF5m/ORF6引发特异性免疫应答，该试验也为研发PRRS新型DNA疫苗提供了新的思路和途径[84]。与传统的疫苗相比，DNA疫苗的免疫原性和安全性更高，是很有发展潜力的一类8 第一章猪繁殖与呼吸综合征的研究进展疫苗，具有潜在的应用前景。1.4.4活载体重组疫苗活载体重组疫苗是用基因工程技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原基因重组到能表达外源性病毒蛋白的活载体中制得的一种疫苗，该疫苗直接免疫动物后可引起机体产生特异性的免疫反应。Alonso等试验中检测到了很高的GP5特异性抗体[85]。TianD等以PRRSVDS722株作为活病毒载体，通过试验证明了，DS722-SIV-PCV2有作为候选三价疫苗的潜力，也揭示了PRRSV作为潜在的活病毒疫苗载体的可能性[86]。近年来，活病毒载体在PRRS疫苗研究领域展现出巨大的潜力，虽然研究者至今还不清楚病毒的自然发生及变异机制，对活病毒载体疫苗株是否会与野生毒株或弱毒疫苗株异常信息交换演变为强毒突变株存在疑虑，但相信随着生物技术的发展，活病毒载体疫苗有希望能成为PRRS疫苗领域的焦点。1.4.5基因缺失疫苗基因缺失疫苗是指在基因工程技术的基础上，切除一些与强毒株的毒力有一定关联的基因，然后再去进行构建的一种缺失性的疫苗。XUYZ等构建了来源于高致病性PRRSVHuN4的减毒疫苗病毒HuN4-F112的nsp2区域中的75个核苷酸（25个氨基酸）缺失的感染性cDNA克隆（rHuN4-F112-Δ508-532），然后将编码新城疫病毒核蛋白的免疫显性B细胞表位（49个氨基酸）的基因片段插入缺失位点，试验结果表明，重组PRRSVrHuN4-F112-Δ508-532可作为PRRS的潜在标记疫苗[87]。HuP等试验结果表明，表达GP5/M基于JEVDNA的复制子可进一步发展成为一种新的、安全的PRRS候选疫苗[88]。ZhouL等对2012-2016年收集的61种PRRS病毒Nsp2高变区（Nsp2HV）和ORF5进行了测序分析，结果显示，在PRRSV中除了典型的30aa不连续缺失之外还检测到Nsp2HV中的五个缺失，因此这一个研究为PRRS基因缺失疫苗以后的发展开通了新的方向[89]。基因缺失疫苗通过定点缺失或突变毒力相关基因后使强毒变为弱毒，使疫苗保持比较完整的免疫原性，对于毒力的恢复在动物的体内不容易产生，而且还可以提供野毒感染和疫苗免疫的鉴别方法。9 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定1.4.6合成肽疫苗肽疫苗是利用重组DNA技术根据病毒基因组序列推导出的病毒蛋白质氨基酸序列人工合成的一类疫苗，通常与佐剂偶联制得。MokhtarH等通过利用跨越整个蛋白质组的合成肽文库和通过反复实验感染对PRRSV-1Olot/91产生免疫的小群猪，更好地表征了T细胞对基因型1（欧洲）PRRSV的应答，但蛋白质组全域肽文库筛选方法的使用以及所鉴定的抗原，需要在下一代疫苗开发的背景下进一步评估[90]。EvansAB等证明苍术酮醇类似物是有希望的抗病毒候选物，其可以增强当前的PRRSV控制策略[91]。MokhtarH等已鉴定M和NSP5蛋白为多功能CD8和CD4T细胞的保守靶标，试验结果表明，来自CD8T细胞的M/NSP5特异性IFN-γ有显著的应答，因此，将来的工作应集中于增强M/NSP5与CD8T细胞的交叉呈递[92]。合成肽疫苗作为一种新型疫苗，虽然起步较晚，由人工合成制得，单一的线性抗原表位对猪的保护能力不太理想[93]。但安全性和稳定性好，生产工艺低廉，能够根据疫情流行情况快速开发出有效的针对性疫苗，因此具有极高的开发前景。1.5选题的目的和意义PRRS具备易传播、流行快、危害大等特点，已经成为目前我国危害生猪养殖业的主要疫病之一，因此建立一个快速、特异性强的检测方法至关重要。PRRSVGP4蛋白是PRPS病毒粒子中相对保守的一个高糖基化的结构蛋白，能够诱导机体产生保护性免疫应答，但PRRSVGP4的抗原性表征和PRRSV进化中该蛋白中突变的作用尚不清楚[94]。WangX等通过使用猪PRRSV阳性血清反应来分析HP-PRRSVGP4的抗原表征，发现GP4上DIKTNTTAASDFVVL多肽与抗体具有强烈的反应强度，达到6401.5，确定了从S29到G56的活性反应区（AR）[95]。本实验通过设计PRRSVGP4基因的引物，扩增GP4目的基因，构建原核表达质粒并转化至BL21(DE3)宿主菌，IPTG诱导表达获得PRRSV重组蛋白SUMO-GP4，在SUMO蛋白酶的作用下，酶切得到目的蛋白GP4，获得具有特异性的蛋白，为PRRSV的检测与预防奠定了一定的基础。10 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化本研究根据Genbank中PRRSVATCCVR2332株的GP4基因序列，进行GP4基因片段扩增。把目的片段克隆至pMD19-T-simple克隆载体中，得到重组克隆载体pMD19-T-GP4。再与表达载体pET-28a-SUMO连接，得到pET-28a-SUMO-GP4重组表达质粒，转化至宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达。经SDS-PAGE凝胶电泳分析样品，结果得到在33KDa处出现与理论值的条大小一致的目的条带，经WesternBlot进一步鉴定，表达重组蛋白能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应，成功获得了SUMO-GP4重组蛋白。重组蛋白SUMO-GP4经SUMO蛋白酶酶切，通过Ni-NTA柱纯化目的蛋白，最终经SDS-PAGE、WesternBlot鉴定获得了能够与PRRSV阳性抗体发生特异性反应的GP4蛋白。2.1材料2.1.1主要仪器设备表2-1主要实验仪器Table2-1Mainexperimentalapparatuse仪器型号购买厂家洁净工作台JB-CJ-1500FX苏州佳宝净化设备公司全自动高压灭菌锅HVA-85HIRAYAMA公司低温恒温槽DC-2006宁波天恒仪器厂超纯水仪XYB2-30-HThermoSCIENTIFICPCR仪FTC51H2D英国TECHNE公司凝胶成像系统721BR03598BIO-RAD公司制冰机SIM-F140AY65SANYO公司脱色摇床TS-1000海门市其林贝尔仪器公司电热恒温培养箱DHP-91b2太仓精宏仪器设备公司核酸电泳仪JY-600君意东方电泳设备公司自动双重纯水蒸馏器52-93型上海亚荣生化仪器厂半干转膜仪221BRBIO-RAD公司水浴锅HH-W600金坛市科技仪器公司低温离心机Legendmach1.6RThermo公司电子天平(0.01g)BP211DSartorius公司11 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定2.1.2主要试剂表2-2主要试剂Table2-2Mainreagents试剂公司预染低分子量蛋白MarkerSolarbio公司HRP标记兔抗猪IgGSolarbio公司Tween-20国药集团化学试剂有限公司丙烯酰胺Sigma公司过硫酸铵（AP）Sigma公司Tris碱GIBCO公司十二烷基硫酸钠（SDS）GIBCO公司PVDF膜Sigma公司溴酚蓝Sigma公司TEMEDSigma公司DAB酶底物试剂盒北京中杉金桥生物公司IPTG粉末Solarbio公司Millipore超滤浓缩管密理博中国有限公司SUMO蛋白酶Solarbio公司PrimeSTARMaxTaKaRa公司10*A-TailingBufferTaKaRa公司dNTPMixtureTaKaRa公司A-TailingEnzymeTaKaRa公司SoulutionITaKaRa公司2.1.3菌株、质粒与血清Marc-145细胞：新乡学院生命科学技术学院生物技术研究中心保存，DH5α工程菌：来源于北京索莱宝生物有限公司购买，BL21（DE3）宿主菌：来源于北京索莱宝生物有限公司购买，原核表达载体pET-28a-SUMO：新乡学院生命科学技术学院生物技术研究中心保存，猪繁殖与呼吸综合征病毒：新乡学院生命科学技术学院生物技术研究中心保存，猪繁殖与呼吸综合征的阳性血清：新乡学院生命科学技术学院生物技术研究中心保存。12 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化2.1.4主要溶液的配制（1）10%FBSDMEM培养液把解冻好的10%的胎牛血清加向DMEM基础培养基中即可，由于购买的DMEM基础培养基中含有双抗，故此不需要再添加，最后把混合均匀的培养液存放于4℃的冰箱备用。（2）1.2%琼脂糖凝胶的配制提前清洗好胶槽和梳子，取25mL的1×TAEBuffer，加入0.3g的琼脂糖，搅拌混匀即可。（3）LB液体培养基称取YeastExtract0.50g、Nacl1.0g和Tryptone1g，先用55mL的去离子水进行充分的搅拌溶解，121℃进行高压灭菌，放置于4℃冰箱保存备用。（4）Tris-HCl溶液(1.0M，pH为6.8)称取Tris碱11.98g，先用110mL的三蒸水进行充分的溶解，再使用提前配制好的稀HCl溶液来调节pH为6.8。最后加入适量的三蒸水进行定容至200mL，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于4℃冰箱备用。（5）Tris-HCl溶液(1.5M，pH为8.8)称取Tris碱18.13g，先用65mL的三蒸水进行充分的溶解，再使用提前配制好的稀HCl溶液来调节pH为8.8。最后再加进去适量的三蒸水进行定容至100mL，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于4℃冰箱备用。（6）30%的丙烯酰胺称取N,N-甲叉双丙烯酰胺4.1g和115.8g的丙烯酰胺，先加进去适量的超纯水进行充分摇晃混匀，然后再开始定容到400mL。最后，用滤纸进行过滤除杂，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于4℃冰箱备用。（7）10%SDS称取SDS30g，先加入160mL的三蒸水充分摇晃混匀，然后再开始向里面加进去灭菌过的纯水直到300mL，最后，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于室温即可。如若有沉淀或者浑浊的现象出现，在37℃水浴锅中加热使用。（8）10×Tris甘氨酸电泳缓冲液称取Glycine34.46g、SDS2.46g和7.22g的Tris碱，添加进去适量的的三蒸水充分13 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定摇晃混匀，然后再定容到600mL，最后贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于室温，试验试验之前稀释成1×电泳缓冲液即可。（9）10%的过硫酸铵溶液称取0.7g的过硫酸铵，加入少量的去离子水，借助玻璃棒进行搅拌溶解，最后再加入适当的去离子水定容到7.0毫升，摇晃混匀。最后，分装成小管，每管都贴上标签纸，同时标注好配制的时间和溶液的名称，存放于-20℃冰箱备用。该试剂的使用时间不宜过长，一般少量的配置，控制在10天内即可。（10）染色液分别准确的量取240mL的甲醇和冰醋酸60mL，再称取一定精确量的0.6g的考马斯亮蓝，充分地进行摇晃，使得能够溶解在70mL的三蒸水里，过滤除杂后，装到棕色瓶中，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，室温存放即可。（11）脱色液把水、甲醇、冰乙酸按照6:3:1的比例进行混合，分别准确的量取600mL的三蒸水、300mL的甲醇和100mL的冰乙酸，摇晃混匀。最后，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于室温即可。（12）封闭液称取脱脂奶粉2.0g，先加入15mL的PBST溶液进行充分摇晃混匀，然后再定容到40mL。贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于4℃冰箱备用。（13）电转缓冲液称取4.33g的甘氨酸和0.9g的Tris碱，先用150mL的三蒸水进行充分的溶解，再加入30mL的甲醇溶液进行混匀，最后再加入适量的三蒸水进行定容至300mL，最后，贴上标注有配制时间和溶液名称的标签纸，存放于4℃备用。（14）10×平衡缓冲液分别称取NaH2PO4·2H2O3.90g、NaCl8.77g和0.68g的咪唑，充分搅拌溶解，加入适当的三蒸水定容至500mL，然后使用NaOH溶液调节pH至8.0，再用0.22μm的滤膜进行过滤除菌。最后，贴上标注好配制时间和溶液名称的标签纸，存放于室温备用。（15）Washbuffer/250×咪唑/500×咪唑方法与10×平衡缓冲液相同。14 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化2.1.5引物设计引物的设计根据GenBank中PRRSVATCCVR2332株的基因序列，设计一对包含ORF4全基因的上、下游特异性引物，分别在上游加入了BamHI的酶切位点、下游加入了XhoI的酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成。GP4F:GCGGGATCCGCTGCGCCCTTTCTTTTCCTCGP4R:CCGCTCGAGTCAAATTGCCAGTAGGATGGC2.2PRRSVGP4表达载体的构建2.2.1细胞培养与病毒分离（1）Marc-145细胞的复苏：提前35min打开超净工作台的紫外，准备一个灭菌且干燥的50mL的烧杯，水浴锅提前预热至37℃，培养基和PBS缓冲液提前15min从4℃冰箱拿出。先在液氮罐中找到Marc-145细胞，迅速把取出来的细胞放到提前预热好的37℃的烧杯中，不断摇动，尽量保证1min之内管内的液体能迅速融化；然后，进行离心7min以1300r/min的转速；再然后，把10%的FBSDMEM培养基加1mL到离心管内进行吹打混匀，转移到提前准备的细胞瓶中，再补加7mL培养基，盖好瓶盖，放入37℃温度下，含5％CO2的培养箱进行养育过夜。（2）Marc-145细胞的传代培养：首先，在显微镜下观察细胞的生长状态，看是否铺满了瓶底，细胞是否是单层且分布均匀的；然后，用6mL的PBS缓冲液进行缓慢地冲洗2次；再次，加入4mL的PBS和200μL终浓度为0.25％的胰酶至细胞瓶中，稍微拧一下瓶盖，将其放入含有5％CO2的培养箱中进行消化，大约需要70s；接下来，迅速的准备好下一步实验用的离心管、移液管和10%的FBSDMEM培养基，把PBS收起来放到4℃冰箱；70s之后查看细胞的消化状态，显微镜下观察到有轻微的脱落迹象就可以了；再然后，向细胞瓶中添加4mL的10%FBSDMEM培养基，用移液器吹打约35次，然后往离心管中转移，进行离心7min以1100r/min的转速进行；最后，根据实验的需要进行分装，标记，继续进行细胞的培养。（3）Marc-145细胞的冻存：冻存的前一天要观察Marc-145细胞的生长状况，选择生长状态良好的细胞进行冻15 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定存。冻存之前先配制冷冻保存溶液，把DMSO、DMEM和胎牛血清按照1：4：5的比例来配制，充分混匀，避光条件下放在室温待用。1100r/min离心7min，收集细胞，丢弃掉上清液，加入适量的冻存溶液，保证细胞的浓度1-5×106cells/mL即可，混合均匀，以每管1mL的量分装于已标记好的冻存管中。最后，先存放4℃冰箱保存35min，转移到-20℃存放3.5h，再移放到-80℃过夜，第二天取出放到液氮进行保存备用。（4）Marc-145细胞的接毒和收集把生长状态良好的Marc-145细胞，胰酶消化后，放入到6孔板中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养，待细胞状态长成单层细胞时开始进行接毒。首先，把之前6孔板中的培养液倒掉，用4mL的PBS清洗，轻轻摇晃几下倒掉。然后，接种550μLPRRSV病毒，放入37℃、5%CO2培养箱中进行培养1.5h，取出倒掉病毒液，再加入适量的无FBSDMEM培养基缓慢清洗3次，每次添加5mL的基础DMEM培养基。最后，加入6mL含2%胎牛血清的DMEM培养基，拧好瓶盖，稍微松一点，放入37℃、含有5%CO2浓度的培养箱中进行继续培养48h-72h。61h后，显微镜下观察细胞发生病变现象，这个时候，开始收集细胞和病毒的混合液，不断重复冻融5次，每次间隔约40分钟，然后以12000r/min的转速进行离心9min，收集到的上清即是猪繁殖与呼吸综合征病毒，然后将收集到的病毒液分装，放于-80℃超低温冰箱保存备用。2.2.2PRRSVGP4目的基因的扩增（1）病毒总RNA的提取提前35分钟打开56℃的水浴锅，第36min开始，把0.2mL的病毒原液与20μL的ProteinaseK、1.0μL的CarrierRNA和0.2mL的BufferVGB进行充分的混合均匀，然后依次性地按照说明书的操作要求，分别地加入BufferRWA、BufferRWB、RNasefreedH2O，然后在室温的环境中静静地放置7min；离心2分钟，在12,000rpm的转速下来洗脱RNA；再把洗脱下的液体再重复离心一次，最终离心管底端中得到的液体就是所得到的RNA，用测量核酸浓度的仪器对所提取的RNA进行浓度的测定，最后快速地放到-80℃的冰箱中保存起来备用，又或者即可进行反转录。（2）反转录合成cDNA首先，在Microtube中取下列反应体系进行混匀：16 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化成分（composition）体积（volume）模板RNA6.0μLOligodTPrimer(50.0μM)1.0μLdNTPMixture(10.0mMeach)1.0μLRNaseFreedH2O2.0μL总体积10.0μL然后，在Microtube管中把上述的混合液与相对应的反应液进行缓慢混匀，在42℃的锅中进行加热大约47min，然后再在95℃的水浴锅中加热6min，反应体系如下：成分（composition）体积（volume）上述混合液10.0μL5×PrimeScriptIIBuffer4.0μLRNaseInhibitor(40U/μL)0.5μLPrimeScriptIIRTase(200U/μL)1.0μLRNaseFreedH2O4.5μL总体积20.0μL最后，把混合液从95℃的水浴锅里拿出来，然后非常快速的把它放到有冰的盒子里面进行即可冷却，这样就得到了所需要的cDNA，开始进行下一步实验。（3）PRRSVGP4全长基因片段的PCR扩增利用设计好的GP4的引物，把上一步实验中准备好的cDNA作为本次PCR的模板，对GP4这个目的基因的片段进行PCR扩增，每管的体系为25.0μL，共做5管，待PCR的各个反应体系都完全地被混合以后，使用小型的离心机进行瞬间的离心，进行PCR反应：95℃条件下进行预变性4min，然后开始在94℃的温度下进行变性，时间为60s，退火的温度为57℃，作用时间为31s，进行延伸53s的时间在72℃的温度下，然后设定31个反应的循环，最后在72℃下使得终延伸13min结束。GP4基因PCR反应的体系见表2-3。17 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定表2-3PRRSVGP4基因片段PCR扩增反应体系Table2-3PCRamplificationreactionsystemofPRRSVGP4totalregion成分（composition）体积（volume）PrimeSTARMax12.5μLGP4F（20μmol/L）0.5μLGP4R（20μmol/L）0.5μLcDNA1.0μLddH2O10.5μL总体积25.0μL（4）PRRSVGP4基因片段PCR产物的回收与纯化根据OMEGA公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，对PRRSVGP4全长基因片段的PCR产物进行胶回收纯化。具体操作如下：首先，取100µL的PCR样品，加入1×核酸缓冲液，利用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳；待电泳结束后，用刀片把含有目的DNA片段的条带切下来；接着把切下的胶块切碎，用天平称取重量，根据说明原理来确定胶块的体积，设定胶条的密度为1g/mL，那么它的体积能够按下列方法得出：若胶条的质量是400mg，则体积就为400μL，因此，把结合缓冲液/BindingBuffer(XP2)按照对等的体积加入到含有胶条的EP管内，把混合物在53℃的水浴锅中加热约9分钟直到凝胶完全熔化，需要不断的摇晃离心管数次，每次间隔约80s；然后，添加700μL的混合液到离心柱/DNAMiniColumn中，再将其装入标配的2mL收集管/CollectionTube中，室温环境下13,000r/pm的转速进行离心2分钟，重复几次，直到把所有混合液体都离心完；接着，把300μL的BindingBuffer(XP2)加入到吸附柱内，室温环境下以13,000rpm的转速进行离心1分钟；添加700μL已用无水乙醇稀释过的SPW清洗液/SPWWashBuffer冲洗离心柱，室温环境下13,000rpm的转速进行离心1分钟，弃掉废液，然后再重复一次该操作；置回离心管，在室温环境下，以13,000rpm的转速进行空转离心3分钟；再把吸附柱转移到另外一个新的管中，添加20μL的去离子水在制备膜的中央处，室温静置1min，在13,000rpm的转速下离心1分钟即可，重复一次加入等量的去离子水，最终洗脱得到的即是DNA。（5）加A反应按照TaKaRa公司DNAA-TailingKit试剂盒的说明，把各反应体系混匀之后，放入72℃水浴锅中反应20分钟，然后在冰盒中静置95s，之后存放4℃冰箱保存或即刻做载18 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化体的连接，反应的体系见表2-4。表2-4PRRSVGP4基因片段的加A反应体系Table2-4PlusAreactionsystemofPRRSVGP4genefragment成分（composition）体积（volume）10*A-TailingBuffer5.0μLdNTPMixture4.0μLA-TailingEnzyme0.5μL胶回收的基因片段25.0μLddH2O15.5μL总体积50.0μL2.2.3PRRSVGP4重组克隆载体的构建（1）PRRSVGP4基因与pMD19-T-simple克隆载体的连接分别把克隆载体pMD19-T-simple与经加A反应以后的胶回收所纯化的目的片段做连接，然后把各类成分的体系轻轻地混匀，接着进行瞬间离心几秒钟即可，放到16.0℃的水槽里面，进行连接14h即可，其连接体系见表2-5。表2-5GP4全长基因片段与pMD19-T-simple克隆载体连接体系Table2-5ConectionsystemofGP4fragmentwithpMD19-T-simpleclonevector成分（composition）体积（volume）pMD19-T-simple载体0.5µLGP4全长基因片段回收产物4.5µLSoulutionI5.0µL总体积10.0µL（2）pMD19-T-GP4连接产物的转化把DH5α感受态细胞放置在冰盒上进行溶解，取样品10µL（按照1:10的比例进行稀释）与DH5α进行混合，缓慢地吹打混匀；放入4℃冰箱，在冰盒里放置35min；然后在42℃的水浴锅中进行热冲击90s；90秒以后立即取出，再冰浴1min-2min，不可震荡剧烈，同时加入适当新鲜的LB液体培养基至1L；接下来进行复壮，把样品放入温度为37℃的摇床中进行培养1小时，设定转速为185r/min；复壮培养结束以后，以4500r/min的转速离心8min；最后进行涂平板，弃去850uL的菌液，把剩余的150µL菌液进行吹19 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定打混匀，最后把混匀的150µL菌液均匀的在含有Kan抗性的平板进行涂平板，繁育大约10h在37℃的温度下进行，10小时以后拿出观察结果。（3）重组质粒pMD19-T-GP4菌液PCR鉴定从上一步转化好的平板上选择单一的个体菌落，37℃摇床中过夜培养，然后进行菌液PCR的鉴定，操作的要求参照PCR仪上面的程序，反应的条件见表2-6。表2-6重组质粒pMD19-T-GP4菌液的PCR鉴定Table2-6IdentificationoftherecombinantcloneplasmidpMD19-T-GP4byPCR成分（composition）体积（volume）PrimeSTARMax12.5μLGP4F（20μmol/L）0.5μLGP4R（20μmol/L）0.5μL菌液模板1.0μLddH2O10.5μL总体积25.0μL（4）重组质粒pMD19-T-GP4的双酶切鉴定把培养好的菌液每次适量的加到反应管里面，按照11,000rpm的转速离心1min，重复操作到最后所有菌液都被离心；每一次都要扔弃掉多余的培养基，只留下沉淀即可，接着，添加已具备RnaseA的SolutionI溶液0.25mL向菌体的沉淀中加入，使劲儿摇晃保证沉淀能完全的溶解；然后再添加0.25mL的SolutionII溶液，缓慢地上、下转圈5-9次，直到菌液变得非常的清澈，在屋子里静放3min-5min，但是总时间不能超过6min；然后接着按照提取质粒的要求，依照顺序加SolutionIII溶液0.35mL、0.5mL的HBCBuffer溶液，0.7mL的DNAWashBufferr溶液，切记需要重复的加入一次等量的DNAWashBufferr溶液；弃去滤液，把柱子放到37℃的恒温培养箱中，大约2分钟左右，以保证酒精能够充分挥发，然后在14,000rpm转速的条件下，进行离心空柱子，大约2min左右；最后，把柱子放到一个新的EP管上，加40µL的去离子水在柱子的正中央（其中灭菌的三蒸水要提前在65℃的水浴锅中预热20min），在常温的屋子里静放3分钟，接着再依照转速为14,000rpm的条件下，进行瞬间离心1分钟，此时管中收到的液体就是我们所需要的目的质粒DNA，标志好存放到－40℃的冰箱作为备用，取少量部分进行双酶切测定。依照双酶切反应条件的要求，把所需要用的各类试剂，按照适当的剂量顺次加入到已被高压灭菌的1.5ml的EP管中，将添加好的各种液体进行瞬间的离心，目20 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化的是使得他们混合的更加匀称，在37℃的水槽中进行反应3.5h，见表2-7。表2-7重组质粒pMD19-T-GP4的BamHI、XhoI双酶切反应的体系Table2-7ReactionsystemofBamHI、XhoIdigestionofpMD19-T-GP4clonevector成分（composition）体积（volume）10×KBuffer1.0µLBamHI0.5µLXhoI0.5µL重组质粒pMD19-T-GP47.0µLddH2O1.0µL总体积10.0µL把已经通过菌液PCR和双酶切都测定合格的重组阳性质粒送到上的海英骏生物工程公司进行鉴定测序。2.2.4PRRSVGP4原核表达载体的构建把原核表达载体pET-28a-SUMO菌种与LB液体培养基，按照1:1000的比例进行混合，并加进去对应量的卡那霉素，在185r/min的摇床中，37℃的温度条件进行摇动菌繁养。根据质粒试剂盒的要求，抽提质粒pET-28a-SUMO，然后把重组质粒pMD19-T-GP4与表达载体pET-28a-SUMO进行双酶切，把每一个成分都摇动混匀，37℃的水槽中进行双酶切作用4.5h，反应的体系见表2-8。表2-8GP4目的基因与原核表达载体pET-28a-SUMO的双酶切体系Table2-8ReactionsystemofBamHI、XhoIdigestionofGP4regionandpET-28a-SUMOexpressionvector成分（composition）体积（volume）10×KBuffer3.0µLBamHI1.5µLXhoI1.5µLGP4/pET-28a-SUMO15.0µLddH2O9.0µL总体积30.0µL接下来，分别把重组质粒pMD-19-T-GP4、表达载体pET-28a-SUMO的各自的双酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳中，进行回收纯化目的基因，具体的操作步骤参照胶回21 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定收试剂盒的要求进行操作。然后把双酶切回收的目的片段和表达载体pET-28a-SUMO进行连接，连接体系中加入以下的成分，见表2-9，把每一个成分都摇动混匀，16℃水槽中进行反应连接10h。连接产物转化以后，分别对重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4进行菌液PCR、双酶切鉴定。表2-9GP4基因片段与pET-28a-SUMO表达载体连接体系Table2-9ConnectionsystemofGP4genefragmentwithpET-28a-SUMOexpressvector成分（composition）体积（volume）T4LigationBuffer1.0µLT4DNA连接酶1.0µLpET-28a-SUMO酶切回收产物2.0µLGP4基因片段酶切回收产物6.0µL总体积10.0µL2.3PRRSVGP4的诱导表达与纯化2.3.1pET-28a-SUMO-GP4的诱导表达（1）把测定合格的阳性重组质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21(DE3)的大肠杆菌中去，37℃温度下养育11h；（2）经过一夜的养育之后，选择单个的细微菌落放到含有3mL容量的LB液体培养基中，再加进去对应量的卡那霉素溶液，37℃条件下，以185r/min的转速进行摇动养育11h；（3）取30μL菌液加入到3mL的含有卡那霉素的LB液体培养液中，37℃条件下185r/min进行摇菌至OD值达到0.6-0.8时（约摇菌的时间为3.5h），然后加入IPTG（至终浓度0.5mmol/L）诱导表达约8h，同时，也要设定pET-28a-SUMO空载诱导与未诱导、样品未诱导的对照、以及BL21(DE3)宿主菌的诱导对照；（4）收集样品，离心15min依从12000r/min的转速在离心机中进行，然后加进去相对应的PBS溶液进行吹打，使得最终管中的液体为1mL，再把相应量的2×上样缓冲液加进去混合一下，用100℃的滚烫热水进行水煮8min，应用SDS-PAGE凝胶电泳进行测定结果。22 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化2.3.2重组蛋白SUMO-GP4的SDS-PAGE分析（1）将清洗干净的配套电泳玻璃板对齐，分别置地放在制胶架子上面的两端，并用夹子夹紧进行固紧，添加一部分的三蒸水来验证玻璃板会不会有漏水的现象。等待大约5min以后，检查发现不漏水了，就把水倒到洗手池里，使用滤纸把玻璃板中的水吸干净。按照表3-2的体系配制15％的分离胶，在烧杯中加入相应的各种试剂，把这些所有试剂都一起混合，特别是最后一步加入TEMED，迅速地添加混合液到固定好的玻璃板中去，每个玻璃制胶板中约需要加入大约7毫升的分离胶溶液，当混合液添加到达距离玻璃板的顶端大约有1.8cm左右时停止，然后添加异丙醇覆着在液体的上面，能够产生压力使得分离胶的液面能保持水平，在这一系列的过程中切记不能产生气泡，最后把配制好的分离胶放在实验室屋子中等待，约2.5h即可凝固。表2-1015%分离胶的配制Table2-10Preprationof15%separationgel成分（composition）体积（volume）ddH2O1.70mL30%Acrylamide3.75mL1.5mmol/LTris-HCl1.90mL10%SDS75.0μLTEMED3.0µL10%APS75.0µL（2）配好分离胶以后，接下来开始配制浓缩胶。按照表3-3的体系配制5%的浓缩胶6.0mL，先是在烧杯中加入相应的各种试剂，把每一个成分都混匀以后，立即加入到玻璃板内，当液面与玻璃板的上端相持平的时候停止加液，然后立即把对应尺寸大小的梳子轻轻插到浓缩胶中（梳子可以提前用电泳缓冲液冲洗3-4遍），这一系列的过程都要尽可能的避免产生气泡，否则会影响实验的结果，然后放在试验台上等待凝固，大约1.5h即可。23 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定表2-115%浓缩胶的配制Table2-11Preprationof5%stackinggel成分（composition）体积（volume）ddH2O2.05mL30%Acrylamide0.50mL1.0mmol/LTris-HCl0.375mL10%SDS30.0μLTEMED3.0µL10%APS30.0µL（3）待浓缩胶凝固完全以后，把制好的胶板放到电泳槽，按照正确的位置进行放置，用两手同时来拔梳子，然后添加1×Tris-Gly缓冲液到电泳槽内，对于暂时不用的胶还可以盖上双层的保鲜膜放在4℃冰箱以备不时之需。接着开始处理需要验证的样品，首先取20µL诱导的样品与20µL2×上样缓冲液进行混合，在100℃的开水中热煮10min-15min。上样的时候，小心地使用移液器缓慢地添加样品到胶孔中，其中添加6µL的彩虹Marker，每个孔加10µL处理过的样品。将电压调节至85V开始进行电泳，约38min后溴酚蓝指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界处时，调节电压至123V，大约1.5h后，观察溴酚蓝指示剂的位置，当跑到胶的底部的时候，再关闭电源、停止电泳。（4）等到电泳完毕以后，小心的从玻璃板中分别取出两个胶块，都把上端的浓缩胶去切除，做好标记。其中一块胶放到染色摇床上，加进去恰当的染色液，70rpm的转速摇动进行染色约2.5h，染色结束以后，先用清水冲洗几次，再放到脱色液中进行脱色9.5h。2.3.3重组蛋白SUMO-GP4的WesternBlot鉴定（1）平衡：目的蛋白经SDS-PAGE电泳结束之后，切下含有目的蛋白条带的胶块，分别把凝胶、滤纸、PVDF膜（预先剪裁好需要用到的与胶大小一样的滤纸8张，PVDF膜1张），放在电转缓冲液中平衡45min，同时，先将PVDF膜在无水甲醇中浸泡20s，再用纯水冲洗掉多余的甲醇即可。（2）铺胶：平衡完毕以后，先把4层滤纸垫在半干转印机上，再把活化好的PVDF膜放上去，然后把胶放在其上，最后再在最上面放上四层滤纸，整个过程一定要缓缓地轻放，特别是在把凝胶放到PVDF膜上的时候，要尽可能的避免各层之间产生气泡，可24 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化以用玻璃棒轻轻地碾压，从而把气泡赶出。（3）转印：把半干转移器合上，电泳仪接好开关，设定90V电压进行转印75min。转印完毕以后，取下PVDF膜，适当剪裁，用纯水冲洗两遍，同时一起把剪裁好的PVDF膜、滤纸都放进适当的玻璃平皿中，并且要分别标记清楚，而后用TBST进行洗涤5次，每次7min，同时，把转膜过的胶放到染色液中继续染色，以检验转印的效果如何。（4）封闭：使用5%脱脂奶粉-TBST封闭液，在室温进行封闭1.5h，封闭结束之后，用TBST在37℃摇床50r/min缓慢振摇冲洗至少6次，每次间隔15min。（5）加一抗：将猪PRRSV阳性血清与5%脱脂奶粉-TBST按1:2000倍稀释，放入到与膜大小相当的封口袋中，做好标记，4℃冰箱孵育24h-36h。接下来，用螺口瓶把用过的一抗进行回收后，洗膜5次，每次7min。（6）加二抗：同上把HPR标记的兔抗猪IgG二抗进行回收以后，缓慢地振摇洗膜6-10次，每次7min。（7）显色：按照说明书要求，把DAB试剂盒中的A、B各50μL，再加900μL的PBS混合配制显色液，迅速在避光的条件下将PVDF膜放入其中，大约反应1-5min，待出现特异性的反应条带，立即终止反应，迅速拍照。2.3.4重组蛋白SUMO-GP4的可溶性分析参照前面2.3.1所述的诱导表达方法，对重组质粒pET-28a-SUMO-GP4进行诱导表达，首先，先把聚集到的菌液进行恰当的处理，先离心15min在11000r/min的转速下，把沉淀留下来，添加进去PBS进行吹打混匀。紧接着设定超声波破碎的程序，样品下面必须放一个装满冰的盒子，破碎时间35min，工作时间5s，间隔时间5s，接下来，把经超声波破碎处理过的菌液，在11000r/min的转速下进行离心32min。最后，把上清和沉淀分开来进行聚集，其中沉淀用与上清相等体积的的PBS进行充分的混匀以后，再加进去相对应体积的2×上样缓冲液来混合样品，标志好上清和沉淀，再分别取上清和沉淀去上样，应用SDS-PAGE电泳做一个测定。2.3.5重组蛋白SUMO-GP4诱导条件的优化（1）温度的优化利用上述测定合格的pET-28a-SUMO-GP4阳性质粒进行诱导表达，其他条件不变的情况下，分别设定16℃、25℃、37℃三个不一样的温度区间作为蛋白诱导的条件，其25 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定他操作的方法和2.2.3的要求一样，然后应用SDS-PAGE电泳做一个测定。（2）时间的优化利用上述确定好的蛋白诱导的最优温度，在其他的条件都不变的情况下，对经测定合格的pET-28a-SUMO-GP4阳性质粒进行诱导，分别设定3h、6h、9h、12h四个不一样的时间区间来作为蛋白表达的条件，其他操作的方法和2.2.3的要求一样，然后应用SDS-PAGE电泳做一个测定。（3）IPTG浓度的优化利用上述确定好的蛋白诱导的最恰当的温度、最恰当的时间，在其他的条件都不变的情况下，对经测定合格的pET-28a-SUMO-GP4阳性质粒进行诱导表达，分别把IPTG的浓度设定为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L三个不一样的浓度区间，其他操作的方法和2.2.3的要求一样，然后应用SDS-PAGE电泳做一个测定。2.3.6可溶性重组蛋白的制备与纯化（1）样品的制备参照上述2.3.5确定的最适的原核表达条件，取测定合格的阳性质粒pET-28a--SUMO-GP4进行摇菌，按照确定好的最恰当的条件进行大量的诱导。首先，养育菌液在摇床中摇动过夜，第二天早上按照1:100的比例，加进去500mL的LB液体培养基中进行扩培，再加进去Kan的量500μL，在190r/min的转速下放进37℃的摇床中培育3.5h。大量菌液养育之后开始诱导，添加对应比例的IPTG至终浓度为0.6mmol/L，在最适当温度25℃的条件下诱导6h以后，把诱导好的菌液装到50mL的离心管中，在4℃离心机条件下，按照11000r/min的转速，进行离心20min/次。弃上清，留沉淀，根据菌体的量加入适量的10×裂解液、5μL的蛋白抑制酶和10μL的溶菌酶（溶菌酶要在破碎前加入），充分吹打混匀。然后根据设定的超声波破碎的条件，使得最终的菌液基本稳定在澄清的状态。接下来按照11000r/min的速度，在4℃条件下进行离心32min，把离心后的上清收集起来，这个时候的上清就是我们所需要的目的蛋白，保存到-20℃的冰箱中备用。（2）SUMO-GP4蛋白的分离纯化与浓缩采用Ni-NTA柱对采集到的重组蛋白进行样品的纯化，具体的要求如下：装柱：把镍柱装到柱子里，然后添加1-2mLNi琼脂糖凝胶填料，当乙醇、凝胶二者26 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化有了分层以后，再把底部的出口打开，让乙醇缓慢地流出。平衡：为了冲干净储存缓冲液，需要借助9mL的去离子水来冲刷，再用13mL的10×裂解液冲洗，每次添加1mL。上样：待上样的样品需要在实验之前进行过滤，以防止堵塞层析柱。洗涤：上样结束以后，迅速用16mL的20×WashBuffer进行冲洗，控制流速为1mL/min。洗脱：需要借助ElutionBuffer冲洗液来获得纯化的目的蛋白，总共进行冲洗10次，其中，先每一次都用1mL的250×咪唑，连续进行3次，再用7mL的500×咪唑冲洗，最后冲洗下来的都是我们所要收集的蛋白。当洗脱结束以后，再用10mL的去离子水重复的冲刷几次柱子，再加3mL的20%乙醇放在柱子里，方便柱子的保存，放到4℃的冰箱。浓缩：把聚集起来的所有蛋白，放到Millipore超滤浓缩管中开始进行浓缩，每管里装进去10mL的蛋白液，离心75分钟按照4800rpm的转速进行，当超滤管中的蛋白液剩余1mL的时候停止，接下来再添加恰当的PBS缓冲液至10mL，再一次进行离心，总共需要重复3次，最后把聚集到的蛋白液保存于-70℃的冰箱中备用，取少部分蛋白与PRRSV猪的阳性血清进行Western-blot反应分析。2.3.7目的蛋白GP4的纯化把经纯化、浓缩得到的重组蛋白SUMO-GP4产物与SUMO蛋白酶根据相对应的比例要求进行酶切，酶切的体系见表2-12。当各类体系混合均匀之后放到4℃的冰箱中进行过夜，第二天酶切结束得到的蛋白就是酶切以后的目的蛋白GP4。得到酶切后的目的蛋白GP4以后，参照2.2.5（2）Ni-NTA柱的要求，目的蛋白GP开始纯化目的蛋白GP4，然后用少部分的酶切后的样品进行SDS-PAGE电泳测定，检验SUMO-GP4是否被切开。27 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定表2-12目的蛋白GP4的酶切反应体系Table2-12ProteincleavagereactionsystemoftargetproteinGP4成分（composition）体积（volume）重组蛋白SUMO-GP41000.0μgSUMOProteaseBuffer20.0μLSUMO蛋白酶2.0μLddH2O定容至1000μL总体积1000.0μL2.4结果与分析2.4.1PRRSVGP4PCR结果使用PRRSVcDNA作为PCR的模板，对GP4全长目的基因片段进行PCR扩增，结果表明，有一条特异性目的条带被扩增出来，大小约为537bp，与实际大小相一致，见图2-1。图2-1GP4的PCR扩增结果Fig2-1PCRproductionofGP4geneM:DL2000DNA分子量标准；1-4：GP4的PCR扩增产物；5：GP4阴性对照M:DL2000DNAMarker;1-4:GP4genefragmentbyPCR；5：GP4Negativecontrol2.4.2pMD19-T-GP4重组载体的构建（1）pMD19-T-GP4重组载体菌液PCR鉴定结果GP4目的基因片段与克隆载体pMD19-T-simple进行连接后，得到了重组质粒pMD19-T-GP4，通过菌液PCR进行扩增，可获得大小约为537bp的目的条带，结果见图2-2。28 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化图2-2pMD-19-T-GP4的菌液PCR扩增Fig2-2PCRproductionofpMD-19-T-GP4plasmidM：DL2000DNA分子量标准；1-2：pMD-19-T-GP4的PCR扩增产物；3：阴性对照M:DL2000DNAMarker;1-2:pMD-19-T-GP4genefragmentbyPCR;3：pMD-19-T-GP4Negativecontrol图2-1GP4的PCR扩增结果Fig2-1PCRproductionofGP4geneM:DL2000DNA分子量标准；1-4：GP4的PCR扩增产物；5：GP4阴性对照M:DL2000DNAMarker;1-4:GP4genefragmentbyPCR；5：GP4Negativecontrol（2）pMD-19-T-GP4重组载体双酶切鉴定结果重组质粒pMD-19-T-GP4经BamHI、XhoI双酶切后，出现了与预期结果相符合的两条带，结果见图2-3。图2-3重组克隆质粒pMD19-T-GP4的双酶切鉴定Fig2.3IdentificationoftherecombinantplasmidpMD-19-T-GP4byBamHIandXhoIdigestionM：DL2000DNA分子量标准；1：重组克隆质粒pMD-19-T-GP4双酶切鉴定M:DL2000DNAmarker;1:ProductionoftherecombinantplasmidpMD19-T-GP4byandBamHIandXhoI（3）pMD19-T-GP4序列分析结果经菌液PCR和双酶切鉴定后的重组克隆载体pMD19-T-GP4，送上海英骏生物技术公司进行测序。结果表明，PRRSVGP4、全长基因片段成功克隆至pMD19-T-simple载29 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定体中，成功构建了克隆质粒pMD19-T-GP4。2.4.3pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体的构建（1）pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体菌液PCR鉴定结果pET-28a-SUMO表达载体和PRRSVGP4全长目的基因片段连接后获得的重组子，菌液PCR进行扩增，可获得大小分别约为537bp的目的条带，结果见图2-4。图2-4重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4的菌液PCR鉴定Fig2-4IdentificationoftherecombinantexpressionplasmidpET-28a-SUMO-GP4byPCRM：DL2000DNA分子量标准；1：重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4的菌液PCR扩增目的条带；2：重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4的阴性对照M:DL2000DNAMarker；1-2:pET-28a-SUMO-GP4genefragmentbyPCR；3：pET-28a-SUMO-GP4Negativecontrol（2）pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体双酶切鉴定结果重组质粒pET-28a-SUMO-GP4分别经BamHI、XhoI双酶切后，出现了与预期结果相符合的两条带，结果见图2-5。图2-5重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4的双酶切鉴定Fig2-5IdentificationoftherecombinantexpressionplasmidpET-28a-SUMO-GP4byBamHIandXhoIdigestionM：DL2000DNA分子量标准；1：重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4双酶切鉴定M:DNAmarkerDL2000;1:TherecombinantexpressionplasmidpET-28a-SUMO-GP4byBamHIandXhoIdigestion30 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化（3）pET-28a-SUMO-GP4重组质粒序列分析结果通过PCR和双酶切鉴定后的重组质粒pET-28a-SUMO-GP4送往上海英骏生物技术有限公司测序，结果成功构建了重组质粒pET-28a-SUMO-GP4。2.4.4重组蛋白SUMO-GP4的SDS-PAGE初步鉴定重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21（DE3）阳性菌之后，经IPTG诱导后，发现均有特异性浓染蛋白带，大小分别为33kDa，与SUMO-GP4融合蛋白大小一致，而空载质粒pET-28a-SUMO转化的菌液在相应位置也出现了目的蛋白条带为14kDa，与SUMO蛋白大小一致，见图2-6。图2-6重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4的SDS-PAGE分析Fig2-6SDA-PAGEanalysisofRecombinantexpressionplasmidpET-28a--SUMO-GP4.M:彩虹蛋白Marker；1：重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4诱导结果；2：空载pET-28a-SUMO诱导结果；3：重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4未诱导对照；4：空载pET-28a-SUMO未诱导对照；5：BL21对照M:RainbowProteinMarker；1:pET-28a-SUMO-GP4/BL21(DE3)induced；2:pET-28a-SUMO/BL21(DE3)induced；3:pET-28a-SUMO-GP4/BL21(DE3)noinduced；4:pET-28a-SUMO/BL21(DE3)noinduced；5:BL21(DE3)2.4.5重组蛋白SUMO-GP4可溶性分析重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21(DE3)阳性菌之后，经IPTG诱导后，进行超声波破碎裂解，结果发现：pET-28a-SUMO-GP4的上清和沉淀中均有特异性浓染蛋白带，大小为33kDa，见图2-7。31 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定图2-7重组表达质粒pET-28a--SUMO-GP4的可溶性分析Fig2-7SolubleanalysisofrecombinantexpressionplasmidpET-28a--SUMO-GP4M:彩虹蛋白Marker；1：pET-28a-SUMO-GP4诱导物裂解沉淀；2：pET-28a-SUMO-GP4诱导物裂解上清M:RainbowProteinMarker；1:pET-28a-SUMO-GP4inducerlysatepellet；2：pET-28a-SUMO-GP4inducerlysissupernatant2.4.6重组蛋白SUMO-GP4温度优化重组阳性质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21(DE3)阳性菌之后，样品的诱导温度分别设定为16℃、25℃、37℃，经IPTG诱导后，进行超声波破碎裂解，结果发现：重组阳性质粒pET-28a-SUMO-GP4在16℃、25℃、37℃三个温度梯度的上清中均有相应位置的目的蛋白条带出现，由此可知，pET-28a-SUMO-GP4最佳的诱导温度是25℃，见图2-8。32 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化图2-8重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4温度的优化Fig2-8OptimizationofrecombinantplasmidpET-28a-SUMO-GP4M:彩虹蛋白Marker；1：pET-28a-SUMO-GP4在16℃诱导物裂解沉淀；2：pET-28a-SUMO-GP4在16℃诱导物裂解上清；3：pET-28a-SUMO-GP4在25℃诱导物裂解沉淀；4：pET-28a-SUMO-GP4在25℃诱导物裂解上清；7：pET-28a-SUMO-GP4在37℃诱导物裂解沉淀；8：pET-28a-SUMO-GP4在37℃诱导物裂解上清M:RainbowProteinMarker；1：pET-28a-SUMO-GP4induceslysateprecipitationat16℃；2:pET-28a-SUMO-GP4induceslysatesupernatantat16℃；3：pET-28a-SUMO-GP4induceslysateprecipitationat25℃；4:pET-28a--SUMO-GP4induceslysatesupernatantat25℃；5：pET-28a-SUMO-GP4induceslysateprecipitationat37℃；6:pET-28a-SUMO-GP4induceslysatesupernatantat37℃2.4.7重组蛋白SUMO-GP4时间优化重组阳性质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21阳性菌经IPTG诱导之后，确定最佳诱导温度为25℃，诱导时间分别设定为3h、6h、9h、12h，进行超声波破碎裂解，结果发现3h、6h、9h、12h四个时间梯度的上清中相应的位置均有蛋白条带出现，对实验结果进行分析对比，确定了最佳的诱导时间是6h，见图2-9。33 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定图2-9重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4时间的优化Fig2-9OptimizationofRecombinantExpressionPlasmidpET-28a--SUMO-GP4TimeM:彩虹蛋白Marker；1：pET-28a-SUMO-GP4诱导3h后裂解的沉淀；2：pET-28a-SUMO-GP4诱导3h后裂解的上清；3：pET-28a-SUMO-GP4诱导6h后裂解沉淀；4：pET-28a-SUMO-GP4诱导6h后裂解上清；5：pET-28a-SUMO-GP4诱导9h后裂解沉淀；6：pET-28a-SUMO-GP4诱导9h后裂解上清；7：pET-28a-SUMO-GP4诱导12h后裂解沉淀；8：pET-28a-SUMO-GP4诱导12h后裂解上清M:RainbowProteinMarker；1:pET-28a-SUMO-GP4inducedthecleavageofthepelletafter3h；2：pET-28a-SUMO-GP4inducedcleavageofthesupernatantafter3h；3：pET-28a--SUMO-GP4inducedthecleavageofthepelletafter6h；4:pET-28a--SUMO-GP4inducedcleavageofthesupernatantafter6h；5：pET-28a-SUMO-GP4inducedthecleavageofthepelletafter9h；6:pET-28a-SUMO-GP4inducedcleavageofthesupernatantafter9h；7：pET-28a-SUMO-GP4inducedthecleavageofthepelletafter12h；8：pET-28a-SUMO-GP4inducedcleavageofthesupernatantafter12h2.4.8重组蛋白SUMO-GP4IPTG浓度优化重组阳性质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至BL21阳性菌经IPTG诱导之后，确定最佳诱导温度为25℃，最佳诱导时间6h，把样品诱导的终浓度分别设定为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L，进行超声波破碎裂解，结果发现0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L五个浓度梯度的上清中相应的位置均有蛋白条带出现，其中0.6mmol/L的上清蛋白条带最粗。由此可知，最佳的诱导浓度是0.6mmol/L，见图2-10。34 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化图2-10重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4浓度的优化Fig2-10OptimizationofRecombinantExpressionPlasmidpET-28a-SUMO-GP4ConcentrationM:彩虹蛋白Marker；1：pET-28a-SUMO-GP4在0.1mmol/L浓度下裂解的上清；2：pET-28a-SUMO-GP4在0.3mmol/L浓度下裂解的上清；3：pET-28a-SUMO-GP4在0.4mmol/L浓度下裂解的上清；4：pET-28a-SUMO-GP4在0.6mmol/L浓度下裂解的上清；5：pET-28a-SUMO-GP4在0.8mmol/L浓度下裂解的上清；6：pET-28a-SUMO-GP4在1.0mmol/L浓度下裂解的上清M:RainbowProteinMarker；1：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof0.1mmol/L；2：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof0.3mmol/L；3：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof0.4mmol/L；4：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof0.6mmol/L；5：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof0.8mmol/L；6：ThesupernatantofpET-28a-SUMO-GP4waslysedataconcentrationof1.0mmol/L2.4.9重组蛋白SUMO-GP4纯化结果按照确定的最佳诱导条件，进行大量诱导表达SUMO-GP4蛋白，采用Ni-NTA柱进行蛋白纯化，通过SDS-PAGE电泳，在相应位置得到浓度较高的重组蛋白SUMO-GP4的目的条带，见图2-11。图2-11：纯化后重组蛋白SUMO-GP4的SDS-PAGE分析Fig:2-11SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinSUMO-GP4afterpurificationM:RainbowProteinMarker；1：纯化后的SUMO-GP4蛋白;2：纯化前的SUMO-GP4蛋白M:RainbowProteinMarker；1：SUMO-GP4proteinafterpurification;2：SUMO-GP4proteinbeforepurification35 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定2.4.10重组蛋白SUMO-GP4的WesternBlot鉴定按照确定的最佳诱导条件，大量诱导获得重组蛋白SUMO-GP4，采用Ni-NTA柱进行蛋白纯化，用纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束之后切下要转膜的重组蛋白进行WesternBlot。通过WesternBlot鉴定分析，结果在33kDa处出现了相应的特异性条带，根据WesternBlot结果可知，猪PRRSV阳性血清能够与表达产物SUMO-GP4重组蛋白发生特异性识别，证明了SUMO-GP4重组蛋白在原核表达系统中能表达且具有良好的反应原性，见图2-12。图2-12重组蛋白SUMO-GP4的WesternBlot分析Fig:2-12Western-blottinganalysisofrecombinantproteinSUMO-GP4M:RainbowProteinMarker；1：纯化前的SUMO-GP4蛋白；2：纯化后的SUMO-GP4蛋白M:RainbowProteinMarker；1：SUMO-GP4proteinbeforepurification；2：SUMO-GP4proteinafterpurification；2.4.11目的蛋白GP4的SDS-PAGE分析重组蛋白SUMO-GP4在Ni-NTA柱亲和层析纯化之后，用特异性蛋白酶SUMO酶进行酶切，经SDS-PAGE电泳分析测定，SUMO-GP4重组蛋白在SUMO蛋白酶的作用下，切开得到了目的蛋白GP4。酶切结果见图2-13在33kDa处出现了目的蛋白酶切前的目的条带，在19kDa处出现了酶切之后目的蛋白GP4预期相对应的条带。36 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化图2-13目的蛋白GP4的SDS-PAGE分析Fig2-13DA-PAGEanalysisoftargetproteinGP4M:彩虹蛋白Marker；1：重组蛋白SUMO-GP4；2：目的蛋白GP4M:RainbowProteinMarker；1：RecombinantproteinSUMO-GP4；2:ProteinofinterestGP42.4.12目的蛋白GP4纯化SDS-PAGE结果重组蛋白SUMO-GP4在SUMO酶的作用下被酶切，用Ni-NTA柱再次进行纯化，经SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果见图2-14对比酶切前纯化蛋白的大小33kDa，酶切后纯化蛋白的大小是19kDa。图2-14组蛋白SUMO-GP4与目的蛋白纯化的SDS-PAGE分析Fig:2-14SDS-PAGEanalysisofthepurifiedRecombinantproteinSUMO-GP4andGP4protein.M:彩虹蛋白Marker；1：酶切前纯化的重组蛋白SUMO-GP4;2：酶切后的GP4蛋白M:RainbowProteinMarker；1:RecombinantproteinSUMO-GP4purifiedbeforeenzymedigestion;2:purifiedGP4proteinafterdigestion37 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定2.4.13目的蛋白GP4的WesternBlot鉴定目的蛋白GP4在Ni-NTA柱亲和层析纯化之后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束之后切下要转膜的重组蛋白。通过WesternBlot鉴定分析，结果在19kDa处出现了相应的特异性条带，证明了猪PRRSV阳性血清能够与表达产物GP4蛋白发生特异性识别，为后续间接ELISA的检测方法提供了抗原，见图2-15图2-15目的蛋白GP4纯化后的WesternBlot分析Fig:2-15WesternBlotanalysisofthepurifiedGP4protein.M:彩虹蛋白Marker；1：酶切后纯化的GP4蛋白M:RainbowProteinMarker；1:purifiedGP4proteinafterdigestion2.5讨论2.5.1表达载体的选择本研究采用大小为5633bp的pET-28a-SUMO原核表达载体来融合表达GP4。SSUMO融合标签能被SUMO蛋白酶准确地识别，采用蛋白酶水解不会产生延伸的一端，能被准确切除，Li等试验结果显示，SUMO蛋白酶具有特异性[96]，Butt等研究结果表明，SUMO蛋白酶在不损伤目的蛋白的条件下，能够高效、准确地特异性切割SUMO与融合蛋白之间的肽[97]。本研究对PRRSVGP4蛋白进行表达时，充分考虑各种因素，由于SUMO本身的高度保守，易表达可溶蛋白的特性，因此，选用pET-28a-SUMO表达载体在IPTG诱导剂的作用下指导外源基因的正确表达。2.5.2原核表达载体的构建本试验在进行构建重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4的试验操作过程中，发现了38 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化很多影响表达载体构建的因素，比如培养基是否污染、摇菌时间过长或过短、质粒的提取浓度的高低、胶回收的含量高低、试验操作者的熟练程度等。一般情况下，培养基应该现用现配且经过高压灭菌；摇菌的时间设置了3个梯度，分别为6h、10h和14h，由于摇菌的时间过长产物积累量多，细菌的生长进入了衰退期，会有很多细菌死亡，且浓度过高容易导致杂菌产生，若时间过短则产物的表达量太少，从而影响实验结果，因此，本实验设置了三个时间梯度来进行摇菌；质粒提取过程中，在用DNAWashBuffer洗脱之后，务必要把柱子放置在37℃恒温培养箱中，时间2分钟左右，使得柱子中残留的酒精能彻底挥发。摇菌最佳时间的不确定和质粒提取浓度偏低是导致原核载体构建失败的主要原因。2.5.3目的蛋白的诱导表达将重组质粒pET-28a-SUMO-GP4转化到宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG的诱导下，进行了蛋白的诱导表达。本试验总共进行了五次诱导表达，第五次成功的将阳性重组质粒pET-28a-SUMO-GP4转化进入宿主菌BL21(DE3)中。在摸索蛋白诱导表达的过程中，用经测序鉴定正确的阳性重组质粒以1:1000的比例转化、挑单菌落进行过夜培养，在转化时要注意平板过夜培养的时间不可超过12小时，以防止霉菌污染；在挑单菌落时，要选择单个、细、浅、圆的菌落来培养；摇菌的时候，需要注意摇床的转速、温度、时间等。诱导温度对重组蛋白的表达量多少会造成一定的影响。本实验分别设定16℃、25℃、37℃的诱导温度，在相同的诱导时间与0.5mml/L的IPTG浓度下，对重组表达质粒进行不同温度下的诱导，诱导结束后，通过超声波破碎处理样品，经SDS-PAGE凝胶电泳分析发现，在25℃条件下，重组蛋白的表达量已经达到了最优值。所以本实验选择目的蛋白的最佳诱导温度是25℃。诱导时间对重组蛋白的表达量多少影响也是很明显的，如若诱导时间太短会造成蛋白含量很低，或者几乎没有；但诱导时间过长，又可能造成目的蛋白都存在于沉淀中。在本实验中，分别设定了3h、6h、9h、12h四个梯度作为诱导的时间，在25℃和0.5mml/L的IPTG诱导条件下进行诱导表达，从第3h开始，每隔三个小时都抽出3毫升的表达菌液，进行处理样品，超声波破碎并离心，SDS-PAGE电泳测定发现，在诱导6h的时候，重组蛋白的表达含量已经达到了最大，随着诱导时间的逐渐增长，GP4重组蛋白的表达含量并未明显的升高。因此，本实验目的蛋白的最佳诱导时间是6h。39 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定诱导浓度的高低也会对重组蛋白的表达量多少有很大的影响。分别设定0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的IPTG浓度梯度，在25℃条件下，诱导6小时对重组表达质粒进行诱导表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析发现，浓度过高会影响蛋白的特性，随着IPTG浓度的增高，沉淀中的蛋白量也会增加，但是在0.6mmol/L条件时，重组蛋白上清和沉淀中的量都有，且上清中的蛋白含量比其他IPTG浓度条件下都多。因此，本实验选择最佳的诱导浓度为0.6mmol/L。最终，优化后的最佳诱导表达条件为诱导温度25℃，诱导时间6h，诱导浓度0.6mmol/L，在该条件下重组蛋白能得到高效、稳定的表达。本实验中通过对重组蛋白SUMO-GP4的可溶性分析，结果显示上清和沉淀中均存在有目的蛋白，经过一系列的条件优化，表达重组蛋白大部分是可溶的，但也有少量的以包涵体形式存在。这是pET原核表达系统本身的特点所决定的，外源基因在大肠杆菌中表达，重组目的蛋白易在细胞浆内积聚，导致错误折叠，使蛋白出现包涵体形式。目的蛋白是否为诱导温度、时间、IPTG浓度以及摇菌的剧烈程度等都可能成为影响蛋白成为包涵体的形成因素。2.5.4蛋白的检测本试验通过使用Western-blot检测方法来鉴定蛋白是否表达，但WesternBlot检测条带有点弱，特异性反应也不明显。在实验过程中，WesternBlot的实验步骤多，每一步都可能是造成实验失败的原因之一。特别是在制备胶时，需要各种试剂充分的混匀，最好现配现用，TEMED在最后一步加进去之后，要迅速的摇晃混匀，然后快速添加溶液到胶板中去，寒冷天气，凝胶会比较慢，可以把胶放到37℃恒温培养箱中来解决该的问题，但要注意不可温度太高，否则会导致胶块中出现气泡，影响跑胶的质量。其他的方面，转膜没有转好、封闭时间太短或太长、二抗浓度稀释太高或太低、上样时添加的量过少等也会对实验结果造成影响。2.5.5蛋白的纯化经SDS-PAGE的可溶性鉴定分析可知，目的蛋白在沉淀和上清中都有一定量的表达，但是要想从沉淀中得到活性较好的蛋白，步骤比较繁琐，而且得到的活性也不高，不利于下一步试验的进行。而从上清中纯化，简化了实验步骤，减少了蛋白纯化中的蛋白损失。本实验选用SUMO-GP4重组蛋白的上清来进行大量扩培，诱导表达，SUMO-GP440 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白的表达与纯化重组蛋白经SUMO蛋白酶酶切后，SUMO蛋白和SUMO酶与Ni-NTA柱结合，GP4出现在上样峰中，采用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白，但目的蛋白与镍柱的结合率不是太高，浓度偏低，需借助超滤管浓缩。在纯化过程中，结合缓冲液、洗脱缓冲液的咪唑浓度等都是影响蛋白纯化浓度的因素，这些条件有都待进一步探索。2.6小结成功克隆出PRRSVGP4基因，得到一段长度为537bp的基因片段，构建了重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4。将重组表达质粒pET-28a-SUMO-GP4转化至宿主菌BL21(DE3)中，成功诱导表达了SUMO-GP4重组蛋白。确定了重组蛋白SUMO-GP4的最优诱导条件，在25℃0.6mmol/L的IPTG浓度下进行诱导表达6h，获得可溶性的重组蛋白。应用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行纯化，通过超滤管浓缩获得的重组蛋白能够与PRRSV猪阳性血清发生反应，且无非特异性条带产生。采用SUMO蛋白酶水解纯化后的SUMO-GP4重组蛋白，得到了分子量为19kDa的GP4目的蛋白。经SDS-PAGE电泳分析，酶切后的GP4蛋白能够与PRRSV阳性血清发生特异性的反应，为进一步PRRSV抗体的快速检测奠定了基础。41 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定42 第三章结论第三章结论本实验构建重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4，应用原核表达系统表达了PRRSVSUMO-GP4重组蛋白，确定了重组蛋白SUMO-GP4在25℃0.6mmol/L的IPTG浓度下诱导表达6h，获得可溶性的重组蛋白，经Ni-NTA亲和层析纯化、SUMO蛋白酶酶切，获得具有特异性的可溶性蛋白GP4。43 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定44 参考文献参考文献[1]WensvoortG,TerpstraC,PolJMA,etal.MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VeterinaryQuarterly,1991,13(3):21-30.[2]焦文强,郎利敏,徐引弟,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2016,(12上)：49-53.[3]LIY,WANGX,JIANGP,etal.GeneticanalysisoftwoporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruseswithdifferentvirulenceisolatedinChina[J].ArchVirol,2008,153(10):1877-1884.[4]KAPPESMA,FAABERGKS.PRRSVstructure,replicationandrecombination:originofphenotypeandgenotypediversity[J].Virology,2015,(479/480):475－486.[5]AlkhamisMA,ArrudaAG,VilaltaC,etal.SurveillanceofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusintheUnitedStatesusingriskmappingandspeciesdistributionmodeling[J].PrevVetMed,2018,150(7):135-142.[6]ThiDieuThuyN,ThiThuN,SonNG,etal.GeneticanalysisofORF5porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatedinVietnam[J].Microbiologyandimmunology,2013,57(7):518-526.[7]WangHM,LiuYG,TangYD,etal.AnaturalrecombinantPRRSVbetweenHP-PRRSVJXA1-likeandNADC30-likestrains[J].TransboundEmergDis,2018,10(3):17-19.[8]GuoZ,ChenXX,LiR,etal.TheprevalentstatusandgeneticdiversityofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChina:amolecularepidemiologicalperspective[J].VirolJ.2018,15(1):2-5.[9]NeiraV,BritoB,MenaJ,etal.EpidemiologicalinvestigationsoftheintroductionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChile,2013-2015[J].PLoSOne,2017,12(7):1371-1569.[10]LiuJK,WeiCH,DaiAL,etal.CompletegenomiccharacterizationoftwoEuropean-genotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatesinFujianprovinceofChina[J].ArchivesofVirology,2017,162(3):823-833.[11]王亚欣.PRRSV强弱毒感染后对PBMCs细胞嗜性和细胞因子产生情况的差异研究及HP-PRRSVT细胞表位的鉴定[D].中国农业科学院,2012.[12]LiL,WuC1,HouG,etal.Generationofmurinemacrophage-derivedcelllinesexpressingporcineCD163thatsupportporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection[J].BMCBiotechnol,2017,17(1):77-81.[13]WangR,YangL,ZhangYetal.PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinducesHMGB1secretionviaactivatingPKC-deltatotriggerinflammatoryresponse[J].Virology,2018,518(15):172-183.45 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定[14]PröllMJ,NeuhoffC,SchellanderK,etal.Transcriptomeprofileoflungdendriticcellsafterinvitroporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)infection[J].PLoSOne,2017,12(11):1733-1735.[15]DuJ,GeX,LiuY,etal.TargetingSwineLeukocyteAntigenClassIMoleculesforProteasomalDegradationbythensp1αReplicaseProteinoftheChineseHighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusStrainJXwn06[J].JVirol,2015,90(2):682-693.[16]HanM,KeH,ZhangQ,etal.NuclearimprisonmentofhostcellularmRNAbynsp1βproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Virology,2017,505(10):42-55.[17]XinY,WangD,HuangM,etal.Proteomeanalysisofdifferentialproteinexpressioninporcinealveolarmacrophagesregulatedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp1βprotein[J].VirusGenes,2018,18(5):1007-1126.[18]LiY,ShangP,ShyuD,etal.Nonstructuralproteinsnsp2TFandnsp2Nofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)playimportantrolesinsuppressinghostinnateimmuneresponses[J].Virology,2018,682(17):3022-3041.[19]XiaoY,WuW,GaoJ,etal.CharacterizationoftheInteractmeofthePorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusNonstructuralProtein2RevealstheHyperVariableRegionasaBindingPlatformforAssociationwith14-3-3Proteins[J].JProteomeRes,2016,15(5):1388-1401.[20]LiB,FangL,LiuS,ZhaoF,etal,ThegenomicdiversityofChineseporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatesfrom1996to2009[J].VetMicrobiol,2010,146(3-4):226-237.[21]LuZH,WangX,WilsonAD,etal.Quasispeciesevolutionoftheprototypicalgenotype1porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusearlyduringinvivoinfectionisrapidandtissuespecific[J].ArchVirol,2017,162(8):2203-2210.[22]FangY,SnijderEJ.ThePRRSVreplicase:exploringthemultifunctionalityofanintriguingsetofnonstructuralproteins[J].VirusRes,2010,154(1-2):61-76.[23]SpearA,WangFX,KappesMA,etal.Progresstowardanenhancedvaccine:Eightmarkedattenuatedvirusestoporcinereproductiveandrespiratorydiseasevirus[J].Virology,2018,516(12):30-37.[24]BianT,SunY,HaoM,etal.Arecombinanttype2porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbetweenNADC30-likeandaMLV-like:Geneticcharacterizationandpathogenicityforpiglets[J].InfectGenetEvol,2017,54(16):279-286.[25]OleksiewiczMB,BotnerA,ToftP,etal.Epitopemappingporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbyphagedisplay:thensp2fragmentofthereplicasepolyproteincontainsaclusterofB-cellepitopes[J].JVirol,2001,75(7):3277-3290.[26]SongT,FangL,WangD,etal.Quantitativeinteractomerevealsthatporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein2formsacomplexwithviralnucleocapsidproteinandcellularvimentin,[J].JProteomics,2016,142(16):70-81.[27]WangX,LiC,ZhouL,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscounteractstheporcineintrinsicvirusrestrictionfactors-IFITM1andTetherininMARC-145cells[J].VirusRes,2014,46 参考文献191(13):92-100.[28]CaoS,CaiX,TanM,etal.Serodiagnosis,targetingnonstructuralprotein4,ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.[J].ArchVirol,2018,163(2):411-418.[29]QiP,LiuK,WeiJ,etal.NonstructuralProtein4ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusModulatesCellSurfaceSwineLeukocyteAntigenClassIExpressionbyDownregulatingβ2-MicroglobulinTranscription[J].JVirol,2017,91(5):14-16.[30]ChenZ,LiM,HeQ,etal.Theaminoacidatresidue155innonstructuralprotein4ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscontributestoitsinhibitoryeffectforinterferon-βtranscriptioninvitro[J].VirusRes,2014,189(16):226-234.[31]YangL,WangR,MaZ,etal.PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusAntagonizesJAK/STAT3Signalingviansp5,WhichInducesSTAT3Degradation[J].JVirol,2017,91(3):16-18.[32]BrownE,LawsonS,WelbonC,etal.Antibodyresponsetoporcinereproductiveandrespiratoryrrsyndromevirus(PRRSV)nonstructuralproteinsandimplicationsfordiagnosticdetectiomanddifferentiationofPRRSVtypesIandII[J].ClinVaccineImmunol,2009,16(5):628-635.[33]JohnsonCR,YuW,MurtaughMP,etal.Cross-reactiveantibodyresponsestonsp1andnsp2ofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JGenVirol,2007,88(4):1184-1195.[34]JankováJ,CelerV.ExpressionandserologicalreactivityofNsp7proteinofPRRSgenotypeIvirus[J]ResVetSci,2012,93(3):1537-1542.[35]WangH,LiuR,CuiJ,etal.Characterizationandutilityofphagesbearingpeptideswithaffinitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp7protein[J].JVirolMethods,2015,222:231-241.[36]WangH,LiuR,ZhangW,etal.Identificationofepitopesonnonstructuralprotein7ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrecognizedbymonoclonalantibodiesusingphage-displaytechnology[J].VirusGenes,2017,53(4):623-635.[37]LiuH,WangY,DuanH,etal,AnintracellularlyexpressedNsp9-specificnanobodyinMARC-145cellsinhibitsporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplication[J].VetMicrobiol,2015,181(3-4):252-260.[38]XuL,ZhouL,SunW,etal.Nonstructuralprotein9residues586and592arecriticalsitesindeterminingthereplicationefficiencyandfatalvirulenceoftheChinesehighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J],Virology,2018,822(18):302-304.[39]ZhaoK,GaoJC,XiongJY,etal.TwoResiduesinNSP9ContributetotheEnhancedReplicationandPathogenicityofHighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus[J].JVirol,2018,92(7):209-217.[40]ZhangZ,WenX,DongJ,etal.EpitopemappingandcharacterizationofanovelNsp10-specificmonoclonalantibodythatdifferentiatesgenotype2PRRSVfromgenotype1PRRSV[J].VirolJ,2017,14(1):116-119.[41]SunY,KeH,HanM,etal,NonstructuralProtein11ofPorcineReproductiveandRespiratory47 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定SyndromeVirusSuppressesBothMAVSandRIG-IExpressionasOneoftheMechanismstoAntagonizeTypeIInterferonProduction[J].PLoSOne,2016,11(12):314-317.[42]ShiX,ZhangX,ChangY,etal,Nonstructuralprotein11(nsp11)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)promotesPRRSVinfectioninMARC-145cells[J].BMCVetRes,2016,12(6):90-95.[43]BautistaEM,FaabergKS,MickelsonD,etal.Functionalpropertiesofthepredictedhelicaseofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Virology,2002,298(2):258-270.[44]BiC,ShaoZ,ZhangY,etal.IdentificationofalinearB-cellepitopeonnon-structuralprotein12ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,usingamonoclonalantibody[J].ArchVirol,2017,162(8):2239-2246.[45]HFan,YPan,LFang,etal.Constructionandimmunogenicityofrecombinantpseudotypebaculovirusexpressingthecapsidproteinofporcinecircovirustype2inmice[J].JournalofVirologicalMethods,2008,150(2):21-26.[46]ZhangQ,BaiJ,HouH,etal.Anovelrecombinantporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruswithsignificantvariationincelladaptionandpathogenicity[J].VetMicrobiol,2017,208(16):150-158.[47]WangC,MengH,GaoY,etal.Roleoftranscriptionregulatorysequenceinregulationofgeneexpressionandreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VetRes,2017,48(1):41-45.[48]袁庆.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白单克隆抗体制备与抗原表位筛选[D].哈尔滨：东北农业大学,2013.[49]ZhouL,NiYY,PiñeyroP,etal.Broadeningtheheterologouscross-neutralizingantibodyinducingabilityofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbybreedingtheGP4orMgenes[J].PLoSOne,2013,8(6):24-26.[50]Kimpston-BurkgrenK,CorreasI,OsorioFA,etal.Relativecontributionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusopenreadingframes2-4totheinductionofprotectiveimmunity[J].Vaccine,2017,35(34):4408-4413.[51]LeeDU,YooSJ,KwonT,etal.GeneticdiversityofORF4-6oftype1porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinnaturallyinfectedpigs[J].VetMicrobiol,2017,199(13):54-61.[52]RobinsonSR,RaheMC,GrayDK,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusneutralizingantibodiesprovideinvivocross-protectiontoPRRSV1andPRRSV2viralchallenge[J].VirusRes,2018,248(3):13-23.[53]YuM,LiuX,SunL,etal.SubcellularlocalizationandtopologyofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusEprotein[J].VirusRes,2010,152(1-2):104-114.[54]SunL,ZhouY,LiuR,etal.CysteineresiduesoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusORF5aproteinarenotessentialforvirusviability[J].VirusRes,2015,197(2):17-25.[55]陈攀.PRRSVGP5糖基化位点对VLPs形成的影响及免疫原性分析[D].南京农业大学,2014.48 参考文献[56]FanB,LiuX,BaiJ,etal.Theaminoacidresiduesat102and104inGP5ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusregulateviralneutralizationsusceptibilitytotheporcineserumneutralizingantibody[J].VirusRes,2015,204(5):21-30.[57]曹佳媛,田明尧,辛舒,等.HBc嵌合PRRSVGP5CLP候选疫苗的构建及其免疫研究[C]//全国免疫学学术大会分会场交流报告.2015.[58]芦炜.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和N蛋白单克隆抗体的制备及新型亚单位疫苗研究[D].华中农业大学,2011.[59]ForsbergR,StorgaardT,NielsenHS,eta1.ThegeneticdiversityofEuropeantypePRRSVissimilartothatoftheNorthAmericantypebutisgeographicallyskewedwithinEurope[J].Virology，2002，299（1）：38-47.[60]周铁忠.辽宁省猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学调查及免疫防制研究[D].吉林大学,2010.[61]蔡雪辉,刘永刚,李艳华,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离毒株GP3、GP5和N蛋白抗原性分析[J].中国预防兽医学报,2005,27(5):321-325.[62]陈琼.广西猪繁殖与呼吸综合征病毒部分Nsp2、ORF5～7基因的克隆、序列分析及分子流行病学调查研究[D].广西大学,2008.[63]席光胜,吴其彪,黄百花,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及流行病学调查[J].中国畜牧兽医,2009,36(6):165-168.[64]李红.CD163及其它蛋白在PRRSV感染细胞过程中的相互作用[D].山东农业大学,2011.[65]王敏功.PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测技术及其单克隆抗体的研究[D].华南农业大学,2009.[66]胡玲玲,汤德元,曾智勇,等.猪繁殖与呼吸综合征诊断技术的研究进展[J].猪业科学,2017,34(6):113-116.[67]蔡家利,姜平,蔡宝祥.应用RTPCR检测流产胎儿组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒[J].VirologicaSinica,2000,15(3):272-276.[68]夏向荣,柏庆荣,柏坤桃,等.PRRSV抗体竞争ELISA检测方法的建立与标准化研究[J].畜牧与兽医,2005,37(11):000007-10.[69]WangXX,WangFX,LiZG,etal.Developmentofanindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)todifferentiateantibodiesagainstwild-typeporcinereproductiveandrespiratorysyndromefromthevaccinestrainTJM-F92basedonarecombinantNsp2protein.[J].JournalofVirologicalMethods,2017,12(7):11-13.[70]冉旭华,赵喜红,闻晓波,等.检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报,2008,30(7):544-547.[71]李素平.PRRSV重组N蛋白ELISA检测方法的建立及单克隆抗体的制备[D].河南农业大学,2009.[72]CaoS,CaiX,MinT,etal.Serodiagnosis,targetingnonstructuralprotein4,ofporcinereproductive49 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定andrespiratorysyndromevirus[J].ArchivesofVirology,2017,234(28):1-8.[73]杨春华.PRRSV监测技术平台的建立及其在疫情预警系统中的初步应用[D].河南农业大学,2014.[74]方立.猪主要病毒性疾病病原的分子检测技术研究[D].浙江大学,2006.[75]赵刚,江馗语.猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展[J].现代畜牧兽医,2013,16(4):39-42.[76]NanY,WuC,GuG.etal.ImprovedVaccineagainstPRRSV:CurrentProgressandFuturePerspective[J].FrontMicrobiol,2017,29(8):37-41.[77]HuJ,NiY,DrymanBA,etal.Immunogenicitystudyofplant-madeoralsubunitvaccineagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].Vaccine,2012,30(12):2068-2074.[78]AnCH,NazkiS,ParkSC,etal.PlantsyntheticGP4andGP5proteinsfromporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruselicitimmuneresponsesinpigs[J].Planta,2018,8(1):1-13.[79]PengJ,YuanY,ShenS.etal.Immunopotentiationoffournaturaladjunvantsco-administeredwithahighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusglycoprotein5subnit[J].VirusGenes,2016,52(2):261-269.[80]PengJ,YuanY,DuY.etal.PotentiationofTaishanPinusmassonianapollenpolysaccharideontheimmuneresponseandprotectionelicitedbyahighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusglycoprotein5subunitinpigs[J].MolCellProbes,2016,30(2):83-92.[81]翟路峰,胡东波,廖永洪,等.猪圆环病毒2型-肺炎支原体二联灭活疫苗佐剂的筛选[J].黑龙江畜牧兽医.2017,(16):147-150.[82]KwangJ,ZuckermannF,RoseG,etal.AntibodyandcellularimmuneresponsesofswinefollowingimmunisationwithplasmidDNAencodingthePRRSvirusORFs4,5,6and7[J].ResVetSci,1999,67(2):199-201.[83]SirisereewanC,NedumpunT,KesdangsakonwutS,etal.PositiveimmunomodulatoryeffectsofheterologousDNAvaccine-modifiedlivevaccine,prime-boostimmunization,againstthehighly-pathogenicPRRSVinfection[J].VetImmunolImmunopatol,2017,183(4):7-15.[84]JiangY,FangL,XiaoS,etal.AsuicidalDNAvaccineco-expressingtwomajormembrane-associatedproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusantigensinduceprotectiveresponses[J].BiotechnolLett,2009,31(4):509-518.[85]AlonsoS,SolaI,TeifkeJP,etal.Invitroandinvivoexpressionofforeigngenesbytransmissiblegastroenteritiscoronavirus2derivedminigenomes[J].JGenVirol,2002,83(3):567-579.[86]TianD,SooryanarainH,MatzinoerSR,etal.Protectiveefficacyofavirus-vectoredmulti-componentvaccineagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,porcinecircovirustype2andswineinfluenzavirus[J].JGenVirol,2017,98(12):3026-3036.[87]XuYZ,ZhouYJ,ZhangSR,etal.Stableexpressionofforeigngeneinnonessentialregionofnonstructuralprotein2(nsp2)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:applicationsformarkervaccinedesign[J].VetMicrobiol,2012,159(1-2):1-10.[88]HuP,ChenX,HuangL,etal.Ahighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome50 参考文献viruscandidatevaccinebasedonJapaneseencephalitisvirusrepliconsystem[J].PeerJ,2017,5:3514.[89]ZhouL,KangR,JiG,etal.MolecularcharacterizationandrecombinationanalysisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemergedinsouthwesternChinaduring2012-2016[J].VirusGenes,2017,14(7):1-13.[90]MokhtarH,EckM,MorganSB,etal.Proteome-widescreeningoftheEuropeanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrevealsabroadrangeofTcellantigenreactivity[J].Vaccine,2014,32(50):6828-6837.[91]EvansAB,DongP,LoydH,etal.Identificationandcharacterizationofsmallmoleculeinhibitorsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].AniviralRes,2017,146(10):28-35.[92]MokhtarH,BiffarL,SomavarapuS,etal.Evaluationofhydrophobic–chitosan–basedparticulateformulationsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccinecandidateTcellantigens[J].VetMicrobiol,2017,209(37):66-74.[93]赵福葳,陈能桥,毛以智,等.猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体消长规律研究[J].黑龙江畜牧兽医,2015,(14):99-100.[94]JiangW,JiangPX,LiY,etal.EnhancedimmuneresponsesofmiceinoculatedrecombinantadenovirusesexpressingGP5byfusionwithGP3and/orGP4ofPRRSvirus.[J].VirusResearch,2008,136(2):50-57.[95]WangX,WangZ,XuH,etal.AsingleaminoacidsubstitutionalterantigenicityofGlycosylatedprotein4ofHP-PRRSV[J].VirolJ,2016,13(1):129-133.[96]LiSJ,HochstrasserM.TheUlp1SUMOisopeptidase:distinctdomainsrequiredforviability,nuclearenvelopelocalization,andsubstratespecificity[J].JCellBiol,2003,160(7):1069-1081.[97]ButtTR,EdavettalSC,HallJP,etal.SUMOfusiontechnologyfordifficult-to-expressproteins[J].ProteinExpressionandPurification,2005,43(1):1-951 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定52 致谢致谢转眼间，三载飞逝，研究生的生涯即将画上一个看似圆满的句号。在这里，有欢笑，有泪水，有成功之欣喜，亦有挫折之苦痛，这一路看似荆棘遍地，却有人帮我一道披荆斩棘。今当离去，无问归期，黯然涕泣，不知所言为何，惟感念一路走来陪伴我身边之人。恩师王选年教授治学甚为严谨，其教学立身，授业育人之法，对我影响之深远，非只言片语所能描述，敦敦教诲言犹在耳，一言一行尽含期许。在此，我特别由衷的向我的恩师王选年教授表达我最诚挚的谢意，谢谢您这三年来对我的指导培养和帮助！同时感谢新乡学院生物技术研究中心的李鹏老师，作为我的指导老师，李老师在百忙之中抽出时间为我亲自示范试验操作，指导我的开题报告、中期考核，毕业论文研究，不辞辛苦。同时在我毕业论文方面也给予了中肯的意见和建议，在此，特别感谢！感谢河南师范大学的李卫国教授，为我研一时期学习理论课知识期间提供了学习的平台，同时在我的开题报告、中期考核等课题的进展方面也给予了中肯的意见和帮助。李老师学识渊博、为人谦逊、待人和蔼，在我的学习和生活中都给予了我很大的帮助，在此，特别感谢。感谢新乡学院生物技术研究中心的张艳芳老师、孙国鹏老师、朱艳平老师、岳锋老师，他们在试验和日常的生活中也给予了我很大的帮助，特此感谢！感谢河南师范大学生命科学学院529实验室的师姐王卫芳、王慧，她们在生活和学习方面的启发与指导对我帮助很大；感谢我的好朋友郭静、张晓静、黎梦、张婷、李玲玲、杨娜娜、米亚双、付金菊，有了她们的陪伴，使我的研究生生活更加的丰富多彩。感谢新乡学院生物技术研究中心研究生师兄李鹏，师姐王军、张秋雨、杨健、李润芷、冯金芳，他们在实验中对我有莫大帮助，在生活中对我照顾有加；感谢我的伙伴王玲玲、闫占鹏、任鹏举、邢瑞林，我们在实验中一起探讨问题，在生活中相互帮助；感谢师妹申一兰、徐若楠、武乐祎、高小静、司艳芳、崔芳微、陈威、刘佳、翟艳芳、全娟娟、林春婷，师弟何海汛、孟广超、刘金宵对我的帮助。感谢河南师范大学发放的奖学金、助学金，感谢我的导师王选年教授每个月为我发放的生活补助，使得我在三年的研究生生活上有了一定的物质保障。同时也衷心感谢我53 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定的父母对我的养育之恩，弟弟妹妹在我生活上的鼓励和支持，使得我能够全身心地投入到试验中。最后，还是要感谢母校河南师范大学和新乡学院对我的教育之恩，我会拿出自己的实际行动回馈母校。王亚平2018年5月河南师范大学54 攻读学位期间发表的学术论文目录攻读学位期间发表的学术论文目录论文1.王亚平，李鹏，任鹏举，闫占鹏，张秋雨，武乐祎，王选年*.猪繁殖与呼吸综合征新型疫苗的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，已录用。2.任鹏举，李鹏，张秋雨，王亚平，武乐祎，王选年*.新型猪瘟疫苗的研究进展[J].中国畜牧兽医，已录用。3.王玲玲，孙国鹏，徐若楠，何海汛，闫占鹏，王亚平，邢瑞林，任鹏举，李鹏，张艳芳，岳峰，朱艳平，王选年*.鸡PD-1单克隆抗体的制备及生物学功能研究[J].中国畜牧兽医，已录用。学术会议1.王亚平，李鹏，任鹏举，闫占鹏，张秋雨，武乐祎，王选年*.猪繁殖与呼吸综合征病毒HN株NSP7-铁蛋白的可溶性表达[C].河南省免疫学会第三届第二次学术会议，2017.2.张秋雨，李鹏，王亚平，任鹏举，银梅，王选年*.新乡某地区鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析[C].河南省免疫学会第三届第二次学术会议,2017“优秀学术论文奖”。3.王玲玲，孙国鹏，徐若楠，何海汛，闫占鹏，王亚平，邢瑞林，任鹏举，李鹏，张艳芳，岳峰，朱艳平，王选年*.鸡PD-1表位结合多肽的筛选及功能鉴定[C].河南省免疫学会第三届第二次学术会议,2017“优秀论文一等奖”。4.任鹏举，李鹏，张秋雨，王亚平，闫占鹏邢瑞林王玲玲武乐祎王选年*.猪瘟病毒E2-Ferritin重组蛋白的可溶性表达[C].河南省免疫学会第三届二次学术会议，2017.55 ｆ！齡Ｖ！