猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及基因进化分析

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独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进巧的硏巧工作及取得的研究成果，，论。尽我所知除了文中特别加标注和致谢的地方外文中不包含其他人己经发表或撰写妊的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用边的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献巧己在论文中作了明确的说明井表示了谢意。研究生签名、时间：：年月Ｓ巧棄又？１占王换关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁蟲，、，允许论文被查阅和借闽可抖采用影印缩印或扫描等复制手段保存、茫编学位论文。同意中国农业科学院可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。＇：研究生签名时间：月＾曰攻志辦ｔ年．王ｊ导师签名：之时间：年Ｉ月知日 中國农业科学院硕±学位论文评阅人、答辩委员会签名表乂方日下ｂ化巧日ｇ乂分子流行病学调查及基因进化分析动物分子论文作者刘杏专化预防兽医学研巧方向妻ＩＪ指导教师武华培养单位（研究所）特产研究所＇姓名职称硕单位专业签名评硕导□．阅硕导口人博导□＇＇°Ｉ钱爱东散赁吉林农业大学预防兽医学；置｜．＇了巡皆班的。硕导口军事医学科学院ｎｖｊｊ＞王兴化研化巧子义防巧医子诺导■军事兽医研究所硕导。高丰教授吉林大学临床兽医学°柳增善敬獲吉林大学预防兽医学為古暮量ｐ葦—＇Ｉ辩王春凤敏授吉林农业大学预防兽医学————委员．Ｉ会议记录（秘书）范琳琳论文答辩时间地点２０１６年５月巧日中国农业科学院特产所７楼会议室 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及遗传进化分析MolecularEpidemiologyandphylogeneticanalysisofPorcineCircovirusType2andPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus硕士研究生：刘杏指导教师：武华申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：特产研究所研究生院2016年4月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationMolecularEpidemiologyandEvolutionAnalysisofGenesofPorcineCircovirusType2andPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusM.S.Candidate：XingLiuSupervisor：HuaWuMajor：PreventiveVeterinaryScienceSpecialty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyApril2016 摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的重要病原体之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）能导致怀孕母猪流产、仔猪严重呼吸症状及死亡。因此，PCV2和PRRSV是影响养猪业发展的两大病原体。目前，养猪场内PCV2和PRRSV混合感染的情况越来越普遍，临床上混合感染猪只临床症状包括严重的呼吸症状、流产和极度虚弱等，且常继发严重的病毒性或细菌性疾病，导致严重的经济损失。因此，PCV2和PRRSV的混合感染的流行病学调查及两种病毒的遗传进化分析对于综合防控猪场疾病具有重要意义。为了解PCV2和PRRSV在中国猪场的混合感染及流行情况，本实验自2013-2015年对吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省进行PCV2和PRRSV分子流行病学调查，采集了192份样品进行检测，PCV2阳性率为64.3%，PRRSV阳性率为23.4%，29份样品为混合感染，阳性率达18.5%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍，混合感染率也较高，加重了疫病防控的难度。采集自不同地区的12个阳性样品进行PCV2全基因组扩增测序及遗传进化分析发现，12个PCV2序列分别属于PCV2b和PCV2d基因型。其中8个测序序列SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6和SP-2单独形成一个位于PCV2d-1和PCV2d-2之间的单系群，3个测序序列SY-Z-4、ZD-1和ZD-7与只在丹麦流行的PCV2c基因型毒株同源性高，分析发现是PCV2c和PCV2b基因型间毒株的重组毒。PCV2毒株迁移进化分析预测有PCV2毒株从丹麦迁移至中国。采集自不同地区的12个PRRSV阳性样品中PRRSVORF5、ORF7、部分Nsp2基因测序分析发现，所有毒株均属于美洲型；12个测序序列在GP5和N蛋白的重要基序上均有关键氨基酸的突变；8个序列SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1与HP-PRRSV一样在Nsp2上的第481位和第533-561位氨基酸有30个氨基酸的不连续缺失；2个序列HLYyq-2015-1和LNsy-2014-2在Nsp2上出现新型缺失即第593-595位氨基酸缺失；1个序列SDly-2014-1与NADC-30毒株ORF7基因相似度高。同时，分离2株PRRSV毒株，命名为LNsy-2014-1和HLJyq-2015-1，接种细胞后细胞出现变圆、聚堆典型病变，RT-PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性，遗传进化分析均为北美洲型且分别与经典毒株JXA1和VR2332相似度最高。关键词：猪圆环病毒2型，猪繁殖与呼吸综合征病毒，混合感染，流行病学调查，病毒分离，基因进化分析I AbstractPorcinecircovirustype2(PCV2)isconsideredasanimportantpathogenrelatedtomultifactorialdiseasesyndromesinpigs,whichhasaworldwidedistributionandcauseshugeeconomiclossesfortheswineindustry.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isaneconomicallyimportantswinepathogenaffectingswineindustryworldwide,whichischaracteristicwithgeneticallyextensivevariation.Thus,PCV2andPRRSVaretwoimportantpathogensaffectingswineindustry.Now,co-infectionofPCV2andPRRSVisacommonprobleminpigfarmsandco-infectedpigswerecharacterizedwithsevererespiratorysymptoms,abortionandextremelyweakness,andgraduallydevelopedintoseconddiseasecausedbypathogenofvirusorbacteria,whichleadstohugeeconomiclosses.Thus,epidemiologyinvestigationofco-infectionofPCV2andPRRSVandphylogeneticanalysisofPCV2andPRRSVhavereferencevaluesforpreventionandcontrolofviraldiseasesinpigpopulations.Toinvestigatethecirculatingandco-infectionofPCV2andPRRSVinpigpopulationofChina,192sampleswerecollectedfrom6provincesofJilin,Liaoning,Heilongjiang,Shanxi,Shandong,GuangdonginChinafrom2013to2015andthepositiveratesofPCV2andPRRSVwere64.3%and23.4%respectively,whiletheco-infectionratewas18.5%.Theco-infectionoftwovirusesisbecomingthemainswinediseasesintheregions.ThemainpurposeofthepaperistoinvestigateandanalysistheinfectionofPCV2andPRRSVintheregions,whichisimportantinpreventingandcontrollingthediseases.PhylogeneticanalysisofPCV2indicatedthat12sequencedwholegenomesequencesofPCV2belongedtoPCV2dandPCV2bgenotypes.SequencesofSX-Z1,SX-Z3,YQ,JL,SY-M-X3,SY-L-3,SY-L-X6andSP-2formedamonophyleticgrouplocatedbetweenPCV2d-1andPCV2d-2,while3sequencesofSY-Z-4,ZD-1andZD-7sharedhighhomologywithstrainofPCV2cgenotypethatwasonlydetectedinDenmarkbeforethestudy.Moreimportant,The3sequencesrevealedtoberecombinantsofstrainsofPCV2candPCV2bgenotypes.ThephylogeographicanalysisonthesesequencessuggeststhattheisolatesmightbeinitiatedinDenmarkandthentransmittedintoChina.PhylogeneticanalysisofPRRSVwerecarriedouttounderstandingthecirculatingofPRRSVinpigpopulationsofChina.Total12ORF5,12ORF7and10highlyvariableregionofNsp2genesweresequenced,andphylogenetictreesbasedontheORF5,ORF7andNsp2genesindicatedthatstrainsoftheNorthAmericantypewerecategorizedintotwogroupsandfivesubgroups.AnoveldeletionofthreecontinuousaminoacidsofNsp2wasdetected.Inaddition,asequenceofSDly-2014-1sharedhighidentitywithNADC30strainofORF7gene.Inthestudy,twostrainswereisolatedfrompositivesamplesandnamedasLNsy-2014-1andHLJyq-2015-1,whichwereNorthAmericantypeandsharedhighidentitieswithclassicstrainsofJXA1andVR2332,respectively.ThedatacontributetounderstandingmolecularvariationandgeneticevolutionofPRRSVinChina.II Keyword:porcinecircovrustype2,porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,co-infection,epidemiologyinvestigation,virusisolation,evolutionanalysisofgeneIII 目录第一章引言...................................................................................................................11.1PCV2研究进展...........................................................................................................11.1.1PCV2基因组及其复制转录................................................................................11.1.2PCV2感染和相关疾病........................................................................................21.1.3PCV2编码蛋白及其功能....................................................................................41.1.4PCV2研究展望....................................................................................................61.2PRRSV研究进展........................................................................................................61.2.1PRRSV基因组及其复制转录.............................................................................61.2.2PRRSV感染及致病力.........................................................................................81.2.3PRRSV编码蛋白及其功能...............................................................................101.2.4PRRSV研究展望...............................................................................................111.3PCV2和PRRSV混合感染研究进展......................................................................12第二章PCV2和PRRSV流行病学调查........................................................................142.1材料和方法...............................................................................................................142.1.1实验材料............................................................................................................142.1.2实验方法............................................................................................................142.2实验结果...................................................................................................................182.2.1样品采集结果....................................................................................................182.2.2临床观察结果....................................................................................................192.2.3病料阳性率和基因PCR扩增测序...................................................................202.2.4PRRSV分离株鉴定...........................................................................................222.3讨论...........................................................................................................................232.3.1PCV2和PRRSV在猪场中的流行及混合感染................................................232.3.2PRRSV分离株...................................................................................................24第三章PCV2遗传进化分析............................................................................................253.1PCV2遗传进化分析方法.........................................................................................25IV 3.2PCV2遗传进化分析结果.........................................................................................253.2.1PCV2测序序列相似度......................................................................................253.2.2PCV2遗传进化树..............................................................................................283.2.3PCV2测序序列核苷酸突变分析......................................................................313.2.4PCV2测序序列重组分析.................................................................................313.2.5PCV2迁移进化分析..........................................................................................333.3讨论...........................................................................................................................34第四章PRRSV遗传进化分析..........................................................................................374.1PRRSV遗传进化分析方法......................................................................................374.2PRRSV遗传进化分析结果......................................................................................374.2.112个测序序列及PRRSV不同亚群之间相似度.............................................374.2.2ORF5遗传进化树.............................................................................................424.2.3ORF7遗传进化树..............................................................................................444.2.4Nsp2遗传进化树................................................................................................464.2.5GP5、N蛋白、Nsp2推导氨基酸序列分析.....................................................484.3讨论...........................................................................................................................65第五章全文结论.............................................................................................................70参考文献.............................................................................................................................71附录.................................................................................................................................85致谢.................................................................................................................................88作者简历.............................................................................................................................89V 图目录图2.1发病猪临床症状20图2.2PCV2疑似病例PCR检测凝胶电泳结果20图2.3PCV2全基因组扩增引物B1、B2PCR扩增产物凝胶电泳结果20图2.4PCV2全基因组扩增引物C1、C2PCR扩增产物凝胶电泳结果21图2.5PRRSV全基因组扩增引物ORF5-F、ORF5-RPCR扩增产物凝胶电泳结果21图2.6PRRSV全基因组扩增引物ORF7-F、ORF7-RPCR扩增产物凝胶电泳结果22图2.7PRRSV全基因组扩增引物Nsp2-F、Nsp27-RPCR扩增产物22图2.8LNsy-2014-1毒株、HLJyq-2015-1毒株RT-PCR鉴定结果22图2.9LNsy-2014-1毒株、HLJyq-2015-1细胞病变、间接免疫荧光鉴定图23图3.112个PCV2测序序列基因组相似度26图3.212个PCV2测序序列ORF1基因相似度26图3.312个PCV2测序序列ORF2基因相似度27图3.412个PCV2测序序列rep蛋白推导氨基酸序列相似度27图3.512个PCV2测序序列cap蛋白推导氨基酸序列相似度27图3.6PCV2全基因组序列构建的进化树29图3.7PCV2ORF2序列构建的进化树29图3.8PCV2测序序列核苷酸突变分析31图3.9RDP重组分析结果32图3.10SY-Z-4,ZD-1,ZD-7的Simplot-Query曲线图32图3.11SY-Z-4,ZD-1,ZD-7的BootScan-Query曲线图33图3.12重组毒与母本毒突变位点比对33图4.1PRRSV12个ORF5测序序列相似度38图4.2PRRSV12个ORF7测序序列相似度38图4.3PRRSV10个Nsp2部分基因测序序列相似度39图4.4PRRSV12个GP5推导氨基酸序列相似度39图4.5PRRSV12个N蛋白推导氨基酸序列相似度40VI 图4.6PRRSV12个Nsp2蛋白推导氨基酸序列相似度40图4.7ORF5基因遗传进化树43图4.8ORF7基因遗传进化树44图4.9Nsp2基因遗传进化树47图4.10GP5蛋白氨基酸序列比对48图4.11ORF5的非同义突变率和同义突变率（dN-dS）比较及其对应的重要motif51图4.12N蛋白氨基酸序列比对53图4.13ORF7的非同义突变率和同义突变率（dN-dS）比较及其对应的重要motif54图4.14Nsp2蛋白氨基酸序列比对56图4.15GP5蛋白的信号肽预测58图4.16GP5糖基化位点预测64VII 表目录表2.1PCV2检测引物及全基因组扩增引物15表2.2PRRSV基因扩增引物16表2.3PRRSV、PCV2疑似发病猪组织样品采集情况19表3.1PCV2迁移路径预测结果34表4.15个亚群之间及美洲型VR2332、欧洲型代表株LV与亚群之间ORF5相似度41表4.2GP5、N蛋白和Nsp2关键氨基酸位点突变，其中发生在基序上的突变加粗48表4.3GP5蛋白不同亚群的遗传标记51表4.4N蛋白不同亚群的遗传标记54VIII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AAAminoacid氨基酸bpbasepair碱基对DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸Highlypathogenicporcinereproductiveand高致病性猪繁殖与呼吸综合征HP-PRRSVrespirotarysyndromevirus病毒IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光实验NspNon-structuralprotein非结构蛋白ORFOpenreadingframe开放阅读框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PCV2Porcinecircovirustype2猪圆环病毒2型PMWSPostweaningmultisystemicwastingsyndrome断奶仔猪多系统衰竭综合征pppolyprotein多聚蛋白PorcinereproductiveandrespiratorysyndromePRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒virusRdRpRNA-dependentRNApolymeraseRNA依赖的RNA多聚酶RNARibonucleicacid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应sgmRNASub-genomeribonucleicacid亚基因组信使核糖核酸TRSTranscription-regulatingsequence转录调控序列IX 第一章引言1.1PCV2研究进展猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）自1991年分离出来时即引起重视，该病原与断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingdisease,PMWS）、皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等多种疾病相关，且能引起猪群的免疫抑制，造成猪群多种疾病病原体混合感染，导致养猪业巨大的经济损失。因此，加强对猪圆环病毒的了解，同时做好PCV2的遗传进化分析有利于制定更加科学有效的防控措施。1.1.1PCV2基因组及其复制转录猪圆环病毒属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），包括猪病毒中的PCV1、PCV2；禽病毒中的鹦鹉热病毒（Psittacinebeakandfeatherdiseasevirus,BFDV）；鸽圆环病毒（Pigeoncircovirus,PiCV）；金丝雀圆环病毒（Canarycircovirus,CaCV）和鹅圆环病毒（Goosecircovirus,GoCV）（Toddetal.,2005）。所有圆环病毒的共同特征是：基因组较小（759-2319nts）且由单链环状DNA组成。病毒粒子直径长16-18nm，无囊膜包裹球形。PCV2基因组为环状单链DNA分子，长度为1767或1768nt，是目前已知的最小的哺乳动物病毒，编码两个主要蛋白：Rep和Cap。这两个蛋白完成病毒最基本的功能：复制和一系列病毒基因组组装。rep和cap基因的起点不同，形成反义基因组。这种结构形成了两个基因间区域，在rep和cap基因3’端之间的更短，其5’端之间的更长且包含病毒基因组复制的起点。联体病毒科和矮化病毒科内的成员也发现有相似的基因组结构。PCV2复制起点是一个茎环结构，其顶端有9个碱基，这个序列和结构特征在病毒、质粒和噬菌体间均是保守的（Mankertzetal.,1997）。一部分复制子具有滚环复制形式，颈环邻近的六碱基基序是复制酶结合位点。PCV2感染细胞后，在宿主细胞各因子的作用下从单链DNA基因组转变为双链DNA复制形式，作为病毒DNA复制的模板。复制起点位于rep和cap开放阅读框之间的非编码区，包含rep基因的启动子在内。圆环病毒有一个特征性的保守的九个核苷酸序列（5’-AAGTATTAC-3’），两侧有重复的11个核苷酸序列（回文结构）。这种结构附近能发现六个核苷酸和五个核苷酸的重复序列。体内实验发现PCV2复制蛋白Rep和Rep’的最小结合位点（minimalbindingsite,MBS）位于重复序列H1和H23’端部分（Steinfeldtetal.,2001）。Rep和Rep’与复制起点结合后，双链DNA不稳定并解旋，使九核苷酸序列以单链DNA的形式暴露，接下来被Rep/Rep’识别并剪切。PCV2复制起点序列的同源性和各Rep蛋白之间的相似性表明其复制模型可能与植物二价染色体及诺洛病毒相同，为滚环十字形结构模型（Hanley-Bowdoinetal.,2000;IlyinaandKoonin,1992;KooninandIlyina,1993;PalmerandRybicki,1998;Stengeretal.,1991）。这种模型假定基因组能形成十字形结构或茎环结构，插入的重复序列形成茎，九核苷酸序列形成顶。近来提出PCV2的一种复制模型，即滚环复制模型（Cheung,2004a,b）。对比而言，滚环十字结构复制模型中Rep/Rep’与复制起点结合后形成不稳定的球体，而不是茎环结构。在这种不稳定的环境下，四个重复的全部序列呈溶解状态。因此，正链和负链DNA都可以作为DNA复制起始模板。序列对比发现，Rep和1 Rep’之间有三个保守的RCR基序：RCR-1（FTLN），RCR-2（HxQ）和RCR-3（YxxK），及dNTP结合的正链GKSbox（P-loop）（IlyinaandKoonin,1992;Steinfeldtetal.,2006;Vega-Rochaetal.,2007）。这四个基序的突变可以改变PCV在细胞培养中的复制（MankertzandHillenbrand,2001;Steinfeldtetal.,2007）。RCR-1对Rep/Rep’的催化作用并不清楚，而RCR-2可以介导二价金属离子与DNA巧妙结合（Hafneretal.,1997;KooninandIlyina,1992;Laufsetal.,1995;Steinfeldtetal.,2006;Vega-Rochaetal.,2007）。RCR-3的Tyr-93通过亲核攻击去除Rep/Rep’磷酸二酯结合键，并且与3’端剪切产物的5’端结合（Steinfeldtetal.,2007;Vega-Rochaetal.,2007）。Rep蛋白与剪切产物的5’端磷酸盐结合，而3’端的羟基团作为DNA合成的引物（Steinfeldtetal.,2007;Vega-Rochaetal.,2007）。PCV2基因组完成一圈复制后，新合成的DNA链在新形成的复制起点剪切，5’磷酸端与新3’羟基团结合，这个过程释放单链单位长度的单体DNA。PCV2的rep转录起点位于核酸767±10范围内。rep的启动子（promoterofrep,Prep）包含复制的起点在内（核酸位点：640-796）。Prep受Rep蛋白的负调控，与六核酸体H1、H2结合。Rep’也与H1、H2结合，但是并不抑制Prep的活性。Rep及Rep’与这些序列元素结合是复制起始所必备的先决条件。因为H1/H2变异体虽然减少但没有完全消除Prep的转录，所以推断Rep蛋白与抑制Prep功能的转录抑制因子反应。相比之下，cap基因并不位于基因之间的区域，而是在rep基因内（核苷酸位置：1168-1428），且Rep，Rep’和Cap不会影响Pcap起始的转录（MankertzandHillenbrand,2002）。cap的转录起始于第1238位核苷酸，起始序列是未翻译的119nt（1238-1120）序列，在ORF1转录的第737位核苷酸的外显子内，与翻译的起始位点相近。这种RNA的出现可能是为了避免在基因内的起始密码子处起始合成另一个蛋白质（Mankertzetal.,1998）。目前对于PMWS动物其PCV2感染细胞的情况知之甚少。通过cDNA差异监测发现（cDNAdifferentialdisplay:DDRT-PCR），几个猪基因不仅在淋巴结组织中，在PK-15细胞中也有上调现象（BratanichandBlanchetot,2006）。第一类：一种与透明质烷介导的运动受体（hyaluron-mediatedmotilityreceptor:RHAMM）相似的基因，结合透明质酸酶后介导Ras-ERK信号通路。RHAMM是一种致癌基因，受到生长促进因子例如TGF-β1，β1整联蛋白和PKC调节，并且与细胞骨架蛋白和DNA修复基因反应。第二类：一种RNA剪切因子（SPF30，NM_005871），对于核蛋白组装入剪接体是必需的。第三类：一种RNA解旋酶组成DEADbox（XM_537542）。第四类：PACSIN2（CR456536）又叫Syndapin2，属于Src-homology3（SH3）结构域蛋白。这些蛋白与动力蛋白和其他几个与囊泡转运密切相关且参与调节泛素聚集、内吞和动力蛋白动力性。第五类：人的一种犬尿氨酸3-单氧酶（AL591898），一种调节色氨酸降解途径的线粒体酶，该途径与人亨廷顿病直接相关。有相似的研究发现，PCV2感染后上调或下调几种基因，它们大多数都参与免疫调节、信号转换和细胞间囊泡的运输。有研究表明PCV2通过使IkBa磷酸化和降解来增强NFkB的活性，随后NFkBp65从细胞浆定位到细胞核。用NFkB的抑制剂处理细胞，减少PCV2编码蛋白的表达和病毒的复制（Weietal.,2008）。这些研究让我们对感染PCV2的细胞有了一定的了解。1.1.2PCV2感染和相关疾病PCV2是在哺乳动物细胞中自主复制的最小的病毒。动物体内的单核细胞、上皮细胞和内皮2 细胞检测到病毒DNA和抗原，但是在单核细胞内未检测到病毒的持续复制。相比之下，通过检测PCV2感染后的Cap和Rep蛋白增加，说明PCV2在内皮细胞系PEDSV.15、大动脉内皮细胞、内脏上皮细胞和纤维细胞的复制（Steineretal.,2008）。内吞活性的变化、病毒结合和摄入与复制效率并不相关，病毒复制与细胞增殖不相关。PCV2吸附细胞受体有氨基葡聚糖肝素、乙酰肝素硫酸盐和软骨素硫酸盐B，而软骨素硫酸盐A和角质素硫酸盐并不是受体，且需要另一个特殊的受体分子（Misinzoetal.,2006）。PCV2病毒粒子吸附并进入猪单核细胞系3D4/31时，能够与所有细胞快速结合，但是其通过网格蛋白介导内吞使病毒内在化的过程非常缓慢，仅能进入少量细胞（Misinzoetal.,2005）。病毒进入宿主细胞有几个共同的途径：例如网格蛋白介导的细胞内吞作用；巨胞饮作用；窖蛋白介导的内吞作用；网格蛋白和窖蛋白共同介导的内吞途径（MarshandHelenius,2006;Vincentetal.,2005）。PCV2对3D4/31细胞的感染受到细胞动力过程抑制剂的抑制，如网格蛋白介导的细胞内吞作用和胞浆酸化过程；而抑制巨胞饮作用和窖蛋白介导的内吞过程并不会减少PCV2的感染。这说明PCV2进入3D4/31细胞是通过网格蛋白介导的内吞作用并且在酸性环境下进行。PCV2内在化后位于内涵体中。内涵体进入细胞内部时，腔内pH降为酸性。抑制实验证明一系列的蛋白酶对于PCV2从内涵体中释放是必须的，而这可能是为了使Cap蛋白降解（Misinzoetal.,2005）。一个相类似的实验发现内涵体内溶酶体酸化抑制剂能促进PCV2感染PK-15内皮细胞，这说明猪内皮细胞内丝氨酸蛋白酶介导的PCV2分解是增强的，但当抑制内涵体内溶酶体系统酸化受抑制时，PCV2在单核细胞内的分解将受到抑制（Misinzoetal.,2008）。免疫荧光分析发现PCV2在内化过程中，与网格蛋白而非窖蛋白共同定位。然而，抑制网格蛋白介导的细胞内吞作用反而会增加PCV2感染PK-15细胞的数量，说明这并不是PCV2进入内皮细胞的主要途径。进一步实验发现PCV2进入细胞主要依赖于小GTP酶和动力蛋白聚合酶，而不是巨胞饮作用、依赖动力的内在化过程和脂筏输入。因此，单独靠动力过程或者胆固醇不能介导PCV2内在过程，而肌动蛋白和小GTP酶共同介导PCV2感染内皮细胞的内在化过程，而网格蛋白介导的PCV2内皮细胞内在化并不能引起足够的感染。PCV2基因组小且编码能力受到极大的限制，因此其生命活动主要依赖于宿主细胞。近来，以酵母或细菌为基础的双向杂交实验表明几种猪体内蛋白与病毒蛋白Rep/Rep’、Cap和ORF3表达的蛋白结合（Finsterbuschetal.,2009;Liuetal.,2007;Timmusketal.,2006）。大多数蛋白与病毒的复制相关，如转录调控和细胞间运输过程。Timmusk等发现了两种与Rep蛋白结合的猪细胞蛋白，一个是与人syncoilin相似的中间细丝蛋白，另一个是转录调控蛋白c-myc（Timmusketal.,2006）。Syncoilin与从细丝到细胞质间联蛋白的重分布有关，且可能与病毒DNA的运输或隔绝相关（Newey,2001）。三个同源蛋白ZNF265，TDG和VG5Q都与Rep蛋白结合（Finsterbuschetal.,2009）。ZNF265可以取代SF2/ASF，作为剪切体的一部分（Adamsetal.,2001）。因此，Rep-ZNF265复合物可能会影响转录和选择性剪切过程，HEK293细胞内共表达使其在细胞核内积累为点状结构，组装成转录的成分。TDG和VG5Q都与转录调控有关。TDG最早发现为DNA修复蛋白（Neddermannetal.,1996），同样也与转录活化因子和共同活化因子如CBP/p300、雌激素α受体和甲状腺转录因子1-TTF1反应，说明其具有转录调控作用（Chenetal.,2003;Misseroetal.,2001;Tinietal.,2002）。3 利用酵母系统发现六个细胞蛋白与Cap蛋白反应（Finsterbuschetal.,2009）。第一个蛋白：MKRN1是E3泛素化线性酶家族的一员，通过泛素化和蛋白酶降解端粒酶亚组hTERT调控端粒长度动态平衡（Kimetal.,2005）。Cap和MKRN1共表达导致Cap表达量下降，表明MKRN1可能促进Cap的降解。第二个蛋白：Hsp40调控蛋白的聚集和分散，以不同的方式影响多个病毒的复制（Hartl,1996）。Hsp40抑制乙型肝炎的复制，但促进促进艾滋病毒基因的表达和复制（KumarandMitra,2005;Sohnetal.,2006）。第三个蛋白：C1q的受体与多个病毒蛋白结合，包括HIV-1Tat和Rev及风疹病毒衣壳蛋白和腺病毒核心蛋白，因此促进病毒转录、复制、衣壳蛋白组装及蛋白运输（Berroetal.,2006）。C1q是汉坦病毒受体，通过抑制RIG-1和MDA5依赖性抗病毒信号途径调控固有免疫（Choietal.,2008;Xuetal.,2009）。细菌双向杂交表明C1qB因子与Cap蛋白结合，是gC1qB的配合基（Timmusketal.,2006）。其中留待解决的问题是三元复合物Cap、C1qB和gC1qB是否能形成。第四个蛋白：Par-4是第一个发现的细胞凋亡前基因产物，上调前列腺癌细胞凋亡且与Wilms’癌症抑制蛋白WT1结合（Johnstoneetal.,1996;Sellsetal.,1994）。研究表明，Par-4与平滑肌细胞骨架上的肌动蛋白的锌指蛋白激酶反应（VetterkindandMorgan,2008）。Cap和Par-4之间的联系可能与病毒蛋白或病毒粒子组装及传播有关。第五个和第六个蛋白：NAP1和NPM1与细胞间物质运输有关，是两种蛋白伴侣并与组蛋白和碱性蛋白结合。NPM1在核糖体生成和细胞中心体复制中是一种核仁磷酸蛋白，且具有蛋白伴侣特性。ORF3蛋白与泛素E3连接酶pPirh2反应，促进病毒感染过程p53的表达。ORF3表达蛋白抑制PCV2感染细胞中pPirh2表达，使得p53的表达增加。PCV2感染细胞和ORF3转染细胞中磷酸化肿瘤抑制基因p53的磷酸化作用与其导致的细胞凋亡有关（Okudaetal.,2000;SavkurandOlson,1998;Szebenietal.,1995;SzebeniandOlson,1999）。PCV1一般不会引起猪的疾病，但PCV2却是引起PMWS的病原（Tischeretal.,1995）。PMWS是一种多因素引起的猪病，于1991年在北美首次发现，从此该疾病几乎席卷了全球所有的养猪地区（Clark,1997;Harding,1996）。尽管临床症状表现多种多样，但典型的PMWS症状包括消瘦、呼吸功能障碍、表面腹股沟淋巴结肿大、腹泻和广泛性淋巴细胞减少（AllanandEllis,2000;Segalésetal.,2005）。机会病原体引起的继发感染是常见的情况，这说明PMWS动物免疫系统功能受到影响。PCV2对环境的抵抗力强，几乎无所不在，这种情况阻碍了对PMWS的诊断。PMWS的确诊有三个原则：一是能同时出现的临床症状，二是轻微到严重的微淋巴损失，三是淋巴组织中中等到高含量的PCV2病毒载量。贯彻实行特定的管理计划，如Madec原则，感染PCV2猪场的病死率可以降低。在最初的生产实验时，观察到不同的实验结果：一方面是根本没有临床症状，只有小量组织损伤，另一方面是完全发展的PMWS。此后有证据表明，免疫系统的活化是形成PMWS的关键步骤（Krakowkaetal.,2001）。PMWS是一种多因素引起的疾病，疾病的发展和症状的严重程度受内在和外在因素的影响。内在的因素包括免疫系统状态和基因遗传因素；外在的因素包括疫苗效力和饲养材料。1.1.3PCV2编码蛋白及其功能PCV2基因组含有两个主要的ORFs，最大的ORF位于位于病毒正链（rep基因或ORF1）。4 ORF1表达两个病毒复制所必需的蛋白：Rep和Rep’。Rep和Rep’是由两个不同但具有重叠区的转录子转录：Rep由全长的转录子转录而成（PCV1：312aa，PCV2：314aa）；另一个重叠的转录子编码截短且C端移码蛋白Rep’（PCV1：168aa，PCV2：178aa）。Rep和Rep’共同的N端有三个基序，这是滚环复制模式启动蛋白的特征。Rep有一个dNTP结合结构域，但是Rep’没有。遗传进化分析发现圆环病毒Rep蛋白可能是诺洛病毒Rep蛋白和微小核糖核酸病毒RNA结合蛋白或原核细胞解旋酶重组形成。有趣的是，Rep’的移码区和Rep的重组位点一致（GibbsandWeiller,1999）。通过拼接产生Rep蛋白变异体是其他单链DNA病毒的特性，但是与玉米条纹病毒不同的是，Rep和Rep’是启动PCV2复制所必需的（MankertzandHillenbrand,2001），分析E.coline中转入的PCV2质粒发现只有Rep存在的情况下，PCV2的复制才能起始（Cheung,2006）。ORF2编码病毒主要结构蛋白Cap（PCV1：232aa；PCV2：233aa），是病毒主要的抗原决定区。Cap的N端是精氨酸富集区，推断与病毒DNA结合有关。细菌和昆虫细胞中表达的Cap蛋白，从电子显微镜下能看到其自我组装的病毒样粒子（VLP：virus-likeparticles）。最近有研究发现致病力与Cap蛋白序列变异之间的联系。一个PCV2分离株在PK-15细胞上连续传代120次（VP120），比第一代毒株（VP1）的复制力更强。VP120在Cap上有两处突变：110位脯氨酸转变为丙氨酸，191位精氨酸转变为丝氨酸。PCV2的VP120和VP1均注射入SPF猪，VP120的病毒血症及病理组织损伤均低于VP1，说明Cap蛋白P110A和R191S两处突变增强了病毒体外生长能力但弱化了病毒体内致病力（Cheung,2004b）。已经找到几个更小的开放阅读框，但是除PCV2的ORF3之外，其他的均没有发现蛋白的表达。ORF3包含在PCV2的ORF1内，但是是反方向转录。有趣的是，PCV1和PCV2的ORF3的序列和大小是不同的：PCV1的ORF3更长，为621nt，而PCV2截短为315nt。人们推断PCV1和PCV2之间ORF3的差异与PCVs的致病力有关。遗憾的是，目前为止，人们只研究了PCV2编码的蛋白。ORF3表达的蛋白对PCV2的复制并不是必需的，但表达的绿色荧光蛋白融合ORF3编码蛋白变异体通过半胱天冬酶8和半胱天冬酶3引起细胞凋亡，因此推断ORF3表达的蛋白具有细胞凋亡活性（Liuetal.,2005）。PCV2野毒株和不能表达ORF3蛋白的变异株体内对比实验发现：两者均能引起血清转换，但是野毒株血清中的病毒载量更高，且变异株不能引起PMWS的典型病变—微小组织损伤。这表明ORF3编码蛋白可能与引起PMWS有关。然而另一个基于嵌合病毒进行的研究并不支持这一假设，他们并不认为ORF3是病毒致病力的主要决定因素。Fenaux等通过交换PCV1和PCV2的cap基因，产生PCV1嵌合病毒（PCV1骨架中嵌入PCV2的cap基因）和PCV2嵌合病毒（PCV2骨架中嵌入PCV1的cap基因）。PCV1嵌合病毒和PCV2嵌合病毒注射猪，均只观察到血清转换而没有致病现象（Fenauxetal.,2004）。PCV2嵌合病毒中含有ORF3，所以ORF3编码蛋白和Cap都不是决定PCV2致病力的唯一因素。Rep和Rep’共同定位于感染细胞的核浆内，而不是核仁内（Finsterbuschetal.,2005）。这种特殊的定位在感染过程中并没有发生改变。Rep和Rep’在其相同的N端均有三个核定位信号（nuclearlocalizationsignals,NLSs）。NLS1和NLS2调节细胞核内的累积，而NLS3促进Rep和Rep’的核输入。对比之下，Cap蛋白的定位方式更多。质粒转染的细胞内，Cap蛋白在细胞整个过程中均定位于核仁。细胞感染PCV早期，Cap蛋白定位于核仁，随后迁移至核浆，也观察到其进入细胞浆，这表明细胞感染期间，Cap蛋白穿梭于细胞的不同组分之间。鉴于PCV编码的所有5 蛋白均主要定位于细胞核内，DNA的复制及环状单链DNA基因组的壳体化可能发生在细胞核。Cap蛋白与细胞核内的蛋白反应可能促进其在细胞核的定位。许多病毒的蛋白具有细胞核定位现象，有观点认为病毒蛋白进入细胞核有利于病毒的转录或影响细胞的生命周期，但是这种现象对PCV2生命周期的影响目前并不清楚。1.1.4PCV2研究展望针对PCV2的分子生物学及相关疾病的研究已经进行了几十年，但仍有很多问题未能解决，病毒与宿主之间的反应及病毒引起疾病的过程均需要进一步的研究。PMWS是一种多因素导致的疾病，要完全了解它并不容易，但是已有的及正在进行的研究会使我们对PCV2及PMWS有一个更好的研究。因此，接下来的研究要集中于细胞与病毒编码蛋白之间的联系，分为两个方面进行：一方面是与致病性相关的，另一方面与病毒生命周期有关。1.2PRRSV研究进展猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，其主要特征是引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道症状（KeffaberKKetal.,1989）。1987年，PRRS在北美首次爆发（WensvoortGetal.,1991），1996年在我国大陆流行（郭宝清等.,1996）。2006年，高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highlypathogenicreproductiveandrespiratorysyndromevirus，HP-PRRS）在我国爆发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失（TianKetal.,2007），该病病原是HP-PRRSV。因此，对PRRSV进行基础研究、遗传进化分析及进行PRRSV分离对控制猪繁殖与呼吸综合征的爆发显得比以往更为重要。1.2.1PRRSV基因组及其复制转录PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）（Cavanagh,Detal.,1997）。PRRSV分为两个血清型，欧洲型（或称1型）和北美型（或称2型）（Allende,Retal.,1999;Nelsen,C.Jetal.,1999）。PRRSV为单股正链RNA病毒，其基因组长约15kb，5’端有帽子结构，3’端有poly（A）尾，编码区有10个开放阅读框（ORF）（YunSIetal.,2013）。PRRSV的复制是从基因组翻译产生pp1a和pp1ab开始的（Brierley,I.etal.,1989），这两个多聚蛋白剪切为成熟的非结构蛋白复制酶，其中由ORF1b编码的非结构蛋白及其他RNA合成过程中的关键酶，如RNA为模板的RNA聚合酶（RdRp;nsp9）和RNA解旋酶（Hel;nsp10），组装成复制与转录复合物（RTC）结合在PRRSV基因组3’端，启动RNA的合成（Pedersen,K.W.etal.,1999）。PRRSV基因组RNA与亚基因组mRNAs合成比例通过蛋白Nsp1调节。2001年，Tijms等通过反向遗传操作首次发现动脉炎病毒科研究模型马动脉炎病毒（EAV）的复制中，Nsp1对基因组RNA合成是非必需的，但是对sgmRNAs合成是必需的（Tijms,M.A.etal.,2001）。2010年，Nedialkova等发现马动脉炎病毒RNA合成的调控因子是Nsp1（Nedialkova,D.D.etal.,2010）。Nsp1调节各亚基因组模板负链RNA的积累水平，因此控制病毒mRNA的数量。2008年，Kroese等通6 过实验使PRRSVNsp1α/Nsp1β裂解失效，使病毒能复制基因组RNA，却不能合成亚基因组sgmRNA（Kroese,M.V.etal.,2008）。Sun等预测马动脉炎病毒Nsp1N端有锌指结构，而在PRRSVNsp1α上有此结构，推测PRRSVmRNAs合成的调控因子是Nsp1α（Beerens,N.etal.,2007）。Nsp1α调控PRRSV的RNA合成的分子机制研究需要结合与RNA合成直接相关的蛋白质来开展，即研究Nsp1α、RNA（特定的RNA基序，如TRS）、调控蛋白（如RNA为模板的RNA聚合酶（RdRp），解旋酶）三者之间空间结构上的关系。RNA为模板的RNA聚合酶（RdRp）活性对PRRSV基因组的合成有重要作用。ORF1b是PRRSV基因组中最保守的部分（denBoon,J.A.etal.,1991），ORF1编码Nsp9及Nsp10等RNA合成关键酶，Nsp9具有RNA为模板的RNA聚合酶（RdRp）活性（Pedersen,K.W.etal.,1999）。Nsp9的RdRp结构域位于复制酶亚基C端（Beerens,N.etal.,2007）。在体外，RNA聚合酶不需要病毒其他蛋白的存在即可合成RNA，但重组EAVRdRp却无法利用病毒基因组3’端的一段序列作为模板合成RNA，这说明在体内还有选择RNA合成模板或活化模板RNA（使模板RNA二级结构打开）的因子与RdRp协同合成RNA（Beerens,N.etal.,2007）。PRRSVNsp10的解旋酶活性可促进PRRSV的RNA合成。PRRSV基因组是单股正链RNA，在合成RNA时，需要RNA解旋酶打开RNA链碱基间互补配对形成的双链结构。2002年，Bautista等实验发现重组EAV和PRRSV的Nsp10具有ATP酶活性，且具有解旋酶活性（Pedersen,K.W.etal.,1999），能在体外从5’端至3’端解旋双链RNA、DNA，这个方向与推测的解旋酶的解旋方向相反（Bautista,E.M.etal.,2002）。RdRp从3’端至5’端合成RNA，因此若解旋酶从5’端至3’端解旋双链RNA，将阻碍RdRp合成RNA，所以这方面还有待进一步的研究来解释。解旋酶是复制酶亚基Nsp10的一部分，同RdRp一样，具有N端预测锌指结构域，即13个保守的半胱氨酸和组氨酸残基，尼多病毒目所有病毒在该区域均保守（Seybert,A.etal.,2005）。2005年Seybert等发现在体外Nsp10的锌指结构域对该蛋白的ATP酶活性及解旋酶活性是必需的。尽管锌指结构域的残基不具有催化活性，但它可能协助Nsp10与底物RNA分子更好的结合（Seybert,A.etal.,2005）。PRRSVNsp11的核糖核酸内切酶活性确保PRRSV复制过程中RNA的准确性。所有的尼多病毒目病毒均含有一个保守的结构域，即核糖核酸内切酶活性结构域（Gorbalenya,A.E.etal.,2006）。目前为止，其他的RNA病毒中均不含有此结构域，因此被认为是尼多病毒目的基因标记（Snijder,E.J.etal.,2003）。动脉炎病毒科病毒核糖核酸内切酶活性结构域位于Nsp11。实验发现，突变EAV核糖核酸内切酶活性位置残基，影响sgmRNAs的正确合成及传代病毒滴度（Posthuma,C.C.etal.,2006）。Nsp11剪切3’端为嘧啶类碱基的单链和双链RNA，更偏好剪切3’端为尿嘧啶类碱基的单链RNA（Nedialkova,D.D.etal.,2009）。2009年，Nedialkova等实验发现，原核和真核细胞表达的Nsp11对细胞具有毒性，说明脱离病毒控制的Nsp11对细胞中RNA成分发挥核糖核酸内切酶活性（Nedialkova,D.D.etal.,2009）。在感染的细胞中，如果Nsp11对病毒RNA发挥内切酶活性将导致病毒的自我消灭，这说明Nsp11结合底物RNA并对其发挥内切酶活性受到病毒其他成分的严格控制，Nsp11整合至多亚基复制与转录复合物（RTC）可能是病毒保护自身RNA免受核糖核酸内切酶酶切的一种策略。研究Nsp11的核糖核酸内切酶活性不仅有助于了解病毒的复制机制，更为利用Nsp11的内切酶活性亚基作为抗病毒药物提出设想。7 根据已有的研究初步绘制PRRSV基因组复制模式。在RNA特殊序列和具有酶活性蛋白质（尼多病毒目是nsp1，PRRSV预测为nsp1α）的共同调控下，合成与基因组或亚基因组等长的负链RNA，前者是PRRSV基因组RNA复制的模板，后者是六条共5’和3’端负链RNA，分别是各亚基因组（sgmRNAs）合成的模板（Pasternak,A.O.etal.,2006;Snijder,E.J.etal.,2006）。合成与亚基因组等长的负链RNA是由特定的RNA信号转录调控序列（Transcription-regulatorysequence,TRS）调控（vanMarle,G.etal.,1999）。TRS分为两类，一类是中间体TRS（bodyTRS），位于基因组中每一个结构蛋白基因的上游，另一类是前导TRS（leaderTRS），位于前导序列的3’端（Pasternak,A.O.etal.,2006）。基因组前导序列（LTH）上TRS二级结构为发夹结构，合成亚基因组长度负链RNA时，3’端合成TRS互补序列（-TRS），与-TRS与TRS碱基互补配对，亚基因组负链RNA合成终止，该亚基因组负链RNA从亚基因组上脱落，3’端TRS与基因组中RNA5’端前导TRS互补配对，整个负链RNA得以伸展并作为模板合成mRNAs（Pasternak,A.O.etal.,2006;Sawicki,S.G.etal.,2007）。因此，从基因组3’端开始合成与亚基因组等长的负链RNA是由中间体TRS减弱并终止，随后以这些负链RNA为模板合成各亚基因组（sgmRNAs）。sgmRNAs合成后即开始翻译对应的结构蛋白，结构蛋白GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N与新合成的基因组RNA组装成病毒粒子，最终释放到细胞外（Mardassi,H.etal.,1995;Meulenberg,J.J.etal.,1996;Wissink,E.H.etal.,2005）。1.2.2PRRSV感染及致病力PRRSV主要通过呼吸道和生殖道侵入动物机体，主要侵害靶细胞为肺泡及血液等组织的巨噬细胞（Duan,X.etal.,1997）。体内感染时，PRRSV对单核/巨噬细胞系具有亲嗜性，同样也感染由单核/巨噬细胞分化而来的肺巨噬细胞及淋巴组织和胎盘（Duan,X.etal.,1997;Teifke,J.P.,2001）。PRRSV不能在非许可细胞内复制繁殖，但能进入非许可细胞（感染后能在此类细胞内检测到病毒基因组RNA），说明PRRSV的细胞亲噬性决定于细胞系是否具有介导病毒侵入的受体蛋白（Kreutz,L.C.,1998）。硫酸乙酰肝素促进PRRSV感染宿主细胞。PRRSV在猪肺巨噬细胞上分离出来5年后，在Marc-145细胞上发现了PRRSV的第一类细胞受体蛋白--硫酸乙酰肝素。实验发现，如果在PRRSV感染Marc-145细胞前用肝素孵育，将显著降低PRRSV的感染效率（Jusa,E.R.etal.,1997）。在猪肺巨噬细胞表面也有类肝素分子，组成一个核心蛋白以共价键与黏多糖（glycosaminoglycans,GAGs）相连（Prydz,K.etal.,2000）。与Marc-145类似，在接毒前用硫酸乙酰肝素黏多糖处理猪肺巨噬细胞，也会显著降低PRRSV的感染效率。研究发现，PRRSV的M/GP5复合体能与肝素结合，提示病毒囊膜上的M/GP5复合体与宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素分子结合（Delputte,P.L.etal.,2000）。唾液酸粘附素介导PRRSV感染。1998年，Duan等制备一系列针对猪肺巨噬细胞的单克隆抗体，其中有两种抗体能阻断PRRSV感染。利用免疫共沉淀发现猪肺巨噬细胞上与其中一种抗体结合的分子与鼠唾液酸粘附素（mSn）高度同源（Duan,X.etal.,1998）。唾液酸粘附素是巨噬细胞特有的1型跨膜糖蛋白，属于唾液酸结合凝集素家族中的一员。实验发现，生理情况下不感染PRRSV的哺乳动物细胞，在细胞表面表达重组猪唾液酸粘附素（pSn）后，经网格蛋白介导，与8 PRRSV病毒粒子表面的唾液酸结合，使PRRSV病毒粒子通过胞吞作用进入细胞（Vanderheijden,N.etal.,2003），说明唾液酸粘附素是PRRSV病毒粒子进入细胞的门户。2010年，VanBreedam,W.发现来源于鼠及人的唾液酸粘附素可以促进PRRSV感染表达猪CD163（pCD163）分子的细胞。进一步实验发现突变体pSn、mSn、hSn（无病毒唾液酸结合位点）则没有促进感染的功能，说明唾液酸结合位点是Sn发挥功能所必须的（VanBreedam,W.etal.,2010）。清道夫受体蛋白CD163是主要在单核/巨噬细胞系表达的1型跨膜糖蛋白（Sanchez,C.etal.,1999）。2007年，Calvert等在建立猪肺巨噬细胞cDNA表达文库时，发现正常情况下不感染PRRSV的细胞，表达CD163分子后能与PRRSV病毒粒子结合（Calvert,J.G.etal.,2007）。2008年，VanGorp等发现37℃条件下用针对CD163分子的抗体孵育巨噬细胞，显著降低PRRSV的感染效率，而将温度下降至4℃时，则失去对PRRSV的阻碍作用（VanGorp,H.etal.,2008）。该实验提示CD163可能位于PRRSV感染途径的中间位置，而不是感染细胞的表面起始PRRSV的感染途径。PRRSV感染细胞模式：PRRSV侵入细胞是细胞受体介导的胞吞作用，其细胞亲嗜性与细胞表面的受体蛋白密切相关。目前已有的研究表明，唾液酸粘附素及CD163是PRRSV进入猪肺巨噬细胞的门户（Delputte,P.L.etal.,2000;Vanderheijden,N.etal.,2003）。现以猪巨噬细胞为例，阐述PRRSV感染细胞的早期过程。病毒黏附：病毒的M/GP5蛋白复合物与细胞硫酸乙酰肝素GAGS结合（Delputte,P.L.etal.,2002）。初步结合后，病毒表面的唾液酸与细胞的唾液酸粘附素（pSn）N端唾液酸结合结构域反应，使病毒粘附细胞更稳定（Delputte,P.L.etal.,2005;Nath,D.etal.,1995）。病毒内吞：巨噬细胞对病毒的内吞通过网格蛋白介导，与病毒受体复合物反应，引发细胞对病毒的内吞（Vanderheijden,N.etal.,2003）。病毒释放：细胞内吞病毒后形成内涵体，内涵体酸化及清道夫受体蛋白CD163（可能是CD163半胱氨酸富集区结构域5）与GP2、GP4蛋白结合是病毒基因组从内涵体中释放至细胞质的必要条件，这个过程还需要细胞内的组织蛋白酶E和尚未定名的胰蛋白酶类似物丝氨酸蛋白酶的参与（Sanchez,C.etal.,1999;Calvert,J.G.etal.,2007）。最后病毒基因组在巨噬细胞质内复制、转录、翻译直至病毒组装并释放。2010年，VanBreedam,W.认为Sn及CD163并不是导致PRRSV严格的宿主亲噬性的主要原因（VanBreedam,W.etal.,2010）。这提出了一个未来的研究方向：PRRSV感染细胞的途径可能不是一个，并且这些途径之间是可以交叉的。猪繁殖与呼吸综合征给世界养猪业造成了巨大的经济损失，它表现为母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经鼻上皮细胞、扁桃体，最终侵入肺巨噬细胞（Rossow,K.D.etal.,1996），引起感染猪肺炎、心肌炎、脑炎、鼻炎、血管炎、淋巴结肿大等病理特征（Rossow,K.D.etal.,1996）。1995年，Halbur选择9株不同分离株感染实验猪，表现出不同的毒力，毒力较弱毒株引起感染猪轻度发热及呼吸急促，毒力较强毒株引起感染猪呼吸困难、嗜睡、厌食及皮肤发绀（Halbur,P.G.etal.,1995）。1996年，Mengeling报道不同毒株毒力差异还表现在引起母猪繁殖障碍的程度（Mengeling,W.L.etal.,1996）。越来越多的数据表明，PRRSV不同毒株在感染猪体内表现出不同的毒力。2006年我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS），又称高热病（LiYetal.,2007）。这类毒株与经典毒株VR2332比较，Nsp2非连续缺失30aa（ZhouYJetal.,2008），使研究人员更9 加重视猪繁殖与呼吸综合征病毒具有基因差异的不同毒株间病毒毒力的研究。2009年，杨汉春发现尽管Nsp2非连续缺失30aa可以作为2006年导致我国爆发高热病的一系列致病毒株的遗传标记，但是致病毒株毒力的增强与此无直接联系（ZhouLetal.,2009）。2014年，杨汉春利用基因关系相近但毒力一强（HP-PRRSV）一弱（LP-PRRSV）的两个感染性克隆pWSK-JXwn和pWSK-HB-1/3.9，进行病毒重组，发现Nsp9和Nsp10突变导致2006年我国爆发的高热病致病原获得致死性毒力（LiYetal.,2014）。同时，他们发现ORF1b与HP-PRRSV的致死性毒力有关；Nsp9和Nsp10与HP-PRRSV的体外复制效率密切相关；Nsp9和Nsp10共同影响HP-PRRSV的体内生长曲线。2014年，WenhuiLu等利用高致病性毒株QY1传代致弱，不同代次毒株（P5，P60，P80和P100）毒力不同，感染猪表现不同的临床症状。P5：烈性高致病性临床症状；P60：轻度至中度临床症状；P80、P100：无临床症状。P100与P5比较发现，共有32aa突变。突变分布在5’UTR、Nsp2、GP2、GP3、GP4、GP5基因区，提示可能是这些区域的基因突变导致高致病性毒株QY1毒力减弱（WenhuiLuetal.,2014）。2014年，XingLiu等通过比较5对强毒株及其致弱毒株（NT0801/NT0801-F80；VR2332/RespPRRSMLV；JA142/IngelvacATPMLV；CH-1a/CH-1R；JXA1/JXAR）发现：基因组中碱基突变引起的氨基酸突变主要集中在NSP2、GP2、GP3、GP5，这些突变可能是导致毒力减弱的因素，而Nsp6和Nsp8没有突变，N、5’UTR、3’UTR仅有1-2个突变，均高度保守（LiuXetal.,2014）。PRRSV毒力定向致弱研究进展迅速，2008年，ByungjoonKwon在PRRSV感染性克隆（FL12）和弱毒株（PrimePac）基础上，置换非结构蛋白开放阅读框（ORF1a、ORF1b）和结构蛋白开放阅读框（ORF2-7），形成一系列嵌合重组病毒，寻找PRRSV毒力因子。实验结果显示：Nsp3-8和GP5是主要的毒力决定因子（KwonBetal.,2008）。2010年，ChengminWang等比较了7株中国猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株（HP-PRRSV）、弱毒株MLV、经典毒株VR2332，发现Nsp2和GP5蛋白氨基酸残基有较大的变异，提示可能是这些变异导致了不同毒株间毒力的差异（WangCetal.,2010）。2013年，Yan-YanNi等首次利用体外DNA同源重组技术致弱PRRSV。基于GP5是PRRSV的主要毒力因子及病毒粒子中GP5和M蛋白形成异源二聚体镶嵌于病毒囊膜上，Yan-YanNi等分别选择了7株和6株母本病毒置换GP5基因和GP5-M基因，结果发现体内与体外实验均能使病毒致弱，为PRRSV弱毒疫苗的研制提供了一个新的方向（NiYYetal.,2013）。目前，PRRSV疫苗株均是从分离的单一毒株选择制备而来，无法对其他所有不同毒力毒株产生完全保护。因此，根据PRRSV主要毒力决定因子，在感染性克隆基础上，有方向性地重组并致弱PRRSV，将是未来PRRSV疫苗研究的主要方向。1.2.3PRRSV编码蛋白及其功能PRRSV基因组含有10个开放阅读框。其中，ORF1a、1b编码两个多聚蛋白：pp1a、pp1ab，pp1ab是由ORF1a移码阅读产生（Brierley,I.etal.,1989;Snijder,E.J.etal.,2007）。pp1a、pp1ab剪切出至少14个非结构蛋白：ORF1a编码10个（NSP1α、Nsp1β、Nsp2-6、Nsp7、Nsp7β、Nsp8），ORF1b编码4个（Nsp9-12）。这14个非结构蛋白的剪切是由4个蛋白酶完成：Nsp1α、Nsp1β、Nsp2和Nsp4（Fang,Y.etal.,2010）。亚基因组mRNAs编码7种结构蛋白，分别为GP2（ORF2a）、E（ORF2b）、GP3（ORF3）、GP4（ORF4）、GP5（ORF5）、M（ORF6）、N（ORF7），其中M、10 N、GP5蛋白是主要结构蛋白。在病毒囊膜上，M和GP5通过二硫键结合形成异源二聚体，而E、GP2、GP3、GP4通过非共价键结合镶嵌在病毒粒子囊膜上（Mardassi,H.etal.,1995）。PRRSV感染猪体后，机体最先产生的是N蛋白诱导针对N蛋白抗原表位的抗体，随后产生针对M蛋白的抗体。但是，N蛋白虽然是数量最丰富的病毒蛋白，其诱导产生的抗体大多数是非中和活性抗体，具有中和活性的抗体是针对PRRSV的M蛋白、GP3、GP4和GP5（Mardassi,H.etal.,1995）。GP5是病毒的主要囊膜蛋白，也是诱导机体产生中和抗体的主要靶蛋白，其表面存在对于抗感染及其重要的中和表位，位于37aa-45aa，但是也存在一个非中和表位27aa-30aa。GP5是ORF5编码的蛋白，美洲型PRRSV的GP5含有200个氨基酸残基，欧洲型PRRSV的GP5含有201个氨基酸残基，GP5的蛋白的分子量为25KD。以往对GP5蛋白的预测分析发现，GP5的N端是含有31个氨基酸残基的信号肽。GP5形成三次跨膜结构域，膜外区有30个氨基酸残基，C端是膜内结构域，含有50-72个氨基酸残基。GP5遗传进化分析发现该蛋白有1个高变区：32aa-40aa；2个多变区分别为57aa-70aa和121aa-130aa；3个保守区分别为41aa-56aa，71aa-120aa，131aa-200aa。预测GP5的糖基化位点，PRRSV毒株GP5含有2-4个糖基化位点，经典的北美型毒株糖基化位点位于N34、N44、N51（Wissink,E.H.etal.,2005）。N蛋白是有ORF7编码的病毒核蛋白，是一种碱性磷酸蛋白，分子量为15KD，是PRRSV含量最丰富的蛋白，约占病毒蛋白总量的40%。N蛋白氨基酸序列在所有的PRRSV毒株中相对比较保守，北美洲型毒株含有123个氨基酸残基，而欧洲型毒株含有128个氨基酸残基。N蛋白在PRRSV病毒粒子中通过共价和非共价结合，以二聚体形式存在。N蛋白作为病毒的核蛋白，其N端有一个RNA结合域，该结合域富含碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）且结构高度灵活，有助于N蛋白与病毒基因组RNA相互作用，包装入病毒粒子中。N蛋白最重要的功能即是与病毒基因组RNA结合完成病毒粒子的装配过程（Meulenberg,J.J.etal.,1996）。Nsp2蛋白是一种非结构蛋白，由ORF1编码的多聚蛋白pp1a裂解的蛋白之一，对应的基因序列为Nsp2基因。Nsp2蛋白最重要的特征即其分子的高变性，其中关注度最大的是氨基酸残基的缺失。2006年在中国及越南爆发的猪繁殖与呼吸综合征给养猪业带来巨大的经济损失，该非典型猪繁殖与呼吸综合征的病原体是高致病性PRRSV，分子特征即为在Nsp2上的第481位和第533-561位氨基酸有30个氨基酸的不连续缺失（WangF.X.etal.,2015）。PRRSV的GP3是ORF3编码的高度糖基化的囊膜蛋白，其分子量为45-50KD，北美洲型含有254个氨基酸残基，欧洲型含有265个氨基酸残基。GP3是PRRSV毒株间保守性最差的蛋白之一，其多数变异位于蛋白的N端。GP4是ORF4编码的一种囊膜蛋白，分子量为31-35KD，北美洲型含有178个氨基酸残基，欧洲型含有183个氨基酸残基。GP4包含N端和C端强疏水区，是典型的I型跨膜蛋白（Murtaughetal.,2012）。1.2.4PRRSV研究展望目前，猪繁殖与呼吸综合征仍是制约我国乃至世界养猪业发展的重要因素，在世界范围内控制和彻底消除该病显得尤为重要。这有待于对病毒的感染、复制机制进行研究，彻底了解病毒侵入宿主细胞的动态过程，从中发现有效的抗病毒药物。同时，通过研究病毒的毒力决定因子，有方向性地对病毒进行改造，较短时间内制备出应对PRRSV的高度安全、长久有效的弱毒疫苗。11 1.3PCV2和PRRSV混合感染研究进展随着PCV2和PRRSV混合感染的情况越来越多，针对这两种病毒混合感染的流行病学调查逐渐增多。2007年，陈学灿等对甘肃省的112个规模化养猪场开展了断奶仔猪多系统衰竭综合征的调查研究的临床调查，结果显示PCV2和PRRSV的混合感染率最高，从而也证实了PCV2和PRRSV在甘肃省规模化养猪场的广泛流行。（陈学灿等.,2007）。2011年李栋等人在甘肃省兰州市发现某猪场仔猪腹泻、咳嗽、四肢末端及腹部皮肤有紫红色斑块、耳朵发绀等临床症状，疑似PCV2和PRRSV混合感染，经PCR和RT-PCR检测确诊为这两种病毒混合感染，对发病猪剖检发现，肺脏有炎性病变，推测肺脏的病理变化是PCV2和PRRSV两种病毒混合感染的主要组织部位且导致明显的病理变化（李栋等.,2013）。2012年，陈金山等人在河南省新乡市发现某猪场90多头发病猪只疑似为PCV2和PRRSV混合感染，经流行病学调查、临床诊断、病理组织剖检、病原及抗体实验室检测等方法最终确诊为PCV2和PRRSV混合感染，且该研究发现使用常规的方法控制PCV2与PRRSV的混合感染效果不理想，而使用自家苗对混合感染发病猪进行治疗，同时配合黄芪多糖注射液和乳酸环丙沙星注射液使用，治愈率可达96.7％（陈金山等.,2013）。2012年，王小敏等人对我国江苏、安徽、上海、山东、浙江、福建、江西7个省份进行PCV2和PRRSV混合感染流行病学调查，采集自发病猪群的血液、脾脏、淋巴结等病料共227份检测发现PCV2和PRRSV混合感染阳性率为25.1%（王小敏等.,2012）。目前研究发现PCV2和PRRSV混合感染具有协同致病性。2008年，T.Opriessnig开展实验探究PCV2和PRRSV共感染对PCV2免疫效果的影响。随机抽取14头21日龄哺乳仔猪，分为6组。第0天，每只仔猪经肌肉或皮肤免疫PCV2单剂量疫苗；第28天，仔猪单独感染PCV2或PRRSV或混合感染；第42天，尸体剖检。血清学检测发现，所以PCV2免疫仔猪第14天至第28天发生血清型转换，由IgM转换为IgG至中和抗体。PCV2和PRRSV混合感染仔猪平均每日增重相对于空白对照组和仅感染PCV2的实验组显著性减少，且产生的抗体水平更低。PCV2和PRRSV混合感染仔猪肺部损伤更严重。两种病毒共感染猪只血清中PCV2DNA含量和淋巴组织中PCV2病毒载量更高（D.M.Madson.,2008）。2014年，ChanghoonPark开展实验发现PCV2和PRRSV混合感染对猪造成的病理损失及免疫抑制等病理变化与感染时PCV2的基因型无关。23头2-6周龄健康仔猪随机分为5组，阴性对照组3头，PCV2a单独感染组5头，PCV2a和PRRSV混合感染组5头，PCV2b单独感染组5头，PCV2b和PRRSV混合感染组5头，不同时间段采集仔猪血液、鼻拭子、肛拭子、口腔拭子。实验室PCV2基因组PCR检测及PCV2抗体ELISA检测发现PRRSV混合感染增强PCV2在机体内的复制，且PCV2病毒载量更高。PRRSV混合感染还能延长PCV2基因组在血液中的存在时间，增加仔猪感染PCV2第28-78天PCV2在血液中的DNA含量，但与PCV2感染的类型无关（ChanghoonPark.,2014）。这些实验都说明PCV2感染猪只如果混合感染PRRSV将更加有力于PCV2在组织内的复制，增加病毒引起的病理变化。因此，有效控制PCV2的前提是做好PRRSV的感染，综合防控才是上策。PCV2和PRRSV两种病毒在猪体内可以相互促进增殖，混合感染具有明显的协同致病作用，PCV2和PRRSV协同致病分子机理研究已经有了初步进展。PCV2感染PAM导致其分泌IFN-α增多，增多的IFN-α使PAM抗感染能力减弱，造成PRRSV的大量感染，加剧了PAM及感染猪只肺部的病理损伤。同时，PCV2和PRRSV混合感染引起机体分泌TNF-α增多，分泌TNF-α的12 单核细胞、巨噬细胞及周围的其他细胞凋亡增多，从而使机体的先天性免疫细胞及先天性免疫系统遭到破坏，并且不能充分有效的调动特异性免疫系统，抵抗病毒的入侵和复制，引起机体体质恶化。PCV2和PRRSV混合感染可造成机体的免疫抑制。PCV2和PRRSV都是能造成机体免疫抑制的病原体，当机体混合感染这两种病毒时，机体内的免疫反应可能与单独感染有一定的区别。2007年，中国农业大学的施开创等人就已经开展这方面的实验。随机选取20只健康的6周龄仔猪，5只每组分为4组，分别为空白对照组、单独感染PCV2组、单独感染PRRSV组、混合感染PCV2和PRRSV组。抽取感染前和感染后第3、7、10天前腔静脉血液，测定先天免疫效应细胞含量，测定的细胞包括白细胞、NK细胞、γδT细胞、单核细胞、粒细胞。实验发现PCV2和PRRSV混合感染猪只外周血中天然免疫细胞量比空白对照组或单独感染少，说明PCV2和PRRSV能够协同降低外周血天然免疫细胞，可在感染早期导致严重的先天免疫（施开创等.,2007）。机体感染后的免疫反应与疫苗免疫效果直接相关，因此PCV2和PRRSV协同造成的免疫抑制将影响PCV2和PRRSV的疫苗免疫效果，给猪群疾病防控及地区和国家消灭该病造成困难。PCV2和PRRSV均能引起猪的免疫抑制，从而导致猪的机体免疫力下降，甚至造成疫苗免疫失败，造成其他病毒或细菌入侵机体引起机体的继发感染和混合感染，因此在这方面需要更多的基础研究。13 第二章PCV2和PRRSV流行病学调查目前，猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征已成为严重危害我国猪群的两大免疫抑制性疾病。猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在我国猪场阳性感染率居高，且PCV2和PRRSV混合感染较为严重。为了解两种病毒在我国猪场的流行及混合感染情况，本研究根据GenBank中PCV2基因组序列及PRRSVORF5、ORF7、Nsp2基因序列设计合成引物，建立了分别用于检测和扩增PCV2和PRRSV的PCR及RT-PCR方法，对2013-2015年采自吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省192份样品进行检测。检测结果发现，PCV2感染率为64.3%，PRRSV感染率为23.4%，29份样品为混合感染，PCV2和PRRSV双阳性率达18.5%。本实验对流行病学调查中采集的PCV2和PRRSV混合感染病料进行PRRSV病毒分离，获得两株PRRSV毒株，分别命名为HLJyq-2015-1、LNsy-2014-1。2.1材料和方法2.1.1实验材料2013年9月至2015年3月陆续从我国吉林省（吉林、长春、四平）、辽宁省（沈阳）、黑龙江省（玉泉、肇东）、山西省（岢岚）、山东省（泰安、德州、临沂）、广东省（广州）6省11地区疑似发病猪场采集192份病料，分别为肺、脾、淋巴结、血液。RNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；DNAMarkerDL2000，DNAMarkerDL15000，pMD18-T载体，E×Taq酶，dNTP（10mM），随机引物RandomPrimer，反转录酶抑制剂RRI均购自大连宝生物工程有限公司；反转录酶及其相应Buffer购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；胎牛血清，感受态细胞JM109购自北京全式金生物技术有限公司。Marc-145细胞；DMEM、MEM培养液；PBS（pH=7.4）；0.22μm微孔滤膜；青霉素（100万IU/mL）、链霉素（80万IU/mL）；25mL、75mL细胞培养瓶均购自Solarbio公司。2.1.2实验方法2.1.2.1PCV2和PRRSV的检测和基因扩增测序1）病料处理及PCR扩增PCV2疑似病料研磨：取小块采集的病料组织放入5mL冻存管，用锋利的小剪子将病料剪碎，再加入研磨砵中进一步研磨，直至病料呈匀浆状，加入4倍病料体积的MEM培养液。病料组织液-80℃和4℃反复冻融3次，使病毒从病料组织细胞中充分释放出来。取处理好的病料研磨液，提取病料DNA，方法按照QIAampDNAMiniKit说明书操作（QIAGEN,Hilden,Germany）。使用针对PCV2基因组设计的引物对A1、A2；B1、B2；C1、C2进行PCR扩增，引物详细信息见-1表2.1。PCR反应体系为50μL，组成为：10×PCRbuffer5μL，dNTPs（2.5mmol•L）4μL，1-1对引物各1μL，模板DNA10μL，ExTaq酶0.5μL（5U•μL），加灭菌超纯水至50μL，混合均匀。将混合物95℃变性10min后，按94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1kb/min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，最后4℃保存。将扩增的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，14 用紫外仪观察目的条带，将目的条带切胶回收，用凝胶回收试剂盒回收纯化，具体步骤按照试剂盒使用说明书进行，最后用20μLddH2O溶解。表2.1PCV2检测引物及全基因组扩增引物Table2.1DetectionprimersandwholegenomeamplificationprimersofPCV2PCV2引物（5’-3’）扩增位置长度（bp）PCV2-A1,A2（检测引物）1232-1362130TGGGCTCCACTGCTGTTATTCAAGGACAGGTTTCGGGGPCV2-B1,B2（测序引物1）862-1753891CATTTTTCCTTCTCCAGCGGTAACGGTGGCGGCCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATAPCV2-C1,C2（测序引物2）1608-12901449CAGTATAACCGATGGTGCGGGAGAGCGAAGTGATAAAAAAGACTCAGTAAPRRSV疑似病料研磨：将病料组织与MEM溶液1:3混合，充分研磨，-80℃和4℃反复冻融3次，-80℃保存备用。使用QIAGENRNA提取试剂盒提取血清样品和组织匀浆中全部RNA（QIAGEN,Hilden,Germany）。使用TakaRa的RandomPrimer进行反转录反应，合成病毒cDNA（TakaRa,Dalian,China）。随后使用针对PRRSVORF5、ORF7和Nsp2基因设计的引物对进行PCR扩增，引物详细信息见表2.2。PCR反应体系同上，反应程序如下：ORF5基因的扩增引物对有ORF5-F和ORF5-R，扩增程序：95℃预变性5min，接下来35个循环即95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，最后72℃后延伸10min。ORF7基因的扩增引物有ORF7-F和ORF7-R，ORF7基因的扩增条件是95℃预变性5min，接下来35个循环即95℃变性30sec，54.4℃退火30sec，72℃延伸30sec，最后72℃后延伸10min。引物对Nsp2-F和Nsp2-R，扩增Nsp2高变区，PCR扩增条件：95℃预变性5min，接下来35个循环即95℃变性30sec，50.5℃退火30sec，72℃延伸3min，最后72℃后延伸10min。将扩增的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外仪观察目的条带，将目的条带切胶回收，用凝胶回收试剂盒回收纯化，具体步骤按照试剂盒使用说明书进行，最后用20μLddH2O溶解。15 表2.2PRRSV基因扩增引物Table2.2GenesamplificationprimersofPRRSVPRRSV引物（5’-3’）扩增位置长度（bp）ORF5-F，ORF5-R13698-14300725CAACCGTTTTAGCCTGTCTTTGGCGTGTAGGTAATGGAAORF7-F，ORF7-R14799-15170506CGTGTTGGGTGGCAGAATTAGAGGCACAGTGTCAATCAGNsp2-F,Nsp2-R1260-48613602CAGGGTTGAGCCCAATACGGCAAGGCAGCAATGAGGTG2）PCR扩增产物连接入克隆载体，反应体系为10μL：回收的PCR扩增产物4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionⅠ5μL，加入到小的PCR管中，16℃连接过夜。3）感受态细胞的制备。第一天：菌种划线培养。准备工作：配备LB培养基300mL；准备三个LB平板，分别为无抗性、氨苄抗性、卡纳抗性；配制PIPES溶液。配制100mLPIPES溶液（15.1gPIPES固体加水定容至100mL），5mol/LKOH调pH值至6.7，0.45μm滤膜超净工作台过滤，分装为小份（4mL每份）于-20℃保存备用。配制1LInone转化液：MnCl2•4H2O10.88g，CaCl2•2H2O2.20g，KCl18.65g，PIPES（0.5mol/L，pH=6.7）20mL，加水定容至1L，0.45μm滤膜超净台过滤除菌。完成准备工作后，将-80℃保存的菌种取出，在无抗性、氨苄抗性、卡纳抗性LB平板上划线，37℃温箱中倒置培养过夜。第二天：挑菌、摇菌。若细菌在无抗性LB板上生长出边缘光滑的圆形菌落，在氨苄抗性和卡纳抗性LB板上未长出菌落，则说明菌种合格。挑取无抗性LB板上位于中间的单个、圆形大菌落于25mLLB培养基中，37℃180-200rpm/min摇床中摇菌6-8h。取摇6-8h后的菌液2mL、4mL、10mL于250mLLB培养液中，18-22℃中速（180rpm/min）摇菌过夜（10-12h）。第三天：菌种加入转化缓冲液及DMSO，分装，冻存。提前冷冻物品：灭菌1.5mLEP管；灭菌50mL离心管；灭菌200μL枪头；灭菌滤纸；EP管架；50mL离心管架。注意DMSO常温保存，不用预冷，低温时结晶。检测菌液OD值，当OD=0.55时，250mL菌液2500rpm/min，4℃离心10min。弃上清，用滤纸吸干上清，加入80mL提前预冷的Inone转化缓冲液，充分悬浮沉淀细菌，2500rpm/min，4℃离心10min。弃上清，用滤纸吸干上清，加入20mLInone转化缓冲液（若细菌较少，可减少加入的Inone转化缓冲液体积，以保证细菌浓度），悬浮沉淀的细菌。加1.5mLDMSO（根据加入的Inone转化缓冲液的体积增减），混匀。将菌液于冰上分装，每个EP管50μL或100μL。分装好后至液氮中迅速冷冻，于-80℃保存备用。4）连接产物转化入感受态细胞。打开超净台，杀菌半个小时。取出冰盒，从-80℃取出感受16 态细胞JM109，立刻放到冰上静置10min，在超净台上将连接产物加入到100μL感受态细胞中，冰浴半个小时以上。提前调好水浴锅，温度为42℃。42℃热击45s，立马放到冰上遇冷3min以上（注意此过程一定要轻，不可剧烈晃动）。冷却后，在超净台上，往EP管中加入800μL无抗的LB培养基，然后转移到试管中。在摇床上37℃，220rpm/min，摇1h。取出试管，将其转移到EP管中，3000rpm/min离心5min。在超净台上取出900μL上清，剩下的充分混匀，均匀涂布在含有氨苄抗性的平板上（每个板涂50μL，涂两个板）。37℃恒温箱培养过夜，若第二天长了菌落，则进行鉴定。5）菌液PCR鉴定。将长出的菌落接到LB（氨苄抗性）培养基中，过夜摇菌。以菌为模板-进行菌液PCR，PCR体系为25μL，组成为：模板2μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol•L1-1）2μL，1对引物各1μL，EXTaq酶0.5μL（5U•μL），H2O16μL。PCR反应程序与扩增时反应程序相同。6）鉴定为阳性的菌液保种并提质粒，质粒送去测序。2.1.2.2PRRSV的分离与鉴定1）病毒的分离将流行病学调查中采集自吉林、山东、山西、黑龙江、广东的经检测为PRRSV阳性病料的组织进行研磨，研磨过程中加入少量液氮，防止病毒基因组RNA降解。待在液氮中研磨的病料为粉状时，停止研磨，加入4倍病料体积的MEM培养液，使研磨好的病料成匀浆状。匀浆状病料中加入配置好的100×青霉素、链霉素。-80℃和4℃反复冻融3次，使病毒从病料组织细胞中充分释放出来。病料组织1000rpm/min离心，小心吸出上清液，0.22μm微孔滤膜过滤。复苏Marc-145细胞，往下传代3-4代，调整细胞至最佳状态，待细胞铺满细胞瓶80%-90%时（这种密度更有利于病毒接触、吸附细胞），取0.5-1.0mL过滤的病料组织上清液接入培养好细胞的25mL细胞瓶中。同时，设置对照组，不接种病料。接种过病料组织上清液的细胞培养瓶置于37℃，5%CO2细胞培养瓶中，孵育1-1.5h。孵育期间每隔二十分钟进行观察，若细胞状态发生改变，如开始脱落等不良状态，立即取出细胞瓶，在超净台中加入2×DMEM培养液。如果孵育期间细胞状态良好，则等孵育1-1.5h后再加入培养液。接种后的细胞培养5-6天，每天早晚进行观察，如果有细胞出现典型病变，即细胞聚堆，即将该细胞-80℃和4℃反复冻融3次，使病毒从细胞中充分释放出来，之后进行分装，-80℃保存备用。如果细胞未出现病变，则继续往下传代，盲传5代后，如果仍旧没有病变，则视为病毒分离失败，停止往下传代。2）病毒的鉴定首先，RT-PCR检测PRRSV毒株。第一步提取病毒基因组RNA：Trizol法提取RNA，500μL病毒液中，加入500μLTrizol，混匀，静置5-10min。加入200μL氯仿，震荡15s，使乳化，静置5min。1300rpm/min，4℃，离心15min，从离心机中取出后分为上、中、下三层，上层为RNA液体。中层为蛋白质，下层为DNA。小心吸取550μL上清液。加等量550μL异丙醇，混匀，将RNA沉淀，且4℃沉淀效果更好。再次1300rpm/min，4℃，离心15min，从离心机中取出后弃上清，倒置EP管在滤纸上吸水。加入800-1000μLDEPC水配置的75%酒精，洗去RNA中杂质。8000rpm/min，4℃，离心10min，弃上清液。残留有液体的EP管在超净工作台吹干，此过程控制在3-5min。9μLDEPC水溶解RNA。72℃促溶2min，分光光度计测RNA浓度。RNA提17 取中，实验人员配戴口罩、手套，且全程保持4℃，防止RNA酶降解RNA。第二歩病毒基因组RNA反转录为cDNA：20μL体系，9μLRNA溶解液，1μL随机引物（RandamPrimer）混匀，72℃10min打开RNA链，使随机引物与RNA链充分接触。冰浴10min，使随机引物与RNA链结合。随后加入10μL预混体系：DEPC水2.5μL，dNTP2μL，5×Buffer4μL，M-MLV（反转录酶）1μL，Rasin（RNA酶抑制剂）0.5μL。37℃水浴锅1-2h。反转录完成后，cDNA进行下一步实验或置于-80℃保存备用。第三歩PCR扩增病毒保守基因，进行毒株检测：实验室已有的针对PRRSV保守基因ORF7的扩增引物进行扩增。95℃热启动5min，94℃变性30s，54.4℃退火30s，72℃延伸45s，变性-退火-延伸进行35个循环，72℃后延伸10min，4℃10min降温，取出PCR管，凝胶电泳检测。其次，间接免疫荧光鉴定PRRSV毒株。分离的病毒接种96孔板单层Marc-145细胞，同时设置阴性对照组不接毒和阳性对照组接PRRSV细胞适应毒作为对照。细胞培养箱中培养36-48h，期间观察接毒细胞，如果细胞有病变，立即取出进行固定。细胞固定：弃培养液，PBS液轻柔洗3遍，待PBS液干后，加50μL配好的-20℃保存的固定液（固定液成分为丙酮：甲醇=3：1），-20℃固定2h。-20℃拿出固定板，室温放置至无雾，轻轻倒去液体，PBS液轻柔洗3遍。加PRRSV高免血清作为一抗，用PBS液1:200稀释，每孔加50μL，37℃放置1h。96孔细胞培养板从37℃温箱中取出，PBS液洗5遍，加入FITC标记兔抗猪IgG荧光二抗，荧光二抗用PBS液1:1000稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置30min，该过程要暗室操作，避免荧光二抗曝光后猝灭。避光PBS液洗5遍，暗室荧光显微镜观察96孔细胞培养板是否有荧光。2.2实验结果2.2.1样品采集结果2013年9月至2015年3月在我国吉林省（吉林、长春、四平）、辽宁省（沈阳）、黑龙江省（玉泉、肇东）、山西省（岢岚）、山东省（泰安、德州、临沂）、广东省（广州）6省11地区进行PRRSV和PCV2流行病学调查，从疑似发病猪场采集192份病料，按照采集病料时间对13个猪场进行编号：No.1-No.13，且对猪场背景进行背景介绍，包括养殖数量、饲养管理情况、发病情况。No.1（吉林/吉林）：27头育肥猪，27头每栏，每日清理圈舍。No.2（吉林/长春）：500头育肥猪场；10头每栏；进行疫苗免疫包括猪瘟与蓝耳，每日清理圈舍，每周消毒一次：过氧乙酸消毒。No.3（吉林/四平）：50头母猪，400头哺乳仔猪，限位栏饲养，每日清理圈舍。No.4（吉林/玉泉）：54头育肥猪，10头每栏，每日清理圈舍。No.5（黑龙江/肇东）：300头育肥猪场，10-15头每栏，进行疫苗免疫包括蓝耳，口蹄疫，猪瘟，伪狂犬，隔日清理圈舍，每月消毒一次：生石灰消毒。No.6（山西/岢岚）：150头育肥猪，（10+21）头母猪，引进后21头母猪时导致蓝耳病的爆发，120头哺乳仔猪，育肥猪20头每栏，母猪及哺乳仔猪限位栏饲养，每日清理圈舍。No.7（辽宁/沈阳）：1000头育肥猪场，10-15头每栏，进行疫苗免疫包括蓝耳，口蹄疫，猪瘟，伪狂犬；，每日清理猪场，每周消毒一次：过氧乙酸消毒。No.8（辽宁/沈阳）：6600头育肥猪场，大栏饲养，每栏46头；进行疫苗免疫包括口蹄疫、猪瘟、伪狂犬、支原体肺炎，每日清理圈舍，每周带猪绿安康（过硫酸氢钾复合物粉）消毒一次，出完一批猪猪舍彻底清洗消毒，消毒剂第一遍火碱，第二遍戊二醛或18 绿安康，每批猪12周，14周各做一次伪狂犬抗体检测。No.9、10、11：山东省兽医检疫局抽检样品，抽检样品总数为385份，因抽检猪场数目较多，猪场背景不在此列举。No.12：2500头种猪场，限位栏饲养，进行疫苗免疫包括口蹄疫、猪瘟、伪狂犬，每日清理圈舍，每周消毒一次，过氧乙酸与戊二醛轮换使用，每个季度做一次猪瘟、猪蓝耳、伪狂犬、口蹄疫抗体检测。No.13：10000头育肥猪场，大栏饲养，每栏30头；进行疫苗免疫包括猪蓝耳、猪瘟、伪狂犬、猪圆环、猪腹泻三联苗，每日清理圈舍，每周消毒一次。样品采集结果见表2.3。表2.3PRRSV、PCV2疑似发病猪组织样品采集情况Table2.3TissuesamplecollectionofpigsuspectedwithinfectionofPCV2orPRRSV样品采集No.省份/临床症状时间/PCV2PRRSV猪场地区年阳性率阳性率呼吸症状肺20131/11/1No.1吉林/吉林流产脾20144/44/4No.2吉林/长春PMWS,转圈运淋巴结,脾,血201412/120/12No.3吉林/四平动液呼吸症状，死亡血液201412/1212/26No.4黑龙江/玉泉流产肺,脾20147/80/8No.5黑龙江/肇东呼吸症状，死亡淋巴结,脾201437/465/46No.6山西/岢岚流产淋巴结,脾20145/74/7No.7辽宁/沈阳PMWS淋巴结,脾201418/600/60No.8辽宁/沈阳未发病血液2014-----1/1No.9山东/泰安未发病血液2014-----2/4No.10山东/德州血液2014-----11/12No.11山东/临沂未发病淋巴结,脾,血20155/71/7No.12辽宁/沈阳PMWS，死亡液2015-----4/4No.13广东/广州呼吸症状，腹泻血液2.2.2临床观察结果2013-2015年，6省11地区不同猪场疑似散发猪繁殖与呼吸综合征或猪圆环病毒相关疾病，进入发病猪场进行临床观察并记录结果如图2.1所示。图2.1-A为发生猪繁殖与呼吸综合征疾病育肥猪，出现典型的“蓝耳”症状。图2.1-B为发生猪圆环病毒相关疾病幼猪，出现运动失调神经症状。图2.1-C猪只极度虚弱，倒地不起，经病原学检测发现为PCV2和PRRSV混合感染。19 图2.1-A图2.1-B图2.1-C图2.1发病猪临床症状Fig2.1Clinicalsymptomsofpigs2.2.3病料阳性率和基因PCR扩增测序157份PCV2疑似病料进行PCR检测，结果有101份病料扩增出目的条带，阳性率为64.3%；192份PRRSV疑似病料分别进行RT-PCR扩增，结果有45份病料扩增出目的条带，阳性率为23.4%。PRRSV与PCV2的混合感染样品29份，双阳性率为18.5%，说明我国PRRSV、PCV2感染率均较高，且在猪群中PRRSV与PCV2的混合感染已经非常普遍。同时，对不同地区的12份PCV2阳性病料进行PCV2全基因组测序，并将扩增序列命名为SY-Z-4、ZD-1、ZD-7、SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6、SP-2和JL-Z，在Genbank上的登录号分别为KU041848-KU041859。对不同地区的12份PRRSV阳性病料扩增ORF5、ORF7和Nsp2基因，其对应的序列分别命名为JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、LNsy-2014-1/2、SXkl-2014-1、HLJyq-2015-1。12个ORF5序列的GenBank登录号：KU163044-KU163055；12个ORF7的GenBank登录号:KU163056-KU163067；10个Nsp2部分基因序列GenBank登录号:KU163068-KU163077。PCV2疑似病料使用A1、A2检测引物进行PCR检测，扩增出130bp目的条带，结果见图2.2；使用全基因组扩增引物B1、B2，扩增出891bp目的条带，结果见图2.3；使用全基因组扩增引物C1、C2，扩增出1449bp目的条带，结果见图2.4。130bpM:DL2000Marker1-13:检测样品14：阴性对照15：阳性对照图2.2PCV2疑似病例PCR检测凝胶电泳结果Fig2.2GelelectrophoresisresultofsamplessuspectedwithPCV220 891bpM：DL2000Marker1-11：检测样品12：阳性对照13：阴性对照图2.3PCV2全基因组扩增引物B1、B2PCR扩增产物凝胶电泳结果Fig2.3GelelectrophoresisresultofamplificationofPCV2genomebyprimersofB1andB21449bpM:Trans2KPlusIIDNAMarker3-5:检测样品2：阳性对照1：阴性对照图2.4PCV2全基因组扩增引物C1、C2PCR扩增产物凝胶电泳结果Fig2.4GelelectrophoresisresultofamplificationofPCV2genomebyprimersofC1andC2PRRSV疑似病料进行RT-PCR扩增，使用ORF5-F、ORF5-R扩增，得到725bp目的条带，结果见图2.5；使用ORF7-F、ORF7-R扩增，得到506bp目的条带，结果见图2.6；使用Nsp2-F、Nsp2-R扩增，得到3602bp目的条带，结果见图2.7。725bpM：DL2000Marker；1-9：检测样品；10：阴性对照；11：阳性对照图2.5PRRSV全基因组扩增引物ORF5-F、ORF5-RPCR扩增产物凝胶电泳结果Fig2.5GelelectrophoresisresultofamplificationofPRRSVgenomebyprimersofORF5-FandORF5-R21 506bpM：Trans2KPlusIIDNAMarker；3-5：检测样品；2：阳性对照；1：阴性对照图2.6PRRSV全基因组扩增引物ORF7-F、ORF7-RPCR扩增产物凝胶电泳结果Fig2.6GelelectrophoresisresultofamplificationofPRRSVgenomebyprimersofORF7-FandORF7-R3602bpM:Trans2KPlusDNAMarker1-2:检测样品3：阳性对照4：阴性对照图2.7PRRSV全基因组扩增引物Nsp2-F、Nsp27-RPCR扩增产物Fig2.7GelelectrophoresisresultofamplificationofPRRSVgenomebyprimersofNsp2-FandNsp2-R2.2.4PRRSV分离株鉴定2.2.4.1病毒分离株RT-PCR鉴定将接种于Marc-145细胞的病毒液提取RNA，反转录后以ORF7为靶基因进行PCR扩增鉴定，PCR扩增产物凝胶电泳结果与预期相符。电泳结果见图2.8。123456507bp1,4:2000Mark;2:LNsy-2014-1;3:HLJyq-2015-1;5:阴性对照;6:阳性对照图2.8LNsy-2014-1毒株、HLJyq-2015-1毒株RT-PCR鉴定Fig2.8RT-PCRamplificationresultsofisolatesofLNsy-2014-1andHLJyq-2015-12.2.4.2病毒分离株间接免疫荧光鉴定对病毒分离株接种Marc-145细胞，进行间接免疫荧光鉴定，鉴定结果为阳性，接毒后的细胞有明显荧光，同时阳性对照有荧光，阴性对照无荧光。接种Marc-145细胞后病变及间接免疫荧光图见图2.9。22 图2.9LNsy-2014-1毒株、HLJyq-2015-1细胞病变、间接免疫荧光鉴定图Fig2.9CytopethiceffectandindirectimmunofluorescenceresultsofisolatesofLNsy-2014-1andHLJyq-2015-12.3讨论2.3.1PCV2和PRRSV在猪场中的流行及混合感染PCV2和PRRSV病原学诊断方面，本研究运用的RT-PCR及PCR检测方法具有快速、安全、灵敏、特异性高等优点，广泛应用在不同病原检测（王鑫等.,2010;孙艳永等.,2009）。本研究发现PCV2与PRRSV的感染率分别为64.3%、23.4%，混合感染率为18.5%，与曹洪志等（2010年）应用PCR、RT-PCR方法对宜宾地区329份病料检测发现PRRSV与PCV2混合感染率达21.9%基本相符，这说明在我国猪群中PCV2、PRRSV的混合感染已非常普遍，已成为严重危害猪群的传染性疾病，值得有关人员的高度重视（曹洪志等.,2010）。猪圆环病毒相关疾病属于外来疾病，1998年开始传入我国，是引起PMWS的病原之一。PMWS是一种多因素引起的新兴猪病，于1991年在北美首次发现，从此该疾病几乎席卷了全球所有的养猪地区（Harding,J.C.S.etal.,1997）。尽管临床症状表现多种多样，但典型的PMWS症状包括消瘦、呼吸功能障碍、表面腹股沟淋巴结肿大、腹泻和广泛性淋巴细胞减少。机会病原体引起的继发感染是常见的情况，这说明PMWS感染动物免疫系统功能受到影响（郎洪武等.,2000）。近几年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国猪场普遍流行，流行病学调查显示部分地区病毒感染阳性率高达60%（邢明伟等.,2010;郭宝清等.,1996）。自2006年我国爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征以来，该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。高致病性猪繁殖与呼吸综合征属于强制免疫性疾病，国家免费发放疫苗进行免疫预防。但是，在本次流行病学调查研究中发现，绝大部分猪场位于偏远地区（乡村和郊区），小规模养猪场和自家养殖户接触不到疫苗免疫等信息，所以我们发现部分养猪场未能进行免疫而爆发该病。PCV2和PRRSV均可以破坏猪的免疫系统，导致猪免疫系统抑制。PRRSV能破坏机体内各种组织的巨噬细胞，肺泡内的巨噬细胞是其主要的靶细胞，且易感性较其它病毒高，侵入的病毒在23 巨噬细胞内大量增殖，导致巨噬细胞崩裂、减少。PCV2能引起淋巴细胞凋亡，抗原递呈细胞递呈抗原能力减弱，同时降低了B淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞机能，使病猪处于免疫抑制状态，机体状况下降。已有研究表明PCV2和PRRSV两种病毒在猪体内可以相互促进增殖，混合感染具有明显的协同致病作用，PCV2感染PAM导致其分泌IFN-α增多，PAM抗感染减弱，造成PRRSV的大量感染，增强PAM及感染猪只肺部的病理损伤。同时，PCV2和PRRSV混合感染引起机体分泌TNF-α增多，分泌TNF-α的单核细胞、巨噬细胞及周围的其他细胞凋亡增多，从而使机体的先天性免疫细胞及先天性免疫系统遭到破坏，并且不能充分有效的调动特异性免疫系统，抵抗病毒的入侵和复制，引起机体体质恶化。PCV2和PRRSV混合感染可以加重或者扩大混感猪免疫器官的病理变化，导致更加严重的免疫抑制（王天户等.,2008），最终的结果是对猪瘟、口蹄疫等疫苗的抗体生成产生抑制，使猪群的主动免疫抗体滴度不够，引起猪瘟、口蹄疫等一些病毒性疾病的爆发。因此，PCV2和PRRSV混合感染的流行病学调查及其协同致病机理、协同免疫抑制机理、混合感染病毒对疫苗免疫的影响的基础研究刻不容缓。2.3.2PRRSV分离株PRRSV是单股正链RNA病毒，其基因组RNA易降解使病毒失活，因此病毒分离的关键步骤是对病料的处理，病料采集后立即低温保存、运输；病料加液氮研磨。辽宁省沈阳市采集自和黑龙江省玉泉市的病料接种Marc-145细胞后，盲传至第三代和第四代，出现PRRSV阳性毒接毒后的典型病变，即细胞变圆、聚堆随后脱落。RT-PCR检测结果为阳性，间接免疫荧光鉴定为阳性。将其分别命名为LNsy-2014-1毒株、HLJyq-2015-1毒株，这两株毒株在第四章病毒遗传分析中均鉴定为美洲型（I型），且分别与经典毒株JXA1和VR2332相似度最大。24 第三章PCV2遗传进化分析本研究中PCV2和PRRSV混合感染双阳性率为18.5%，其中PCV2感染阳性率为64.3%，说明PCV2感染已经成为影响我国部分地区养猪业的重要因素。为了解PCV2毒株在我国的遗传进化过程，本研究对不同猪场采集的阳性样品进行PCV2全基因组扩增测序，获得12个PCV2全基因组测序序列。利用不同生物信息软件对这12个PCV2基因组测序序列遗传进化分析发现：12个测序序列之间相似度较高，分别属于PCV2b和PCV2d两种基因型，其中8个测序序列SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6和SP-2单独形成一个位于PCV2d-1和PCV2d-2亚基因型之间的单系群；3个测序序列SY-Z-4、ZD-1和ZD-7的部分序列与PCV2c基因型毒株同源性高，分析发现是PCV2c和PCV2b基因型间毒株的重组毒，而我国并未发现PCV2c基因型毒株，该基因型毒株仅在丹麦流行。进一步PCV2毒株迁移进化分析预测有PCV2毒株从丹麦等国家迁移至中国。3.1PCV2遗传进化分析方法12个PCV2基因组全序列及推导氨基酸序列分析，运用的软件主要有：DNAStar软件包测序序列拼接、比对，MEGA6构建遗传进化树，RDP（Recombinationdetectionprogram）序列重组分析，SimPlot重组毒株序列相似度分析，BioEdit序列点对点比对，MigraPhyla程序包毒株迁移进化分析。现对进化树的构建、毒株重组分析、毒株迁移进化分析的软件、方法简单介绍。构建PCV2进化树的步骤：GenBank下载的84个PCV2毒株序列进行遗传进化分析，1个PCV1毒株序列作为外群，用MEGAv.6软件构建PCV2全基因组及ORF2基因序列进化树。进化树是基于最大似然法所建立的，Boot-strap值的计算是序列比对的1000个重复。进化树是基于最大似然法所建立的，并且以TN模型作为核酸替代模型。RDP软件进行PCV2的12个测序序列重组分析，应用RDP，GENECONV，Chimera，MaxChi，SiScan，BootScan和3Seq七种方法，SimPlot程序对重组毒株和母本毒株之间进行核酸相似分析以及bootscanning分析，BioEdit软件对序列重组位点分析重组母本毒与子代毒之间的相似序列及准确的重组位点。用Megalign程序，将重组毒株和母本毒株的序列进行比对分析来寻找重组序列的重组位点。为了分析PCV2重组毒株的地理来源，将GenBank上与本研究中的重组毒相似度≥96%的所有毒株下载下来，使用MigraPhyla程序包进行迁移进化分析：使用DELTRAN和ACCTRAN两种方法进行蒙特卡洛分析（MonteCarloanalysis）。3.2PCV2遗传进化分析结果3.2.1PCV2测序序列相似度使用DNAStar中的MegAlign软件对本研究中的12个PCV2测序序列全基因组、ORF1、ORF2、ORF1基因序列推导的Rep蛋白氨基酸序列、ORF2基因序列推导的Cap蛋白氨基酸序列进行序列相似度比较，相似度分别为96.2%-100%、97.4%-100%、93.6%-100%、99.4%-100%、93.1%-100%。25 结果分别见图3.1、图3.2、图3.3、图3.4、图3.5。图3.112个PCV2测序序列基因组相似度Fig3.1Genomeidentitiesbetween12PCV2sequences图3.212个PCV2测序序列ORF1基因相似度Fig3.2ORF1geneidentitiesbetween12PCV2sequences26 图3.312个PCV2测序序列ORF2基因相似度Fig3.3ORF2geneidentitiesbetween12PCV2sequences图3.412个PCV2测序序列rep蛋白推导氨基酸序列相似度Fig3.4Aminoacididentitiesbetween12PCV2sequencesofrep27 图3.512个PCV2测序序列cap蛋白推导氨基酸序列相似度Fig3.5Aminoacididentitiesbetween12PCV2sequencesofcap3.2.2PCV2遗传进化树进化树是基于GenBank上下载的84个分离株序列和12个PCV2测序序列全基因组及ORF2序列所建立的。根据遗传进化树分析，可以将其分为PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四个基因型。本论文中的12个PCV2测序序列属于PCV2b和PCV2d这两个基因型。这12个测序序列中有8个PCV2测序序列，SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6、和SP-2可以看作一个单系群（monophyleticgroup），即从相近地区相邻时间内分离或检测到的遗传相似度高的毒株群，其基因型介于PCV2d-1和PCV2d-2之间。另外3个PCV2测序序列SY-Z-4、ZD-1、ZD-7和GenBank上的毒株KM974911-CHN-2014处于PCV2b上另一个小的分支。PCV2全基因组进化树构建结果见图3.6，PCV2ORF2基因进化树构建结果见图3.7。28 AY424405-ASTRIA-200340AY484414-UK-2003DQ201639-CHN-2005CHN:ChinaGQ359006-CHN-2008AY256457-HNGRY-2003AY579893-CHN-2003VIE:VietnamDQ923524-BRA-2006AF055394-UK-199863EF524515-CHN-2006IND:India9834AF201311-FRNC-199927AY321984-FRNC-2003AY484413-NED-2004GER:GermanyGU799576-USA-20096530HQ713495-USA-200597DQ220731-CNDA-2005UK:TheUnitedKingdomEU340258-USA-200752EU257511-CHN-2007AY484407-UK-2003PCV2bBRA:Brazil89AY682995-CHN-2004AY847748-CHN-2004AY691169-CHN-2004FRNC:France7094EF524535-CHN-200651KM974911-CHN-2014CNDA:CanadaZD-1-CHN-2014-192SY-Z-4-CHN-2014-16373ZD-7-CHN-2014-1NED:NetherlandsJQ181589-VIE-201145100KF742550-CHN-2013JF827599-CHN-2010HNGRY:HungaryAY556477-CHN-2004AY713470-GER-20042457100JX099786-VIE-2008ASTRIA:AustraliaAY181947-CHN-2002AY181946-CHN-200275AY484410-CHN-2003JPN:Japan59GU808525-IND-2007100EF524539-CHN-200629FJ594471-CHN-2008ESP:SpainFJ644927-CHN-2008JL-Z-CHN-2014-12799KP112484-CHN-2014TWN:TaiwanJQ181600-VIE-2011KC800640-CHN-2013SX-Z3-CHN-2014-1USA:TheUnitedStatesofAmerica53SY-M-X3-CHN-2014-1SX-Z1-CHN-2014-188JL-CHN-2013-1KOR:KoreaYQ-CHN-2014-1SY-L-3-CHN-2015-1PCV2dDNMRK:DenmarkSY-L-X6-CHN-2015-198SP-2-CHN-2014-137KC800643-CHN-201361KC515005-CHN-2012KJ187306-BRA-2013KM360049-CHN-2013HM038017-CHN-2007JX535296-USA-2012KC514966-CHN-2011HM038031-CHN-2008KF742548-CHN-2013KJ729075-IND-2014HM038030-CHN-2007GU001710-CHN-2009HQ395022-CHN-2009AY035820-CHN-2001AB072302-JPN-200149AY146993-TWN-2002AY180396-TWN-2003100AB426905-JPN-2008HM038034-CHN-20106475HQ402903-CHN-2008GU001709-CHN-200999JQ806749-CHN-2010100EF524532-CHN-200693FJ660969-CHN-200899AF201308-ESP-2000AY256459-HNGRY-2003PCV2aKC514989-CHN-201290KJ729073-IND-201453GQ359003-CHN-20093490AF381176-CHN-2001AY424402-CNDA-2003AF465211-TWN-20028772AF118095-CNDA-2000AF264042-USA-200096AF381177-CHN-2001EF524540-CHN-200751AB072301-JPN-2001AY699793-USA-200421AF520783-KOR-200216AY325495-UK-20036298DQ397521-USA-2006EU148505-DNMRK-2007EU148503-DNMRK-2007PCV2cEU148504-DNMRK-2007AY184287-PCV10.1图3.6PCV2全基因组序列构建的进化树Fig3.6PhylogenetictreeofPCV2basedonwholegenomesequences29 JX535296-USA-2012KJ729075-IND-2014JQ181600-VIE-2011CHN:ChinaJL-Z-CHN-2014HQ395022-CHN-2009HM038030-CHN-2007VIE:VietnamHM038017-CHN-2007HM038031-CHN-2008KC514966-CHN-2011IND:IndiaGU001710-CHN-200988KF742548-CHN-2013KC800643-CHN-2013KP112484-CHN-2014GER:Germany61KC515005-CHN-2012KJ187306-BRA-201331KC800640-CHN-2013UK:TheUnitedKingdomKM360049-CHN-2013SY-L-X6-CHN-201535PCV2dYQ-CHN-2014BRA:BrazilJL-CHN-2013SP-2-CHN-201484SX-Z1-CHN-2014FRNC:FranceSX-Z3-CHN-201414SY-L-3-CHN-2015SY-M-X3-CHN-2014EF524539-CHN-2006CNDA:Canada598FJ594471-CHN-2008AY181946-CHN-20021144AY181947-CHN-2002NED:Netherlands25AY484410-CHN-2003GU808525-IND-200717EU450616-KOR-2006HNGRY:HungaryFJ644927-CHN-20086235JF827599-CHN-2010AY556477-CHN-2004AY713470-GER-2004ASTRIA:Australia8787JX099786-VIE-2008EU340258-USA-200782GU799576-USA-2009JPN:JapanDQ220731-CNDA-20054339HQ713495-USA-2005AY321984-FRNC-2003ESP:SpainAF201311-FRNC-1999AY484413-NED-200455AF055394-UK-1998TWN:TaiwanEF524515-CHN-2006JQ181589-VIE-201188KF742550-CHN-20137DQ923524-BRA-2006PCV2bUSA:TheUnitedStatesofAmerica97GQ359006-CHN-2008KM974911-CHN-2014ZD-1-CHN-2014KOR:Korea80SY-Z-4-CHN-2014ZD-7-CHN-20149872AY682995-CHN-2004DNMRK:DenmarkAY847748-CHN-200462DQ201639-CHN-20057EF524535-CHN-2006EU257511-CHN-2007AY256457-HNGRY-2003AY424405-ASTRIA-2003AY484407-UK-2003AY484414-UK-2003AY579893-CHN-2003AY691169-CHN-2004AY035820-CHN-200125EF524532-CHN-200688GU001709-CHN-200999JQ806749-CHN-20101751FJ660969-CHN-2008AB072302-JPN-200187AF201308-ESP-2000AY256459-HNGRY-200390AB426905-JPN-2008059AY146993-TWN-2002HM038034-CHN-2010986899HQ402903-CHN-2008AY180396-TWN-2003PCV2a91GQ359003-CHN-200986KJ729073-IND-20144595KC514989-CHN-201293AY424402-CNDA-2003AF381176-CHN-2001AF465211-TWN-20027548AF118095-CNDA-2000AF264042-USA-200091AF381177-CHN-2001EF524540-CHN-200727AB072301-JPN-2001AY699793-USA-200417AF520783-KOR-200227AY325495-UK-20035593DQ397521-USA-2006EU148505-DNMRK-2007EU148503-DNMRK-2007PCV2c9780EU148504-DNMRK-2007AY184287-PCV10.05图3.7PCV2ORF2序列构建的进化树Fig3.7PhylogenetictreeofPCV2basedonORF2genesequences30 3.2.3PCV2测序序列核苷酸突变分析序列比对分析表明，JL-Z分离株和JQ181600-VIE-2011分离株同源性最高。单系群之间的同源性在99.1%到100%之间，SY-Z-4、ZD-1和ZD-7这三个毒株同源性更高达99.8%-99.9%。通过分析比对单系群分离株和PCV2分离株的核苷酸序列发现了两个核苷酸替换，第70位核苷酸由A突变为G；第532位核苷酸由C突变为T。此外，在SY-Z-4、ZD-1、ZD-7和KM974911分离株和其他PCV2b分离株之间还发现两个核苷酸突变，第535-536位核苷酸由CG突变成TT，分析结果见图3.8。图3.8PCV2测序序列核苷酸突变分析Fig3.8NucleotidemutationsonsequencesofPCV23.2.4PCV2测序序列重组分析病毒的进化和遗传多样性的产生主要是依靠基因组的重组和突变来实现的。根据以上PCV2遗传进化树可知，有3个PCV2测序序列SY-Z-4、ZD-1和ZD-7在以基因组序列为基础构建的进化树和以ORF2基因为基础构建的进化树中，虽然都属于PCV2b基因型，但是其在进化树中的位置发生了较大的改变，形成不同的分支，因此怀疑这三个序列相关毒株是重组毒株。使用重组分析软件RDP对12个PCV2全基因组测序序列进行重组分析，发现SY-Z-4、ZD-1和ZD-7是AY579893（PCV2b基因型）毒株和EU148504（PCV2c基因型）毒株重组产生的，RDP软件重组分析结果见3.9。31 图3.9RDP重组分析结果Fig3.9RecombinationanalysisresultofsequencesbyRDPprogram另外，利用SimPlot软件进行母本毒与重组毒株之间相似度及Bootscanning分析，发现尽管SY-Z-4、ZD-1和ZD-7这三个分离株和AY579893分离株是同一个基因型，但它们ORF1位置和EU148504分离株的同源性比AY579893分离株高，且分析发现SY-Z-4、ZD-1和ZD-7的重组位点位于ORF2基因第748位核苷酸和第963位核苷酸，分析结果见图3.10及图3.11。图3.10SY-Z-4,ZD-1,ZD-7的Simplot-Query曲线图Fig3.10Simplot-QueryanalysisresultofSY-Z-4,ZD-1,ZD-732 图3.11SY-Z-4,ZD-1,ZD-7的BootScan-Query曲线图Fig3.11BootScan-QueryanalysisresultofSY-Z-4,ZD-1,ZD-7最后，从突变位点方面对重组毒与母本毒进行单个碱基比对分析。SY-Z-4、ZD-1、ZD-7和它们的母本序列在ORF2基因第748位核苷酸和第963位核苷酸为重组毒株的重组位点。在重组位点之间，有12个核苷酸突变位点，在这个序列上SY-Z-4、ZD-1和ZD-7分离株有9个核苷酸与EU148504分离株一致，但是仅有2个核苷酸与AY579893分离株一致。并且在重组位点之间的区域与EU148504分离株的同源性大于98%，与AY579893分离株则小于98%，分析结果见图3.12。图3.12重组毒与母本毒突变位点比对Fig3.12Positionsofsubstitutionalignmentbetweenrecombinantstrainsandparentalstrains3.2.5PCV2迁移进化分析从GenBank下载所有与我们测序得到的这些序列同源性等于或高于96%的461个分离于许多不同国家的PCV2序列。通过MigraPhyla程序包分析比对这461个序列和12个测序序列，预测重组毒株来源，同时发现三条具有显著性的PCV2传播至中国的途径，分别是从韩国到中国，33 从丹麦到中国，从越南到中国。毒株迁移进化分析表明，丹麦是本研究中PCV2重组毒株最有可能的起源地，分析最终结果见表3.1。表3.1PCV2迁移路径预测结果Table3.1PredictionofPCV2migration起源地传播地ACCTRANDELTRAN迁移P值sFDR迁移P值sFDR次数次数丹麦中国40.16250.00945340.47080.01194韩国中国90.00000.00049890.00000.000498越南中国70.00000.00074670.00000.0007463.3讨论PCV2最早于20世纪90年代在仔猪多系统衰竭综合症的猪身上被分离发现，其典型的临床症状是淋巴结肿大。PCV2是几个不同疾病综合征的重要病原体之一，这些疾病统称为猪圆环病毒病（PCVD），它包括仔猪多系统衰竭综合症（PMWS），繁殖障碍，猪呼吸道疾病综合征（PRDC），猪皮炎和肾病综合征（PDNS），增生性坏死性肺炎（PNP）和神经系统病变和肠炎。本研究中，流行PCV2的猪场感染猪只出现的临床症状包括PMWS、呼吸症状、流产、转圈运动以及死亡，这些症状与此前报导的PCV2感染引起的临床症状相符合。PCV2病毒属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）。PCV2基因组是1766-1768bp的单股负链环状DNA分子，主要包括三个主要的开放阅读框，ORF1（rep基因，945bp的，位置第51-995位核苷酸）主要编码与病毒复制相关联的蛋白，ORF2（cap基因，702或705bp，位置第1734/1735-1030/1033/1034位核苷酸）主要编码病毒的结构蛋白，ORF3（315bp，位置第357-671位核苷酸）主要编码与PCV2早期发病相关的蛋白。此外，另一个开放阅读框ORF4（180bp，位置第386-565位核苷酸），有抑制蛋白酶的活性和调节T淋巴细胞的作用（Olveraetal.,2007）。PCV2的分离株之间核酸同源性大于93%。PCV2基因组复制将病毒遗传信息由亲代传递给子代，为确保遗传信息的准确传递，PCV2毒株自身具有校正（Proofreading）机制，但是基因组的校正功能和稳定性是相对的。随着PCV2毒株所处的环境及复制条件的改变，病毒基因组的遗传序列及遗传特性也会相应的发生改变。PCV2基因组遗传进化的方式包括：基因组重组和基因核苷酸发生改变，如碱基突变，缺失，插入，交换等（Wangetal.,2009;Zhaietal.,2012）。PCV2的ORF2序列进行遗传进化分析，可将PCV2分为4个基因型，PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。其中，PCV2c只在丹麦和巴西被报导出现，且巴西是2015年才首次报道分离到PCV2c基因型毒株，而PCV2a和PCV2b在全世界范围内广泛分布。2003年开始，PCV2在世界范围内主要的基因型开始从PCV2a过渡到PCV2b，PCV2d是自2010年开始在中国流行的新型基因型。PCV2能导致猪的不同的临床症状（Chae,2005），目前认为PCV2检测方法是检测猪场是否感染PCV2的一种快速且有效的方法（Alarconetal.,2011;Grau-Romaetal.,2009），因此本实验中应用PCR检测34 技术进行中国部分地区PCV2分子流行病学调查。PCV2呈世界范围内流行，目前该病流行的亚洲国家有越南、泰国、韩国、印度、印度尼西亚、马来西亚、日本和中国。该病在中国的流行始于1998年，且PCV2在中国养猪场的感染率普遍较高。此前，在中国的不同地区进行了PCV2较为全面的分子流行病学调查和遗传进化分析。调查数据和研究分析发现在中国存在的PCV2基因型包括PCV2a、PCV2b、PCV2d，但是没有PCV2c（Guoetal.,2010;Wangetal.,2009;Zhaietal.,2012;Zhaoetal.,2010）。大多数的PCV2遗传进化分析集中于ORF2编码区，ORF2作为PCV2基因组中差异最大的区域是PCV2毒株遗传进化分析的一个可靠的遗传代表区（Olveraetal.,2007）。EU规定PCV2的ORF2基因序列如果遗传差异度等于或大于0.035时，可以划分为不同的基因型（www.pcvd.net/）。本研究对中国不同地区的流行毒株进行全基因组测序，并且以全基因组和ORF2基因序列构建遗传进化树，发现12个测序序列分别属于PCV2b和PCV2d两种基因型。JL-Z毒株序列属于2010年在中国新出现的PCV2d基因型，与同型的分离自越南和中国的其他毒株相似度很高。并且，迁移进化分析发现该群PCV2毒株是从越南迁移至中国的毒株。PCV2毒株从越南传播至中国有两种可能的传播途径。一种途径是：中国的南方与越南的边界相邻，因此PCV2毒株可能通过该途径传播至中国猪群中。另一条途径就是中国从越南引进种猪和猪肉等产品，同时带来PCV2毒株。目前，经济全球化中动物和动物产品贸易，使其携带的病原微生物传播至全球，导致传染病不断出现并且风险逐渐增加（Corteyetal.,2012）。本研究对吉林、辽宁、黑龙江、山西四个省份不同地区采集的157份病料进行检测，其中101份为阳性。对每个地区的流行毒株进行测序，最终得到12个PCV2测序序列。其中8个测序序列SX-Z1、SX-Z3、YQ、JL、SY-M-X3、SY-L-3、SY-L-X6和SP-2，来自相同的地理区域-中国，且相互之间有高度同源性>99.0%，因此这8个序列形成了一个单系群，属于PCV2d基因型，且位于PCV2d-2和PCV2d-2之间。该单系群与PCV2d-2和PCV2d-2毒株有2个位置发生核苷酸突变（A70G和C532T），这可能就是该单系群的遗传标记。重组和突变是PCV2产生遗传多样性的主要原因。在中国，主要的基因型是PCV2a、PCV2b和PCV2d，其中PCV2b最为普遍。明确PCV2基因型在中国不同省区的分布情况对病情的防控有至关重要的作用。对该12个测序序列进行遗传进化分析发现，有3个测序序列的基因在ORF1区与PCV2c基因型高度同源，对这3个测序序列进行重组分析发现，其与丹麦的PCV2c毒株之间存在重组。同时对PCV2进行毒株迁移进化分析，证实确实有毒株从丹麦传播到中国，使我们更进一步的了解PCV2毒株在中国的遗传进化情况。SY-Z-4、ZD-1和ZD-7测序序列属于PCV2d基因型，与KM974911属于PCV2d基因型的另一个分支，而该分支上两个核酸位点的突变（535CG536突变为535TT536）是这四个毒株出现该单独分支的原因。毒株间的重组是PCV2进化的一个重要机制，它引起病毒毒株间的差异（Olveraetal.,2007）。PCV2毒株的基因型之间和基因型内重组事件都有报导（Cadaretal.,2012）。2007年，Olvera从GenBank上下载大量PCV2毒株序列进行全面的重组分析发现，rep基因内基因型之间重组发生率最高。此前研究报导，PCV2基因型之间的重组事件主要发生于乌拉圭、韩国和美国（Hesseetal.,2008;Maetal.,2007;Ramosetal.,2013）。另外，也有大量临床报导显示PCV2基因型之间和基因型之内的重组发生于cap基因内。35 SY-Z-4、ZD-1和ZD-7属于PCV2b基因型，因此，这三个重组毒株的两个重组母本毒中一定有一个也属于PCV2b基因型。本研究的重组分析显示该重组是发生于PCV2b（AY579893）和PCV2c（EU148504）之间的基因型之间的重组。2007年Olvera对GenBank上的大量序列进行重组的理论分析发现，rep基因的第42-89位核苷酸位置和第389-429位核苷酸位置是发生重组的热点区，且分别为重组发生的开始位点和结束位点（Olveraetal.,2007）。然而，本研究中的重组位点：第748位核苷酸和第963位核苷酸与该2007年的研究不相符，这可能是发生重组的另一个新的重组位点。本研究中在rep基因之间发生重组的重组序列在猪场不同的猪体内检测到，说明重组毒株可以在猪群中传播。目前需要更多关于重组毒株的进一步的研究和更多的临床报导。两种不同的PCV2毒株共感染同一动物是发生自然重组事件的前提（Khaisebetal.,2011）。另外，PCV2c基因型只流行于丹麦和巴西（Dupontetal.,2008;Franzoetal.,2015），而PCV2a、PCV2b和PCV2c基因型都在丹麦的猪群中流行（Dupontetal.,2008）。本研究中的三个测序序列SY-Z-4、ZD-1和ZD-7是首次发现的起源于PCV2c基因型的毒株，我们推测该重组毒株可能起源于丹麦，在丹麦和中国的广泛的商业贸易中，传播至包括中国在内的其他国家。这些重组毒株在进一步的基因遗传进化后转变为现在的毒株。本研究中的测序序列对应的毒株可能与丹麦毒株EU148504处于相似的选择压力之下，从而在此压力下发生核苷酸突变。总体来说，本研究对2013年至2015年中国北方地区PCV2进行分子流行病学调查，通过来自不同地区的流行毒株的序列分析发现了一个属于PCV2d的单系群，有三个流行毒株与PCV2c基因型毒株同源性高，分析发现是PCV2c基因型与PCV2b基因型毒株的重组毒。同时，PCV2迁移进化分析显示PCV2毒株从丹麦等国家迁移到中国的迁移路线。这些调查及分析结果表明随着经济全球化的发展，中国PCV2毒株的遗传进化有很大一方面来自于毒株重组及国外毒株迁移事件。36 第四章PRRSV遗传进化分析本研究中PCV2和PRRSV的混合感染率为18.5%，其中PRRSV的感染率为23.4%，接近PCV2和PRRSV的混合感染率。PCV2和PRRSV混合感染流行病学调查发现，PRRSV检测为阳性的猪场通常也感染PCV2，且此前有实验证明PCV2和PRRSV混合感染的机体内，PRRSV促进PCV2的复制。因此，PRRSV在PCV2和PRRSV混合感染中有重要作用。为了解在我国部分地区流行的PRRSV毒株的遗传关系和分子进化过程，对采集自不同地区的12个阳性样品中PRRSVORF5、ORF7、部分Nsp2基因测序序列分析发现，所有测序序列均属于美洲型；12个测序序列在GP5和N蛋白的重要基序上均有关键氨基酸的突变；8个测序序列SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1与HP-PRRSV一样在Nsp2上的第481位和第533-561位氨基酸有30个氨基酸的不连续缺失；2个测序序列HLYyq-2015-1和LNsy-2014-2在Nsp2上第593-595位氨基酸出现新型缺失；1个测序序列SDly-2014-1的ORF7基因序列与美国高致病性PRRSV毒株NADC-30相似度最高。4.1PRRSV遗传进化分析方法12个PRRSV的ORF5、ORF7、Nsp2基因序列及推导氨基酸序列分析，运用的软件主要有：DNAStar软件包测序序列拼接、比对，MEGA6构建遗传进化树，蛋白质分析的网站如SNAP网站进行同义突变率和非同义突变率分析，N-glycoside网站蛋白质N端糖基化位点预测分析，SignalP4.1网站蛋白质信号肽预测。现对进化树的构建、毒株重组分析、毒株迁移进化分析及蛋白特性分析的软件、方法及网站简单介绍。构建PRRSV进化树的步骤：GenBank下载的82个PRRSV毒株序列进行遗传进化分析，3个PRRSV毒株序列作为外群，用MEGAv.6软件构建PRRSVORF5、ORF7及Nsp2基因序列进化树。进化树是基于最大似然法所建立的，并且以TN模型作为核酸替代模型。使用DNASTAR软件包（DNASTARInc.,MadisonWI）对本研究中的12个PRRSV和82个GenBankPRRSV毒株的ORF5、ORF7和Nsp2部分基因序列以及其推导氨基酸序列进行序列比对。使用Mega6.0软件建立遗传分析进化树，采用的方法是最大似然法，Boot-strap值的计算是序列比对的1000个重复。使用SNAP分析网站，对基于密码子比对的ORF5和ORF7序列进行同义突变率和非同义突变率分析（http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/SNAP/SNAP.html）。使用N-glycoside网站对GP5的推导氨基酸序列进行N端糖基化位点预测分析（http://hcv.lanl.gov/content/sequence/GLYCOSITE/glycosite.html）。使用SignalP4.1网站对GP5的信号肽进行分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。4.2PRRSV遗传进化分析结果4.2.112个测序序列及PRRSV不同亚群之间相似度为了解本研究中12个测序序列和以往报道的PRRSV毒株之间的遗传进化关系，对ORF5、ORF7、Nsp2部分基因序列及其推导氨基酸序列进行遗传进化分析。12个ORF5测序序列之间相37 似度为87.9%-100%，分析结果见图2.19；12个ORF7测序序列之间相似度为87.6%-100%，分析结果见图2.20；10个Nsp2部分基因序列相似度为71.1%-100%，分析结果见图2.21；GP5推导氨基酸序列相似度为85.0%-100%，分析结果见图2.22；N蛋白推导氨基酸序列相似度为88.6%-100%，分析结果见图2.23；Nsp2蛋白部分推导氨基酸序列相似度为59.3%-100%，分析结果见图4.1。图4.1PRRSV12个ORF5测序序列相似度Fig4.1Nucleotideidentitiesbetween12ORF5seqencesofPRRSV图4.2PRRSV12个ORF7测序序列相似度Fig4.2Nucleotideidentitiesbetween12ORF7seqencesofPRRSV38 图4.3PRRSV10个Nsp2部分基因测序序列相似度Fig4.3Nucleotideidentitiesbetween10Nsp2segmentseqencesofPRRSV图4.4PRRSV12个GP5推导氨基酸序列相似度Fig4.4PutativeaminoacididentitiesofGP5between12seqencesofPRRSV39 图4.5PRRSV12个N蛋白推导氨基酸序列相似度Fig4.5PutativeaminoacididentitiesofNproteinbetween12seqencesofPRRSV图4.6PRRSV12个Nsp2蛋白推导氨基酸序列相似度Fig4.6PutativeaminoacididentitiesofNsp2proteinbetween12seqencesofPRRSV40 12个测序序列和以往报道的82个PRRSV毒株可以划分为2个群和5个亚群。不同亚群之间的相似度见表4.1。表4.15个亚群之间及美洲型VR2332、欧洲型代表株LV与亚群之间ORF5相似度Table4.1Percentnucleotide（nt）andaminoacid（aa）identity（%）ofORF5,ORF7andpartialNsp2amongsubgroupI-VandVR-2332andLelystadvirus亚群亚群ORF5GP5ORF7NNsp2Nsp2-proteinI95.4-10093.5-10096.8-10091.9-10074.2-10072.6-100II93.5-95.786.5-95.593.8-96.289.4-97.676.9-90.776.0-84.1IIII85.7-95.084.0-92.587.9-93.886.2-97.665.9-74.552.8-67.9IV87.7-89.983.0-90.591.1-95.788.6-97.661.9-76.153.6-66.0V85.9-89.481.5-93.091.9-99.788.6-95.174.9-87.767.4-80.4I93.5-95.786.5-95.593.8-96.289.4-97.676.9-90.776.0-84.1II92.5-10090.5-10098.9-10094.3-10099.2-10098.2-100IIIII85.6-97.583.5-94.087.6-96.085.4-96.770.3-77.256.1-67.3IV87.2-92.087.5-91.590.9-97.891.1-96.772.2-78.063.1-67.3V87.2-92.085.5-94.593.0-96.892.7-94.387.3-92.977.4-85.7I85.7-95.084.0-92.587.9-93.886.2-97.665.9-74.552.8-67.9II85.6-97.583.5-94.087.6-96.085.4-96.770.3-77.256.1-67.3IIIIII85.1-10085.0-10087.4-10087.8-10073.9-10064.9-100IV85.6-91.782.5-88.589.5-99.588.6-98.468.0-79.257.4-69.6V83.6-91.782.5-92.584.0-94.687.0-94.369.1-77.657.4-66.1I87.7-89.983.0-90.591.1-95.788.6-97.661.9-76.153.6-66.0III87.2-92.087.5-91.590.9-97.891.1-96.772.2-78.063.1-67.3IVIII85.6-91.782.5-88.589.5-99.588.6-98.468.0-79.257.4-69.6IV98.2-10095.5-10091.1-10094.3-10086.1-10081.0-100V91.2-99.087.0-98.089.8-96.292.7-95.168.3-76.457.6-64.9I85.9-89.481.5-93.091.9-99.788.6-95.174.9-87.767.4-80.4II87.2-92.085.5-94.593.0-96.892.7-94.387.3-92.977.4-85.7VIII83.6-91.782.5-92.584.0-94.687.0-94.369.1-77.657.4-66.1IV91.2-99.087.0-98.089.8-96.292.7-95.168.3-76.457.6-64.9V88.6-10087.0-10091.9-10010090.7-10081.5-100I88.6-89.986.5-90.593.3-94.491.1-97.664.9-74.954.3-62.0II88.6-92.088.5-91.593.8-94.693.5-96.776.4-77.064.9-65.5III85.9-91.783.5-88.590.1-99.291.9-98.472.3-78.458.8-67.3VR2332IV98.7-10096.5-10092.7-10096.7-10086.9-10082.1-98.2V91.0-98.888.5-91.591.9-94.994.372.4-75.457.1-62.5I-V85.9-10083.5-10090.1-10091.1-10064.9-10054.1-10041 表4.15个亚群之间及美洲型VR2332、欧洲型代表株LV与亚群之间ORF5相似度（续）Table4.1Percentnucleotide（nt）andaminoacid（aa）identity（%）ofORF5,ORF7andpartialNsp2amongsubgroupI-VandVR-2332andLelystadvirus（continued）亚群亚群ORF5GP5ORF7NNsp2Nsp2-proteinI64.2-65.457.1-59.269.2-70.362.5-65.839.8-48.819.2-23.7II63.8-65.556.6-58.769.4-70.362.5-65.051.3-51.924.1-24.8LelystadIII62.1-65.555.6-58.764.5-6760.0-64.248.1-50.613.0-19.3virusIV64.6-65.156.6-58.765.9-68.462.5-65.044.4-45.521.9-24.0V25.9-27.456.1-58.268.9-71.165.851.1-53.925.5-26.2I-V59.4-62.056.1-59.265.8-71.162.5-65.837.8-45.118.4-23.7I-VI-V83.6-10082.5-10086.8-10081.6-10065.4-10052.1-1004.2.2ORF5遗传进化树基于ORF5基因序列和GP5推导氨基酸序列构建的遗传进化树发现：PRRSV毒株可以划分为两个群及五个亚群，见图4.7。五个亚群的代表株分别为JXA1（I亚群）、CH-1a（II亚群）、MN184A（III亚群）、VR2332（IV亚群）和JA142（V亚群）。本研究中的12个测序序列中，10个（JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、SXkl-2014-1）划分为I亚群，其他两个（LNsy-2014-1/2和HLJyq-2015-1）为IV亚群。所有的ORF5序列都是603bp并且编码200aa。ORF5序列比对分析发现12个毒株核苷酸水平的相似度为87.9%-100%，推导氨基酸序列的相似度为85.0%-100%。I亚群中的10个流行株与I亚群代表株JXA1的相似度为99.2%-99.5%（核苷酸水平）和97.5%-98.5%（氨基酸水平），另外两个位于IV亚群的序列与IV亚群代表株VR2332的相似度为99.2%（核苷酸水平）和98.0%（氨基酸水平）。42 SXkl-2014-1SDly-2013-109HUB2BB0907BJsy06GDGZZBHEB1Henan-1HN-HWHuN4Jiangxi-3JN-HSJSyxJX143JXA1JXwn06NX06SHHSDly-2013-2SDta-2013-1SDly-2013-3SDly-2013-449SDly-2014-1SDdz-2013-1SubgroupIGroupILNsy-2014-1XH-GDWUH1TPTJSY0608HUB262HUB1BJ1102NT0801JX200667WUH4HeNan-A1JXA1-P170YD63JL-04/12JLcc-2013-1BJ63HuN20AH0701LN6510-10HEB-1SD-ZQSHB49HB-3(cz)HB-2(sh)/20021143EM2007CH-1aCH2004SubgroupII77CH2003895CH2002P129JA142NVSL97-78951194SubgroupVIngelvacATPMN30100HENAN-XINX30MN184B40MN184C95SubgroupIII83MN184A100SPHZ-31LMYGroupII54C6C533C1C1159HN1PL97-1PL97-1/LP136PRRSV02PRRSV03VR-2332VR-2332V76565LNsy-2014-2SubgroupIVHLJyq-2014-1GS200264BJ-4GS2003GS2004S161PRRSV01MLVRespPRRSReproClone20CC-101NP1.2EuroPRRSVLelystadvirus1009901CB10.05图4.7ORF5基因遗传进化树Fig4.7PhylogenetictreesbasedonORF5gene43 4.2.3ORF7遗传进化树ORF7遗传进化分析发现：SXkl-2014-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、LNsy-2014-1和JLcc-2013-1位于I亚群，与I亚群代表株JXA1的相似度为94.5%-99.7%；SDly-2014-1位于III亚群，与III亚群代表株MN184A的相似度为88.4%；LNsy-2014-2和HLJyq-2015-1位于IV亚群，与IV亚群代表株VR2332的相似度为100%。基于N蛋白的推导氨基酸序列建立的遗传进化树与ORF7序列构建的遗传进化树相似，见图4.8。所有的ORF7序列均是372bp并且编码123aa。序列比对发现12个测序序列的ORF7核苷酸水平相似度为87.6%-100%，氨基酸水平相似度为89.4%-100%。44 SHHSXkl-2014-1SD-ZQNX06LNJXA1-P170JXA1JX2006JX143JSyxJN-HSJLcc-2013-1JL-04/12Jiangxi-3HuN4HuNHUB2HUB1HN-HWHeNan-A1Henan-1HEB121GZZBGDBJsy06BJ1102BJSubgroupIBB0907GroupIAH070110-10HEB-1SY0608TJTPWUH1WUH4XH-GD6YD09HUB2NT080145EM2007JXwn06SDly-2013-253SDly-2013-4SDdz-2013-142LNsy-2014-1SDly-2013-1SDly-2013-3SDta-2013-1HB-3(cz)MN30100SHB34HENAN-XINX27SDly-2014-1HZ-31NADC30likeGS200252GS2003GS2004MN184A35MN184CMN184B31HB-2(sh)/2002SubgroupIIIC1110001NP1.2BJ-4C1C5C6CC-122Clone20HLJyq-2014-1HN1LMYGroupIILNsy-2014-2MLVRespPRRSReproSubgroupIVPL97-1/LP1PL97-1PRRSV01PRRSV02PRRSV03S1SPVR-2332VR-2332V7IngelvacATPJA142NVSL97-7895P129SubgroupVCH-1aCH200239CH200357CH2004SubgroupIIEuroPRRSV01CB110075Lelystadvirus0.02图4.8ORF7基因遗传进化树Fig4.8PhylogenetictreesbasedonORF7gene45 4.2.4Nsp2遗传进化树Nsp2部分基因及其推导氨基酸序列遗传进化分析发现：SXkl-2014-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、LNsy-2014-1和JLcc-2013-1位于I亚群，与I亚群代表株JXA1的核苷酸水平相似度为99.4%，氨基酸水平相似度为98.2%；LNsy-2014-2和HLJyq-2015-1位于IV亚群，与IV亚群代表株VR2332的核苷酸水平相似度为98.1%-99.3%，氨基酸水平相似度为95.7%-99.3%。Nsp2序列比对分析发现，本研究中的12个测序序列的核苷酸水平相似度为74.1%-100%，氨基酸水平的相似度为59.3%-100%，远远低于ORF5和ORF7序列和其推导氨基酸序列之间的相似度，遗传进化树见图4.9。46 TPWUH4SHHJXwn06JXA1SDly-2013-1SDly-2013-3SDly-2013-4TJHeNan-A1HuN4HEB1HN-HWAH0701GZZBLNYDJL-04/12JXA1-P170JSyxGDHUB1HUB2HuNJX143WUH1SubgroupIXH-GDBJGroupIHB-3(cz)Henan-1NX06BJsy06JX2006LNsy-2014-1SDdz-2013-1SDly-2014-1SDly-2013-2SXkl-2014-1SY0608BJ1102BB090710-10HEB-1JN-HSNT0801SHBCH-1aCH2002SubgroupIICH2003CH2004NVSL97-7895IngelvacATPJA142SubgroupVMN30100LMYPRRSV03VR-2332V7PRRSV02C1C11C5C6HLJyq-2014-1LNsy-2014-2CC-1SubgroupIVClone20GS2003GS2004GS2002PRRSV01GroupIIS1VR2332PL97-1/LP1PL97-1MLVRespPRRSReproHN101NP1.2BJ-4SPMN184CMN184ASubgroupIIIMN184B01CB1EuroPRRSVLelystadvirus0.5图4.9Nsp2基因遗传进化树Fig4.9PhylogenetictreesbasedonNsp2gene47 4.2.5GP5、N蛋白、Nsp2推导氨基酸序列分析为了解PRRSV亚群之间和亚群内毒株的分子差异，对GP5，N蛋白和Nsp2的推导氨基酸序列进行氨基酸位点-位点的比对分析，氨基酸突变结果见表4.2。表4.2GP5、N蛋白和Nsp2关键氨基酸位点突变，其中发生在基序上的突变加粗表示Table4.2AminoacidmutationsonGP5,NproteinandNsp2,andkeyresiduemutationsoccurredonmotifswereshowedinboldGP510-13-15-23-34-58-80-137-151-159-196-KRLFNNGARVQSDly-2013-1PSVKSDly-2013-2PSVKSDly-2013-3PSVKSDly-2013-4PSVKSDly-2014-1NSKSDta-2013-1PSVKSDdz-2013-1PSVKSXkl-2014-1KLNsy-2014-1VRJLcc-2013-1RKLNsy-2014-2QSIHLJyq-2014-1QSINNsp247-48-51-61-102-109-117-473-486-587-636-KKEDVQ/HV/ANPAKSDly-2013-1GKSDly-2013-2GKLTNSDly-2013-3GQSDly-2013-4GSDly-2014-1HRRTLTSDta-2013-1GSDdz-2013-1GGLTNSXkl-2014-1ETLTLNsy-2014-1GL48 4.2.5.1GP5的氨基酸突变GP5是ORF5编码的PRRSV的主要结构蛋白（Deaetal.,2000）。本研究中的10个测序序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1位于I亚群，GP5氨基酸序列第39位氨基酸L（亮氨酸）突变为I（异亮氨酸），第94位氨基酸V（缬氨酸）突变为A（丙氨酸），而且I亚群中所有其他毒株都有此相同突变。另外，本研究中的9个测序序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1所特有的突变位于GP5第151位氨基酸，由R（精氨酸）突变为K（赖氨酸）；本研究中的2个测序序列LNsy-2014-2和HLJyq-2015-1所特有的突变位于GP5第159位氨基酸，由V（缬氨酸）突变为I（异亮氨酸）。GP5的关键氨基酸位点第13位、第137位，在I亚群和1313713LNsy-2014-1/2、HLJyq-2015-1上由R（精氨酸）和A（丙氨酸）突变为Q（谷氨酰胺）和137S（丝氨酸），突变位点用红框表示，见图4.10。49 102030405060708090100110120130140150160170180190200....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|VR‐2332MLEKCLTAGCCSRLLSLWCIVPFCFAVLANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWAVESFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVALVTVSTAGFVHGRYVLSSIYAVCALAALTCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGRLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSVATPITRVSAEQWGRPSDly‐2013‐4..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSDta‐2013‐1..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSDly‐2013‐3..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSDly‐2013‐2..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSDly‐2013‐1..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSDdz‐2013‐1..G.....C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LLNsy‐2014‐1..G.....C......F......SYL...V....NN...I..................Q.......T.............V...........G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L......R...LSDly‐2014‐1..G.....C......F......SYL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LSXkl‐2014‐1..G.....C......F......SYL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.............K.........V..G....................A...L..........LHeNan‐A1..G.....C......F.......YL...V.....N...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L......R....WUH4..G.....C......F.......YL...V....NN.P.I...C..............Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L......R...LJXA1..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L......L...LYD..G..M..C.....PF......SYL...V....NN...I..................Q.....A.T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V.......................A...L......L...LJXA1‐P170..G.....C......F.......YL...V...DNN...I..................QN......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V.......................A...L......L...LJL‐04/12..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................R.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V.......................A...L......L....BJ1102..G.....C.....FF........L........NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S...............H.......V..G....................A...L......R....NT0801..G.....C.....PF.......YL........NN...IR.................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G.....G..............A...L..........LHenan‐1..G.....C......F.......YL........NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LSY0608..G.....C......F.......YL........NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LGZZB........C......F.......YL........NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L...........10‐10HEB‐1..G.Y...C......F.......YL........SN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........L09HUB2..G.....C......F.......YL........SN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LBB0907..G.....C......F.......YL........SN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LJN‐HS..G.....C......F.......YL........SN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LBJ..G.....C.Y....F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LJiangxi‐3..G....VC......F.......YL...V....NN...I..........P.......Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L...........JX2006..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T..............P..........G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..GR...................A...L........A.LWUH1..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LBJsy06..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LGD..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHEB1..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHN‐HW..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHUB1..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHUB2..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHuN..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LHuN4..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LJSyx..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LJX143..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LJXwn06..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LNX06..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LSHH..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LLN..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I....SL.........S.......................V..G....................A...L..........LTJ..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LTP..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LAH0701..G.....C......F.......YL...V....NN...V..................Q.......T.........................GRA......YY..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LXH‐GD..G.....C......F.......YL...V....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YC..................I.....L.........S.......................V..G....................A...L..........LSD‐ZQ..G....................YL..HV....NN...I..................Q.......T.........................G.A......YY..................I.....L.........S....................S..V..G........................L..........LHB‐3(cz)..G....................YL...V....SN...I..................Q.......T.........................G........YY.R................I.....L.........S.......................V..G.........V..............L..........LSHB..G....................Y....V....NN...I..................Q.......T.........................G........YY.R................I.....L.........S.......................V..G........................L..........LSP..G.............F...........V...YS.........................................................G.........Y..................I.....L.........S..........................G......S.............A...L...........HZ‐31..V......F..Q..F........SIA.VS.NGN...YS................................................................R....................V.SV...................................G.......Q............................LMY..G.........Q..F......S..VAIVS.N.S...N....................R......C.........................G............................I.....L.........S..................................Q...P........P...V.........H.C1..G.........Q...................SNN......................D............................................................................................K.................G...............................C11..G.........Q...................SN.......................D............................................................................................K.................................................C5..G.........Q....................N.......................D............................................................................................K.................................................C6..G.........Q....................N.......................D............................................................................................K.................................................HN1............Q............VA....N.................................................................................A............L.........................................................................VR‐2332........................................................................................................................................................................................................VR‐2332V7........................................................................................................................................................................................................PRRSV03........................................................................................................................................................................................................PRRSV02........................................................................................................................................................................................................PL97‐1............Q...........................................................................................................................................................................................PL97‐1/LP1............Q...........................................................................................................................................................................................CC‐1............Q...................S.............................................................................................S.......................G.................................................Clone20............Q...................S.....................................................................................................................G.................................................PRRSV01........D...Q.........................................................................................................................................G.................................................S1........D...Q.........................................................................................................................................G.................................................01NP1.2............Q.........................................................................................................................................G.................................................MLVRespPRRSRepro............Q.........................................................................................................................................G.................................................HLJyq‐2014‐1............Q.............A...........................................................................................................................G.......I.........................................LNsy‐2014‐2............Q.............A...........................................................................................................................G.......I.........................................BJ‐4............Q.............A.................................................................................C.........................................G.................................................GS2004............Q.............A.................................................................................C.........................................G.............A................................A..GS2002............Q.............A.................................................................................C.........................................G.............A......................R.........A..GS2003............Q.............A.................................................................................C.........................................G.............A......................R.........A..CH2003..G....T....................V..NSN....F..........................T..............P..........G.........Y..................I.....L.........S.......................V..GR......................RL........A.LCH2004..G....T....................V..NSN....F..........................T..............P..........G.........Y..................I.....L.........S.......................V..GR......................RL........A.LCH2002..G....T....................V..NSN....F..........................T..............P..........G.........Y..................I.....L.........S.......................V..GR......................RL........A.LCH‐1a..G....T....................V..NSN....F..........................T.........................G.........Y..................I.....L.........S.......................V..G........................L..........LHB‐2(sh)/2002..G.......Y.Q...............V...SN..P.F..................ER......T.........................G.I.......Y.R................I.....L.........S...................P...V..G........................L..........LP129..G.........................GS.NSS....F..................E.......T.........................G.........Y..................I.....L.........S..........................G........................L..........LMN30100..GR.....Y.............W....V..NST....F..................G.......A.........................G.........C........V.........I...............S..........................G........................L...........NVSL97‐7895..GR......................A.V..NSN......................KD.......T.........................G.........Y..................I.....L.........S..........................G........................L..........LIngelvacATP..GR......................A.V..NSN......................KD.....L.T.............S...........G.........Y........................L.........S..........................G........................L..........LJA142..GR......................A.V..NSN......................KD.......T.........................G.........Y..................I.....L.........S..........................G........................L..........LEM2007..G...........PF.......W.V..V..NRT....F..................D.......T.........................G.I.......Y..................I..I..L.........S.......................V..G....................A...L...........HENAN‐XINX..V...A.....Q.PF.......Y..A.V..NSN............I.........GSN......T.........................G.I......YF.K................V..A..L.........S.............K............E...D.G..............A...V.KI........MN184A..G......Y..Q..F........L.A.V..DSN.........X..I.........N.H.S....T....................L....G.I......YC.K................I.....LT........S.............................I..G.D............A...V.K.........MN184B..G......Y..Q.PF........L.A.V...SN............I.........NDH.S....T.........................G.I......YY.A................I.....LT........S.............................I..G.D............A...V.K.........MN184C..G......Y..Q.PF........L.A.V..DSN............I.........N.H.S....T.........................G.I......YY.E................I.....LT........S.............................I..G.D............A...V.K.........图4.10GP5蛋白氨基酸序列Fig4.10AminoacidsequencesalignmentofGP550 本研究中的测序序列的GP5序列与以往大多数的毒株及典型毒株对比，发现了一些新的氨基酸突变位点，例如SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4在第15位氨基酸由L（亮氨酸）突变为P（脯氨酸），同时，YD、BJ1102、NT0801、Em2007、HENAN-XINX、MN184B和MN184C也有此突变；SDdz-2013-1、SDta-2013-1和SDly-2013-1/2/3/4在第23位氨基酸由F（苯丙氨酸）突变为S（丝氨酸），同时有此突变的还有YD和LMY；JLcc-2013-1在第58位氨基酸由N（天冬酰胺）突变为R（精氨酸）；SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4和LNsy-2014-1在第80位氨基酸由G（甘氨酸）突变为V（缬氨酸）；LNsy-2014-1在第196位氨基酸由Q（谷氨酰胺）突变为R（精氨酸），同时有此突变的还有HeNan-A1、WUH4和BJ1102。GP5序列比对分析发现不同亚群具有各自的基因标记。I亚群的遗传标记（geneticmarker）24353958位于Y（酪氨酸）、N（天冬酰胺）、I（异亮氨酸）和Q（谷氨酰胺）；II亚群的遗传标记位4404794于R（精氨酸）和F（苯丙氨酸）；III亚群的遗传标记位于I（异亮氨酸）、I（异亮氨酸）、101191334Y（酪氨酸）和K（赖氨酸）；IV亚群的遗传标记位于E（谷氨酸）和D（天冬氨酸）；V58亚群的遗传标记位于D（天冬氨酸），各遗传遗传标记位点用黑框表示，见图4.10，各遗传遗传标记位点统计结果见表4.3。表4.3GP5蛋白不同亚群的遗传标记Table4.3GeneticmarkersonGP5proteinofsubgroupsResidue482435394758669294101102121127137189191positionMajorityKACSLLNTGVFYLLSLRIYNIQAIITIIIIIYKIVSAVTFAIVRSNAP软件分析ORF5的非同义突变率和同义突变率（dN-dS）之间的差值是正值（0.013129±0.000430），这意味PRRSV的ORF5基因位于正性选择压力之下，且ORF5基因发生的是适应性分子进化。同义突变位点位于36-44、69-82、92-99、107-129和157-164，非同义突变位点位于22-28，分析结果见图4.11。图4.11ORF5的非同义突变率和同义突变率（dN-dS）比较及其对应的重要motifsFig4.11NonsynonymousandsynonymousrateofORF5andthecorrespondingvitalmotifs51 4.2.5.2N蛋白重要基序上的关键氨基酸位点突变本研究中的测序序列在N蛋白的重要基序和蛋白区域上的关键氨基酸发生突变。与VR2332相比，本研究中的9个序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4和57101113SXkl-2014-1以及I亚群毒株第5-13位氨基酸发生突变：由NGKQQKRKK（天冬酰胺-甘氨57101113酸-赖氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸）突变为NGKQQKKKK（天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸），第46-48位氨基酸发464748464748生突变：由KKK（赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸）突变为RKK（精氨酸-赖氨酸-赖氨酸），而57101113SDly-2014-1则突变为NGRQQNRKK（天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-天冬464748酰胺-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸）和RHR（精氨酸-组氨酸-精氨酸）。SDly-2014-1在第34位氨343461基酸由N（天冬酰胺）突变为S（丝氨酸），SXkl-2014-1在第61位由D（天冬氨酸）突变61为E（谷氨酸），而SDly-2013-1/2/3/4、SDdz-2013-1、SDta-2013-1和LNsy-2014-1在第51位氨5151基酸由E（谷氨酸）突变为G（甘氨酸）。SDdz-2013-1在102位氨基酸处由V（缬氨酸）突变为G（甘氨酸），SDly-2014-1在109位氨基酸处突变为R（精氨酸），同时SDly-2014-1和SXkl-2014-1第117位氨基酸突变为T（苏氨酸），突变位点用红框表示，见图4.12。52 图4.12N蛋白氨基酸序列比对Fig4.12AminoacidsequencesalignmentofNprotein53 91109117对N蛋白比对分析发现，I亚群的基因标记为A（丙氨酸），Q（谷氨酰胺）和A（丙97氨酸）；II亚群的基因标记为R（精氨酸），III亚群的基因标记为R（精氨酸），IV亚群的基因111347标记为亚群的基因标记为R（精氨酸），V亚群的基因标记为R（精氨酸）、N（天冬酰胺）120121和PS（脯氨酸-丝氨酸），遗传标记位点用黑框表示，见图4.12，统计的各亚群遗传标记位点统计结果见表4.4。表4.4N蛋白不同亚群的遗传标记Table4.4GeneticmarkersonNproteinofsubgroupsResidue791113464791109117120-1217positionMajorityKQKKKKTHVSPKIRAQAIIRIIIRRIVRVRNPSORF7的SNAP分析显示ORF7基因序列整体属于处于阳性选择（0.022858±0.000957），这表明基因处于适应性分子选择压力之下。ORF7基因的阳性选择位点位于24-33、78-90和104-115，而阴性选择位点位于46-51，分析结果见图4.13。图4.13ORF7的非同义突变率和同义突变率（dN-dS）比较及其对应的重要motifsFig4.13NonsynonymousandsynonymousrateofORF7andthecorrespondingvitalmotifs4.2.5.3Nsp2氨基酸的缺失和突变Nsp2基因高变区的推导氨基酸序列位于VR2332的471-638aa，由于氨基酸的缺失，该区氨基酸序列长度差异很大，有8类长度：100aa、116aa、138aa、148aa、157aa、164aa、165aa和168aa。与VR2332及其他亚群比较，本研究中位于I亚群的8个测序序列，LNsy-2014-1、SDdz-2013-1、SXkl-2014-1、SDly-2014-1和SDly-2014-1/2/3/4及I亚群的毒株在481位和533-561位氨基酸发生不连续缺失。同时，毒株YD在481、489-510和533-561位氨基酸发生52个氨基酸的不连续缺失。最重要的是，HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2在第593-595位发生3个氨基酸连54 续缺失。序列比对分析发现，以前报道的毒株C5和C6在这个位置有相同的缺失。Em2007在499-566位氨基酸发生68个氨基酸的连续缺失，而HB-2（sh）/2002在471-481位氨基酸发生11个氨基酸的连续缺失。MN184A/B/C在第486位和502-520位氨基酸发生20个氨基酸的不连续突变。与本研究中的测序序列HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2以及C5和C6对比发现，C1和C11在503位氨基酸发生缺失。序列比对分析发现本研究中的测序序列推导Nsp2氨基酸序列发生了氨33基酸突变。比对结果显示SDly-2013-1/2第3位氨基酸由N（天冬酰胺）突变为K（赖氨酸），33SDly-2013-3的第3位氨基酸由N（天冬酰胺）突变为Q（谷氨酰胺）。LNsy-2014-1、SDdz-2013-1、486SDly-2014-1、SDly-2013-2和SXkl-2014-1在第486位发生氨基酸替换，由P（脯氨酸）突变为486604604L（亮氨酸），而LNsy-2014-1在第604位发生氨基酸替换，由E（谷氨酸）突变为G（甘587氨酸）。在第587位氨基酸位置，SDdz-2013-1、SDly-2014-1、SDly-2013-2和SXkl-2014-1由A587636637（丙氨酸）突变为T（苏氨酸）。比对分析发现，SDly-2013-2从KY（赖氨酸-酪氨酸）突636637636636变为NN（天冬酰胺-天冬酰胺），而SXkl-2014-1从K（赖氨酸）突变为N（天冬酰胺），突变位点用红框显示，见图4.14。55 480490500510520530540550560....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|VR2332GGDVSNSWEDLAVSSPFDLPTPPEPATPSSELVIVSSPQCIFRPATPLSEPAPIPAPRGTVSRPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSANX06.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SY0608.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM...GGS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JX143.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HuN.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HUB2.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HUB1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JX2006.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JSyx.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..MI.M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐WUH1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M.LM..P.L.PASRRVPKLI....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐BJ1102.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S.LM..M..P.L.PAS.FVPKLM...IGS..V....K..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐10‐10HEB‐1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S.LM..M..P.LAPAS.FVPKLM...IGS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐BB0907.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S.LM..M..P.L.PAS.FVPKLM...IGS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JN‐HS.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S.LM..M..P.L.PAS.FVPKLM...IGS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐XH‐GD.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF.A.S..M..M..P.L.PASRRVSKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐Henan‐1.DN.P.GS.E‐T.DG.LNF...S..M..M..P.LEPASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐NT0801.DN.P.GS...T..G.LNF...S..M..M.KP.LTPAL.RVPKLM..S.GS..V....R......A......FLS.S.H.S.R.EKANP.LNsy‐2014‐1.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDdz‐2013‐1.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDly‐2014‐1.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDly‐2013‐2.DQ.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SXkl‐2014‐1.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JL‐04/12.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF..SS..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐AH0701.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐GZZB.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M....L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HN‐HW.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.LMPASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐YD.DN.P.GS.E‐T.GG.LN‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐VPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HEB1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐TJ.DN.P.GS.E‐T.GG.LN....S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HeNan‐A1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.LMPASRRAPKLM....G...V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HuN4.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.LMPASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐TP.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF..SS..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐WUH4.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JXA1.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐JXwn06.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDly‐2013‐1.DQ.P.GS.E‐T.GG.LN....S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDly‐2013‐3.DK.P.GS.E‐T.GG.LN....S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SDly‐2013‐4.DN.P.GS.E‐T.GG.LN....S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SHH.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HB‐3(cz).DN.P.GS.G‐T.GGLLNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐GD.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF...S..M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐LN.DN.P.GS.E‐T.GG.LNF......M..M..P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐BJ.DN.P.GS.E‐T.GGLLNF...S..T..MG.P.L.PASRRVPKLM....GS..V....R..T‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐HB‐2(sh)/2002‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐..GG.LNFS..S.LV..LG.P.LMPAS.HVS..V........V....RI....M......TF.F..W..S...EEANP.Em2007.DN.PSGR.C.T.DGTL.F.VLS..M.‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SHB.DN.P.GS...T.GG.L.FQ..S..TI.M..P.LTPAL.RVPKLM..S.GS..V....R.....M......FF.S...Y.....EEANP.CH‐1a.DN.P.G...F..GG.L.F...S..M..L..P.LMPAS.H.P..V....G...V....R.....M.......F.S...H.....EEANP.CH2002.DN.P.G...F..GG.V.F...S..M..L..P.LMPAS.H.P..V....G..RV....R.....M.......F.S...H.....EEANP.CH2003.DN.P.G...F..GG.V.F...S..M..L..P.LMPAS.H.P..V....G..RV....R.....M.......F.S...H.....EEANP.CH2004.DN.P.G...F..GG.V.F...S..M..L..P.LMPAS.H.P..V....G..RV....R.....M.......F.S...H.....EEANP.JA142.DN.PDGR...T.GG.L..S..S..M..L..PALMPAL.Y.S..V.S..VL..V....R.............F.S...H.....EEANL.IngelvacATP.DN.PDGR...T.GG.L..S..S..M..L..PAPMPAL.Y.S..V....VL..V....R.............F.S...H.....EEANL.NVSL97‐7895.DN.PDGR...T.GG.L..S..S..M..L..PALMPAL.Y.S..V.S..VL..V....R.............F.S...H.....EEANL.MN30100DDN.PDCR..MI..C.L.FS..S.LM..L.GPALMPAL.HASG.V.S..V...V..L.RA............F.S...H.....EKAHL.SP.NNLPD.......GC.S....S...V..L..PAS..A.RRS...VK.....V.V....K.....A...................EKVNP.MN184B..NLPD.R....GG.‐..F..L..LVAS...‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐.V.V....RV...L.SSPIVST.......GLR..EGMNL.MN184C..NLPD.R....GG.‐..F..L..LVAS...‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐.V.V....RV...L.SSPIVST.......GLR..EGMNL.MN184A..NLPD.Q....GG.‐..F..L..LVVS...‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐SV.V....RV...L.SSPIVST.......GLR..EGMNL.LMY.D..L........G..SG.............P.V..A..............T........A......................ARK....PRRSV03....P.....................................................................................VR‐2332V7....P.....................................................................................PRRSV02....P.....................................................................................CC‐1....P......T..............................................................................Clone20....P.....................................................................................GS2002....P................R..L.................................................................GS2003....P................R..L.................................................................GS2004....P................R..L.................................................................C1.D..P............N.............‐L........S.................................V..S...........C11.D..P............N.............‐L........S.................................V..S...........C5....P......................................................................V..S...........C6....P................................................................D.....V..S...........HLJyq‐2014‐1....P.....................................................................................LNsy‐2014‐2....P.....................................................................................PRRSV01....................A.....................................................................S1....................A.....................................................................VR2332..........................................................................................01NP1.2....P.....................................................................................BJ‐4....P...................L.................................................................HN1....P.....................................................................................MLVRespPRRSRepro....P.....................................................................................PL97‐1/LP1....P.....................................................................................PL97‐1....P.....................................................................................图4.14Nsp2蛋白氨基酸序列比对Fig4.14AminoacidsequencesalignmentofNsp256 570580590600610620630....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|...VR2332AAIPPYQNEPLDLSASSQTEHEASPPAPPQSGGVPGVEGHEAEETLSEISDMSGNIKPASVSSSSSLSSVRITRPKYSNX06‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......SY0608‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......JX143‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......HuN‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......HUB2‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......HUB1‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......JX2006‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAGAQ....V......ILNDTN..P..........K.......JSyx‐TTLTH.D...........KY..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P...G......K.......WUH1‐TTLTH.D............YD.F.L..S.NM.ILEAG.Q....V....P.IPNDTN..P..........K....R..BJ1102‐TTLTH.D............YK.F.L..S.NI.ILEAG.R....V.......LNDTN..P.........IK.A.....10‐10HEB‐1‐TTLTH.D............YK.F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......BB0907‐TTLTH.D............YK.F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......JN‐HS‐TTLTH.D............YK.F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......XH‐GD‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........E.......Henan‐1‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM..LEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......NT0801SMTLTR.D............Y..F.L..S.NM.LLEAV.Q....V......ILNDTNH.P..........K.....H.LNsy‐2014‐1‐TTLTH.D............Y....LT.S.NM.ILEAG.Q...GV......ILNDTN..P..........K.......SDdz‐2013‐1‐TTLTH.D............Y..F.LT.S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......SDly‐2014‐1‐TTLTH.D............Y..F.LT.S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K.......SDly‐2013‐2‐TTLTH.D............Y..F.LT.S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K....NN.SXkl‐2014‐1‐TTLTH.D............Y..F.LT.S.NM.ILEAG.Q....V......ILNDTN..P..........K....N..JL‐04/12‐TTLTHRD......V.....Y..F.L..S.NM.ILEAS.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......AH0701‐.TLTH.D............Y....L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......GZZB‐TTLTH.D............Y....L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.P.....HN‐HW‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K...S...YD‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAR.Q.V.GV......ILNDTN..P..........K.......HEB1‐TTLTH.D.........R..Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......TJ‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......HeNan‐A1‐TTLTH.D.....P......Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......HuN4‐TTLTH.D.....P......Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......TP‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......WUH4‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......JXA1‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......JXwn06‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......SDly‐2013‐1‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......SDly‐2013‐3‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......SDly‐2013‐4‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......SHH‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......ILNDTN..P..........K.......HB‐3(cz)‐TTLT..D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V.......LNDTN..P..........K.......GD‐TTLTH.D............Y.VF.L..S.NM.ILEAG.Q....V.......LNDTN..P..........K.......LN‐TTLTH.D............Y.VF.L..S.NM.ILEAG.Q.V..V......TLNDTN..P..........K.......BJ‐TTLTH.D............Y..F.L..S.NM.ILEAG.Q....V......VLDDTN..P..........K...S...HB‐2(sh)/2002..TLTC.D............Y..Y.L..LENI..LEAG.Q....V..G...ILD.TN..P..........K.......Em2007‐‐‐‐‐F.D...........VY....L..L.NT..LEAG......V......VLCDTN.VP..................SHBITALTH.D............Y..P.L..L.NM.ILEAG.Q....V......VLNDTS..PA.........K.......CH‐1a.TTLT..D.......F....C....L..L.NM.ILEAG.Q....V..G...ILND.N..P..................CH2002.TTLT..D.......F....C....V..L.NM.ILEAG.Q....V..G...ILND.N..P..................CH2003.TTLT..D.......F....C....V..L.NM.ILEAG.Q....V..G...ILND.N..P..................CH2004.TTLT..D.......F....C....V..L.NM.ILEAG.Q....V..G...ILND.N..P..................JA142.TTLTH.D............Y....LT.L.NM.ILE.G.Q....V......TLND.N..P..........K.....H.IngelvacATP.TMLTH.D............Y....LT.L.NM.ILE.G.Q....V...N..TLND.N..P..........K.....H.NVSL97‐7895.TTLTH.D............Y....LT.L.NM.ILE.G.Q....V......TLND.N..P..........K.....H.MN30100TTTLTC.D............Y....L..L.NM.ILE.G.QKV..V......IPND.N..P..........E....R..SP..TLGC.D.FP......H..Y....LVL..N.D.LE..ER....I..G...ILDA.....A.........A.......MN184B.VTLAC.D............Y....L.L.L.ED.LA..RR.V..V..G..G.PDD.RL.P.........IE.......MN184C.VTLAC.D............Y....L.L.L.ED.LA..RR.V..V..G..G.PDD.RL.P.........IE.......MN184A.VTLAC.D............Y....L.L.L.ED.LA..RR.V..V..G..G..DD.RL.P.........IE.......LMYVV.....D.........L..Y..L.L.....E.ALR.....V..A.........GT...P................H.PRRSV03.......D............Y.............L...........................................VR‐2332V7.......D............Y.............L...........................................PRRSV02.......D............Y.............L...........................................CC‐1................L...Y.........N...L...........................................Clone20....................Y.........N...L...........................................GS2002..........V.........Y....A......R.L...........................................GS2003..........V.........Y....A......R.L...........................................GS2004..........V.........Y....A......R.L...........................................C1....................Y....Q......‐‐‐...........................................C11....................Y....Q......‐‐‐...........................................C5....................Y....Q......‐‐‐...........................................C6....................Y....Q......‐‐‐...........................................HLJyq‐2014‐1....................Y...........‐‐‐..G........................................LNsy‐2014‐2....................Y...........‐‐‐..G........................................PRRSV01....................Y.............L........................................T..S1....................Y.............L........................................T..VR2332..............................................................................01NP1.2....................Y.............L...........................................BJ‐4....................Y.............L...........................................HN1....................Y.............L....................................V......MLVRespPRRSRepro........K...........Y.............L...........................................PL97‐1/LP1....................Y.............L...........................................PL97‐1....................Y.............L...........................................图4.14Nsp2蛋白氨基酸序列比对（续）Fig4.14AminoacidsequencesalignmentofNsp2（continued）478511515氨基酸比对分析发现：I亚群的基因标记S（丝氨酸）和VPKLM（缬氨酸-脯氨酸），481576581II为亚群的基因标记为F（苯丙氨酸）、F（苯丙氨酸）和C（半胱氨酸），III亚群的基因474496522593600标记为L（亮氨酸）、V（缬氨酸）、V（缬氨酸）、D（天冬氨酸）和R（精氨酸），IV473496529563565亚群的基因标记为D（天冬氨酸）、A（丙氨酸）、G（甘氨酸）、IPP（异亮氨酸-脯氨600605613617酸-脯氨酸）、H（组氨酸）、T（苏氨酸）、SGNIK（丝氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-57 620491503520赖氨酸）和S（丝氨酸），V亚群的基因标记为S（丝氨酸）、A（丙氨酸）和V（缬氨酸），遗传标记位点用黑框显示，见图4.14。4.2.5.4GP5的信号肽和N端糖基化位点预测GP5的信号肽预测发现：本研究中不同测序序列的信号肽剪切位点不同，见图4.15。本研究中的10个测序序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、SXkl-2014-1和LNsy-2014-1剪切位点位于第31和32位氨基酸之间（A31S32,称为“site2”）。而HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2的剪切位点在第26位和第27位氨基酸之间。并且，这两种剪切位点都在2013年Thaaetal的研究中报道过（Thaaetal.,2013）。图4.15GP5的信号肽预测Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP558 图4.15GP5的信号肽预测（续）Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP5（continued）59 图4.15GP5的信号肽预测（续）Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP5（continued）60 图4.15GP5的信号肽预测（续）Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP5（continued）61 图4.15GP5的信号肽预测（续）Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP5（continued）62 图4.15GP5的信号肽预测（续）Fig4.15SignalpeptidepredictionofGP5（continued）63 糖基化位点是指N-X-S/T序列，即天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸，其中X代表任意氨基酸。GP53033潜在的N端糖基化位点位于第30位氨基酸（NAS），第33位氨基酸（NDS），第34位氨基34354451酸（NNS），第35位氨基酸（NSS），第44位氨基酸（NLT）和第51位氨基酸（NGT）。304451本研究中的12个毒株有三个保守的N端糖基化位点：30（NAS）、44（NLT）和51（NGT），其中10个毒株JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、3435LNsy-2014-1和SXkl-2014-1含有另两个N端的糖基化位点：34（NNS）和35（NSS），而33HLJyq-2015-1和LNsy-2014-233含有另一个N端的糖基化位点：33（NDS），糖基化位点预测结果见图4.16。图4.16GP5糖基化位点预测Fig4.16GlycosylationpredictionofGP564 4.3讨论猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征的病原体，引起仔猪呼吸系统疾病和死亡，母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎，造成世界养猪业的巨大经济损失。PRRSV作为正链RNA病毒，基因的一个重要特征是易变异。1987年，猪繁殖与呼吸综合征首先发生于美国，随后迅速流行至欧洲和亚洲地区（Keffaber,1989;Wensvoortetal.,1991）。1996年，猪繁殖与呼吸综合征在中国猪群中开始流行，并于2006年爆发非典型猪繁殖与呼吸综合征，引起中国养猪业巨大的经济损失（Chenetal.,2006;Guoetal.,1996）。猪繁殖与呼吸综合征的临床特征是怀孕母猪繁殖障碍，吮乳仔猪多发的呼吸系统症状和进行性虚弱和死亡。PRRSV是猪繁殖与呼吸综合征的病原体，且是动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员之一。PRRSV是有囊膜病毒且基因组为单股正链RNA，基因组长约15kb（Cavanagh.,1997;Meulenbergetal.,1993）。PRRSV的基因复制是通过RNA依赖的RNA复制来完成的，即RNA复制。RNA病毒基因多样性的形成主要与四个方面有关。第一类是RNA重组和重配，RNA重组：不同基因组RNA分子核苷酸序列断裂后交换。RNA重配：同类多组分基因组病毒间整条RNA分子发生交换。第二类是核苷酸错配：RNA依赖的RNA聚合酶没有校正功能，所以RNA病毒基因组复制时核苷酸错配率较高，易产生准种。第三类是缺陷干扰RNA的形成：缺陷干扰RNA比正常病毒RNA基因组短，与正常病毒存在竞争关系，干扰病毒基因组复制。第四类是RNA编辑：RNA复制时的编辑作用，改变核苷酸。PRRSV最主要的基因组进化机制主要是RNA基因组重组及核苷酸错配。PRRSV基因组包含10个互相之间有重叠的开放阅读框（Meulenbergetal.,1993）。PRRSV的前两个开放阅读框（ORF1a和ORF1b）占据基因组的4/5，编码两个多聚蛋白1a和1b。这两个多聚蛋白（pp1a和pp1b）被蛋白酶降解为至少14个非结构蛋白。基因组3’-末端开放阅读框ORFs3-10编码蛋白GP2a、GP2、GP3、GP4、GP5、GP5a、M（膜蛋白）和N（核壳蛋白）（Snijderetal.,1998）。PRRSV的遗传进化分析显示其可分为两种基因型：欧洲型（I型）和北美洲型（II型），各自的代表株是LV和VR2332（Nelsenetal.,1999）。针对PRRSV的分子研究发现不同毒株在基因、抗原和毒力方面的差异及多样性（Meng.,2000;Nelsenetal.,1999）。在PRRSV的所有基因中，Nsp2是其中一个变异最大的基因，包括碱基突变、基因缺失和插入等变异（Fangetal.,2004;Gaoetal.,2004;Hanetal.,2006;Shenetal.,2000）。PRRSV的另一个变异较大的基因是ORF5，ORF5编码主要囊膜蛋白GP5，GP5蛋白对病毒的感染力和病毒诱导机体产生抗体具有重要作用（Kapuretal.,1996;Pirzadehetal.,1998）。ORF7是PRRSV最保守的基因之一（Mengetal.,1995），同样也用来确定PRRSV不同毒株之间的遗传进化关系。猪感染PRRSV后的第一阶段，N蛋白诱导机体产生抗体。因此，N蛋白是作为血清检测和诊断的靶蛋白之一（Seuberlichetal.,2002;Witteetal.,2000）。因此，ORF5、ORF7和Nsp2基因对于PRRSV的分子变异、进化和流行病学分析十分重要。PRRSV是已知的对世界养猪业最具破坏力的病原体之一（Neumannetal.,2005）。1996年，中国分离到PRRSV；2006年，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起非典型猪繁殖与呼吸综合征爆发并给中国养猪业带来巨大的经济损失（Chenetal.,2006;Guoetal.,1996）。在中国进行大范65 围的PRRSV的疫苗免疫，导致该病毒位于较强的选择压力之下，由此而产生较多的基因突变株。本研究的开展是为了了解在2013至2015年之间，中国北方地区PRRSV的分子变异和基因进化趋势。为了了解中国部分地区猪繁殖与呼吸综合征的流行情况及PRRSV流行毒株的分子变异和进化过程，本研究从2013年至2015年中国13个地区采集192份样品，其中45份为阳性，阳性率为23.4%。这些地区的猪场在感染PRRSV后，出现严重的临床症状：怀孕母猪严重的繁殖障碍，育肥猪皮肤红斑以及吮乳仔猪呼吸道症状和颤抖。但是，山东三个地区一些猪场感染PRRSV后不出现临床症状，为隐性感染。从每个地区选择一份阳性样品进行测序，获得12个测序序列（广东/广州地区由于病料较少，只进行了病原阴阳性检测，未能成功进行测序）部分基因组序列，即12个ORF5基因、12个ORF7基因和10个Nsp2部分基因序列（Nsp2基因序列长3602bp且变异大，所以只成功扩增了10个毒株的Nsp2部分基因）。利用本研究中的12条基因序列和从GenBank下载的82条序列建立ORF5基因、ORF7基因和Nsp2部分基因的三个遗传进化树，这三个遗传进化树均显示这94条北美型毒株序列分为5个亚群。遗传进化树显示本研究中的12个测序序列分别属于亚群I（以JXA1为代表株）和亚群IV（以VR2332为代表株）。在中国猪群中，PRRSV正发生着毒力不断改变、遗传基因差异增大、遗传分子不断进化的过程。另外，PRRSV的Nsp2基因正发生着基因的缺失和插入过程。本研究中发现Nsp2基因的三个连续氨基酸的缺失，这类缺失发生于来自黑龙江和辽宁的测序序列。本研究中的数据对于了解中国部分地区流行毒株的遗传进化和进行流行病学调查、流行毒株监测有一定意义。本研究对12个PRRSV测序序列的完整ORF5、ORF7和部分Nsp2基因进行测序，并将它们与82个北美型毒株及3个欧洲型毒株比对分析。其中3个欧洲型毒株作为遗传进化中的外群。HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2与VR2332同一亚群且是从具有典型的猪繁殖与呼吸综合征症状的发病猪采集病料，检测到的毒株。典型的PRRSV一直在中国猪群中流行且引起典型症状。基于ORF5、ORF7、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列，对本研究中的12个序列及82条GenBank下载序列构建遗传进化树发现，所有毒株可以划分至5个亚群，本研究中的12个毒株均为北美型且位于I亚群和IV亚群。JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、LNsy-2014-1和SXkl-2014-1位于I亚群，并且与2006年分离的HP-PRRSV代表株JXA1高度相似。HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2位于IV亚群，并且与IV亚群的代表株VR2332及其疫苗株MLV高度相似。PRRSV的GP5是高免疫原性的，并且在北美洲毒株中发现了数个抗原表位。GP5的主要中和位点（theprimaryneutralizingepitope,PNE）位于其胞外区的中部的37-45位氨基酸，序列为SHLQLIYNL（丝氨酸-组氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-亮氨383942383942酸）（Ostrowskietal.,2002）。2012年的一项研究发现当GP5的HL和I突变为TY和T时，可以阻断中和抗体中和GP5的PNE（LiandMurtaugh,2012）。经dN-dS计算GP5的非同义突变率与同义突变率发现，PNE区域处于正向选择中，这表明PNE区域发生的主要是非同义突变。I亚群中的所有毒株，包括本研究中的10个序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、3939SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、SXkl-2014-1的第39位氨基酸由L突变为I。因为I亚群的大多数毒株都是造成中国2006年非典型PRRS爆发的HP-PRRSV，所以推测PRRSV的第39位39氨基酸由为I时也可能对阻断中和抗体中和病毒起到一定的作用，因此导致疾病的传播与爆发。30333435PNE序列的上游有多个N端糖基化位点NAS、NDS、NNS和NSS，下游有一个糖基化位66 5144点NGT。糖基化位点对于GP5的正确折叠、定位、感染和信号转导有重要作用，而NLT位于44PNE上。而NLT与PNE序列重叠且本研究中所有的12个流行株都有此保守位点。2730GP5上的序列（A/V）LVN，位置靠近PNE，是主要的抗体识别位点，且是免疫显性和非中和抗原表位，可能是一种诱导抗原表位，诱导大多数针对GP5的非中和抗体且使中和抗体的产生至少推迟三星期（LopezandOsorio,2004）。因此，该抗原表位可能在病毒逃避抗体识别PNE2730中发挥一定的作用。IV亚群和V亚群在GP5上的此序列为VLAN，而I、II和III亚群是此诱2730导抗原表位序列VLVN。GP5的N端是其变化最大的区域，其中还包含有信号肽序列，而GP5的C端则较保守（Zhouetal.,2009）。GP5的C端的三个抗原表位即第151-156位氨基酸:RLYRWR，第171-179位氨基酸:GHLIDLKRV，第196-200位氨基酸:QWGRL，在所有的北美型毒株中均是高度保守的。抗原151156表位对应的序列RLYRWR的后五个氨基酸在本研究中所有的北美型毒株完全一样，只有第151位的氨基酸是有差异的。本研究中的8个序列SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、151151SDly-2014-1和SXkl-2014-1由R突变为K，并且近期报道的山东省从2013至2015年的毒株151156也有此突变。因此，PRRSV在山东和其临近地区如山西可能正经历该抗原位点序列RLYRWR151151中第151位氨基酸从R突变为K。本研究中位于IV亚群的HLJyq-2015-1和LNsy-2014-2第151151151151位的氨基酸是G而不是R，而该亚群中其它毒株都是R。IV亚群中有一个美国的疫苗毒MLVRespPRRSRepro，1998至2000年的研究发现GP5上第151位甘氨酸是疫苗毒的分子标记，但是随着疫苗毒在猪体内复制的过程，甘氨酸逐渐丢失，取而代之的是精氨酸（Allendeetal.,2000;Madsenetal.,1998;Yangetal.,1998）。因此，本研究中的分离株HLJyq-2015-1和测序序列LNsy-2014-2和疫苗株MLVRespPRRSRepro可能有一定的相关性，因为中国也使用该疫苗使其同时存在于中国的猪群中。I亚群中大多数的毒株都是在2006年爆发非典型PRRS后分离到的，其抗原位点序列196200196200QWGRL是非常保守的。2010年的一项研究预测抗原位点序列QWGRL是HP-PRRSV196200的特征序列，而突变序列RWGRL则是相应的低毒株序列（Wangetal.,2010）。本研究发现196200LNsy-2014-1、HeNan-A1、WUH4和BJ1102是突变序列RWGRL，这与2010年的研究不相符，因为HeNan-A1、WUH4和BJ1102都是高致病PRRSV。另外，JLcc-2014-1、JXA1、YD、196200JXA1-P120和JL-04/12均突变为LWGRL。GP5有两个免疫显性T细胞抗原表位，可以刺激γ干扰素分泌细胞，分别分布于GP5的第117131117-131位氨基酸，序列为LAALTCFAIRFAKN，及GP5的第149-163位氨基酸，序列为149163KGRLYRWRSPVIIEK（Ostrowskietal.,2002）。I亚群中的毒株包括JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1、LNsy-2014-1和SXkl-2014-1在这两个T细胞抗121121127127原表位上有三处突变，包括第121位氨基酸从T突变为I，第127位氨基酸从F突变为L161161和第161位氨基酸从I突变为V。而且，Jian-KuiLiu在2013年也发现有同样的突变（Liuet149163al.,2013）。另外，在抗原表位KGRLYRWRSPVIIEK上发现了新的突变。本研究中的9个测序序列JLcc-2013-1、SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1149151161163突变为KGKLYRWRSPVIIEK，而LNsy-2014-1/2和HLJyq-2015-1则突变为149151159163KGGLYRWRSPIIIEK。67 13137第13位氨基酸R和第137位氨基酸A是GP5的关键氨基酸，与PRRSV的毒力弱化有137关。并且，第137位氨基酸A可能可以用来区分疫苗毒和野毒（Allendeetal.,2000;Madsenetal.,1998;Yangetal.,1998）。与VR2332相比，毒株LNsy-2014-2和HLJyq-2015-1以及I亚群的毒1313137137株在此关键氨基酸位点都发生了突变：从R突变为Q，从A突变为S。84962015年的研究发现GP5缺失TSHFLDTVALVTV序列会减缓PRRSV在Marc-145细胞上97119的增长速度，同时GP5缺失STAGFVHGRYVLSSTYAVCALAA序列的反向克隆拯救毒株抑制毒株的体外复制（Muetal.,2015）。与VR2332相比，I亚群中的毒株在这两个特殊氨基酸序列9294107108上各有两个突变，分别为G、A和YY。N蛋白是数量最丰富病毒蛋白，且能最快速的引起猪对PRRSV的抗体免疫。北美型毒株的N蛋白已经发现有数个基序（Murtaughetal.,2002;Snijderetal.,1998）。PRRSV的N蛋白，当单独表达时或者与红偏移绿色荧光蛋白融合表达时，可以在核仁和核质中观察到，这与在同属于套式病毒目的动脉炎病毒和冠状病毒中的观察是一致的。N蛋白上的几种信号基序被认为与起始N蛋白从胞浆，穿过核孔复合物，进入到细胞核有关。N蛋白的核定位信号1（NLS-1）基序位于N蛋白的第10-13位氨基酸。IV亚群的毒株NLS-110131013101113的序列是KRKK，I、II、III和V亚群的序列是KKKK，而SDly-2014-1的序列是KNKK。2003年的一项研究表明：NLS-1序列的突变或缺失并不影响N的核定位（Rowlandetal.,2003）。41N蛋白的核定位信号2位于N蛋白的中部，第41-48位氨基酸，其保守序列为PGKK（N/S）4841464748KKK（Rowlandetal.,2003）。SDly-2014-1毒株的N蛋白上NLS-2序列为PGKKNRHR，可能会影响NLS-2的核定位信号。N蛋白的核仁定位信号基序（NoLS）位于N蛋白的第41-724172位氨基酸，序列是PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDURHHFTPSER（RowlandandYoo,2003）。本研究中的7个测序序列SDly-2013-1/2/3/4、SDdz-2013-1、SDta-2013-1和LNsy-2014-1在第5151516161位氨基酸由E突变为G，而SXkl-2014-1序列在第61位氨基酸由D突变为E。N蛋白从核浆转运到胞浆与PRRSVN蛋白N端的核输出信号（NES）有关。NES位于N蛋白的第106-117106117位氨基酸，保守序列是LPTHHTVRLIRV（RowlandandYoo.,2003）。本研究中所有相关毒株的NES都十分保守，只在第109位和第117位氨基酸有差异。I亚群的毒株N蛋白上第109位和109117109117第117位氨基酸分别为Q和A，SDly-2014-1是R，而SDly-2014-1和SXkl-2014-1是T。PRRSV的N蛋白之间的连接是通过共价和非共价反应，是病毒衣壳装配的基础。N蛋白第31372331-37位氨基酸序列为AQQNQSR对N蛋白之间的非共价连接十分重要，氨基酸残基C对N蛋白之间的共价连接十分重要（WoottonandYoo.,2003）。本研究中所有相关毒株及测序序列在N蛋白上的该序列和氨基酸残基都是相同的，只有SDly-2014-1和HENAN-XINX第34位氨基酸从3434N突变为S。PRRSV的病毒基因组和信使RNA（mRNA）都含有Poly（A）。Poly（A）结合蛋白（PABP）是一种细胞蛋白，能与病毒Poly（A）结合从而减少病毒RNA的合成，病毒编码蛋白的表达最终减少PRRSV的复制（Wangetal.,2012）。PRRSVN蛋白上有一个与PABP结合的结构域，其5258氨基酸序列为PEKPHFP。本研究中所有毒株及测序序列N蛋白上的该结构域都是保守的，只54有CH2002、CH2003、CH2004、GS2002、GS2003和GS2004毒株第54位氨基酸突变为D。ScottP.KenneyA发现N蛋白上一种特别保守的Src同源物3（SH3）的结合基序，位于N蛋68 5056白的第50-56位氨基酸，保守序列为PxxPxxP。2003年，RowlandandYoo的研究发现第56位的脯氨酸突变将导致病毒的感染力下降，这说明N蛋白上的第56位的脯氨酸对于病毒周期是十分重要的（RowlandandYoo.,2003）。然而，N蛋白上第50位和第53位氨基酸的突变并不会影响PRRSV的感染力，这说明SH3基序上的保守脯氨酸不是至关重要的功能因子，而可能是通过与宿主细胞反应提供给病毒选择性生长优势。本研究中所有毒株及测序序列在N蛋白上的SH35056结合基序的序列都是PxxPxxP。111123研究发现N蛋白C端的第111-123位氨基酸序列TVRLIRVTASPSA是N蛋白构象决定区，与构象相关的单抗结合，而该区域内112-123位氨基酸对于不连续的多个抗原表位的产生十117117分重要（Woottonetal.,1998）。I亚群中的毒株在第117位氨基酸由V突变为（A/T），而118118SDly-2014-1在第118位氨基酸由A突变为T，这些突变可能会影响N蛋白的结构和抗原性。N蛋白的第120位丝氨酸对N蛋白的磷酸化至关重要，其在绝大多数毒株中都是保守的，但120是有3个毒株IngelvacATP、NVSL97-7895和JA142突变为P。5132011年的研究发现N蛋白第5-13位氨基酸NGKQQKKKK序列可以作为外源基因插入和10表达及疫苗候选标记的位点（Tanetal.,2011）。所有的毒株在第10位氨基酸为K，只有10SDly-2014-1和HENAN-XINX是N。而HENAN-XINX毒株是2012年分离到的NADC-30类似毒，NADC-30是在美国流行的强毒株。目前不少地区已经监测到新毒株NADC-30like毒株，包括HENAN-XINX株、HENAN-HEB株和CHsx1401株。NADC-30like毒株与美国NADC毒株同源性在95%以上，虽然目前尚无确切的证据证明NADC-30like毒株就是来源于美国NADC毒株，但与频繁的引种有一定的关系。比对分析发现本研究中的8个测序序列SDdz-2013-1、SDta-2013-1、SDly-2013-1/2/3/4、SDly-2014-1和SXkl-2014-1与HP-PRRSV一样在Nsp2上的第481位和第533-561位氨基酸有30个氨基酸的不连续缺失（Wangetal.,2015）。同时，与VR2332相比，HLYyq-2015-1和LNsy-2014-2在Nsp2的第593-595位氨基酸有缺失。同样的缺失也发现在2013-2015年山东省分离到的毒株C1、C5、C6和C11。这种现象说明近年来，中国北方猪群中流行的PRRSV，其Nsp2上第593-595位氨基酸随着病毒在猪群中的复制传播而逐渐丢失，这可能与病毒所承受的选择压力有关，最主要来自于疫苗选择压力。69 第五章全文结论1.PCV2和PRRSV混合感染流行病学调查结论：2013-2015年吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东采集192份样品，PCV2、PRRSV、双阳性率分别为64.3%、23.4%、18.5%；分离2株美洲型PRRSV毒株。2.PCV2遗传进化分析结论：12个PCV2全基因组测序序列分别属于PCV2b和PCV2d基因型；8个序列形成单系群；3个序列是PCV2c和PCV2b基因型间毒株的重组毒；预测有PCV2毒株从丹麦等国家迁移至中国。3.PRRSV遗传进化分析结论：12个PRRSVORF5、ORF7、部分Nsp2基因测序序列均属于美洲型；1个序列ORF7基因与NADC-30相似度最高；12个序列GP5和N蛋白均有关键氨基酸突变；8个序列Nsp2第481位和第533-561位氨基酸缺失，2个序列Nsp2第593-595位氨基酸缺失。70 参考文献1.曹洪志,杨丁,李成贤,等.宜宾市PRRSV和PCV2感染的流行病学调查[J].中国动物检疫,2010,27（6）:50-51.2.陈金山,韩庆功,马金友,等.猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病混合感染的诊断与防治方法[J].湖北农业科学,52（1）:121-123.3.陈学灿,韩庆彦,徐峥嵘,等.甘肃省断奶仔猪多系统衰竭综合征的调查研究[J].动物医学进展,2007,28（10）:07-110.4.郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离猪生殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）的研究[J].中国畜禽传染病,1996,2:1-5.5.郎洪武,张广川,吴发权,等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技,2000,30（2）:1-5.6.李栋,邱翔宇,宁明刚,等.猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征自然混合感染病例的研究[J].甘肃农业大学学报,48（2）:6-10.7.孙艳永,刘智俊,王泽,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪II型圆环病毒混合感染的诊断[J].吉林农业大学学报,2009,31（6）:755-758.8.邢明伟,曾祥伟,柴洪亮,等.SYBRGreen荧光RT-PCR法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒[J].中国兽医学报,2010,35（4）:597-601.9.赵坤,张宏,李敬玺,等.PRRSV和PCV2感染引发猪免疫抑制的机理及对策[J].河南科技学院学报:自然科学版,2006,34（4）:25-26.10.王天户,娄忠子,刘思当.猪PRRSV单独感染及与PCV2混合感染的免疫病理学研究[J].西南农业学报,2008,21（1）:190.11.王鑫,周铁忠,李菲,等.应用RT-PCR方法快速诊断猪繁殖与呼吸综合征的研究[J].吉林农业大学学报,2010,32（6）:666-669.12.王小敏,何孔旺,张敏敏,等.猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的流行病学调查[J].华北农学报2012,397（增刊）:390-394.13.Adams,D.J.,VanDerWeyden,L.,Mayeda,A.,etal.,Anovelspliceosomalproteinabletoinducealternativesplicing[J].JournalofCellBiology,2001,154:25-32.14.AlarconP,VelasovaM,WerlingD,etal.,Assessmentandquantificationofpost-weaningmulti-systemicwastingsyndromeseverityatfarmlevel[J].PreventiveVeterinaryMedicine,2011,98:19-28.15.AllanG.M,EllisJ.A,Porcinecircoviruses:Areview[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,2000,12:3-14.16.Allende,R.,Kutish,G.F.,Laegreid,W,etal.,Mutationsinthegenomeofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusresponsiblefortheattenuationphenotype[J].ArchivesofVirology,2000,145:1149-1161.17.Allende,R.,Lewis,T.L.,Lu,Z.,etal.,NorthAmericanandEuropeanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesdifferinnon-structuralproteincodingregions[J].JournalofGeneral71 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附录PRRSV构建遗传进化树从GenBank下载的参考序列信息GenBankNo.StrainsDateAreaAccessionNo.1CH-1aAY0326261996China2BJ-4AF3318311996China3S1DQ4594711998China4HB-2（sh）/2002AY2623522001China5PRRSV01FJ1756872001China6CH2002EU8804382002China7GS2002EU8804412002China8PRRSV02FJ1756882002China9HN1AY4576352003China10Clone20FJ8995922003China11CH2003EU8804402003China12GS2003EU8804422003China13PRRSV03FJ1756892003China14CH2004EU8804392004China15GS2004EU8804432004China16SHBEU8642322005China17JXA1EF1124452006China18WUH1EU1874842006China19HUB1EF0759452006China20HUB2EF1124462006China21TPEU8642332006China22HEB1EF1124472006China23HN-HWFJ7976902006China24HuNEF5179622006China25HuN4EF6350062006China26NX06EU0977062006China27BJsy06EU0977072006China28JX143EU7087262006China29JX2006EU8804322006China30JXwn06EF6410082006China31TJEU8602482006China32SY0608EU1440792006China85 PRRSV构建遗传进化树从GenBank下载的参考序列信息（续）GenBankNo.StrainsDateAreaAccessionNo.33JSyxEU9393122006China34HB-3（cz）EU4784352006China35CC-1EF1534862006China36GDEU1095032006China37LNEU1095022006China38SHHEU1068882006China39SD-ZQEU0866052007China40EM2007EU2626032007China41BJEU8257232007China42GZZBEU1406112007China43Jiangxi-3EU2009612007China44XH-GDEU6241172007China45Henan-1EU2009622007China46JN-HSHM0161582008China47NT0801HQ3158362008China4809HUB2JF2686832009China49YDJF7487172009China50BB0907HQ3158352009China5110-10HEB-1JQ6635512010China52AH0701GU4612922007China53BJ1102KF7512372011China54WUH4JQ3262712011China55JL-04/12JX1776442012China56HZ-31KC4451382012China57HeNan-A1KJ0024512013China58HENAN-XINXKF6119052013China59C1KM2295152013China60C5KM2295192013China61C6KM2295202013China62C11KM2295252014China63LVM962621991Netherlands6401NP1.2DQ0563732001Thailand6501CB1DQ8647052003Thailand66VR-2332AY1505642002Denmark86 PRRSV构建遗传进化树从GenBank下载的参考序列信息（续）GenBankNo.StrainsDateAreaAccessionNo.67MLV-ReproAF1591491999USA68EuroPRRSVAY3665251999USA69P129AF4940422002USA70JA142AY4242712003USA71NVSL97-7895AY5459852004USA72MN184ADQ1760192005USA73MN184BDQ1760202005USA74VR-2332V7DQ1760212005USA75IngelvacATPDQ9880802006USA76MN184CEF4887392007USA77MN30100EF5360002007USA78NADC30JN6544592009USA79PL97-1AY5852412004Korea80PL97-1/LP1AY6126132004Korea81LMYDQ4734742006Korea82SPAF1842121999Singapore87 致谢时光荏苒，岁月如梭，三年的研究生生活即将结束。回首昨日，心怀感恩，感谢我的导师武华研究员，感谢武老师三年来对我的关怀和爱护。三年来，每当实验开展出现较大困难时，老师总是给予最及时的帮助与支持，让我度过难关。老师最令我们学生敬佩和仰慕的不仅仅是丰富的科研经历，更是公平公正的为人态度以及干出一番事业的雄心壮志。印象最深刻的一件事就是有一次我给老师您发邮件用词不当，老师您给我打电话又给我发短信告诉我应该怎么跟老师沟通，以后进入社会又应该怎么跟上级沟通。您告诫我做人做事心中要有一把标尺，以后一定要做出些成绩来，您期望您所有的学生成材就像父辈期待孩子们成长为社会的有用之人。当时被老师您批评心情是又紧张又愧疚又感动，现在临近毕业了，心里只有对您的不舍，只恳求在以后的岁月中老师您继续鞭策学生，前进的道路上伴随有您的谆谆教诲才不会迷茫。感谢我的实验指导老师王凤雪副研究员、温永俊研究员，感谢两位老师伴随我的实验开始至最终结束的所有帮助。刚进入实验室时，王凤雪老师带我熟悉实验室的各种仪器，每天帮我看电泳图片分析实验结果，教给我分析基因序列的各个软件。这位大师姐尽可能的给予我实验各个方面的指导和帮助，期望我能在实验过程中少走弯路。温永俊老师每周都会听取我们的实验进展汇报，督促并指导我的实验，使我加快脚步不断前进。这位大师兄总是在我们汇报结束时告诉我们有很多地方做的不好需要改进，虽然每周汇报的时候心里会紧张，但是我们的成长却是显而易见的。感谢我的师姐刘莹给予我实验上的帮助，生活上莫大的鼓励和关心，有一段时间因为肾结石腰疼，你总是抢着帮我做实验，让我觉得“师妹”真是世界上最幸福的身份。感谢实验室的同学赵航、张贺伟、仝明微、王西西、林鹏、何明辉、张孟雅、李家伟、汪孟航、温永胜、曹志刚，谢谢你们带给我的快乐和温暖。感谢同届同学王晗、周盼伊、马凡舒、路晓、宋姗姗、陈银彬、石昆、樊燕燕、王洋、徐成路、乔永在、孙浩然、张伟、王权威、欧阳艳飞的陪伴，谢谢你们带来的同窗之谊。感谢实验室的老师程世鹏老师给予的关怀和帮助，李真光、任静强、孙娜、朱洪伟、杨勇、张淑琴、郭利、易立、王建科、王改丽老师给我实验上的建议和生活上的关心。感谢中国农业科学院及特产研究所的培养。感谢特产研究所科研处处长闫喜军老师，工作人员范琳琳、陈曦、焉石在我们回到特产所后，从论文开题、中期审核至最终提交论文各个环节付出的劳动和不厌其烦的帮助。感谢我的父母和弟弟，谢谢你们对我学业的全力支持和生活的无私关怀。每周一次给您们打电话是我最放松的时刻，电话中爸爸会告诉我家里最近有什么打算，妈妈总是欣喜而期待的说菜园子里长出了我爱吃的菜，弟弟会抢过电话跟我说一说少年的烦恼。爸爸妈妈虽然是农民，对我的专业懂得不多，却是我人生路途中最亮的一盏明灯，他们以身作则教我成为一个善良、勤奋、宽容的人。88 作者简历刘杏，女，汉族，1990年9月出生，湖南省浏阳市人。教育背景：2009年9月-2013年7月，就读于东北林业大学野生动物资源学院，动物医学专业，获农学学士学位；2013年9月-至今，就读于中国农业科学院，预防兽医学专业，动物疫苗与分子免疫方向，攻读硕士研究生。发表文章：1.LiuX.,WangF.X.,ZhuH.W.,SunN.,WuH.,Phylogeneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)isolatesinChinawithhighhomologywithPCV2c[J].Archievesofvirology,onlineavailable(IF:2.28).2.刘杏，王凤雪，温永俊，武华,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的流行病学调查[J].吉林农业大学学报,已录用.3.刘杏，王凤雪，温永俊，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和复制机制及其毒力研究进展[J].病毒学报，2015,31（5）：585-592.4.WangFX,QinLT,LiuY,LiuX,SunN,YangY,ChenT,ZhuHW,RenJQ,SunYJ,ChengSP,WenYJ,NovelNsp2deletionbasedonmolecularepidemiologyandevolutionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinShandongProvincefrom2013to2014[J].InfectGenetEvol.2015Jul;33:219-226.(IF:3.015)5.WangFX,LiuY,ZhuHW,LiuX,YangY,SunN,ChengSP,WenYJ.,Safetyofinoculationofbovineparainfluenzavirus3aspotentialvaccinevectorinpigs[J].Virusdisease.2015Jun,26(1-2):89-91.6.YingLiu,Feng-XueWang,Yong-JunWen,Zhen-GuangLi,XingLiu,ZaSun,YongYang,Shu-QinZhang,Hong-WeiZhu,Shi-PengChen,HuaWu,EffectofNonstructuralProtein2HypervariableRegionsintheReplicationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusinMarc-145Cells[J].Intervirology.onlineavailable.(IF:1.77)7.孙娜，刘杏，陈强，刘莹，温永俊，程世鹏，胞内劳森氏菌PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报，已接收。8.王凤雪，刘莹，杨勇，朱洪伟，孙娜，刘杏，程世鹏，温永俊，高致病性PRRSVJL-04/12株核衣壳蛋白的表达与抗原性分析[J].动物医学进展，2015.36（10）：60-64.89