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学校代码１０４５９学号或申请号２０１５２２５２４３２４＾密级密公开级专业硕士学位论文抑制葡萄糖脑苷脂酶降低组织蛋白酶Ｄ引起小鼠帕金森病的机制研究作者姓名：孙政导师姓名：马建军教授专业学位名称：神经病学培养院系：郑州大学人民医院２０１８完成时间：年３月 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterThemechanismresearchofinhibitingGlucocerebrosidaseleadstoParkinson’sdiseaseinMiceviaDecreasingCathepsinDByZhengSunSupervisor:Prof.JianjunMaNeurologyPeople’sHospitalofZhengzhouUniversityMay,2018 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人？或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均Ｂ在文中以明确方式标明。本声明的法律贵任由本人承担。学位论文作者：日期：２０￥年夕月日孤歡／学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大。、学根据郑州大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有，关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被査阅和借阅：本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用。本人离校后发表影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文、一使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第署名单位仍然为郑州大学。。保密论文在解密后应遵守此规定学位论文作者：１日期：２对年Ｓ月／日 抑制葡萄糖脑苷脂酶降低组织蛋白酶D引起小鼠帕金森病的机制研究硕士研究生：孙政导师：马建军教授郑州大学人民医院神经内科中国郑州450003摘要研究背景帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是常见的神经系统退行性疾病，PD的病理特征为中脑黑质内多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元丢失、路易小体（Lewybodies,LB）出现以及LB内α-突触核蛋白（alpha-synuclein,α-syn）的病理性沉积，沉积的α-syn对神经元有毒性作用。发生PD危险因素有很多，近年来，有研究指出葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GCase;GBA）含量下降是发生PD的危险因素之一。GCase是一种可溶性的糖酯类物质，广泛存在于细胞溶酶体内，主要参与鞘脂代谢，由GBA基因表达形成。当GBA突变时，GCase的表达含量及活性下降。研究发现在散发性PD患者脑内黑质中，GCase的含量及活性均下降。有动物模型发现抑制GCase表达时，黑质内α-syn沉积增多，可以出现PD症状。中枢神经系统细胞内主要靠两大途径维持蛋白质的稳态，分别是自噬-溶酶体途径（autophagylysosomepathway,ALP）和泛素-蛋白酶体系统，其中ALP是降解α-syn的主要途径。组织蛋白酶D（CathepsinD,CTSD）是溶酶体内的一种水解酶，在水解蛋白沉积物时发挥重要作用，CTSD的含量可以反映溶酶体的功能。α-syn经过磷酸化、硝基化的修饰，形成有毒性的不可溶的蛋白聚集体，沉积在细胞突触前膜。研究证实丝氨酸129(serine129,S129)磷酸化α-syn参与α-syn的转运和病理性积聚，在PD的病理过程中特异I 性较α-syn高。目的本研究使用8w的雄性C57BL/6小鼠。抑制GCase水平后，观察小鼠运动情况、黑质内DA神经元数目变化情况以及S129磷酸化α-syn、CTSD、GCase蛋白水平的变化情况。材料与方法本研究选用体重20-25g、8周的雄性C57BL/6小鼠。将小鼠分成3组（每组30只），分别是：对照（Control）组、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）组和神经酰胺β-环氧化物（conduritolβ-epoxide,CBE）组。MPTP组腹腔注射MPTP（30mg/kg），连续5天，每天上午9点注射，建造亚急性PD模型。Control组腹腔注射相等体积的生理盐水。CBE组腹腔注射CBE（200mg/kg），连续注射2天，每天上午9点注射。用爬杆试验观察小鼠运动情况。分别计数小鼠在顶端准备向下爬行的时间（timetoorientdownwards,t-turn）和小鼠从准备向下爬行至木杆底部的时间（timetodescendthepole,t-descend），t-turn反映小鼠运动协调性，t-descend反映小鼠是否出现运动迟缓。利用Westernblotting技术观察小鼠黑质内S129磷酸化α-syn、CTSD及GBA的表达变化。为了解小鼠黑质内DA神经元的变化情况，运用免疫组化观察小鼠神经元内酪氨酸羟化酶（TyrosineHydroxylase,TH）免疫阳性细胞数目的变化。采用GraphPadPrism6.0统计软件进行单因素方差分析，比较用药前后的变化情况，P<0.05为差异有统计学意义。结果1．与Control组相比，腹腔注射MPTP、CBE后小鼠出现竖毛、竖尾、静止性震颤、运动迟缓、姿态平衡障碍的症状。爬杆试验结果显示，t-turn和t-descend的时间延长（P<0.001）。2．免疫组化结果显示：与对照组相比，MPTP组和CBE组双侧黑质内的TH免疫阳性细胞数目显著减少（P<0.001）。II 3．Westernblotting结果显示：与对照组相比，MPTP组和CBE组均出现S129磷酸化α-syn表达增多（P<0.01,P<0.05），CTSD、GBA表达降低（P<0.001）。结论1．溶酶体水解功能下降是黑质区S129磷酸化α-syn沉积的原因。2．GCase的水平降低是发生PD的危险因素之一。3．抑制GCase蛋白水平时，通过降低CTSD的含量引起黑质区S129磷酸化α-syn聚集和DA神经元丢失，导致小鼠出现PD症状。关键词:葡萄糖脑苷脂酶；丝氨酸129磷酸化α-突触核蛋白；组织蛋白酶D；溶酶体功能障碍；帕金森病III TheresearchofinhibitingGlucocerebrosidaseleadstoParkinson’sdiseaseinMiceviaDecreasingCathepsinDPostgraduate:ZhengSunTutor:JianjunMaNeurologyPeople’sHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhouChina450003AbstractBackgroundParkinson'sdisease(PD)isthemostcommonneurodegenerativedisease.ThepathologicalhallmarksofPDarelossofdopaminergic(DA)neuronsinthesubstantianigraofthemidbrain,theappearanceofLewybodies(LB)andpathologicalaccumulationofalpha-synuclein(α-syn)inLBwhichhastoxiceffectonneurons.TherearemanyriskfactorsforPD,studieshaveshowedthatglucocerebrosidase(GCase;GBA)deficiencyisoneoftheriskfactorsfordevelopingPDinrecentyears.GCaseisasolublesugaresterwhichiswidelypresentincelllysosomes.ItisinvolvedinsphingolipidmetabolismandencodedbyGBAgene.MutationsinGBAmaketheexpressionandactivityofGCasedecrease.ThestudieshaveconfirmedthatthedeclineofGCaseexpressionandactivityarefoundinthesubstantianigraofsporadicPDpatients.AnimalmodelshaveexhibitedthatinhibitingtheexpressionofGCaseleadstotheaccumulationofα-syninsubstantianigraandtheoccurrenceofPD.Twomajorpathwaysareusedtomaintainproteinhomeostasisincentralnervoussystem:autophagy-lysosomepathway(ALP)andubiquitin-proteasomesystem.ALPisthemainpathwayforthedegradationofα-syn.CathepsinD(CTSD)isalysosomalhydrolasewhichplaysanimportantroleinthedegrationofproteinaggregates.TheexpressionofCTSDreflectsthefunctionoflysosomes.ModifiedbyphosphorylationIV andnitration,α-synchangesintotoxicandinsolubleproteinaggregatesinthepresynapticmembraneofcells.Studieshaveshowedthatserine129(S129)phosphorylatedα-synisinvolvedinthetransformationandpathologicalaccumulationofα-syn.ThespecificityofS129phosphorylatedα-synishigherthanα-syninpathologicalprocessofPD.ObjectiveInthisstudy,maleC57BL/6micewereinjectedintraperitoneallywith1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP),andsubacutePDmodelwasestablished.IntraperitonealinjectionofCBE(conduritolβ-epoxide)wasusedtoinhibitGCaselevelinmicebrain.ThechangesofDAneuronsinthesubstantianigraofmiceandthechangesofS129phosphorylatedα-syn,CTSDandGBAwereobservedbyimmunohistochemistryandWesternblottingrespectively.MaterialandmethodsInthisstudy,maleC57BL/6miceweighing20-25gand8weekswereused.Thesemiceweredividedinto3groups(n=30foreachgroup):Controlgroup,MPTPtreatmentgroupandCBEtreatmentgroup.ThemiceinMPTPtreatmentgroupwereinjectedwith30mg/kgMPTPinnormalsalineat9A.M.for5daysconsecutivelytoinducesubacutePDmodelmice.ThemiceintheControlgroupweresubjectedtointraperitoneal(i.p.)injectionofnormalsalinewiththesamevolume.ThemiceinCBEgroupreceivedasinglei.p.injectionof200mg/kgofCBEindeionizedwaterat9A.M.for2daysconsecutively.Apoletestwasemployedtoevaluatethemotorability.Theamountoftimetoorientdownwards(t-turn)andthetotaltimetodescendthepole(t-descend)weremeasured.T-turntimereflectsextentofmotorcoordinationandt-descendtimereflectsextentofbradykinesia.WesternblottingwasusedtoevaluatetheexpressionsofS129phosphorylatedα-syn,CTSDandGBAinsubstantianigraofmice.ToexplorethechangeofDAneuronsinthesubstantianigraofmice,immunohistochemistrywasusedtoobservethenumberofTyrosineHydroxylase(TH)-positivecells.AllstatisticalanalyseswerecarriedoutusingGraphPadPrismV 6.0software.Weusedone-wayanalysisofvariance(ANOVA)analysistocomparechangesbeforeandaftertreatment.Pvaluesoflessthan0.05wereconsideredstatisticallysignificant.Results1.ComparedwiththeControlgroup,MPTPandCBEgroupsshowedverticalhair,verticaltail,tremble,bradykinesiaandposturalinstabilitysymptoms.Poletestresultsshowedsignificantlyincreasedtimetoturnanddescendinthesetwogroups(P<0.001).2.ImmunohistochemistryresultsshowedthatthenumbersofTH-positivecellsinthebilateralsubstantianigraofMPTPandCBEgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththeControlgroup(P<0.001).3.TheresultofWesternblottingshowedthatincomparisontotheControlgroup,thelevelofS129phosphorylatedα-synwereincreased(P<0.01,P<0.05),buttheexpressionsofCTSDandGBAweredecreasedinMPTPandCBEgroups(P<0.001).Conclusion1.LysosomaldysfunctionresultsintheaccumulationofS129phosphorylatedα-syninsubstantianigra.2.GCasedeficiencyisariskfactorfortheoccurrenceofPD.3.InhibitionofGCaseleadstotheaccumulationofS129phosphorylatedα-synandlossofDAneuronsinsubstantianigraviadecreasingCTSD,whichresultintheoccurrenceofPDinmice.Keywords:glucocerebrosidase;serine129phosphorylatedalpha-synuclein;CathepsinD;lysosomaldysfunction;Parkinson’sdiseaseVI 目录正文部分中英文简略词对照表..............................................................................................Ⅷ1.引言............................................................12.材料与方法......................................................43.结果...........................................................114.讨论...........................................................135.结论...........................................................16参考文献.........................................................17附图.............................................................20综述部分葡萄糖脑苷脂酶与帕金森病.........................................24参考文献.........................................................30附录部分个人简历、研究生论文.............................................34致谢.............................................................35VII 中英文简略词对照表简略词英文全称中文PDParkinson’sdisease帕金森病GDGaucher’sdisease戈谢病GCase;GBAglucocerebrosidase葡萄糖脑苷脂酶GlcCerglucosylceramide葡萄糖神经酰胺LSDsLysosomalstoragediseases溶酶体贮积障碍性疾病α-synαlpha-synucleinα-突触核蛋白S129serine129丝氨酸129CTSDCathepsinD组织蛋白酶DDAdopaminergic多巴胺能LBLewybodies路易小体THtyrosinehydroxylase酪氨酸羟化酶ALPautophagylysosomepathway自噬-溶酶体途径CMAchaperonemediatedautophagy分子伴侣介导的自噬ALRautophagiclysosomereformation自噬溶酶体重建PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰氨凝胶OCToptimalcuttingtemperaturecompound聚乙二醇和聚乙烯醇混合物i.p.intraperitoneal腹腔注射CBEconduritolβ-epoxide神经酰胺β-环氧化物MPTP1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶＋MPP1-methyl-4-phenylpyridine1-甲基-4苯基吡啶离子t-turntimetoorientdownwards在顶端准备向下爬行的时间t-descendtimetodescendthepole准备向下爬行至到达木杆底部的时间PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液PVDFpolyvinylidenefluoride聚亚乙烯双氧化物膜TBSTTrisbufferedsalinetween洗膜缓冲液NSnosignificance无统计学意义VIII 抑制葡萄糖脑苷脂酶降低组织蛋白酶D引起小鼠帕金森病的机制研究硕士研究生：孙政导师：马建军教授郑州大学人民医院神经内科中国郑州4500031引言帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病，据估计在65岁以上的老年人中，有1-2％的人患有PD[1]。PD患者表现出一系列运动和非运动症状。常见的运动症状有静止性震颤、运动迟缓、姿势异常，非运动症状如抑郁、焦虑、流涎、便秘、嗅觉减退、睡眠障碍、认知障碍和血压降低等[2,3]。PD的主要病理表现为中脑黑质内多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元逐渐丢失以及路易小体（Lewybodies,LB）的出现。LB是细胞内出现的异常的蛋白质沉积体，主要由α-突触核蛋白（alpha-synuclein,α-syn）构成。当黑质中DA神经元丢失70-80％时，PD患者出现运动症状[4]。研究表明α-syn在经过一系列磷酸化、硝基化的过程后，转变为有神经毒性的蛋白，不可以正常被溶酶体水解，沉积在细胞突触前膜，对神经元有毒性作用，诱导PD的发生，其中，丝氨酸129(Serine129,S129)磷酸化α-syn参与α-syn的磷酸化过程，在PD的病理过程中特异性较α-syn高[5]。目前关于α-syn异常积聚诱导PD发病的具体机制仍在研究中。神经细胞内主要靠两大途径维持细胞内蛋白质的稳态，分别是自噬-溶酶体途径（autophagylysosomepathway,ALP）和泛素-蛋白酶体系统，其中ALP是降解α-syn的主要途径[6]。有研究显示，当实验性抑制ALP功能时，α-syn在神经细胞内异常聚集，反之，当ALP功能被实验性增强时，神经细胞内则没有α-syn积聚[7]。还有实验证明，异常积聚的α-syn反过来可能会抑制ALP功能[8]。正常人体细胞内，ALP可以有效降解α-syn，但在PD患者中，ALP功能异常，导致α-syn无法正常清除，而是病理性积聚在神经1 细胞突触前膜内，引起PD症状。国内外研究表明在ALP中，溶酶体功能起重要作用。当溶酶体内水解酶发生变化或者溶酶体数量减少时，溶酶体水解能力下降，神经细胞内蛋白质异常积聚。Murphy等[9]利用Westernblotting检测死亡后的PD患者神经元内溶酶体膜蛋白的水平，发现无论是早期或者晚期的PD患者，其脑内的溶酶体膜蛋白的含量并没有发生改变，提示PD患者中DA神经元丢失、α-syn积聚时，细胞内溶酶体的数量没有发生变化，导致溶酶体功能下降的原因可能是溶酶体内水解酶发生变化。组织蛋白酶D（CathepsinD,CTSD）是一种主要的溶酶体内肽酶，它对长寿命蛋白质的降解至关重要[10]。基因遗传和临床研究表明，CTSD缺陷可能引起一些迟发性进行性神经退行性疾病如PD。溶酶体降解过程异常可以引起溶酶体储存障碍性疾病（Lysosomalstoragediseases,LSDs）。大多数LSD患者有神经症状，如运动功能障碍，智力缺陷和进行性神经变性[11]。戈谢病（Gaucher’sdisease,GD）是最常见的LSD。GBA纯合突变引起GD的发生。GBA负责编码葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GCase;GBA）[12]。GCase是一种溶酶体水解酶，广泛存在于细胞溶酶体内，主要参与鞘脂代谢，可以将葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide,GlcCer）水解为神经酰胺和葡萄糖[13]。当GBA突变时，GCase的含量及活性下降，内脏组织中巨噬细胞内GlcCer不能被正常水解而积累在溶酶体中，使细胞失去原有功能[14,15]。这些病理性巨噬细胞在人体器官中浸润，表现出肝脾肿大、贫血、血小板减少和骨髓浸润等症状。GD按临床表现可以分为3种类型[16]：Ⅰ型最常见，多见于成年人，又称非神经型，主要累及周围器官；Ⅱ型称神经型，婴儿期发病，神经系统受累较重；Ⅲ型起病较Ⅱ型缓慢，可在婴幼儿期发病，内脏和神经系统均受累。近年来，已有研究发现，当GBA杂合突变时，GCase含量和活性下降可能引起PD发生。Migdalska等[17]对年龄在80岁以上且合并GCase缺陷的患者进行随访调查，结果显示有10-30％的患者发展为PD。而对PD患者进行基因检测，发现约10-25％的患者合并GBA突变（Parkinson-GBA）。目前已证实的与PD发生相关的GBA突变位点有2种，分别是N370S和L444P。研究显示80岁以上的携带GBA杂合突变的患者发展为PD的概率是是未携带者的20倍[18,19]。对合并杂合子GBA突变的PD患者死亡后的脑组织进行分析，发现黑质2 神经元内GCase蛋白表达下降58%[20]。导致GCase蛋白水平下降的机制有很多，如老龄化、α-syn积聚、内质网应激及钙失调等，其中α-syn积聚被认为可能是导致GCase下降的主要因素。在散发性PD患者脑脊液和血液样本中也发现GCase蛋白水平及活性有所下降[21,22]。此外，研究显示，在未携带GBA突变的PD患者的大脑中，GCase的活性和蛋白质水平也显著降低[23]。更重要的是，PD-GBA的病理学特征与散发性PD相同，也存在黑质中DA神经元的丢失和和α-syn的异常积聚，因此GCase缺陷被认为是PD发生的危险因素之一。大规模流行病学调查研究显示散发性PD患者脑中GCase的减少与S129磷酸化α-syn的病理性积聚相关，但具体机制仍在研究中。本研究拟在8w的雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP），建造亚急性PD模型[24]，腹腔注射神经酰胺β-环氧化物（conduritolβ-epoxide,CBE），抑制小鼠脑内的GCase水平，利用爬杆试验观察小鼠用药前后运动症状的变化，通过免疫组化、Westernblotting技术，分别观察小鼠黑质内DA神经元数目变化情况以及S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA蛋白水平的变化情况。探讨抑制GCase是否通过降低CTSD，导致溶酶体功能受损，进而引起S129磷酸化α-syn的积聚，导致PD的发生，为PD新药的研发提供依据。3 2材料和方法2.1材料2.1.1实验动物实验用健康雄性C57BL/6小鼠，购置于北京维通利华实验动物科技公司，年龄为6-8w，体重为20-25g。动物房室温维持在24±2℃，湿度维持在55%±15%，给予小鼠充足的水源和饲料，每天8点至20点动物房维持灯光照明。该实验获得郑州大学伦理委员会的批准。2.1.2主要实验仪器小鼠冠状切片脑模具0.55mm深圳瑞沃德生命科技有限公司冰冻切片机Leica,Germany冰冻离心机ThermoFisher,USA超低温冰箱ThermoFisher,USA垂直电泳仪北京六一仪器生物科技有限公司转印电泳仪北京六一仪器生物科技有限公司电脑三恒多用电泳仪电源北京六一仪器生物科技有限公司FlourChemR多功能成像分析系统ProteinSimple,USA光密度扫描分析系统BIO-RAD,USA多功能显微镜Olympus,JapanEP管、移液枪枪头Axygen,USA粘附载玻片江苏世泰公司高品质显微镜盖玻片江苏世泰公司2.1.3主要实验试剂全细胞裂解液RIPA上海生工生物工程有限公司PMSF上海生工生物工程有限公司脱脂奶粉上海生工生物工程有限公司多聚甲醛粉剂上海生工生物工程有限公司4 蛋白磷酸酶抑制剂混合物北京索莱宝科技有限公司Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒北京康为世纪公司10×Tris/Glycine/SDSBufferBIO-RAD,USA10×Tris/GlycineBufferBIO-RAD,USA预染梯度分子量MarkerThermoScientific,USAPVDF膜MerckMillipore,USABCA蛋白定量试剂盒北京康为世纪公司LuminataForteWesternHPRSubstrateMerckMillipore,USA兔SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素北京中杉金桥公司法检测系统）DAB试剂盒北京中杉金桥公司OCT冰冻切片包埋剂Sakura,USABlockerBSAinTBS(10×)ConcentrateThermoScientific,USA无菌1×PBS溶液北京博士德生物公司10×TBST（含0.5%Tween20）缓冲液北京索莱宝科技有限公司5×蛋白上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司丽春红染色液上海碧云天生物技术公司1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Sigma-Aldrich,USAtetrahydropyridine粉剂conduritolβ-epoxide粉剂Sigma-Aldrich,USA兔抗αlpha-synuclein(phosphorS129)Abcam,UK鼠抗CathepsinDAbcam,UK兔抗GBAAbcam,UK兔抗TyrosineHydroxylaseAbcam,UK辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)JacksonImmunoResearchLaboratories,USA辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(H+L)JacksonImmunoResearchLaboratories,USA鼠抗β-actinProteintechGroup,USA2.1.4实验动物分组5 实验动物按照随机数表随机分成以下3组，每组30只小鼠：对照组（Control组）MPTP用药组（MPTPtreatment组）CBE用药组（CBEtreatment组）用于Westernblotting蛋白定量分析的动物，共分3组，即Control组，MPTP组，CBE组，每组n≥6只；用于免疫组织化学实验分析的动物，共分3组，即Control组，MPTP组，CBE组，每组n≥6只。2.1.5小鼠亚急性PD模型制备在MPTP组小鼠模型中，将MPTP粉剂溶于生理盐水中使最终溶液浓度为5mg/ml，分装在EP管内，在-20℃条件下避光保存，腹腔注射MPTP溶液，30mg/kg，连续5天，每天上午9点注射，制备亚急性PD模型。Control组注射同等剂量的生理盐水，连续注射5天，每天上午9点注射。2.1.6小鼠GCase缺陷模型制备在CBE组小鼠模型中，将CBE粉剂溶于去离子水中使最终溶液浓度为20mg/ml，在4℃条件下保存，避免保存时间过久，腹腔注射CBE溶液，200mg/kg，连续2天，每天上午9点注射，制备GCase不足模型[25]。2.2方法2.2.1行为学评估爬杆试验的装置是一根长约50cm的木杆，直径约1cm，将纱布缠绕在木杆上防止小鼠在爬杆过程中打滑，木杆的顶部有一个圆球，木杆的底部放置在干净的木屑上，防止小鼠向下爬行时受伤。该装置可以观察小鼠运动协调性、平衡性及是否存在运动迟缓的现象。当小鼠放置在木杆顶部的圆球上时，小鼠会本能的沿着木杆向下爬行至底部。我们计数小鼠在顶端准备向下爬行的时间（timetoorientdownwards,t-turn）和小鼠从准备向下爬行至到达木杆底部的时间（timetodescendthepole,t-descend）。T-turn数值长短反应小鼠运动的协调性，t-descend数值反应小鼠运动迟缓的程度。在最终测试前，连续5天训练小6 鼠爬杆。在最终测试的那一天，小鼠允许练习2次后进行测试，每次测试包含5次爬杆试验，取5次爬杆试验时t-turn和t-descend的平均值为试验的最终结果。2.2.2提取细胞总蛋白在小鼠行为学测试后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.01ml/g）小鼠。3-5分钟后小鼠麻醉成功，使用精细剪沿双耳连线断头，迅速将大脑完整取出，将取出的大脑置于冰冻磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline,PBS,0.01M,pH=7.4）中。待小鼠脑切片模具、切片刀、EP管放于冰盒内降温一段时间后，将取出的大脑放置于脑切片模具内，沿冠状面切成厚度为1mm的脑片。根据小鼠脑立体定位图谱，选取包含双侧黑质的脑片，在显微镜下用纤维镊分离双侧黑质组织，将取出的组织放在EP管内称重，然后放入液氮罐内冷冻，待组织硬化后，用纤维镊将脑组织完全转移至手持式匀浆器内，并在冰上进行组织研磨，将全蛋白裂解液加入匀浆器内，每100mg组织加入1ml全细胞蛋白裂解液（由全细胞裂解液RIPA、PMSF及磷酸酶抑制剂按体积之比为100:1:1比例混合而成），将组织充分研磨，用移液枪将组织匀浆液吸至EP管内震荡后冰上静置30min，用4℃冰冻离心机离心，转速12000rcf，时间10min，吸取蛋白上清液即为全细胞蛋白，分装蛋白样本于EP管内，进行蛋白定量测定或-80℃保存。2.2.3蛋白浓度测定按北京康为世纪BCA蛋白定量测定试剂盒说明书操作，配置蛋白标准溶液，将蛋白样本和蛋白标准溶液分别加入96孔板内，避免气泡产生，混匀后，在温箱中37℃孵育30min，利用光密度扫描分析系统测定562mm波长的吸光度，根据蛋白标准品吸光度和实际浓度，绘制标准曲线散点图，结合拟合度和公式，计算蛋白样本的浓度。2.2.4Westernblotting方法及步骤1.聚丙烯酰氨凝胶（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）制备：将玻璃板安装在制胶架上，短玻璃板在内侧，长玻璃板在外侧，用去离子水检漏，7 30min后将去离子水沿一侧缓慢倒出，避免玻璃槽内部有残留的水珠。在室温下，按照目的蛋白分子量及凝胶制备说明书分别制备浓度为12%的分离胶和5%的浓缩胶。用移液枪将分离胶沿玻璃板一侧缓慢加入槽内，避免气泡产生，加去离子水覆盖分离胶，加水时动作缓慢，避免将分离胶冲变形，40min后，待分离胶完全凝固，沿一侧将去离子水倒出，缓慢加入浓缩胶，将1.0mm的10孔梳水平插入浓缩胶中制孔，防止气泡产生，静置40min，待浓缩胶凝固后把制胶架放入电泳槽内，倒入电泳液淹没制胶架的铂金丝，双手将梳子水平拔出，开始上样。2.蛋白样品的制备：每组分别取80ug的全细胞蛋白，在冰上与5×蛋白上样缓冲液混匀，离心后95℃水浴5min，每孔使用移液枪加入煮好的蛋白样品。3.电泳：浓缩胶80v恒压电泳约30min，待所有样品跑至同一基线结束浓缩胶电泳，分离胶电泳期间，电压调至100v,电泳时间约为100min，根据蛋白Marker条带指示以及目的蛋白分子量选择结束分离胶电泳时间，关闭电源，终止电泳。4.转膜：电泳完成后，将玻璃板从电泳槽内取出，用去离子水将玻璃板上残留的电泳液冲洗干净，用镊子把玻璃板轻轻撬开，切掉浓缩胶，在一个干净的盘子内倒入转膜液，把玻璃板放在转膜液内，充分浸润，用切胶板沿胶和玻璃板之间轻轻撬动，使分离胶与玻璃板分开，在转膜液内充分浸泡分离胶。根据目的蛋白分子量分别选用孔径为0.22um和0.45um的聚亚乙烯双氧化物（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜，根据分离胶的大小剪相同大小的PVDF膜，然后将PVDF膜浸泡于甲醇，激活PVDF膜，1min后去离子水浸泡5min，转膜液浸泡15min。取厚滤纸2张、纤维垫2块在转膜液内充分浸润，转印夹黑色面朝下放在转膜液内，依次放上纤维垫、厚滤纸、分离胶、PVDF膜、厚滤纸、纤维垫，用玻璃棒轻轻赶走每层的气泡。夹好后，放入转印电泳仪内，转印夹黑色面对电泳仪黑色面，倒入转膜液至淹没转印夹，冰浴下，300mA恒流转印90-120min，根据目的蛋白分子量确定转膜时间。8 5.蛋白免疫反应：转膜完成后，将转印夹从槽内取出，用镊子将PVDF膜放入丽春红染色液3min，用去离子水洗去丽春红，观察PVDF膜上是否出现红色的蛋白条带。用5%的脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温摇床孵育1h。一抗选择及稀释浓度：兔抗α-syn(phosphorS129)（1：2500）、鼠抗CTSD（1:1000）、兔抗GBA（1:500）和鼠抗β-actin（1:2000），一抗稀释液选用5%脱脂牛奶。将一抗倒进孵育盒内，充分覆盖PVDF膜，然后将孵育盒放置在4℃冰箱内过夜。次日将孵育盒放置在室温复温1h后结束一抗反应，回收一抗于EP管内，放置在-20℃冰箱，将TBST（Trisbufferedsalinetween,TBST,ph=7.5）倒入孵育盒内，充分覆盖PVDF膜，孵育盒放置在摇床上漂洗3次，每次5min。在孵育盒内加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(H+L)（1：5000），充分覆盖PVDF膜，二抗稀释液选用TBST。室温孵育2h，倒掉二抗。将TBST倒入孵育盒内，摇床漂洗3次，每次5min。6.曝光：将发光显影液按A液与B液体积之比为1：1的比例均匀混合，将混合液倒入孵育盒内，充分覆盖PVDF膜，然后将PVDF膜放入FlourChem成像系统内自动曝光，读取条带。2.2.5免疫组织化学标本制备使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.01ml/g）。3-5分钟后小鼠麻醉成功，将小鼠呈仰卧位四肢固定在板上。用眼科剪先剪开腹腔，找到膈肌后，剪开膈肌进入胸腔，充分暴露心脏，用灌注针从心尖缓慢插入直至主动脉，进针长度大约3mm，用止血钳固定灌注针，剪开右心耳。用注射器连接灌注针，将4℃生理盐水从注射器内快速注入心脏，冲净全身血液，待右心耳流出的液体由红色变澄清后，换用装有4℃的4%多聚甲醛的注射器灌注，速度先快后慢。待小鼠四肢、颈部僵硬后，结束灌注。沿双耳连线断头取脑，将大脑完整取出，放在4℃的4%多聚甲醛内固定，1d后换用4%多聚甲醛配制的15%、30%蔗糖溶液分别进行梯度脱水，直至脑组织下沉至底部。将固定好的脑组织进行OCT（optimalcuttingtemperaturecompound）冰冻包埋、切片（厚度为15um），取包含黑质的脑片用于后续实验。9 2.2.6免疫组织化学方法及步骤1.将脑片放于装有PBS的24孔板内，摇床上漂洗脑片5min，重复漂洗3次，然后按照兔S-P试剂盒说明书操作；2.将试剂盒中的A液加入24孔板内用于阻断内源性过氧化物酶，充分覆盖脑片，室温反应30min后倒掉A液，换PBS摇床漂洗5min，重复3次；3.将试剂盒中的B液加入24孔板内进行封闭，室温反应1h后倒去B液；4.一抗选择及稀释浓度：兔抗TH（1:2000），一抗稀释液选用包含5%BSA的TBS，加入适量一抗，室温反应1h后，将24孔板放在4℃冰箱里过夜。5.次日将24孔板从冰箱拿出，室温下复温1h后结束一抗，回收一抗，将PBS加入24孔板，摇床漂洗5min，重复6次，然后逐孔加入试剂盒中的C液，室温反应2h后倒去C液，换PBS漂洗5min，重复6次；6.将试剂盒中的D液加入24孔板，室温反应30min后倒去D液，加入PBS漂洗5min，重复3次；7.在24孔板内逐孔加入新鲜配置的DAB显色液进行显色，反应1min后终止显色，倒掉DAB。用勾线笔将脑片平整贴在载玻片上，勿褶皱，风干过夜；8.将贴有脑片的载玻片依次放入浓度为70%、80%、95%及100%的酒精进行梯度脱水，再放入二甲苯透明，用中性树脂、盖玻片封片，使用多功能显微镜阅片、拍照。2.2.7数据处理及统计采用GraphPadPrism6.0进行数据统计分析，所有实验均独立重复3次，结果用均数±标准差表示，多组数据之间的计量资料的比较采用单因素方差分析10 （One-wayANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。11 3结果在本研究中，共使用90只小鼠。其中，因麻醉意外死亡2只，腹腔注射MPTP后死亡5只，腹腔注射CBE后死亡2只。1.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠运动症状的变化在腹腔注射MPTP、CBE后，利用爬杆试验观察小鼠运动协调性、平衡性和是否存在运动迟缓的现象。腹腔注射两种药物后，观察到小鼠出现竖毛、竖尾、静止性震颤、运动迟缓、姿态平衡障碍的现象，表明MPTP组出现亚急性PD的症状，CBE组也出现了与MPTP组类似的症状。与Control组相比，MPTP组和CBE组爬杆试验的时间均增长，其中，t-turn和t-descend的时间与Control组相比，差异有统计学意义（P<0.001,图1A、B）。MPTP组和CBE组相比，两组爬杆时间均增长，但差异无统计学意义（P>0.05,图1A、B）。2.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠黑质内DA神经元的变化为了检测小鼠脑内黑质DA神经元的变化情况，我们应用免疫组化技术检测TH的表达变化。结果显示：在10×、400×镜下，Control组小鼠脑内双侧黑质区分布有TH免疫阳性细胞，形状为圆形或卵圆形，可见轴突从胞体发出，TH蛋白阳性表达位于神经细胞的胞浆，呈棕黄色（图2A、D）。MPTP组和CBE组小鼠脑内黑质区域TH免疫阳性细胞数目减少，排列紊乱（图2B、E；图C、F），与Control组相比，差异有统计学意义(P<0.001)。MPTP组和CBE组相比，两者小鼠脑内TH免疫阳性细胞数目没有统计学意义（P>0.05）。MPTP、CBE药物诱导后，小鼠黑质中DA神经元的数目较之前下降。3.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠黑质内S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA的表达变化采用Westernblotting检测小鼠黑质内S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA的表达水平，使用β-actin作为内参。结果显示S129磷酸化α-syn的目的条带在14kDa处、CTSD的目的条带在28kDa处、GBA的目的条带在56kDa处。与Control组相比，MPTP组和CBE组小鼠CTSD、GBA蛋白表达量均下降（图3A、C、D），差异有统计学意义（P<0.001）。但MPTP组和CBE组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。MPTP组和CBE组的S129磷酸化α-syn蛋白表12 达量明显升高（图3A、B），与Control组相比，差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05），MPTP组和CBE组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。13 4讨论PD是一种复杂的神经系统退行性疾病，以锥体外系运动障碍为主要特征，多累及65岁以上的中老年人。导致PD发生的危险因素如年龄、环境、遗传、基因突变、农药及重金属接触等。PD的发病机制也很多，如ALP、氧化应激、凋亡等。在雄性C57BL/6小鼠中腹腔注射MPTP是模拟亚急性PD病理过程的经典模型之一，该模型稳定可靠，与人类PD病理过程相似，被广泛应用于PD的发病机制、诊断和治疗的研究中。MPTP为一种常见的神经毒素，某些农药中常含有与MPTP化学结构类似的物质，当MPTP透过血脑屏障进入中枢神经系统后，在单胺氧化酶-B的作用下代谢为1-甲基-4苯基吡啶离子（1-＋methyl-4-phenylpyridine,MPP），然后被DA转运体摄取后在DA神经元内聚集，通过促进异常蛋白聚集、氧化应激、损伤线粒体结构功能及影响细胞间信号传递导致神经细胞变性死亡。本实验给雄性C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP（30mg/kg），连续注射5天后，观察到小鼠运动症状改变，表现为竖毛、竖尾、静止性震颤、少动、姿势异常的现象，表明小鼠亚急性PD模型建造成功，这与以往的研究报道相似[24]。而CBE组中的小鼠，腹腔注射CBE（200mg/kg），连续注射2天后表现出与MPTP组小鼠相同的症状，CBE可以抑制细胞内GCase的水平，说明抑制GCase水平后，小鼠也可以出现PD症状。常用的行为学检测有爬杆试验、尾悬挂试验、旋转试验、旷场试验等。爬杆试验是检测PD模型小鼠是否出现运动障碍的定量分析方法之一[26]，国内外众多研究利用爬杆试验分析腹腔注射MPTP后小鼠是否出现PD的运动症状，但尚无研究使用该实验评测腹腔注射CBE后小鼠是否出现PD的运动症状，所以本实验选取爬杆试验分别观察MPTP组和CBE组小鼠的运动情况。爬杆试验结果显示，MPTP组小鼠的t-turn和t-descend时间较Control组延长，其中t-turn、t-descend的数值分别反应小鼠运动协调性及运动迟缓程度，表明MPTP组小鼠出现运动迟缓、姿势平衡异常的PD症状，与以往的研究报道类似[27]。与Control组相比，CBE组小鼠的t-turn、t-descend数值增加，说明CBE组小鼠也出现PD的运动缺陷症状。既往研究显示，抑制GCase水平可以出现PD14 症状[28]，GCase减少是PD发病的原因之一[17]，本研究使用CBE抑制神经元细胞内GCase水平，同样出现PD症状，与国外研究结论一致。研究证实当PD患者出现运动症状时，黑质DA神经元已经出现变性和丢失[4]。TH是儿茶酚胺类活性物质合成的限速酶，在DA的合成中起重要作用，TH在黑质中活性的强弱和表达水平的高低可以直接影响DA的合成，TH的变化直接影响PD的发生及发展。为检测小鼠腹腔注射MPTP和CBE后黑质内DA神经元的变化情况，本研究通过免疫组化技术计数细胞内TH免疫阳性细胞数量。免疫组化结果发现MPTP组TH免疫阳性细胞数量减少，排列紊乱，表明黑质内DA神经元存在丢失的现象。研究表明当黑质内DA神经元数量丢失70-80%时，DA的含量就会降至正常的30%，而出现PD的症状[4]。本实验MPTP组小鼠在爬杆试验中表现出运动缺陷症状，与黑质内DA神经元丢失情况一致。CBE组小鼠中，TH免疫阳性细胞数目与Control组相比下降，说明抑制GCase表达后，引起黑质内DA神经元的丢失，这与PD的病理特征一致，而DA神经元的丢失程度也与小鼠的运动症状严重程度一致。进一步证实抑制GCase水平后，可以导致PD的发生，正常细胞内α-syn通过ALP在溶酶体内降解，ALP参与神经细胞内蛋白的稳定，其过程涉及自噬生成、自噬成熟和溶酶体降解三个主要过程。其中溶酶体降解在整个过程中发挥最主要的作用。溶酶体降解是指自噬溶酶体内的酸性水解酶将各种大分子物质水解的过程，这个过程受自噬成熟及溶酶体降解能力调控。当溶酶体数量以及内部水解酶发生变化时，溶酶体降解能力发生改变。CTSD是溶酶体内的酸性水解酶之一，在中枢神经系统的蛋白降解过程中，发挥至关重要的作用。当CTSD的蛋白表达下降时，可以提示溶酶体蛋白降解功能受损[10]。在PD患者中，已有研究证实，ALP功能出现损害[29]。Murphy等[9]利用Westernblotting检测死亡后的PD患者神经元内溶酶体膜蛋白的水平，发现无论是早期或者晚期的PD患者，其脑内的溶酶体膜蛋白的含量并没有发生改变，提示PD患者中DA神经元丢失、α-syn积聚时，细胞内溶酶体的数量没有发生变化，导致溶酶体功能下降的原因可能是溶酶体内水解酶发生变化。有研究表示α-syn经过磷酸化、硝基化的修饰后，形成有毒性的不可降解的蛋白聚集体，沉积在细胞突触前膜，导致突触功能障碍，影响DA的释放[30]，引起中枢神经系统的功能障碍，导致PD的出现。动物模型发现在一些核蛋白疾病中，磷酸化α-15 syn的积累在疾病的发生中发挥主要作用[31,32]。在PD患者脑内，LB内磷酸化α-syn占总α-syn的90%[5,31]，所以本研究选择检测黑质内S129磷酸化α-syn水平反应PD的发生和发展。在本实验中，通过Westernblotting检测，发现与Control组小鼠相比，MPTP组小鼠黑质神经细胞内，CTSD蛋白含量下降，而S129磷酸化α-syn的水平升高，进一步表明溶酶体水解功能受损导致S129磷酸化α-syn积聚。GCase含量下降是PD发生的危险因素之一，在PD患者脑内神经元、脑脊液以及血液样本中检测出GCase水平和活性的下降。本实验通过Westernblotting检测，发现MPTP组黑质内GBA蛋白的表达下降。Michael等[33]在尸检后的PD患者脑内也发现GCase蛋白下降，与本实验结果一致。在CBE组小鼠中，由于CBE可以化学性抑制GCase的表达，Westernblotting检测到GBA的含量下降。同时，研究发现CBE组小鼠中，黑质内同样存在S129磷酸化α-syn的聚集，CTSD的表达含量下降。抑制GCase后，S129磷酸化α-syn聚集，说明在CBE组中，细胞内S129磷酸化α-syn代谢的平衡被打破，细胞不能正常地降解蛋白。当用CBE抑制细胞内的GCase水平时，溶酶体的形态发生改变、PH值增加，溶酶体内的酸性水解酶也发生改变[34-38]。本研究显示CBE组CTSD的表达减少，表明溶酶体的水解能力下降，溶酶体功能受损。此外，Cullen等[39]发现合并CTSD表达缺陷的绵羊中，磷酸化α-syn沉积在中枢神经系统细胞内，在正常的绵羊中没有出现这种情况。Bae等[40]也发现CTSD表达的降低导致溶酶体功能障碍和α-syn聚集。还有实验显示，当小鼠合并CTSD缺陷时，比野生型小鼠更容易受到MPTP神经毒性作用的影响[41]。在PD患者神经细胞内同样检测到低表达的CTSD[39,42]。当GCase受到抑制时，CTSD的含量降低，溶酶体的水解功能下降，大量S129磷酸化α-syn沉积在细胞内，对中枢系统神经起到毒性作用，同时黑质内DA神经元丢失，两个因素共同使小鼠表现出PD症状。综上所述，本研究在雄性C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP后，溶酶体水解功能下降是黑质区S129磷酸化α-syn沉积的原因；当小鼠注射CBE时，黑质内GCase表达下降，同时CTSD的含量降低，引起S129磷酸化α-syn聚集，DA神经元丢失，最终小鼠出现PD症状。进一步对GCase的具体机制进行研究，可以为PD的发病机制及治疗提供新的方向和思路。16 5结论1.溶酶体水解功能下降是黑质区S129磷酸化α-syn沉积的原因。2.GCase的水平降低是发生PD的危险因素之一。3.抑制GCase蛋白水平时，通过降低CTSD的含量引起黑质区S129磷酸化α-syn聚集和DA神经元丢失，导致小鼠出现PD症状。17 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附图图1.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠运动症状的变化图1A为Control组、MPTP组、CBE组小鼠爬杆试验中从顶端向下准备爬行的时间（timetoorientdownwards,t-turn），图1B为小鼠从准备向下爬行至到达木杆底部的时间（timetodescendthepole,t-descend）。与Control组相比，MPTP组和CBE组爬杆试验的时间均增长，其中，t-turn和t-descend的时间与Control组相比，差异有统计学意义（P<0.001,图1A、B）。MPTP组和CBE组相比，两组爬杆时间均增长，但差异无统计学意义（P>0.05,图1A、B）。***P<0.001,NS(nosignificance,P>0.05)。21 图2.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠黑质内DA神经元的变化应用免疫组化技术检测黑质TH的表达来反应DA神经元的变化。图2A、B、C为10×镜下，Control组、MPTP组、CBE组TH的免疫组化结果，图2D、E、F为相应组黑质区黑框内400×镜下的TH阳性细胞放大图。图2G为Control组、MPTP组、CBE组黑质区TH免疫阳性细胞计数。***P<0.001,NS(nosignificance,P>0.05)。22 23 图3.腹腔注射MPTP、CBE后小鼠黑质内S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA的表达变化图3A为Control组、MPTP组、CBE组黑质区S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA的蛋白表达变化，使用β-actin作为内参。图3B、C、D为S129磷酸化α-syn、CTSD、GBA的蛋白定量分析图。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,NS(nosignificance,P>0.05)。24 综述葡萄糖脑苷脂酶与帕金森病孙政综述马建军审校帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种复杂的神经系统退行性疾病。已有研究表明，在散发性PD患者中，约10%的患者与基因突变有关，在过去的20年里，目前已知的与PD相关的突变基因有20种。有研究指出GBA基因突变不仅可以引起戈谢病（Gaucher’sdisease,GD）的发生，还可以导致PD[1]。GBA基因负责编码葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GCase;GBA），它是一种溶酶体内的水解酶，主要参与鞘脂代谢[2]。当发生GBA突变时，GCase表达下降，需要降解的底物沉积在细胞内，引起疾病的发生。GBA突变被认为是PD发生的最重要的危险因素之一。GBA突变携带者出现PD的可能的分子机制多种多样，如细胞内的α-突触核蛋白（αlpha-synuclein,α-syn）沉积、自噬-溶酶体途径（autophagylysosomepathway,ALP）功能异常、内质网应激、GCase的底物沉积等。至少有5%的PD患者存在GBA突变，且脑内GCase的含量及活性下降。但在没有合并GBA突变的PD患者脑内，也发现了GCase表达缺损[3]。细胞和动物实验表明，当实验性的提高GCase的表达时，细胞内α-syn的水平降低[4]。本文就GCase与PD的关系做一综述。1GCase的生物学特征GCase即葡萄糖脑苷脂酶，也称葡萄糖神经酰胺酶、葡萄糖苷酯酰鞘氨醇酶）是一种酸性水解酶，广泛存在细胞溶酶体内，主要参与鞘脂代谢。GCase使葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide,GlcCer）水解为葡萄糖和神经酰胺。神经酰胺可以作为细胞信号传递的第二信使，也是一些鞘脂复合物的前体，如糖鞘脂类（比如GM1，GM2，GM3神经节苷脂）和鞘磷脂[2]。GCase由GBA基因编码，GBA基因位于1号染色体q21上，长度为7.6kb，包含11个外显子和10个内含子，编码497个氨基酸组成的蛋白质，分25 子量约62kDa。纯合GBA突变导致GD的发生，GD是常见的溶酶体贮积障碍性疾病（Lysosomalstoragediseases,LSDs）。据研究报道GBA突变患者一般存在点突变、插入、缺失、框架移位、剪接位点改变等。GBA突变导致GCase减少或缺乏，内脏组织中巨噬细胞内GlcCer不能被正常水解而积累在溶酶体中，使细胞失去原有功能[5,6]。这些病理性巨噬细胞在人体器官中浸润，表现出肝脾肿大、贫血、血小板减少和骨髓浸润等症状。GD按临床表现可以分为3种类型[7]：Ⅰ型最常见，成年人好发，又称非神经型，主要累及周围器官；Ⅱ型称神经型，婴儿期发病，神经系统受累较重；Ⅲ型起病较Ⅱ型缓慢，可在婴幼儿期发病，内脏和神经系统均受累。2GCase与PDPD是常见的神经系统退行性疾病。典型病理特征是黑质内多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元的丢失和路易小体（Lewybodies,LB）出现。LB是细胞内出现的异常蛋白质沉积体，主要由α-syn构成。α-syn常聚集在突触前膜，不仅对神经元有毒性作用，对突触功能和细胞信号传递也有影响，导致PD发生。当黑质内DA神经元丢失70-80%时，出现PD的运动症状[8]。PD的临床表现分为运动症状和非运动症状，常见的运动症状是运动迟缓、静止性震颤、姿势异常[9]。研究认为尽管Ⅰ型GD患者不会累及神经系统，但国内外研究发现部分GD患者表现出与PD相同的病理特征和症状[10,11]。Sidransky等[12]进行了一项为期数年的多中心大规模临床研究，研究入组患者包含5691名PD和GD患者、4898名健康志愿者，发现PD和GBA突变之间存在一定关联性。合并GBA突变的患者更容易患PD[1]。目前已发现的GBA突变位点有326个，其中与PD发生相关的突变位点有2种，分别是N370S和L444P。研究显示80岁以上的携带GBA杂合突变的患者约有10-30%的几率发展为PD，是未携带突变者的20倍[13,14]。对合并杂合子GBA突变的PD患者死亡后的脑组织进行分析，检测到黑质神经元内GCase蛋白表达下降58%[3]。GCase蛋白表达下降的危险因素有很多，大家公认的机制是老龄化、α-syn积聚、溶酶体功能缺陷、内质网应激及钙失调等。LAMP1、LAMP3及LIMP2为常见的溶酶体膜蛋白，Murphy等[15]利用Westernblotting检测死亡后的PD患者神经元，发现无论是早期或者晚期的PD患者，其脑内的溶酶体膜蛋白的含量并没有发生改变，26 提示PD中DA神经元丢失、α-syn积聚时，细胞内溶酶体的数量没有发生变化。因此细胞内GCase含量下降、导致α-syn积聚的原因并不是溶酶体数量的减少。早期PD患者溶酶体功能障碍可以通过一些溶酶体蛋白的改变体现。在散发性PD患者脑脊液和血液样本中也发现GCase蛋白水平及活性有所下降[16,17]。所以我们设想可以通过检测血液和脑脊液中GCase的表达诊断早期的PD患者。老龄化是PD的危险因素之一，有研究表明随着年龄的增长，GCase的水平也逐渐降低。在人类和小鼠模型中，研究表明随着年龄的增长，发现黑质、纹状体和壳核等中脑区域内，GCase蛋白水平及活性均下降[18,19]。猕猴与人类相同都是灵长类动物，与人体机能最相似，随着猕猴年龄的增长，在猕猴的纹状体和海马内，同样发现GCase蛋白水平下降，α-syn、S129磷酸化α-syn的积聚[20]。在DA神经元中，线粒体功能障碍和氧化应激也可能导致GCase活性的下降。Burbulla等[21]发现氧化应激可以引起DA的氧化，继而抑制GCase活性，导致溶酶体功能障碍。3GCase与α-syn的代谢神经细胞内存在两大主要降解途径来维持细胞内蛋白质的稳态，分别是自噬-溶酶体途径（autophagylysosomepathway,ALP）和泛素-蛋白酶体系统[22]。其中ALP为降解α-syn的主要途径。ALP的整个过程包含自噬生成、自噬成熟和溶酶体降解三个部分。溶酶体降解功能在ALP中起主要作用[23]。溶酶体降解指自噬溶酶体与溶酶体表面融合通过胞吞途径进入溶酶体，在水解酶的作用下降解后的产物转移回细胞质循环使用，用于细胞成分的合成或能量的生产[24]。研究显示巨自噬和分子伴侣介导的自噬（chaperonemediatedautophagy,CMA）功能受损参与了α-syn积累、聚合和细胞间的传递[24]。蛋白错误折叠、降解过程障碍都可以导致α-syn异常沉积在突触前膜[25]。但降解过程障碍是主要的影响因素。影响溶酶体降解过程的主要因素为溶酶体数量和溶酶体水解功能。国内外研究结果显示，溶酶体功能障碍和PD的发生有密切联系，而GCase作为溶酶体内的一种水解酶，与PD之间也存在一定关联。GD的病理特27 征和PD相同，也可以出现α-syn异常沉积。Mazzulli等[4]报道了GCase和α-syn之间的双向作用的关系。使用免疫荧光技术检测携带GBA突变的DA神经元，结果显示α-syn的荧光表达增强，但酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）荧光表达减弱[26,27]。采集携带杂合GBA突变PD患者的脂肪干细胞，检测到α-syn的水平表达增加[28]。已有研究显示当ALP功能受损时，α-syn含量将逐渐增加[29]。Braak等[30]提出，脑内LB的扩散是因为α-syn细胞间的传递，影响PD的病程进展。Bae等[31]在SH-SY5Y细胞群中，用锌指核酸酶技术抑制GBA的表达，发现溶酶体功能受损，α-syn水平增加。Magalhaes等[32]在小鼠皮层神经细胞内，腹腔注射神经酰胺β-环氧化物（conduritolβ-epoxide,CBE）抑制GCase水平，结果显示巨自噬通量下降，并且α-syn水平增加。当用CBE抑制细胞内的GCase水平时，巨自噬通量下降，溶酶体的形态发生改变、PH值增加，溶酶体内的酸性水解酶也发生改变[4,31-34]。综上所述，当GCase受到抑制时，巨自噬通量下降，ALP中溶酶体功能受损，长寿命和短寿命蛋白水解过程受到抑制，细胞内α-syn含量逐渐增加[4,28,33]。但还没有研究显示GCase缺乏时，CMA是否受到影响。尽管溶酶体内GCase的下降影响了α-syn的代谢，但是具体的机制仍在研究。当GCase在内质网翻译修饰后，与转运蛋白LIMP2结合运送至高尔基体，最后转运至溶酶体，转运时同时进行若干次糖基化修饰[35-37]。正常人类皮层神经元内出现α-syn积聚时，经过糖基化修饰的GCase含量下降，最后在溶酶体内形成的成熟的GCase含量也随之下降。在散发性PD患者脑内，α-syn水平与GCase也存在负相关[15]。Fishbein等[38]在小鼠模型中，抑制α-syn的表达后，GCase的蛋白含量及活性均提高。但当用腺病毒过表达人类A53T基因后，α-syn含量增高，GCase的蛋白含量及活性下降[39]。在一些细胞模型中，过表达α-syn后，同样检测到GCase蛋白水平及活性的下降[27,40,41]。但也有研究发现当小鼠模型过表达人类α-syn蛋白时，GCase含量及活性并没有发生变化[42]。已有实验结果证实α-syn阻扰GCase从内质网向高尔基体的转运过程[43]。还有研究提出另外一种假设，细胞内增高的α-syn水平可能引起内质网应激，继而影响GCase向溶酶体的转运过程[44]。表明增高的α-syn水平可能抑制溶酶体分泌成熟的GCase的过程。GCase缺陷导致ALP受损的另一种机制可能是通过自噬溶酶体重建28 （autophagiclysosomereformation,ALR）[45,46]。在巨自噬过程结束后，自噬小体已经被溶酶体吞噬成为自噬溶酶体，原始溶酶体小管从自噬溶酶体中凸出，小管逐渐发育成熟为功能性溶酶体，最后恢复功能完整的溶酶体，在这个过程中，mTOR发挥重要作用[45,47]。Kinghorn等[48]在果蝇模型中敲除GBA基因后，GCase水平下降，细胞内mTOR活性降低，ALR过程受到抑制。Magalhaes等[32]在SH-SY5Y细胞群及神经元细胞内，当GCase活性下降时，ALR过程受损，巨自噬通量下降，细胞内S129磷酸化α-syn的水平增加。由于GCase参与鞘脂代谢，当GCase下降时，GlcCer水解过程受影响而沉积在细胞内，水解产物也相应减少，细胞内脂质组成发生变化，可能影响细胞自噬及溶酶体功能，具体是GlcCer沉积或其他脂质的变化尚不清楚。在小鼠GD模型中，发现α-syn和GlcCer的含量均增加[18,49,50]。但Gegg等[51]在携带杂合子GBA突变的患者体内，并没有发现GlcCer含量增加。Boutin等[52]在散发性PD患者的大脑中，GCase活性下降，但GlcCer含量却没有发生变化。这些研究都是在死亡后的人体组织中进行，死亡后组织中多是神经元和神经胶质的混合物，可能只有特定的细胞类型才可积聚GCase底物，或者亚细胞位置的细微变化也可能对α-syn的代谢产生影响。所以，在未来的工作中，对携带杂合子GBA突变的PD患者，GlcCer含量是否变化有待我们进一步研究。4展望GBA突变是PD的危险因素，在散发性PD患者中GCase蛋白含量及活性均下降。因此恢复GCase的含量及活性可能是药物开发的新目标。可以尝试酶替代疗法，外源性补偿GCase的含量来补充内源性的酶的不足，但是由于GCase属于大分子蛋白质，不能顺利透过血脑屏障到达中枢神经系统，虽然可以有效治疗Ⅰ型GD患者，但是治疗合并神经系统受累的Ⅱ、Ⅲ型GD患者无效，也不适合PD患者的治疗。直接补充大分子蛋白质治疗效果有限，我们猜测是否可以通过慢病毒载体将GBA有效的整合到宿主染色体上，从而达到在宿主细胞内蛋白持久、稳定表达的效果。有研究已经在GD的小鼠模型中，将GBA通过慢病毒载体介导，体内注射至神经元，使细胞持续性表达GCase，结果显示这一方法有效的补充了细胞内GCase的含量，且减少了α-syn的积聚，改善了模型小鼠的症状[49,53]。29 Morabito等[39]在小鼠模型中，过表达人类A53T基因，使小鼠脑内α-syn沉积，诱导PD发生，然后静脉注射整合有GBA的AAV病毒，结果显示GCase含量增高，脑内沉积的α-syn含量下降，PD症状明显减轻。这些实验结果说明，体内注射携带GBA的病毒载体，可以补充细胞内GCase含量，减少α-syn沉积，有效改善GD和PD症状。但是该疗法也存在不足之处，病毒载体在皮层、海马、小脑和脊髓中神经元传递效果非常好，但传递到黑质神经元的数量非常有限，可能不能达到完全治愈PD的目的。Sardi等[54]认为当GCase缺乏时，GlcCer不能完全水解，沉积细胞内诱导疾病的发生，他们在小鼠的GD模型和过表达人类A53T基因的模型中，给予GlcCer合成酶的抑制剂GZ667161，结果发现当降低GlcCer水平后，α-syn聚集体的含量减少。还有一些研究提出分子伴侣可以结合内质网内突变的GCase，帮助它们再折叠，糖基化后向溶酶体转运，最后在溶酶体内形成成熟的GCase。这个治疗方法不仅改善了溶酶体功能，降解α-syn，而且减轻内质网应激。研究证实氨溴索可以作为分子伴侣，增加细胞内GCase的活性[55]。Suzuki等[56]在果蝇的GD模型中发现，氨溴索可以减轻内质网应激，缓解运动缺陷症状。Migdalska等[57]携带杂合子L444PGba突变的小鼠PD模型中，给予小鼠口服氨溴索，发现脑干、中脑、皮层内GCase的活性增加；而在野生型小鼠模型中，口服氨溴索也可以增加脑内GCase活性。推测氨溴索能作为散发性PD的治疗药物。进一步研究GCase在散发性PD中的作用机制，将丰富对GCase和溶酶体功能的认识，为临床治疗PD提供新靶点。30 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个人简历、研究生论文个人简历姓名：孙政性别：女民族：汉族出生年月日：1991年10月20日籍贯：河南省郑州市学历：研究生学位：硕士院校：郑州大学人民医院专业：神经病学导师：马建军研究方向：帕金森病研究生论文1、ZhengSun,ChengChang,Jian-JunMa,etal.InhibitionofGlucocerebrosidaseleadstoParkinson’sdiseaseandAccumulationofserine129phosphorylatedalpha-synucleininMiceviaDecreasingCathepsinD,NeurochemicalResearch,(submitted).2、孙政,闫维维,马建军,等.吡贝地尔对早期帕金森病患者不同睡眠障碍类型的治疗作用.中华实用诊断与治疗杂志,2018,32(4):385-387.3、孙政,杜小静,马建军,等.帕金森病抑郁对不同运动亚型帕金森病患者生活质量的影响.中华老年心脑血管病杂志,(submitted).4、杜小静,孙政,马建军,等.流涎对帕金森病患者生活质量的影响.中华老年心脑血管病杂志,2017,19(3):288-291.5、杜小静,马建军,孙政,等.长期睡眠剥夺与帕金森病的相关性研究.中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(4):361-363.6、杜小静,孙政,马建军,等.吡贝地尔对早期帕金森病患者不同记忆亚型的影响.中华老年心脑血管病杂志,2017,19(8):809-811.35 致谢时光如白驹过隙，不知不觉间，在郑州大学人民医院三年的学习生活即将进入尾声。此时此刻，内心期盼又不舍。期盼的是即将走上工作岗位，人生将开启新的篇章，不舍的是，校园学习生活即将结束。仅藉此机，谨向所有关心帮助我的各位老师、师兄师姐、师妹及同学们致以最真诚的感谢！衷心感谢我的导师马建军教授，三年来，在临床学习、课题设计、科研工作、论文撰写的方方面面，您都给予了我悉心的指导和无私的奉献。您严谨的治学、谦卑的为人、和蔼的态度，深深的影响着我。您的治学态度和坚韧的探索精神将使我终生受益，是我学习的楷模。恩师如父，您对我无微不至的关怀如同涓涓暖流，学生终生难以忘怀。借此机会衷心感谢河南省人民医院神经内科李学主任、杨红旗主任、祁亚伟老师、吴少璞老师、李东升老师在临床实践中对我给予的指导和帮助！衷心感谢郑州大学基础医学院解剖教研室的常成教授在基础实验、论文撰写上提供的指导和帮助！感谢河南省人民医院神经内科全体医护人员对我的帮助！衷心感谢陈思远师姐、杜小静师姐、古祺师姐、赵振向师兄对我实验方向及具体操作的指导和帮助！衷心感谢闫维维师妹、李林忆师妹对我学习和生活上的帮助！衷心感谢室友李俊利、王菲、魏莉莉、陈盼盼、秦芸芸、许倩、张冲冲、朱智瑞、卫淑芳在日常生活中的悉心照顾！衷心感谢郑州大学人民医院研究生处及河南省人民医院科研外事处的老师的辛勤培养和教育！衷心感谢在我学习期间一直给予我大力支持和理解的家人！最后向在百忙之中抽出时间参与论文评阅的各位专家、老师及同学致以深深的谢意！谢谢！36
