猪繁殖与呼吸综合征病毒gp4蛋白单克隆抗体制备与抗原表位筛选

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１申阐分类号ｉ学校代码１０２２４密绒公巧学号１２０６１０４４３＿：＿ｉ＾Ｉ普／、聲硕女学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒ＧＰ４蛋白单克隆抗体制备与抗原表位ｆ帛逸作者袁庆导师李广兴教授学位类别农学硕七所在学院动物民学学院￣级学科兽医学二级学科预防兽医学’二〇－五年六月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研。究成果据我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的），本栏可空或其他教育机构的举位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名＇；日期；年＾月巧学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可レッ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检崇，可采用影印、、汇编学位论文缩印或扫描等复制手段保存。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：哀表日期；年如００＇导师签名嫁日期；加年如＞０ ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNO.：120610443DissertationfortheMasterDegreeGenerationofMonoclonalAntibodyagainstPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusGP4ProteinandItsAntigenicEpitopeScreeningCandidate:YuanQingSupervisor:ProfessorLiGuangXingDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofVeterinaryMedicineFirstleveldiscipline:VeterinaryMedicineSecondleveldiscipline:PreventiveVeterinaryMedicineHarbinChinaJune2015 目录目录摘要...............................................................................................................................................I英文摘要.....................................................................................................................................III1前言...........................................................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)概述................................................................................11.1.1PRRS的流行病学.........................................................................................................11.1.2PRRS的病原学.............................................................................................................11.1.3PRRS的基因组.............................................................................................................21.1.4PRRSVGP4蛋白..........................................................................................................21.1.5GP4在PRRS新型疫苗研制中的作用..........................................................................31.2抗原表位的研究和应用.....................................................................................................31.2.1抗原表位的概述...........................................................................................................31.2.2T细胞抗原表位的研究手段.........................................................................................41.2.3B细胞抗原表位的研究手段.........................................................................................41.2.4表位疫苗的研究进展...................................................................................................51.2.5PRRSVGP4表位的研究进展.......................................................................................61.3研究目的和意义.................................................................................................................62材料与方法...............................................................................................................................72.1材料....................................................................................................................................72.1.1菌株、载体与质粒.......................................................................................................72.1.2细胞与病毒..................................................................................................................72.1.3实验动物......................................................................................................................72.1.4主要试剂......................................................................................................................72.1.5标准参照物..................................................................................................................82.1.6主要仪器设备...............................................................................................................82.2实验方法............................................................................................................................92.2.1PRRSVGP4基因亚克隆及原核表达............................................................................92.2.2PRRSVGP4蛋白单克隆抗体制备..............................................................................122.2.3PRRSVGP4蛋白单克隆抗体的特性鉴定..................................................................142.2.4应用噬菌体展示技术筛选PRRSVGP4蛋白抗原表位.............................................163结果.........................................................................................................................................193.1PRRSVGP4基因重组表达质粒的构建和鉴定................................................................193.2PRRSVGP4蛋白的诱导表达及纯化................................................................................19I 东北农业大学农学硕士学位论文3.2.1PRRSVGP4蛋白的诱导表达.....................................................................................193.2.2PRRSVGP4蛋白的纯化.............................................................................................203.3PRRSVGP4蛋白单克隆抗体制备及特性鉴定................................................................213.3.1免疫Balb/C小鼠血清抗体效价测定.........................................................................213.3.2最佳抗原抗体工作浓度的确定..................................................................................213.3.3阳性杂交瘤细胞的筛选.............................................................................................213.3.4杂交瘤细胞培养上清效价的测定..............................................................................223.3.5单克隆抗体亚类鉴定.................................................................................................233.3.6单抗腹水制备与纯化.................................................................................................243.3.7单抗腹水效价的测定.................................................................................................243.3.8间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与PRRSV的反应性.........................................253.3.9免疫印迹方法鉴定单克隆抗体与GP4蛋白的反应性...............................................263.3.10单克隆抗体特异性分析............................................................................................273.4PRRSVGP4蛋白抗原表位的筛选...................................................................................283.4.1噬菌体筛选与扩增.....................................................................................................283.4.2亲和能力检测与测序..................................................................................................283.4.3竞争性阻断实验..........................................................................................................314讨论.........................................................................................................................................324.1目的基因的选择...............................................................................................................324.2免疫抗原和筛选抗原的选择............................................................................................324.3动物免疫与细胞融合.......................................................................................................334.4抗GP4蛋白单克隆抗体5F12的特性分析.....................................................................334.5噬菌体展示技术筛选PRRSVGP4蛋白抗原表位...........................................................345结论.........................................................................................................................................35致谢............................................................................................................................................36参考文献.....................................................................................................................................37攻读硕士学位期间发表的学术论文...........................................................................................44II CONTENTSCONTENTSAbstract.........................................................................................................................................IAbstractinEnglish....................................................................................................................Ⅲ1Introduction..............................................................................................................................11.1OverviewofPRRS...............................................................................................................11.1.1EpidemiologyofPRRS..................................................................................................11.1.2EtiologyofPRRS...........................................................................................................11.1.3ThegenomeofPRRSV..................................................................................................21.1.4TheGP4proteinofPRRSV............................................................................................21.1.5NewvaccinedevelopmentrelatedwithPRRSVGP4......................................................31.2Researchmethodsforantigenicepitope...............................................................................31.2.1Overviewofantigenicepitope........................................................................................31.2.2MehtodsforT-cellepitope..............................................................................................41.2.3MehtodsforB-cellepitope.............................................................................................41.2.4Developmentofepitopebasedvaccine...........................................................................51.2.5ResearchprogressofPRRSVGP4epitopevaccine.........................................................61.3Thepurposeandsignificance...............................................................................................62MaterialsandMethods.............................................................................................................72.1Materials..............................................................................................................................72.1.1Bacteria,vectorsandplasmids.......................................................................................72.1.2Cellsandvirus...............................................................................................................72.1.3Animals..........................................................................................................................72.1.4Reagents........................................................................................................................72.1.5Markers..........................................................................................................................82.1.6Instrumentsandequipments...........................................................................................82.2Methods...............................................................................................................................92.2.1GenecloningandprokaryoticexpressionofPRRSVGP4protein...................................92.2.2Generationofanti-PRRSVGP4monoclonalantibody(mAb).......................................122.2.3Characterizationofanti-PRRSVGP4mAb...................................................................142.2.4GP4proteinepitopesbiopanningwithphagedisplay....................................................163Results.....................................................................................................................................193.1ConstructionandidentificationofrecombinantexpressionplasmidofPRRSVGP4gene.193.2InducedexpressionandpurificationofGP4protein...........................................................193.2.1InducdexperssionofGP4protein.................................................................................19III 东北农业大学农学硕士学位论文3.2.2PurificationofGP4protein..........................................................................................203.3Generationandcharacterizationofanti-PRRSVGP4mAb.................................................213.3.1DeterminationoftheserumantibodytiterofimmunizedBalb/cmice...........................213.3.2Optimalconcentrationsofantigenandantibody...........................................................213.3.3Screeningofpositivehybridomacells..........................................................................213.3.4Determinationofantibodytiterinhybridomaculturesupernatant................................223.3.5Identificationofanti-PRRSVGP4mAb5F12subclass.................................................233.3.6Generationandpurificationofasciticfluid...................................................................243.3.7Determinationofascitesantibodytitersafterpurification.............................................243.3.8Indirectimmunofluorescenceanalysis..........................................................................253.3.9Westernblotanalysis....................................................................................................263.3.10Specificityanalysisofanti-PRRSVGP4mAb............................................................273.4ScreeningofPRRSVGP4proteinepitope..........................................................................283.4.1Biopanningandamplificationofaffinityphage............................................................283.4.2Affinityanalysisandsequencingofpositivephages.....................................................283.4.3Competitiveinhibitionanalysisofpositivephages.......................................................314Discussion................................................................................................................................324.1Selectionoftargetgene......................................................................................................324.2Selectionofantigensforimmunizationandscreening........................................................324.3ImmunlzationofBalb/Cmiceandcellfusion.....................................................................334.4Characterizationofanti-PRRSVGP4mAb5F12................................................................334.5ScreeningofGP4proteinepitopewithphagedisplaytechnique.........................................345Conclusions.............................................................................................................................35Acknowledgements....................................................................................................................36References..................................................................................................................................37PaperspublishedintheperiodofPh.M.education..................................................................44IV 摘要摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus），临床感染主要表现为发热，早产，流产，死胎和木乃伊胎等猪群的繁殖障碍和呼吸道症状。GP4蛋白是病毒粒子囊膜的组成部分，是该病毒的次要结构蛋白之一，是由ORF4基因编码的糖基化蛋白，少量存在病毒粒子中，由183或178个氨基酸残基组成，有4个糖基化位点，GP4能够诱导机体产生中和抗体，而且在细胞受体识别病毒粒子以及在病毒变异等方面具有重要意义。噬菌体展示技术研究抗原表位不仅可以证明抗原分子的具体结构与功能，还可以揭示抗原抗体的反应机制，已广泛用于研发多种多肽疫苗和新型药物。本实验以PRRSV-HUN4株为研究对象，制备了其GP4蛋白单克隆抗体并对其抗原表位进行了筛选和初步研究。本实验以原核表达的PRRSVGP4蛋白为免疫原免疫Balb/C小鼠，通过常规方法进行细胞融合，3轮亚克隆后，成功筛选出1株抗PRRSVGP4蛋白的单克隆抗体，经亚类鉴定为IgG2b型，该株抗体的稳定性与特异性较好，不仅能够与重组GP4蛋白反应，而且能够与PRRSV有良好的反应性。应用噬菌体随机肽库对制备成功的5F12单抗进行4轮生物淘选，得到10株阳性噬菌体，测序后结果为：10个噬菌体中有4个氨基酸序列相同，其12肽序列分别为AKFEVCSPVVLG、GVNQENMLHFSF、NPRIRLNFIRIG和SGVYKVAYDWQH，命名为phage-Ⅰ-Ⅳ。序列比对发现phage-Ⅰ和Ⅱ的12肽序列分别与PRRSVHuN4株GP4蛋白第112至123位和第84至95位氨基酸序列具有很高的相似性。噬菌体竞争抑制试验与ELISA方法证实筛选出的亲和噬菌体与PRRSV及其GP4蛋白有很高的反应性，可以用于检测PRRSV及相关表位疫苗的研究，这为PRRSV病毒特性及其临床防治研究奠定理论和实验基础。关键词猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP4蛋白；单克隆抗体；噬菌体展示技术；抗原表位I AbstractGenerationofMonoclonalAntibodyagainstPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusGP4ProteinandCharacterizationofItsAntigenicEpitopeScreeningAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)wasclassifiedinthefamilyofArteriviridaeinthenewlycreatedorderNidovirales.TypicalclinicalsymptomsofPRRSwerefever,abortion,prematurity,stillbirthsandrespiratorydiseaseinpigblocks.GP4protein,asoneoftheminorstructuralprotein,istheconstituentofthevirionenvelopencodedbytheviralopenreadingframe4(ORF4).GP4isaheavilyglycosylatedproteinof180/178aminoacidswhichhas4glycosylationsitesis,andexistsatsmallamountinvirion.GP4couldinduceneutralizingantibodies,andhasalsosignificanceincellreceptorrecognitionofvirusparticles,aswellasvirusmutation.Theepitoperesearchwithphagedisplaytechnologynotonlydemonstratesthestructureandfunctionofantigen-specificmolecule,butalsorevealsthemechanismofantigen-antibodyreaction,andnowhasbeenwidelyusedinthedevelopmentofpeptidevaccinesandnewdrugs.Inthisexperiment,withPRRSVHUN4strainastheresearchobject,itwasundertakentopreparethemonoclonalantibodyagainstPRRSVGP4protein,screenandpreliminarilycharacterizeitsantigenicepitopes.Inthispaper,PRRSVGP4proteinwasprokaryoticlyexpressedand,andusedasantigentoimmunizeBalb/Cmice.Withconventionalcellfusionmethod,ananti-PRRSVGP4proteinmonoclonalantibody5F12wassuccessfullypreparedafterthreeroundsofsubcloneandscreen.ItwasidentifiedasIgG2asubclass,andhadbetterstabilityandspecificity,whichnotonlyresponsedwithrecombinantPRRSVGP4proteinbutalsoreactedwithPRRSV.Withphagedisplaytechnique,phagerandompeptidelibrarywaspannedwith5F12monoclonalantibodyfor4rounds,and10affinityphagecloneswereharvested.Sequencingresultsshowedthat4consensussequencesofthe12peptideswereidentifiedasAKFEVCSPVVLG,GVNQENMLHFSF,NPRIRLNFIRIG,andSGVYKVAYDWQH,andnamedasphage-Ⅰ-Ⅳrespectively.Itwasfoundthe12peptideofphage-ⅠandⅡhadhighsimilaritywithPRRSV(HuN4)GP4aminoacidsequenceof112-123,and84-95,respectively.Phage-basedELISAandantigencompetitiveinhibitiontestconfirmedthattheaffinityphagesdisplayedgoodreactivityIII 东北农业大学农学硕士学位论文withPRRSVanditsGP4protein.Ingeneral,thiswouldfacilitatethePRRSVdiagnosisanddevelopmentofepitopevaccinesandprovidesolidtheoreticandexperimentalbasisforthestudyofbiologicalcharacterizationofPRRSVandcomprehensivecontrolofPRRS.Keywords:PRRSV;GP4protein;Monoclonalantibody;Phagedisplaytechnique;AntigenicepitopeCandidate:YuanQingSpeciality:PreventativeVeterinaryMedicineSupervisor:ProfessorLiGuangXingIV 前言1前言1.1猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)概述猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）俗称猪蓝耳病，是一种在全球范围内传播比较广泛的新型猪病，是引发猪群繁殖和呼吸障碍的致病因素[1]。上世纪九十年代此病在欧洲和美国被首次报道，从此对世界范围的养猪业造成了严重的影响[2-3]。PRRSV属于套式病毒目，动脉病毒科，动脉病毒属。动脉病毒科的其他相关病毒是马动脉炎病毒EAV，乳酸脱氢酶病毒LDV和猴出血热病毒SHFV[4-5]。PRRSV分为两个基因型，欧洲型叫做I型病毒以及美洲型叫做II型病毒。这两种基因型表现出大约60%的基因序列同源性[6-7]。1.1.1PRRS的流行病学猪是PRRSV的易感动物，尤其以怀孕母猪和仔猪最为易感[8]，带毒猪与患病猪可成为该疾病的传染源，此病全年皆可发生。本病的诱因有很多，比如不科学的饲养，不善的管理，不完整的防疫措施和不彻底的消毒等[9]。PRRSV作为RNA病毒，极易发生重组或突变，且不同毒株之间的基因组也有大规模变异的风险，亚群或亚种会随着在猪体内的持续传染而产生。利用进化树分析，欧洲型毒株之间变异小于美洲型[10]。欧洲型：LV，美洲型：VR2332为该疾病经典毒株。1.1.2PRRS的病原学PRRSV属于动脉炎病毒属[11]，是单股正链的RNA病毒，外观呈球形，并有囊膜，直径45-65nm，膜表面平滑有纤突，核衣壳呈立方体，直径约为25-35nm。PRRSV对温度较为敏感，能够在-70℃至-20℃的情况下存活4个月左右，4℃存活30天，21℃存活7天，56℃20分钟即可失活。可在pH值6.5至7.5范围内保持生物活性，pH值小于6.0或大于7.6时导致其感染能力下降[12]。氯仿，乙醚等有机化学药剂可破坏其囊膜使其无法复制[13]。PRRSV具有苛刻的增殖条件，仅能在猴肾细胞Marc-104、猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，以及Marc-145等少数细胞中进行人工培养，可产生明显的细胞病变。研究表明PAMs易分离到PRRSV的欧洲型毒株，用CL-2621、Marc-145容易分离到美洲型毒株[14-16]。病毒在每种细胞中都能够呈现出非常出明显的病变，其主要特征为细胞圆缩与溶胞，最终细胞会逐渐脱落[17-18]。鼻甲、扁桃体等组织单核细胞对PRRSV也比较敏感[19-20]。通过免疫荧光等试验可以看到病毒抗原大多数存在于胞浆中，这说明PRRSV的复制主要在胞浆。除此之外，在感染易感细胞6-12h后，病毒从生芽到复制出子代病毒并通过细胞胞吐作用被释放出来[21]。1 东北农业大学农学硕士学位论文1.1.3PRRS的基因组PRRSV有欧洲型代表毒株Lelystadvirus，美洲型代表毒株VR-2332组成。PRRSV基因组长约15.1~15.5kb，通过一系列亚基因组mRNA转录本（mRNA1~mRNA7）进行表达，每个亚基因组mRNA翻译1或2个开放阅读框（ORFs）[22]。mRNA1翻译ORF1a和ORF1b两个开放阅读框，ORF1a翻译后形成pp1a多聚蛋白，ORF1b通过核糖体移码翻译形成pp1ab多聚蛋白。病毒本身的蛋白酶对2个多聚蛋白切割处理产生14种非结构蛋白（NSP），包括4个蛋白酶（NSP1α，NSP1β，NSP2和NSP4），RNA依赖性RNA聚合酶（NSP9），解旋酶（NSP10）和核酸内切酶（NSP11）等[23]。ORF2~5编码糖基化囊膜蛋白GP2~GP5，ORF6和ORF7分别编码非糖基化的囊膜蛋白M和核衣壳蛋白N。ORF2b位于ORF2内，形成非糖基化蛋白GP2b[24]。现在又发现ORF5a编码5a蛋白。PRRSV有大量的膜蛋白，这也是套式病毒目的特征，并且所有的结构蛋白都影响其感染力。1.1.4PRRSVGP4蛋白目前被报道的PRRSV的结构蛋白有8个，其中GP2~5蛋白是糖基化蛋白，GP2b、5a、M和N蛋白为未被糖基化修饰的蛋白。GP5和M蛋白含量比较高，称为主要囊膜蛋白（majorenvelopedprotein）；GP2、GP2b、GP4、GP4和5a蛋白在病毒粒子中比例比较少，称为次要囊膜蛋白（minorenvelopedprotein）。次要蛋白在PRRSV感染以及产生中和抗体中具有重要作用[25]。其中GP4蛋白具有较强的抗原性，大量实验结果证明针对PRRSVGP4产生的抗体能够有效抑制病毒感染，可以使猪免受PRRSV的感染，但其产生抗体的能力弱于GP5[26]。GP4由ORF4基因编码,在LV株中发现GP4是糖基化蛋白,但其糖基化效率很低,用抗GP4多肽特异性血清与CL2621细胞培养物及经裂解的感染的CL2621细胞进行免疫沉淀试验表明,LV株GP4蛋白有两种产物,一种为细胞内存在的20一28kDa的GP4蛋白,一种为成熟病毒粒子中31-35aa的GP4蛋白,这可能与蛋白在内质网和高尔基体的运转过程中添加了N-糖链有关。与Roeland等报道的一样,在EAV中GP4在病毒感染的细胞内很大一部分也没有被糖基化,而完全糖基化的GP4仅发现在病毒粒子中,这是因为在病毒感染的细胞中,由于糖基化处于不成熟状态,大部分GP4蛋白滞留在内质网中,只有一少部分GP4蛋白被组装到病毒粒子中。对于EAV的GP4蛋自已经证实属于典型I类膜蛋白。在GP4蛋白的N端和C端都有高度的亲水区域,N端的疏水氨基酸(l-17aa)认为是该蛋自的信号肽序列[27],而C端的疏水区(165-183aa)可以将该蛋白锚定到病毒的膜上。推测二者之间的部位位于蛋白的外区,构成主要抗原区,这些与该蛋白属于典型的I类膜蛋白的特征是一致的。GP4蛋自具有4个N-糖基化位点,在欧美株中是保守的。研究表明LV株的GP4蛋白具有诱导中和抗体的活性[28-30],但GP4的单抗在中和病毒方面很明显不如GP5的有效[32]。利用PRRSV丹麦分离株的ORF4基因免疫质粒免疫猪,也可以在猪体内检测到中和抗体[33]。然而Kwang等在实验中发现从美国和加2 前言拿大猪场采集的PRRSV感染猪血清大约有65%与原核表达的北美洲分离株GP4重组蛋白反应呈阳性,但Gnoni等却认为康复猪血清的病毒中和抗体和抗GP4抗体的出现没有关系[34]。因此,至于PRRSV感染后GP4能否诱发产生中和抗体还是具有有争议的。由于美洲型与欧洲型之间以及美洲型毒株之间存在很大变异，美洲型毒株GP4有没有与中和作用有关的抗原位点，暂时还难以断定。1.1.5GP4在PRRS新型疫苗研制中的作用PRRSV严重影响了世界养猪行业，造成了巨大的经济损失，当前较成熟的商品化疫苗是弱毒苗和灭活苗，但它们的缺点是疫苗的免疫效果并不稳定与也并不安全，无论是弱毒苗还是灭活苗给猪体提供的保护只是部分的。其中弱毒苗仅仅能保护同源病毒的感染，而对异源毒株没有良好的保护效果，对强毒株的攻击更是无法抵抗，同时弱毒疫苗还会出现返祖现象，诱发毒力返强的危险，而灭活苗的免疫失败现象更是经常出现[35]。将PRRSVGP3，GP4，GP5蛋白串联或分别重组到腺病毒载体当中，活体试验已经证明这种重组病毒具有良好的免疫原性，并且针对GP4的单克隆抗体不会产生抗体依赖性增强反应[36]。单独利用GP4或是GP5其中一种蛋白，刺激机体产生的中和抗体的滴度都比较低，但是将三种蛋白串联在一起后，刺激机体产生的抗体滴度却较高，同样，串联表达的重组腺病毒比灭活疫苗或弱毒疫苗相比，前者的免疫效果要好。将GP4和GP5蛋白作为免疫原，给怀孕母猪分别能够提供68.4%和50%的保护率[37]。其中GP4的保护力度在抗体水平较低的情况下更高，这可能是因为GP4不能够诱导体液免疫却可以诱导细胞免疫的结果，因为有文献说明在诱导细胞免疫方面GP4要比GP5略强一些，即GP4增殖水平在GP3与GP5之间，但产生的中和抗体水平却是GP4在感染初期最高，在后期GP5才高于GP3和GP4。因此，即使GP4能产生中和抗体，但弱于GP5，且GP3、GP4、GP5的协同作用远大于它们单独作用[38]。1.2抗原表位的研究和应用1.2.1抗原表位的概述抗原分子上的免疫活性区刺激机体后，能够产生致敏淋巴细胞或抗体，这一活性区为抗原表位。只识别抗原表位而不识别完整的抗原分子决定了抗体的特异性[39]。抗原表位为5-30个大小的氨基酸残基。根据所结合细胞的不同分为B、T两种表位；根据不同的结构，可分为连续性与非连续性表位，并且前者又称为线性表位，后者又称为构象性抗原表位[40]。表位决定了蛋白质的抗原性，对新型疫苗分子以及开发诊断试剂方面具有很大的意义[41]。3 东北农业大学农学硕士学位论文1.2.2T细胞抗原表位的研究手段由于T细胞识别线性表位，所以用合成肽法的方法，随机或连续合成肽链，再用它的免疫功能分析可能被T细胞识别的肽段。该方法的缺点为耗费人力，且容易遗漏表位。此外，筛选T细胞抗原表位也可以通过免疫信息学和多肽活性测定等方法进行[42]。1.2.3B细胞抗原表位的研究手段1.2.3.1理论性预测该法对于已知结构的蛋白质或多肽进行预测更适用一些。自80年代提出亲水性参数对表位进行预测的方法后[43]，对表位的研究有了很大的推进。现已被接受并有一定预测效果的方法主要为亲水性方案[44]、可及性方案[45]、抗原性方案[46]、可塑性方案[47]、电荷分布方案[48]、二级结构预测方案[49]6种。各种方案的正确率均不是很高。1.2.3.2核磁共振光谱技术及表面等离子共振技术X射线衍射是唯一能真正反映抗原与抗体互相识别彼此的一种技术[50]。核磁共振光谱技术（NMR）是具有磁距的原子核在高强度磁场力的调节作用下，吸收了特定频率的电磁波辐射，出现不同的频率，进而形成共振谱。原子的具体位置、数目和潜在功能在光谱结果中得到显示，物质的分子量、有机结构、生物学功能也分别被分析出来。而表面等离子共振（SPR）与NMR的结合，可以明确像抗原与抗体分子之间的相互关系[51-52]。Zvi等通过上述技术获得了艾滋病病毒gp120特异性抗体与病毒结合的结构示意图，最终确定了14个氨基酸是gp120抗原表位的一部分[53]。应用以上两种技术手段筛选空间构象型表位的缺点是程序复杂耗时。1.2.3.3表位肽扫描技术是根据已知蛋白质抗原分子的基因序列，合成或表达连续的重叠短肽，与相应的单抗或多抗反应，分析检测结果，以确定相应的抗原表位。这一技术要求有明确的抗原一级结构，并且检测结果为抗原线型表位，对构象型表位则无从获知。基本方法有：①根据蛋白质抗原分子的基因序列合成多肽片段，这些片段覆盖了整个蛋白质抗原分子序列并且部分重叠，然后利用单抗或多抗来检测能起阳性反应的片段，以获取抗原表位。②设计相应的引物将蛋白质抗原分子进行分段表达，表达产物纯化后用特异性抗体进行检测，根据阳性反应肽段的相应编码基因片段进行表位推测。周艳君等[54-56]将猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白进行一系列的氨基酸截短表达，通过蛋白质免疫印迹试验证实了M蛋白第ll7位～第129位氨基酸序列可与猪繁殖与呼吸综合征的阳性血清进行特异性反应，从而确定出相应的B细胞抗原表。③利用某些核酸外切酶具有选择性从3末端切除核苷酸的活性，来消化编码区核苷酸序列，并将不同消化时问的产物分别插入适当载体，经表达得到一系列长度不等的同源性多肽，有抗4 前言原性的多肽经免疫反应筛选出来，再测定相应的DNA序列，即可知道表位图谱。1.2.3.4蛋白质“切割”法此法是在获得蛋白质抗原分子的基础上用某种化学试剂或蛋白酶将纯化的蛋白质切割成若干小片段的多肽，用聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤和离子交换等方法将其分开，然后通过蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附试验等检测手段检测他们与不同单克隆抗体或高免血清是否有反应，从而确定蛋白质的抗原表位[57-58]。或者是将蛋白质抗原和抗体先进行反应，然后利用蛋白酶进行水解，蛋白质上与抗体结合的部位将不被蛋白酶所作用，从而推测出相应的抗原表位。1.2.3.5噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将备选多肽的基因克隆到线性噬菌体的基因组中，在噬菌体外壳蛋白表面备选的短肽以融合形式得以表达，形成了噬菌体展示肽库。线性表位和空间表位均可以利用噬菌体展示技术进行筛选而得到。在三维结构上，确定构象表位的具体位置是有难度的。因为抗原上分散的氨基酸与任何的序列缺乏同源性的模拟肽均可能被筛选出来。在线性的鉴定过程中，并不是所有备选肽都可以找到一个同源序列。没有任何单独的技术能够普遍地、成功地应用于模拟肽的定位，但在T细胞抗原表位的筛选与鉴定过程中，最直接有效的方法当属噬菌体展示技术，这比其他方法都容易[59]。徐和敏构建了猪瘟病毒E2基因的噬菌体展示文库，用该技术对猪瘟单克隆抗体和猪瘟高免兔源血清分别得到了5条与E2蛋白高度同源的多肽序列[60]；Jiang等利用生物信息学和噬菌体展示肽技术相融合的方式，成功获得了登革热病毒非结构蛋白位于36-45位氨基酸和187-196位氨基酸的2个表位[61,62]。1.2.4表位疫苗的研究进展表位疫苗(Epitopevaccine)，它是用抗原表位制备的疫苗，其中包括几种，分别为合成肽疫苗、重组表位疫苗及表位核酸疫苗，这几种是目前有关传染性疾病和恶性肿瘤疫苗的重点研究方向。将多种T细胞表位的氨基酸，连接于分支状的多聚赖氨酸骨架上，形成独特三维空间结构的大分子多抗原肽疫苗[63]。由于基因疫苗肌注后诱导的免疫应答比较弱，因此新疫苗的研发已成为研究的热点之一[64-65]。虽然表位疫苗有许多优点，但也存在着一些问题：(1)单独应用多肽免疫原性较低[66]。(2)表位的鉴定与筛选是基础与前提。(3)基因限制性问题。新型表位疫苗较传统疫苗具备一定的优势。当前，表位疫苗在抗肿瘤、抗病原微生物及抗寄生虫等领域被应用。Mine等报道，治疗黑色素瘤的表位疫苗已经在日本进入临床应用的阶段[67]。周维英等构建了良好免疫原性的表位疫苗[68]；另外，Chen等构建了成功刺激小鼠产生高效价的特异性IgG的铜绿假单胞菌多表位基因疫苗[69]。最近Curtidor等通过计算机预测表位及化学合成了恶性疟原虫的高结合性表位，并制成了表位多肽疫苗，该疫苗接种猴后能够引起持久高效的抗体滴度[70]。5 东北农业大学农学硕士学位论文1.2.5PRRSVGP4表位的研究进展目前在欧洲分离株的GP4蛋白已经发现至少含有3到5个线性表位和2个不连续表位其中包括至少2个线性中和表位和l个不连续中和表位。Meulenbegf等(1997)利用PRRSVLV株的15株针对GP4的有中和活性的特异性单抗,鉴定出2个线性表位,其中40-79aa区域的抗原表位能被所有15株单抗识别,而表位59-67aa(R59KASLSTS67,)只被其中6株单抗所识别,而其他9株单抗不与该区域反应。推测这9株单抗识别的表位是构象依赖型的或者是它们识别一个不连续的表位,这个不连续的表位与59-67氨基酸的部位毗邻或者存在部分的重叠,或者二者相互作用,相互关联。虽然这些单抗具有病毒中和活性,但它们并不识别和中和LUX株[71]。而且经比较发现鉴定出的中和表位在欧洲型分离株间高度变异,并认为此处的突变可造成GP4蛋白抗原性发生改变,推测该区域可能易受免疫选择压力的影响。由于北美洲型毒株在该区与Lv株中和表位的序列存在4个氨基酸的缺失。因此该区的构象是否与北美洲型的构象一致或者北美洲型毒株在该区是否也存在中和表位尚有待考究。而Olekseiwicz等(2001)应用噬菌体展示技术对欧洲型PRRSV进行抗原表位定位时,在GP4中筛选到一个具有很强抗原性的表位ES12,其位于48-76aa,并且通过实验表明该表位在各分离株间高度保守。从以上研究来看,这两个区域虽然相互重叠,但结论却相反,因此我们认为该表位是否保守还有待于进一步论证。目前在北美洲型分离株中尚未见关于GP4抗原表位的详细报道,仅有一研究组用昆虫细胞表达的北美洲VR2385株重织GP4蛋白制备了4株单抗,这些单抗都不具有中和活性,经鉴定后认为这4株单抗所针对的抗原表位都是构象依赖型表位,但却没有精确定位。1.3研究目的和意义鉴于之前的研究，GP4蛋白在PRRSV感染细胞以及病毒粒子装配的过程中具有不可替代的重要作用[73]，特别是GP4蛋白在与CD163受体相结合的过程中占据主要地位[72]，同时PRRSV毒力会因为GP4糖基化位点的突变而受到影响[74]。针对GP4蛋白功能及其抗原表位的研究对于阐明病毒特性具有重要意义。故此，本实验制备了PRRSVGP4蛋白的单克隆抗体，并利用噬菌体展示技术筛选抗PRRSVGP4蛋白单克隆抗体的高亲和性配体（即PRRSVGP4蛋白抗原表位），阐明该蛋白的抗原表位这将为PRRSV病毒特性及其表位疫苗研究奠定理论和实验基础。6 材料与方法2材料与方法2.1材料2.1.1菌株、载体与质粒大肠杆菌感受态JM109、Rossetta，大肠杆菌系统原核表达载体原核表达载体pET‐32a,由本实验室冻存,质粒pET‐32a‐PRRSV/GP4，由本实验室构建。2.1.2细胞与病毒杂交瘤细胞SP2/0、猴肾上皮细胞Marc‐145、TGEV、PEDV、PPV、PrV等均由本实验室保存,PRRSVHuN4株由东北农业大学动物医学系基础兽医学李广兴老师惠赠。2.1.3实验动物Balb/CSPF小白鼠，体重大约为20g，年龄为8周龄，在哈尔滨市兽医研究所实验动物中心购买。2.1.4主要试剂2.1.4.1生物工程酶及常规试剂盒质粒DNA提取试剂盒，DNA胶回收与纯化试剂盒购自索莱宝公司；Ex‐Taq、r‐TaqDNA聚合酶购自大连宝生物公司；HRP标记山羊抗鼠IgG二抗和FITC标记山羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；M13噬菌体多克隆抗体购自NEB公司；RNA快速提取试剂盒购自北京莱博赫斯公司。2.1.4.2主要药品及试剂蛋白胨、IPTG、琼脂糖、弗氏佐剂、酵母提取物，均购自Sigma公司。乙醇、NaCl等化学药品及试剂均为分析纯。TMB显色液，购自北京天根生物有限公司。细胞培养液、灭活胎牛血清均购自Gibco公司，单克隆抗体亚类检测试剂盒购自Sigma公司。（1）PBS（pH7.4）：137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LKH2PO4。（2）50×TAE（pH8.0）：Tris121g，冰醋酸28.55mL，0.5mol/LEDTA50mL。（3）LB液体培养基（总体积1000mL，pH7.0）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl107 东北农业大学农学硕士学位论文g，混匀后进行高压灭菌，4℃保存。（4）Amp+固体培养基（1000mL，pH7.0）：LB液体培养基，琼脂粉15g，高压灭菌后加入氨苄霉素，倒板，待凝固后4℃保存。（5）Kana+固体培养基（1000mL，pH7.0）：LB培养基，琼脂粉15g，高压灭菌后加入卡那霉素，倒板，待凝固后4℃保存。（6）Low-LB液体培养基（1000mL，pH7.0）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，高压灭菌，而后4℃保存。（7）四环素LB液体培养基（1000mL，pH7.0）：LowLB培养基，高压灭菌后，加入50µg/mL的四环素，而后4℃避光保存。（8）四环素LB固体培养基（1000mL，pH7.0）：LowLB培养基，琼脂粉15g，高压灭菌后，加入50µg/mL的四环素，倒板，待凝固后4℃避光保存。（9）IPTG-Xgal：1.25gIPTG与1gXgal溶于2.5mlDMSO中，混匀，充分溶解后，-20℃避光保存。（10）IPTG-Xgal固体培养基(1000mL)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷至70℃左右，加入1mLIPTG-Xgal，混匀后倒板，待凝固后，4℃进行保存。（11）顶层琼脂（1000mL，pH7.0）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，MgCl2·6H2O1g，琼脂粉7g，高压灭菌后，室温进行保存。（12）PEG-NaCl：20%PEG-8000，2.5mmol/LNaCl，高压灭菌，室温保存。（13）封阻液：0.1mol/LNaHCO3（pH8.6），5mg/mLBSA，0.02%NaN3，过滤除菌，4℃保存。（14）PBST：0.01mol/LPBS，0.1%Tween-20，室温保存。（15）OPD显色液（pH5.0）：0.2mol/LNa2HPO425.7mL，0.1mol/L柠檬酸24.3mL，蒸馏水50mL，4℃保存[70]。2.1.5标准参照物DNA标准分子量，购自大连宝生物公司；蛋白质标准分子质粒，购自ThermoFisherScientific公司。2.1.6主要仪器设备PCR扩增仪、电转仪及电源及酶标测定仪：美国Bio-RAD公司高速离心机(J2-21M)和台式小离心机(16G)：美国SIGMA公司-80℃低温冰箱、-20℃低温冰柜、4℃冷藏冰柜：海尔公司DNA/RNA/蛋白微量检测仪：Thermo公司电泳槽，电泳仪(DYYIII-11)：北京六一仪器公司8 材料与方法空气振荡器：哈尔滨东联电子公司电热恒温水浴槽：森信实验仪器公司电子pH调试计、台式离心机（TGL-16型）：上海医疗器械六厂水平型摇床：北京六一仪器公司微量电子天平、CO2恒温培养箱，METTERAE260型：Deltalange公司凝胶成像仪：UItra-VIoletProductsLimitedCambridgeUK公司倒置荧光显微镜：日本NIKON公司。2.2实验方法2.2.1PRRSVGP4基因亚克隆及原核表达2.2.1.1引物设计参照GenBank上发表的PRRSV-HUN4株GP4基因序列（No.EF635006.1）设计上下游引物。目的片段编码GP4基因，长度应该为537bp。表2-1M基因引物序列Table2-1PrimerssequencesofGP4gene引物名称引物序列P15′GGGGGAATTCATGGCTGCGTCCTTTCTT′P25′CCCCCTCGAGTCAAATTGCCAGTAGGATPCR反应体系（单位µL）：反应总体积10pcDNA3.1-TGEV/M0.5Ex-Taq酶0.1510×buffer1dNTP1上游引物（P1）0.5下游引物（P2）0.5灭菌水6.35PCR的条件设置为：预变性95.0oC，10min；之后进入PCR反应30个循环，94.0oC，1min；退火温度53℃，1min；72oC，60s；终延伸72oC，10min；降温至4℃后取出反应物，制备浓度为1%的琼脂糖凝胶，取2μL反应产物进行电泳鉴定，剩余PCR产物可置于4℃保存。2.2.1.2DNA目的片段纯化应用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化并回收：9 东北农业大学农学硕士学位论文（1）用大梳子制备浓度为1%的琼脂糖凝胶；（2）将PCR产物加入胶孔中，80V条件下进行电泳；（3）电泳结束后，将胶至于紫外灯下，准确切出含有目的DNA的凝胶块，尽量切除不含目的片段的胶块；（4）将切好的凝胶块置于EP管中，用分析天平确定目的胶块的重量；每100mg凝胶加入300μL溶解液，将EP管置于56℃水浴条件下加热，间隔几分钟震荡一次EP管，至胶块融化；（5）将融化的胶液加到吸附柱上，并放到套管上，10,000rpm离心1min，弃掉套管中的液体；（6）向吸附柱中加入600μL的漂洗液，离心后弃掉漂洗液；（7）重复步骤6）；（8）不加任何液体，高速空离2min；（9）将吸附柱放到干净的EP管中，向吸附柱中央加50μL洗脱液，10,000rpm离心2min；（10）将EP管中收集的液体重新加回吸附柱中，10,000rpm离心2min，以达到提高回收率的目的；2.2.1.3目的片段GP4与pET-32a载体的双酶切处理过程（1）双酶切处理体系（单位µL）：反应总体积50XhoI2.5EcoRI2.510×Kbuffer5目的片段GP4或pET-32a空载体15灭菌水15具体反应条件37.0℃；4h（2）应用小量DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，具体步骤同2.2.1.2方法。（3）JM109感受态细胞的制备1）配制Inoue缓冲液，HEPES10mM，KCl250mM，调PH至6.5，灭菌后冷却至室温，加入MnCl255mM无水CaCl2120mM，彻底溶解后用0.45um滤器过滤，备用；2）将冻存的JM109菌种划线培养在LB平板上，37℃培养过夜；3）挑取单个菌落于2mLLB中，摇床中培养8h；4）菌液按1:100接到LB培养基中，25℃，150-180rpm摇菌过夜（12小时左右）；5）将菌液分装至无菌离心管中，2,500rpm离心5-10min，弃上清，用20mLBuffer（4℃遇冷）重悬；6）冰浴10min，-20℃15min；7）500rpm离心5-10min，弃上清，用5ml(分装量)Buffer（4℃遇冷）重悬；10 材料与方法8）冰浴10min，43℃-4h(或过夜)9）加DMSO至终体积的7%，混匀后再分装（也可4℃放30min再分装）。10）最好经过液氮，短时间速冷，再放入-80℃冰箱2.2.1.4重组表达质粒的构建连接体系如下（单位µL）：连接反应总体积20pET-32a5目的片段1110×Ligationbuffer2DNA链接酶2反应温度16.0℃样品在16℃条件下连接过夜，连接产物转化到JM109感受态。2.2.1.5重组蛋白GP4蛋白阳性质粒的转化（1）将阳性重组质粒pET-32a-GP4加入到处于冰水混合物状态的100μL大肠杆菌JM109感受态中，轻轻弹离心管管壁后，使之混匀后冰上作用30min。（2）将冰浴后的离心管放入水浴锅里42℃，静置90s。（3）再将离心管冰上作用2min。（4）将离心管内的混合物加入到含有37℃预热的LB培养基的离心管中。（5）轻弹离心管壁，使其混匀，再将混合物在37℃条件下振荡，培养45min。（6）将振荡培养的菌液，在含氨苄抗性的平板上划线培养，37℃倒置培养过夜。2.2.1.6重组菌的诱导（1）用10μL枪头从培养过夜的LB平板上轻轻挑取单个菌落，接种于氨苄抗性的培养基中扩大培养12h左右；（2）将培养的菌液按照1:100的比例接种氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃下剧烈震荡培养3h；（3）取出1mL菌液作为诱导前对照，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂。将加入诱导组和对照组继续在37℃培养；（4）参照以往的条件，将大肠杆菌大量诱导5h后的蛋白表达量最大，再经超声波进行破碎裂解处理。而后将超声后的样品离心10min，收集沉淀，向沉淀中加入上样缓冲液，在水浴锅里煮沸10min，待冷却至室温后进行SDS-PAGE。2.2.1.7重组菌的表达（1）参照分子克隆的具体要求，向事先固定好的胶板中缓慢加入浓度为12%的下层胶，然后加入1mL双蒸水，将下层胶的液面压平，待下层胶彻底凝固；11 东北农业大学农学硕士学位论文（2）参照分子克隆的具体要求，将胶板中的1mL双蒸水倒出，用吸水纸吸净剩余水层后将充分混匀的浓度为5%的上层胶，注入到胶板中，迅速插入梳子同时避免产生气泡，上层胶完全凝固需约1h；（3）将胶板固定于配套的固定架上，放置于电泳仪中，将新配置的Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入到内槽中加满，将电泳液倒入外槽，液面略高于玻璃板底边；（4）将蛋白样品分别取出10µL加入到上层胶的胶孔中，按照上层胶恒压80V、下层胶恒压120V的条件进行电泳，直至蓝色条带彻底跑出胶体；（5）小心将切除上层胶，再将下层胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色10min后，再转移至清水中进行缓慢震荡脱色。2.2.1.8重组GP4蛋白的纯化采取的是切胶纯化的方法。首先，将大量诱导后蛋白样品通过SDS-PAGE进行分离，待电泳终止后用蒸馏水清洗凝胶，切去蓝色条带部分。随后，再用PBS轻轻清洗凝胶。最后，将凝胶放在4℃预冷的0.25MKCl溶液中，显色5min。待胶体上出现清晰的白色条带时，用小刀切下目的蛋白，并将其充分研碎后加入适量PBS混匀。反复冻融三次，使蛋白裂解于PBS溶液中，10,000rpm离心10min，此时的上清即为纯化的重组GP4蛋白，而后放于-20℃备用。2.2.1.9纯化蛋白的复性用电泳检测纯化的蛋白条带是否单一，确定单一后对其进行复性。透析袋的预处理：1）将含有2%NaHCO3的预处理液进行煮沸，2）将透析袋煮沸5min，之后用无菌水清洗干净，再将透析袋放于煮沸的EDTA中，3）将透析袋保存于4℃条件下同浓度的EDTA中。2.2.1.10聚丙烯酰胺凝胶电泳分析先制备浓度为12%的下层胶与5%上层胶。将样品进行上样，同时设对照，进行SDS-PAGE分析。2.2.1.11重组蛋白浓度的检测与保存将蛋白稀释液作为空白组，测定制备的蛋白浓度，方法按公式计算：蛋白质浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数。将浓度较高的蛋白分装冻存于-80℃。2.2.2PRRSVGP4蛋白单克隆抗体制备2.2.2.1动物免疫将纯化后的重组GP4蛋白作为抗原进行免疫，首免时，将GP4蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化，并按80µg/只的剂量腹腔注射BALB/c小鼠。首免两周后进行二免，剂量与方式参12 材料与方法照第一次免疫，值得注意的是佐剂换为弗氏不完全佐剂，然后于二免两周后进行三免。在三免后一周，对小鼠血清进行分离，用ELISA法检测其血清抗体效价，于融合前3d取80µg/只GP4蛋白进行腹腔注射的加强免疫。2.2.2.2间接EILSA方法检测血清中抗GP4蛋白效价用pH8.6的0.1MNaHCO3将纯化后的GP4蛋白稀释至5µg/mL，在酶标板中以100µL/孔4℃包被过夜。第二天，弃去包被液，用PBS清洗两次，再用5%脱脂乳封闭。将待检血清与阴性血清分别从1:50开始进行连续二倍倍比稀释，在酶标板上孵育1h，弃液后用PBS进行洗涤，再加入1:5000稀释的HRP标记山羊抗鼠二抗，避光孵育50min后弃掉，进行显色。最终于490nm处读取OD值，将P/N≥2的最高稀释度作为抗体效价。2.2.2.3饲养层细胞的制备在融合前一天，将健康的BALB/c小鼠进行眼球取血，然后拉颈处死，在酒精中浸泡5min。而后移入超净台中，将小鼠的四只爪子用针头固定，用镊子提起腹部的皮肤，再用灭菌剪刀在提起的皮肤处剪一小口，对皮肤进行钝性分离，充分暴露腹膜后，用注射器将HAT培养液注入小鼠腹腔，然后固定注射器，再用酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部，最后吸出腹腔内培养液，将吸出的培养液转移至100mL的葡萄糖瓶中备用，向其中加入50mLHAT培养液进行混匀，然后滴到96孔板中，100µL/孔。2.2.2.4骨髓瘤细胞的制备对实验室保存的SP2/0细胞，在无菌室进行复苏，用1640完全培养基培养。在融合前一天，对细胞进行常规传代，第二天将呈对数生长期的SP2/0细胞从管瓶壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心后弃上清，计数备用。2.2.2.5脾细胞的准备将免疫的BALB/c小鼠眼球放血，然后拉颈处死，将分离的血清放入离心管中，作为阳性对照。在75%酒精中浸泡5min后，移入超净台，将小鼠的四只爪子用针头固定，无菌条件下，取出脾脏，在盛有基础1640的无菌平皿中，反复清洗4-5次，同时将脾脏被膜上的结缔组织进行剥离。在脾脏一端，用注射器的针头刺数个小孔，用镊子夹起脾脏的另一端，将培养液用注射器从脾脏内注入，从另一端的数个孔流出，进行反复操作，尽量将脾细胞冲洗出来，将平皿中脾细胞悬液转移置离心管中，离心后弃上清，再用2mL培养液悬起细胞后进行细胞计数。2.2.2.6细胞融合按常规步骤，将SP2/0与脾细胞按1：8的比例混合后加人到离心管中，再用1640培养液补充到l0mL，离心弃正清，轻轻弹管底，使两种细胞混匀，将离心管放入37℃的水中，再吸取37℃预热的PEG3350在60s内将其沿转动的离心管壁缓慢滴人，再用吸管将细胞悬液在30s左右缓缓吸入，静止30s，再在30s内将其重新吹入细胞离心管内。在37℃水浴13 东北农业大学农学硕士学位论文锅中水浴90s，立即将10mL37℃预热的1640基础培养液在5min内加人，离心弃上清，用培养液洗涤，最后用20%的HAT培养液将沉淀轻轻悬起。加人到铺有饲养层细胞的96孔板中，l00ul/孔，37℃5%CO2的温箱中培养。融合后的3-5天，出现小克隆，杂交瘤细胞为较大的圆形透明细胞，而其它细胞逐渐死亡。融合9天后，观察并记录，每孔中杂交瘤细胞堆数。2.2.2.7融合细胞的筛选、克隆阳性杂交瘤细胞融合以后，要认真的观察细胞生长状态，作好相关记录。待细胞长满孔底1/5-1/3左右，细胞融合后第12天，对杂交瘤细胞培养上清进行间接ELISA方法检测（同2.2.2.2），同时将SP2/0细胞培养上清作为阴性对照，未免疫小鼠血清、免疫小鼠的血清作为对照组，P/N大于2为阳性，对检测出的阳性孔其进行亚克隆。对克隆后剩余的细胞扩大培养并冻存。亚克隆后10d左右，检测上清，对其中的2-3个阳性孔再进行亚克隆，方法同上，直至筛选出100%阳性结果为止。2.2.2.8杂交瘤细胞的冻存因为杂交瘤细胞经过长期培养易丧失分泌抗体的能力，因此必须及时冻存。将细胞从细胞培养瓶中轻轻吹下，离心，将血清、DMSO按一定的此例，配置成冻存液，将吹下的细胞离心后弃上清，加人细胞冻存液，转移到冻存管中。4℃预冷30min,然后-20℃放置1h，最后-80℃贮存。2.2.3PRRSVGP4蛋白单克隆抗体的特性鉴定2.2.3.1杂交瘤细胞上清效价的测定将ELISA板进行抗原包被，孵育倍比稀释的杂交瘤细胞株的细胞上清，同时将SP2/0培养上清液作为阴性对照，以P/N≧2为阳性，因此大于2的基础上，抗体最大稀释度作为最终效价。2.2.3.2单克隆抗体亚类检测按照亚类试剂盒说明书进行检测。具体步骤如下：用pH8.6的0.1MNaHCO3，将纯化后的GP4蛋白稀释，然后以100µL/孔包被酶标板，4℃过夜。孵育待检上清，将SP2/0设为对照组，37℃孵育30min；用PBST洗板5次，用含10%胎牛血清的PBST将六种酶标记物按1:1000比例进行稀释，100µL/孔，37℃下孵育30min；再用PBST洗板5次，OPD显色后用2M硫酸终止，读取OD值。2.2.3.3单克隆抗体腹水制备与纯化（1）将液体石蜡注射到10周龄BALB/cSPF级小鼠腹腔中，每只小鼠注射剂量为0.5mL；（2）一周后，将产生抗GP4蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞5F12按每只小鼠5×105/0.214 材料与方法mL的剂量向腹腔缓慢而均匀地注射；（3）每天观察小鼠腹部，待腹部膨大明显，皮肤呈紧张感时，即可用16号针头收集腹水。可收集2-3次，每次间隔1-2天；（4）将收集到的腹水离心后收取上清，再用三氯甲烷处理腹水去脂，-80℃分装冻存。2.2.3.4辛酸-硫酸铵法纯化单抗腹水（1）向1.7mL腹水中加入4mLpH4.0的0.06M醋酸盐缓冲液，然后用0.1M的HCl将pH调节至4.5；（2）将56µL正辛酸在30min内滴入其中，此过程在室温下缓慢搅拌进行。4℃静置2h后，离心，弃去悬浮物，收集上清备用；（3）过滤上清，用大约上清5倍体积的pH7.4的0.01MPBS，加入其中，再用2MNaOH将pH调节至7.4；（4）将pH7.4的饱和硫酸铵溶液在4℃条件下，30min内缓慢加入其中直至45%饱和度，并在4℃条件下沉淀过夜；（5）4℃条件下，10,000rpm离心30min，弃上清，将沉淀溶解于pH7.4的1mLPBS中；（6）将溶解液装于透析袋中，用4℃的蒸馏水，进行2h的透析，再将溶解液转移到pH7.4的PBS中，透析过夜，最后用PBS透析4h；（7）最后收取的透析液即为粗提抗体，而后进行电泳纯度分析。2.2.3.5纯化前后腹水效价的检测纯化前后腹水效价，均用间接ELISA方法进行测定。2.2.3.6间接免疫荧光分析用0.5g/L胰酶，将长成单层的marc-145细胞消化后，将细胞分装到96孔细胞培养板中，在37℃温箱中培养24h左右,细胞长满至80%，再感染病毒，在37℃温箱中孵育72h后进行间接免疫荧光实验。步骤如下：（1）待细胞出现明显病变时，弃去上清，用PBST清洗3次。（2）加入0.4mL4%多聚甲醛，常温固定30min；（3）每孔加入0.4mL0.1M甘氨酸，室温中和5min，PBST清洗3次；（4）每孔加入0.5mL0.1%TritonX-100，室温作用10min，PBST清洗3次；（5）每孔孵育筛选后的杂交瘤培养上清，同时SP2/0上清液作为阴性对照，37℃条件下孵育1h，之后PBST清洗3次；（6）将FITC标记的二抗进行1:200稀释，37℃条件下作用1h，PBST清洗3次；（7）光显微镜观察结果。2.2.3.7免疫印迹分析单克隆抗体与GP4蛋白的相互作用，采用Westernblot技术进行检测。15 东北农业大学农学硕士学位论文（1）将GP4蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；（2）将滤纸片和硝酸纤维素（NC）膜修剪成蛋白胶样品区域的大小，并侵润到膜转移缓冲液；（3）按照仪器说明书要求的顺序在半干转印仪上放置好滤纸、NC膜、蛋白胶体，整齐叠放并排出气泡；（4）40mA恒流转印90min;（5）转印结束后，用含5％脱脂奶粉的PBST进行封闭处理，4°C过夜；（6）次日用PBST将NC膜清洗3次，每次10min；（7）将PBST稀释的杂交瘤上清在37°C条件下轻轻缓慢地震摇1h；（8）再用PBST清洗NC膜3次，每次10min；（9）将NC膜浸泡到HRP标记的山羊抗鼠二抗中，37°C作用1h；（10）再用PBST清洗NC膜4次，每次10min，利用H2O2-DAB显色系统进行显色并记录结果。2.2.3.8单克隆抗体特异性分析参照2.2.2.2应用间接ELISA的方法检测单克隆抗体与PRRSV反应的特异性。用pH8.60.1M的NaHCO3将猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）HR/DN1株，猪流行性腹泻病毒（PEDV）HLJBY株，猪细小病毒（PPV）2010株，以及伪狂犬病毒（PrV）Kaplan株等病毒液稀释至200µg/mL，200µL/孔4℃包被过夜。单克隆抗体与纯化后的GP4蛋白的作用作为阳性对照，SP2/0上清与以上各病毒的相互作用作为阴性对照（N），P/N≥2判定为阳性。2.2.4应用噬菌体展示技术筛选PRRSVGP4蛋白抗原表位2.2.4.1噬菌体筛选与扩增应用噬菌体展示12肽筛选试剂盒对PRRSVGP4蛋白单克隆抗体进行四轮配体筛选，包括三轮洗脱和扩增以及最后一轮的洗脱。（1）用pH8.6的0.1MNaHCO3，将纯化后的腹水稀释，取100µL加入到酶标孔中，4℃过夜（随着筛选次数的增加，靶分子包被量是逐渐降低的）；（2）次日，弃去包被液，清洗3次，再用5%的BSA，4℃封闭4h；（3）弃去封闭液，用0.1%TBST清洗6次，将1.5×1011PFU/100µL的噬菌体原始文库加入其中，常温下震荡10min，静止10min，反复共40min；（4）弃去未结合的噬菌体，用0.1%TBST清洗10次（随着轮数的增加，洗涤次数逐渐增多）然后加入100µL洗脱液（0.2Mglycine-HClpH2.2），室温缓慢震荡30min；（5）向洗脱液中加入1MTris-HCl，中和洗脱液；（6）将收集的洗脱液，用于噬菌体扩增及滴度测定；（7）将ER2738宿主菌，在四环素抗性的LB板上划线培养。第二日挑取单个菌落于四环素抗性的LB培养基中，培养4.5h，将200µL培养后的ER2738的菌液加入到LB液体培16 材料与方法养基中，与此同时，加入50µL每一轮筛选时未扩增的洗脱产物，在37℃条件下摇床扩增培养4.5h；（8）培养后的菌液离心后，将上清液转移至新的离心管中，同时，加入1/6体积的20%PEG8000/NaCl，充分混匀后，4℃沉降过夜；（9）次日，溶液离心15min后，弃上清，将沉淀用TBS进行重悬；（10）再次4℃离心5min后，将上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入1/6体积的20%PEG8000/NaCl，充分混匀后，4℃沉降1h；（11）最后4℃离心15min，弃上清，沉淀用TBS进行重悬，此时的溶液为扩增产物；2.2.4.2噬菌体滴度的测定与噬菌斑的扩增将ER2738单菌落接种接种于LB培养基中，摇床培养。在每个微量离心管中都加入90ul培养至对数中期的菌液，向第一管中加入l0ul噬菌体，然后依次进行10倍的倍比稀释，未扩增的洗脱物稀释成101-104，扩增的噬菌体培养物上清稀释至107-1011，每个稀释度一管，用手指轻弹管壁进行混匀，然后立即倒入37℃预热的LB/IPTG/Xgal平板上，将平板倾斜摇晃使平板中的上层琼脂均习铺开。待上层琼脂冷凝后，在37℃温箱中先正放1h，倒置培养过夜。第二天观察平板，对小于100个噬菌斑的平板进行计数。将ER2738菌液按1:100的比例接种于LB液体培养液中，培养过后每个培养管分出1mL。随之挑选的多个噬菌斑放人到培养管中。37℃摇床培养4.5-5h。再将培养物转人微量离心管中，离心30s。将上清转人一新管中，冉进行离心。用移液器将80%的上清转人新鲜离心管中，比即为扩增的噬菌体贮液。2.2.4.3噬菌体亲和力的检测将过夜培养的ER2738按1:100的此例接种干培养基中。每管ER2738培养液中加人5uL噬菌体上清液，37℃培养4.5小时左右。将培养物转移到新的离心官中，加1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉降过夜。第二天4℃条件下离心弃上清。用TBS将沉淀重悬，将悬液转移到离心管中，4℃离心，将上清放到新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl进行沉降过夜。然后在冰上沉降15-60min，4℃离心弃上清。用50uLTBS将沉淀进行重悬，测定滴度，4℃保存备用。将单克隆抗体作为靶分子在密封湿盒中4℃进行包被过夜，每个待鉴定的克隆包被2个孔。次日将平板倒置在纸巾上进行拍甩以除去残液，然后加入封阻液200uL/孔，4℃条件下封闭4h。移除出封阻液，清洗6次。将每种噬菌体稀释成每100uL含有1011个病毒子，放入96孔板中，室温震荡1h。用TBST清洗6次，将HRP标记的抗M13抗体进行1:5000稀释，室温孵育1h。用TBST清洗6次，最后加人100uL底物，通过酶标仪读取490nm处的吸光值。2.2.4.4噬菌体DNA的快速纯化与测序对亲和能力较高的噬菌体快速提取DNA：将200µLPEG8000/NaCl加入到500µL噬菌体上清中，充分混匀后4℃条件下静置10min；再在4℃条件下13,000rpm离心10min，弃17 东北农业大学农学硕士学位论文上清，用100µL碘化物缓冲液重悬沉淀，进行快速裂解，以释放出其基因组DNA；再向其中加入250µL无水乙醇，在室温条件下静置10min来对DNA进行沉降；4℃条件下13,000rpm离心10min，弃上清；最后经过70%无水乙醇的洗涤沉淀后，加入30µLTE溶液对沉淀进行溶解。参照说明书提供的测序引物P3/P4对噬菌体筛选肽核酸序列进行扩增。表2-1噬菌体测序引物序列Table2-1Primerssequencesforphagesequencing引物名称引物序列P35′-GTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3′P45′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′PCR反应参照NEB试剂盒说明书进行。取少量PCR产物进行鉴定，其余PCR产物待纯化后进行测序。反应总体积25噬菌体DNA5μLEx-Taq0.2μL10×PCRBuffer2.5μL上游引物P31μL上游引物P41μLdNTP2.5μL灭菌水12.8μL将靶向序列测序结果转换成氨基酸格式，并与PRRSVGP4蛋白氨基酸序列进行比对（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。2.2.3.3竞争性阻断实验靶向噬菌体是否能够竞争性阻断PRRSV或GP4蛋白与纯化腹水相互作用可利用间接ELISA进行检测。病毒或GP4蛋白的包被量以及方式可分别参照2.2.2.2。待封闭2h后，加入1.5×1011PFU的靶向噬菌体与1:100稀释的腹水的混合物作为的一抗，37℃条件下孵育1h,再孵育1:5,000稀释HPR山羊抗鼠IgG，用OPD显色，读取OD值。本实验以“只加腹水不加噬菌体”为阳性对照组，参照以下公式进行抑制率的计算：抑制率=（OD490阳性-OD490靶向噬菌体）/OD490阳性×10018 结果3结果3.1PRRSVGP4基因重组表达质粒的构建和鉴定提取PRRSV-HuN4病毒RNA，将RNA反转录为单链cDNA，然后以cDNA为模板进行GP4片段的克隆，获得大小预计为537bp的特异性条带，并通过XhoI和EcoRI位点插入pET-32a原核表达载体。结果如图3-1，重组质粒pET-32a-GP4经双酶切和PCR鉴定，可得到长度约5900bp的载体带和537bp的目的带，PCR鉴定结果仅得到单一的、长度为537bp的条带，证明重组质粒pET-32a-GP4构建正确。M.TransplusII2KDNA分子质量标准；1.PCR鉴定结果；2.双酶切结果M.TransplusIIDNAmarker;1.PCRproductofGP4gene;2.pET-32a-GP4digestedwithXhoI&EcoRI图3-1重组质粒pET-32a-GP4的鉴定Fig.3-1IdentificationofrecombinantplasmidpET-32a-GP43.2PRRSVGP4蛋白的诱导表达及纯化3.2.1PRRSVGP4蛋白的诱导表达将之前保存的阳性重组质粒pET-32a-GP4转化后，将菌液摇混后加入IPTG对重组GP4蛋白进行诱导表达。凝胶结果表明，37℃、IPTG终浓度1mM，诱导4-5h后，重组GP4蛋白表达量最高。此时，在37kD处可见一条明显的蛋白条带，通过与诱导前对照相比，确认即为重组GP4蛋白，这与DNAStar软件预测的蛋白大小相符（图3-1）。19 东北农业大学农学硕士学位论文M.蛋白质分子质量标准;0.诱导前样品对照;1-5.诱导后1h至h蛋白表达情况;6.菌体超声裂解上清;7.菌体超声裂解后沉淀M.Standardproteinmarker;0.ControlofpET-32avector;1-5.InductionofGP4proteinfrom1hto5h;6.Thesubstanceofbacterialsupernatantlysedbysonication;7.Thesubstanceofbacterialdepositedlysedbysonication图3-1PRRSVGP4蛋白诱导表达的SDS-PHAGE分析Fig.3-1SDS-PAGEanalysisoftheinducedexpressionofPRRSVGP4protein3.2.2PRRSVGP4蛋白的纯化SDS-PAGE后的凝胶经遇冷的0.25mMKCl溶液显色后，小心切下目的条带，尽量不要切到杂带，研磨后加入PBS并在-20℃反复冻融三次，将目的蛋白裂解释放到上清中，经SDS-PAGE电泳分析纯化效果。结果如图3-4所示，纯化后仅有单一条带，证明重组GP4蛋白纯化效果较好。20 结果M.蛋白质分子质量标准;1.诱导后菌体沉淀;2.纯化的GP4蛋白;M.Standardproteinmarker;1.Pelletsofinducedproductlyses;2.PurifiedrecombinantGP4protein图3-2重组GP4蛋白纯化Fig.3-2PurificationofrecombinantGP4protein3.3PRRSVGP4蛋白单克隆抗体制备及特性鉴定3.3.1免疫Balb/C小鼠血清抗体效价测定第四次免疫后，小鼠尾静脉采血，4℃沉降血液凝固后，2,000rpm离心10min，分离血清作为待检血清。待检血清与阴性血清从1:100进行倍比稀释，用间接ELISA方法测定效价，阴性血清为对照，结果如图3-3，可见4只小鼠的血清效价均较高，都可达到1:12800，均可以进行后续融合实验。3.3.2最佳抗原抗体工作浓度的确定用纯化后的蛋白包被ELISA板，釆用方阵法确定最佳包被浓度及血清的最佳稀释浓度，结果根据阳性血清孔的OD490nm值接近1.0，阴性血清OD490nm值<0.4，P/N≧2，检测得到最佳抗体稀释度为1：500，抗原最佳包被浓度为5ug/ml。3.3.3阳性杂交瘤细胞的筛选细胞融合后第10天左右，对96孔细胞培养板统计其中融合成功的细胞克隆孔数量及每孔内融合后的细胞堆数量，取出细胞上清液作为待检抗体，参照2.2.2.7方法进行阳性筛选，并半更换新鲜的培养液；筛选结果为阳性的细胞进行扩大培养，接着进行第二次克隆；两个星期后，再进行第三次克隆。最终，得到1株能稳定分泌抗PRRSVGP4蛋白的阳性杂交瘤21 东北农业大学农学硕士学位论文细胞，命名为5F12。图3-3融合前免疫小鼠抗GP4蛋白抗血清效价测定Fig.3-3Titerdetectionofanti-GP4proteinantibodyinimmunizedmiceserum3.3.4杂交瘤细胞培养上清效价的测定分别用重组蛋白和病毒包被ELISA板，上清分别从1:100和1:50作倍比稀释，SP2/0为阴性对照，用间接ELISA法检测上清效价，结果如图3-4和图3-5，5F12株的效价分别为1:12800和1:1600，以P/N大于2为阳性，细胞上清与病毒虽然有反应，但反应性较弱。22 结果图3-4蛋白包被组上清效价的测定Fig.3-4Thedetectionoftitreinhybridomasupernatantwithproteincoating图3-5病毒包被组上清效价的测定Fig.3-5Thedetectionoftitreinhybridomasupernatantwithviruscoating3.3.5单克隆抗体亚类鉴定参照2.2.3.2的方法，吸取5F12培养上清，经ELISA方法鉴定5F12的抗体亚类为IgG2b23 东北农业大学农学硕士学位论文（如图3-6）。图3-65F12亚类鉴定结果Fig.3-6Identificationofmonoclonalantibody5F12subtype3.3.6单抗腹水制备与纯化将阳性杂交瘤细胞5F12进行小鼠腹腔注射，待小鼠腹部出现明显膨大时，及时取出腹部的腹水，离心取上清，即为5F12单抗腹水，将所得腹水采用正辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，并通过SDS-PAGE进行纯度分析。如图3-7所示，与纯化前腹水样品相比，纯化后样品均含有两条特异性条带，且大小分别约为55kD和25kD，这与小鼠IgG重、轻链大小基本相符。以上结果证明，纯化后腹水中IgG纯度较好，可以用于后续试验。M.蛋白质分子质量;1.纯化前腹水;2.纯化后腹水;M.Standardproteinmarker;1.Unpurifiedasciticfluid;2.Purifiedasciticfluid图3-7腹水纯化效果分析Fig.3-7Purificationanalysisofasciticfluid3.3.7单抗腹水效价的测定用间接ELISA方法测定制备的单抗腹水，如图3-8和3-9所示，腹水与蛋白的效价可以达到1:25600，腹水与病毒的效价稍微低一些，可以达到1:1600。纯化后腹水效价比纯化前腹水效价是相同的，并没有太大的差别。24 结果图3-8蛋白包被组单克隆抗体腹水效价的测定Fig.3-8Thedetectionoftitreinasciteswithproteincoating图3-9病毒包被组单克隆抗体腹水效价的测定Fig.3-9Thedetectionoftitreinasciteswithviruscoating3.3.8间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与PRRSV的反应性Marc-145细胞被PRRSV感染后，应用阳性杂交瘤细胞5F12培养上清为一抗进行病毒识别的检测。间接免疫荧光实验的结果表明，明显的绿色荧光信号显著地存在与细胞浆中；所25 东北农业大学农学硕士学位论文设阴性对照和空白对照及阳性对照均成立。以上结果证明，抗GP4蛋白的单克隆抗体5F12可以识别天然状态下的PRRSV，结果如图3-10。a.细胞阴性对照;b.小鼠阴性血清对照;c.PRRSV阳性血清对照;d.5F12上清检测PRRSV感染的Marc-15细胞;e.SP2/0细胞上清a.cellnegativecontrol;b.micenegativeserum;c.normalcellwithanti-PRRSVpositiveserum;d.PRRSVinfectedMarc-15cellsdetectedwith5F12supernatant;e.SP2/0control图3-10间接免疫荧光分析Fig.3-10Indirectimmunofluorescenceassays3.3.9免疫印迹方法鉴定单克隆抗体与GP4蛋白的反应性取5F12单克隆抗体与天然PRRSV和GP4重组蛋白进行免疫印迹实验。结果（如图3-11）表明，在5F12培养上清液组与天然PRRSV和重组GP4蛋白在37KD左右有明显的免疫学反应条带出现，而小鼠阴性血清组无任何反应，证明5F12培养上清液可以与天然PRRSV和变性条件下的重组GP4蛋白相互识别。26 结果1.PRRSV检测组;2,4SP2/0细胞上清;3.重组GP4蛋白检测组;M.蛋白marker组1.PelletdetectedwithPRRSV;2,4SP2/0control3.PelletdetectedwithGP4protein;M.proteinmarkercontrol图3-11免疫印迹分析Fig.3-11Westernblottanalysis3.3.10单克隆抗体特异性分析按照200µg/mL，每孔加入200µL的剂量，将TGEV、PEDV、PRRSV、PrV和PPV包被在酶标板中，对5F12培养上清进行检测。结果表明，5F12培养上清可以与PRRSV发生明显的反应，且P/N＞2，而5F12培养上清与其他病毒不反应，差异极显著。该结果证明，其它猪源常见病毒均不具备5F12上清所对应的抗原位点，所制备的单克隆抗体具有良好的特异性，结果如图3-12所示。27 东北农业大学农学硕士学位论文图3-12单克隆抗体5F12特异性鉴定结果Fig.3-12Analysisofmonoclonalantibody5F12specificity3.4PRRSVGP4蛋白抗原表位的筛选3.4.1噬菌体筛选与扩增以纯化后的抗PRRSVGP4蛋白单克隆抗体为靶分子进行四轮噬菌体筛选，将每一轮筛选过程中的包被量、噬菌体投入量、产出量进行统计，并比较每一轮的产出/投入比，具体结果如表3-1所示。在靶分子包被量递减、投入量不变的情况下，每一轮的噬菌体洗脱量及洗脱量/投入量均呈递增趋势。表3-1纯化的单克隆抗体5F12的噬菌体筛选Table.3-1Biopanningtopurifiedmonoclonalantibody1F7第一轮第二轮第三轮第四轮靶分子包被量20μg15μg10μg5μg投入量1.5x10111.5x10111.5x10111.5x1011洗脱量9.4x1031.6x1043.7x1045.2x106扩增产物滴度5.9x10116.2x10116.8x10113.4.2亲和能力检测与测序对第四轮筛选的洗脱产物进行滴度测定，选取蓝斑数小于100的平板（图3-13），随机28 结果挑取20个单克隆噬菌体蓝斑进行扩增，并通过间接EILSA方法检测与靶分子的亲和能力，无关噬菌体作为阴性对照。结果表明，与原始文库对照相比，10个阳性噬菌体均与靶分子即纯化的单克隆抗体5F12，具有一定的亲和能力，如图3-14所示。随后，以10个阳性噬菌体的基因组DNA为模板进行PCR，均扩增出的长度约为250bp的特异性条带（如图3-15）。将PCR产物纯化回收并进行核酸序列测定，10个噬菌体中有4个序列相同，所以得到4个的12肽序列分别为AKFEVCSPVVLG、GVNQENMLHFSF、NPRIRLNFIRIG、SGVYKVAYDWQH，命名为phage-Ⅰ-Ⅳ（如表3-2）。应用在线序列比对软件clustalw2，将筛选出的4组12肽序列与PRRSVGP4蛋白进行氨基酸序列比对。比对后发现phage-Ⅰ的12肽与GP4蛋白第112至123位氨基酸具有一定的相似性，其中有四个位点的氨基酸完全一致（第114位F、第116位V、第121位V和第123位G）；发现phage-Ⅱ的12肽与GP4蛋白第84至95位氨基酸具有一定的相似性，其中有六个位点的氨基酸完全一致（第85位V、第88位E、第89位N、第91位L、第92位H和第94位S）图3-13第四轮噬菌体洗脱物在IPTG/Xgal/LB平板上的单克隆蓝斑Fig.3-13BluephagespotatFourthroundintheIPTG/Xgal/LBplate29 东北农业大学农学硕士学位论文图3-1420个阳性噬菌体亲和能力检测Fig.3-14Affinityanalysisof20positivephages图3-1510个阳性噬菌体的PCR产物Fig.3-15PCRproductsof10positivephages表3-210个阳性噬菌体的测序结果Table.3-2Sequencingresultsof10positivephages编号命名核苷酸序列氨基酸序列phage2、3、4、7phage-ⅠAKFEVCSPVVLGphage1、5、8、9phage-ⅡGVNQENMLHFSFphage10phage-ⅢSGVYKVAYDWQHphage11phage-ⅣNPRIRLNFIRIG30 结果3.4.3竞争性阻断实验应用间接ELISA方法检测筛选出的phageⅠ-Ⅳ是否对PRRSV与单抗的结合发生阻断作用。如图3-16所示，phage-Ⅰ可以阻断PRRSV或GP4蛋白与纯化后腹水的相互作用，抑制率分别达到59.3%和72.5%，而phageⅡ-Ⅳ阻断效果不明显。图3-16phage-Ⅰ对PRRSV或GP4蛋白与腹水结合的抑制作用Fig.3-16Inhibitionofphage-ⅠtothereactofPRRSVorGP4proteinwithmonoclonalantibody31 东北农业大学农学硕士学位论文4讨论我国众多地区自2006年以来流行着以高热、皮肤发红等为特征的猪“高热病”，该病迅速蔓延，流行范围广，传播速度快，较长的持续时间，病死猪数量多等都是前无古人后无来者的，这给养猪行业是一个不小的冲击，也带来了相应严重的经济损失，因此引起了全社会重视。经检测证实HP-PRRSV是引起该病的主要病原[75]。对于PRRSVGP4蛋白抗原表位的研究，深入了解PRRSV的抗原结构功能与抗原抗体识别机制有着重要作用。对于欧洲型PRRSV，采用了感染性克隆和单克隆抗体等技术对其各结构蛋白的抗原表位进行了分析，多个抗原表位得以明确，但却缺少对于美洲型毒株抗原表位的研究[76-86]。噬菌体展示技术对于以往繁琐的鉴定和表达过程进行了简化，分析抗原表位的亲和筛选法正是利用了表型与基因型相统一的这一特性，噬菌体展示随机肽库技术提供了一种简单价廉的分析方法，能够从中获得构象型表位的模拟表位。4.1目的基因的选择目前研究得比较成熟的是GP5、M、N等PRRSV的主要结构蛋白，而研究得比较少的是GP4次要结构蛋白的结构和功能。研究欧洲株LV株的GP4蛋白己经证明其参与病毒粒子囊膜的组装，是结构蛋白[87]，而研究加拿大QuebeeIAF-Klop证明GP4蛋白不是病毒粒子的组成成分，是弱的膜相关蛋白[88]。对美洲株FL12株GP4蛋白的最新研究表明，其同欧洲株一样，GP4蛋白都是结构蛋白[89]。Plana等[90]证明GP4蛋白作为抗原免疫猪体后能够保护猪只不被PRRSV感染，可达到68.4%的保护率。由于GP4蛋白的抗原性特征，推测GP4蛋白可能诱导细胞免疫应答，从而保护了被免疫的猪只。而cancel-Tirad等[91]利用单克隆抗体技术发现GP4蛋白中含有中和表位，能够诱导机体产生中和抗体。由于尚不明确GP4蛋白的结构与功能，且经常得到相互抵触的结论，因此对该蛋白进行深入研究也是有必要的。对于GP4蛋白的研究，不仅仅为进一步研究GP4蛋白的结构与功能奠定了基础，也为研究PRRSV的诊断，预防等方面提供了新的思路。4.2免疫抗原和筛选抗原的选择单克隆抗体是由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌的一种高度均质性的特异性抗体，由杂交瘤细胞产生。单克隆抗体、多克隆抗体二者具有一些优点：1）强特异性、高纯度性、高均质性；2）杂父瘤细胞可以体外传代与存活；3）利用相对不纯的抗原，获得特异性且均一的抗体。单克隆抗体技木被广泛应用。自Mab技术成立后，人们开始研究PRRSV单克隆抗体，Meulenberg、韩庆安等[92-93]以病毒粒子作力免疫原制备了多种单抗，并将其应用于病毒衣壳蛋白的研究中去。以完整的病毒粒子作为免疫原接种小鼠产生的单抗大多是针对N蛋白的[94]。这可能是因为N蛋白在PRRSV结构蛋白中的地位是比较特殊，也是有优势的，它良好的免疫原性能够诱导免疫应答反应，而其它结构蛋白的免疫原性相对较弱。由于GP4蛋白作是病毒结构蛋白中比较小的，在病毒复制过程中含量很低，所以几乎不可能32 讨论用全病毒制备出针对GP4蛋白的单抗。所以本试验在体外表达了GP4蛋白，以此为免疫原来制备GP4单克隆抗体。4.3动物免疫与细胞融合免疫效果的好坏决定于免疫小鼠时所用的抗原剂量。有报道称高剂量的免疫原可在小鼠体内诱发初次免疫应答，产生的抗体主要为IgM类、并且亲和力比较低。反而低剂量免疫原诱发的抗体主要为IgG类、且具有高亲和力[95]。因此免疫时所用的免疫原剂量不宜过多，本次实验所用的免疫原剂量约为80µg/只，得到了亚类为IgG2b的1株5F12单抗。融合效果好坏有很多因素，如饲养层细胞的制备、骨随瘤细胞的状态、脾细胞的取材、融合剂的用量、操作者的技术等等。其中，骨髓瘤细胞的状态至关重要，骨髓瘤细胞必须要在对数生长期时融合才效果最好，因为此时的细胞最有活性与生命力。此外，也需要有适当脾细胞与骨髓瘤细胞比例，我的试验进行了两次融合，第一次融合失败的原因可能由于骨髓瘤细胞培养状态不是特别好，并没有在对数生长期进行融合，第二次调整了细胞状态，融合效率达到了60%。在试验中，一定要对处于克隆期的细胞抗体效价进行检测，防止细胞分泌抗体功能丧夫，影响到之后的操作。对杂交瘤细胞的稳定性分析时，发现1株分泌能力不太稳定的单抗，出现急性下降的情况。我们发现在体外不宜长期对杂交瘤细胞进行传代培养。4.4抗GP4蛋白单克隆抗体5F12的特性分析此部分实验的待检测单克隆抗体为阳性杂交瘤细胞5F12培养上清，对其特性进行分析。猪场常见病毒PEDV、TGEV、PrV、PRV和PCV等都可以与PRRSV发生混合感染，并引发相似的临床症状。为了临床检测而制备出特异性检测抗体，我们选择了具有高度保守性的GP4蛋白，制备了抗GP4的单克隆抗体。在单克隆抗体特异性分析实验中，与对照组相比，5F12上清可以与酶标板中包被的PRRSV高特异性结合，而不能与其它几种常见的猪源病毒结合。这充分说明了5F12分泌的单克隆抗体在临床检测PRRSV方面具有巨大潜力和应用价值。经鉴定由5F12分泌的单克隆抗体为IgG2b亚型，实验结果显示它与PRRSV的反应性不是很强，分析原因可能是病毒粒子中含有较少的GP4蛋白，但同时间接免疫荧光及Westernblot结果表明，该单克隆抗体IgG2b亚型可以同时与天然状态下的PRRSV，以及无糖基化的原核重组表达的GP4蛋白发生免疫学反应，这使得抗GP4蛋白单克隆抗体的应用范畴得到了拓展。本实验以PRRSV-GP4蛋白为抗原接种小鼠，得到了1株抗PRRSVGP4蛋白的单克隆抗体，通过ELISA、IFA和Westernblot检测得出该单抗与PRRSV的结合能力不是很高，但却与PRRSVGP4蛋白有较强的结合能力，因此推断这株单抗识别的可能是GP4蛋白的线性表位。为了筛选出特异性好的噬菌体，温度、靶分子浓度和淘洗轮数等因素在生物淘选过程中是至关重要的。通过竞争抑制试验，验证了靶分子与噬菌体二者的结合能力，结果表明，检测出的10个阳性噬菌体与PRRSV-GP4蛋白可以竞争性的跟5F12单抗结合。说明所筛选的噬菌体展示多肽空间构象与天然抗原表位有一定的相似性。这对深入研究GP4蛋白模拟表位有很大意义。33 东北农业大学农学硕士学位论文4.5噬菌体展示技术筛选PRRSVGP4蛋白抗原表位1985年[96]发明了噬菌体展示技术，其将靶向外源基因插入到丝状噬菌体f1基因组当中，使其与噬菌体表面蛋白III以融合蛋白的形式在噬菌体表面共表达，Scott于1990年将多种随机短肽与噬菌体M13表面蛋白PⅢ进行共表达，第一次成功建立噬菌体随机肽库。该技术具有两大特点：①噬菌体表面融合性表达了外源蛋白，而病毒核心DNA中插入了外源基因；②该技术使表达产物与亲和筛选进行结合，可以针对不同的靶分子进行筛选。如今该技术已在各个领域广泛的应用与研究。实验结果表明，由杂交瘤细胞5F12分泌的抗PRRSVGP4蛋白单克隆抗体既可以识别天然结构的PRRSV颗粒，也可以识别变性条件下的重组GP4蛋白，抗原位点位于病毒囊膜外侧也得到了初步的证明。特异性检测结果表明，5F12上清中的单克隆抗体仅与GP4蛋白表面的某一个或多个表位相互识别。这些结果表明了该单克隆抗体所识别的这些位点在PRRSV参与的免疫应答中发挥重要作用，这为GP4蛋白抗原表位的进一步筛选打下了基础。抗原表位能够刺激机体、免疫细胞产生特异性的抗体，也会发生特殊的免疫学反应。明确抗体识别的抗原表位，且在设计和开发基于表位的安全有效的疫苗以及诊断试剂有重要意义。我们优化了针对靶分子的筛选过程：①靶分子的包被量应该逐轮减少；②逐轮对淘洗过程中未结合噬菌体的洗涤次数以及每次洗涤的时间进行增加；③为了筛选到抗GP4蛋白单抗的高亲和度配体、减少因非特异性结合而造成的假阳性，提高了TBST中Tween-20的浓度；④为了防止因长时间扩增导致的高偏嗜性噬菌体的产生，我们严格遵守4.5h的时间要求，避免对后续筛选产生影响。利用噬菌体展示技术获得了与抗GP4蛋白单抗高度亲和的10个随机噬菌体克隆。本实验用的M13噬菌体是主要应用于鉴定抗原表位和受体的单链DNA、温和型的噬菌体。这10个噬菌体的测序结果大部分完全相同（phageⅠ-Ⅱ=AKFEVCSPVVLG、GVNQENMLHFSF），在接下来的功能验证中，phage-Ⅰ可以竞争性地阻断天然PRRSV颗粒以及纯化的重组GP4蛋白与抗GP4蛋白单抗的有效结合，这说明phage-Ⅰ中包含的12肽在免疫学功能上与GP4蛋白表面抗原非常相似。通过氨基酸序列的比对我们将噬菌体展示的12肽定位于GP4蛋白第112至123位氨基酸，而且第114位F、第116位V、第121位V和第123位G这四个临近的氨基酸位点完全一致，这也说明，这4个氨基酸所组成的基序“-FVVG-”在GP4蛋白抗原表位中发挥重要作用。而且较近距离的四个氨基酸可能在空间结构内表现出了线性特点，这也间接证明了该单克隆抗体可能识别线性的GP4蛋白。今后我们可以通过生物信息学技术手段分析GP4蛋白与基序“-FVVG-”之间的空间构象关系。当然，要得到准确的GP4蛋白空间构象还需要晶体衍射技术的支持。总之，本实验利用大肠杆菌表达系统成功表达HP-PRRSVHuN4株的GP4蛋白，随后用纯化后的GP4重组蛋白作为免疫原，免疫小鼠后，成功制备了抗GP4蛋白的1株单抗，该株是能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，并且证明了这株单抗均具高特异性与稳定性。它们对于GP4蛋白结构与功能的研究以及对于HP-PRRSV致病机理的研究打下了基础，并对开发安全有效的疫苗和诊断试剂有着重要的意义。34 结论5结论（1）利用重组表达的PRRSVGP4蛋白免疫Balb/C小鼠，成功制备了1株PRRSVGP4蛋白的单克隆抗体杂交瘤5F12株，并通过间接免疫荧光与免疫印迹技术证明PRRSVGP4单克隆抗体与原核重组GP4蛋白和PRRSV都有较好的特异性反应。（2）应用噬菌体展示技术筛选出两个PRRSVGP4蛋白的模拟抗原表位（A112KFEVCSPVVLG123）和（G84VNQENMLHFSF95），噬菌体竞争抑制试验与ELISA证实筛选出的亲和噬菌体与PRRSV及其GP4蛋白有很高的反应性。35 东北农业大学农学硕士学位论文致谢3年的硕士学习生活转瞬即逝。在这一千多个日日夜夜里，有导师对我的谆谆教导、有同学和朋友对我的支持与鼓励，也有家人对我无私的奉献，因此在我即将踏出校门之际，我向你们表示最衷心的感谢与最诚挚的祝福。我的两位导师任晓峰教授和李广兴教授不仅仅是我学习生涯中的良师，更是我生活中的益友，我被两位教授踏实的工作作风以及严谨的治学态度所深深影响，他们教会了我科学的科研思路，同时也授予了我正确的做人道理，在这三年中我所积累的学习成果以及为人之道都将是我这一生的财富。与此同时我还要对实验室中的每一位同学表示感谢，让我在科研的道路上少了些坎坷，少走了些弯路，谢谢你们。更要感谢家人对我一如既往的包容与鼓励，我会继续努力以更优异的成绩回报大家，不辜负大家对我的期望。36 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