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對娥码：１０２８５０１３４２柳２学号；２４系１牡考ＡＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹｉｉｉｉｉ＾＾ｎｎ、＂＂＇：？＾ｌ：＇＊２聖尿碱細創恤施肝与颈动＾＇＇ｍｍ脉粥欄似朕性醒察Ｈ＾ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｅｍｍｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒａｎｄ＿．，＾＿＇ｓｕｂｃｌｌ：ｈｉｉｎｉｉｈｉｉｎｋａａｌｅ阳ｓｃｌｅｒｏｓｓｐａｔｅｎ怯ｗｌ：ｔｅ２ｄａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｔｙｐｉｕｓ研究生姓名周颖异指导教＂巧姓名成兴波巧专业名称内科学（内分泌与代谢病学）研究方向糖尿病及其并发症的基础与临床所在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期２０１６年５月 苏Ｉｔ大学学値论交讓翻牲黃醜本人鄭重声骄辦纏樂雜攀鞍旅文摆本乂藝辱ＩＩ饒？＃下，戮立雞耗辩究工锥新漱鑛齡彌黨６餘文申色銳紙顯副用煎尚霉辨，东论文不會其銳个Ａ纖雜Ｂ鑑器讓藻誘霉城ｉｌｉｆ麵乘，擴不镶秀戴得苏嫌犬学或藏食截驚挑機猶学衛拖带前德用过鑛縣料。綺乘义雜曆究作：ｉ霊要戴雜鱗个人煎集雜，銷巧崔文带踐額纖方或灘頸窃杀入承渔本声觀餘攘律蠻焦。．－襄＾雜兼雅繁盤篇ＩＨ期立簿怒１同！多ｊ＾；－ 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察中文摘要2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察中文摘要目的：探讨2型糖尿病（T2DM）患者血清血管性血友病因子(vWF)与颈动脉粥样硬化(AS)的相关性。通过分析vWF与糖脂代谢及炎症因子的相关性，为阐明其在2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化形成过程中所起的作用提供一定的理论依据，探讨其作为糖尿病颈动脉粥样硬化早期诊断、干预及治疗靶点的可能性。方法:根据彩色多普勒超声仪检查双侧颈动脉的结果，将120例2型糖尿病患者分为T2DM无颈动脉粥样硬化组（T2DM+NAS组，60例）、T2DM合并颈动脉粥样硬化斑块组（T2DM+AS组，60例）；同期门诊健康体检者56例为正常对照组（NC组）。测量血压、身高、体重、空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（HbAlc）、超敏C反应蛋白（hsCRP），并计算体重指数（BMI）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（ELISA）检测所有受试者血清vWF浓度。结果：（1）三组比较，T2DM+AS组、T2DM+NAS组血清vWF水平（57.29±8.18，51.18±8.42）pg/mL均显著高于NC组（45.43±7.67）pg/mL（P<0.05），T2DM+AS组血清vWF水平显著高于T2DM+NAS组（P<0.05）。（2）单因素相关分析结果显示血清vWF水平与TG、hsCRP、SBP、FBG、HbA1c呈正相关(r分别为0.20、0.27、0.210、0.504、0.44，P<0.05)，与HDL呈负相关（r=-0.28,P<0.05）。（3）Logistic回归分析显示vWF为颈动脉粥样硬化的风险预测因子。结论：（1）vWF在T2DM不合并颈动脉粥样硬化患者的血清中表达已增多，在T2DM合并颈动脉粥样硬化斑块的患者血清中表达进一步增多，提示vWF可能参与了2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的早期形成，促进了动脉粥样硬化斑块的发生、发展，或可作为2型糖尿病患者测颈动脉粥样硬化的一个早期指标。（2）相关分析显示vWF水平与TG、hsCRP、SBP、FBG、HbA1c呈正相关，且FBG、HDL-C为独立影响因素，提示良好控制血压、空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂或可使T2DM患者血清vWF水I 中文摘要2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察平下降，从而延缓颈动脉粥样硬化的发生、发展。关键词：2型糖尿病；血清血管性血友病因子（vWF）；颈动脉粥样硬化作者：周颖异指导老师：成兴波II 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察英文摘要AssociationbetweenserumvonWillebrandfactorandsubclinicalatherosclerosisinpatientswithtype2diabetesmellitusAbstractObjective：ToinvestigatethevalueofserumvonWillebrandfactor(vWF)asamarkerofsubclinicalatherosclerosisbydeterminingthecarotidintima-mediathickness(IMT)inpatientswithtype2diabetes.ToprovidecertaintheoreticalbasisonclarifyingtheroleofintheformationofarteryplaqueinT2DMpatientsbyanalyzingthecorrelationofvWFandglucolipidmetabolismandinflammatoryfactor.ToexplorethepossibilityofvWFasanewtargetspotforearlydiagnosis,interventionandtreatmentinT2DMpatientswithmacroangiopathy.Methods：UltrasonographicmeasurementofbilateralcarotidarteryIMTwasperformedfor120type2diabetespatients,andpatientsweredividedintogroupsaccordingtoacarotidIMT≥1.5mm(n=60)and<1.0mm(n=60).Fifty-sixhealthyparticipantswereincludedasacontrolgroup.Patients’demographicdataandbaselinecharacteristicswerecollected.Pearsoncorrelationtestsandassessmentusingforwardstepwisemultivariateregressionwereperformed.Results：SerumvWFlevelsindiabetespatientswithacarotidIMT<1.0mmweresignificantlyhigherthanthoseinhealthycontrols,butlowerthanthoseindiabetespatientswithacarotidIMT≥1.5mm(P<0.05).TheserumvWFlevelwaspositivelycorrelatedwiththelevelsoftrigelyceride(r=0.20,P=0.042),highsensitivityC-reactiveprotein(r=0.270,P=0.011),systolicbloodpressure(r=0.210,P=0.049),fastingplasmaglucose(FPG,r=0.504,P<0.001),andhemoglobinA1c(r=0.44,P<0.001)andnegativelycorrelatedwithhigh-densitylipoproteincholesterol(HDL-C,r=-0.28,P=0.008).vWFlevels、HbA1candHDL-Cwereindependentlyassociatedwithcarotidplaquesintype2diabetespatients.Conclusion：ElevatedserumlevelsofvWFmayberelatedtoanincreasedriskofdevelopingcarotidplaquesintype2diabetespatients,andthus,theserumvWFIII 英文摘要2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察levelmayrepresentasystemicbiomarkerofsubclinicalatherosclerosisforsuchapopulation.Keywords：type2diabetesmellitus；vonWillebrandfactor(vWF)；carotidatherosclerosisWrittenby:ZhouYingyiSupervisedby:ChengXingboIV 目录前言.................................................................1资料与方法..............................................................4结果.................................................................9讨论................................................................15结论................................................................18参考文献...............................................................19综述血管性血友病因子的研究进展.....................................22中英文对照缩略词表.....................................................34攻读硕士期间公开发表论文...............................................36致谢................................................................37V 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察前言前言糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一种常见的全球流行性慢性内分泌和代谢性疾病，该病及其并发症的发病率、患病率和死亡率均随着经济的发展、城市化进程、人口老龄化和生活饮食方式等的改变在不断地增长，并造成了巨大的社会经济负担。根据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）的最新数据，中国[1]2014年DM的患病人数为9629万人，居全球首位，其次为印度（6685万人），之后为美国（2580万人），由此表明我国已经成为世界上糖尿病患病人数最多的国[2]家。2014年根据IDF报告，我国DM患者达9629万（其中2型DM占93.7%），患病率为9.3%。根据2002年数据统计分析，我国DM患病率的高峰年龄为70～89岁。此外，2002年31个省市自治区的调查显示，儿童、青少年的DM患病率已接近美国[3]等发达国家，应引起重视。世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）的有关资料表明，DM的患病率、致残率和病死率以及对总体健康的危害程度，已居于慢性非传染性疾病的第3位，DM及其并发症所造成的死亡人数也已居于世界死亡原因[4]的第5位。有数据表明2008年全国糖尿病病人直接疾病经济负担为677.52亿元，其中直接疾病经济负担中直接医疗费用为630.89亿，非医疗直接费用为46.63亿元。根据卫生服务调查中的未就诊及未住院率还估算出我国2008年糖尿病产生潜在卫生服务需求为145.09亿元。由此可以看出无论是健康损失还是经济损失，糖尿病给我国居民带来了巨大的疾病负担。[5]2型糖尿病的主要死亡原因为大血管病变，即大血管动脉粥样硬化。糖代谢异常的人群动脉粥样硬化发病年龄较小，在糖尿病诊断前，患者的心脑血管事件危险已[6]经是正常人群的3倍，甚至在2型糖尿病诊断之前15年已经倍增，故早期发现和[7,8]干预动脉粥样硬化在2型糖尿病中有着重要意义。大量研究证实，内皮功能损伤是动脉粥样硬化的始动因素和核心环节。[9,10]血管性血友病因子（vWF）是由内皮细胞和巨核细胞合成的糖蛋白,其合成基因位于第12号染色体,其相应的mRNA碱基数目为8500~9000个,内含有合[11]成2818个氨基酸肽链(前vWF原)的密码。vWF也是一种大分子蛋白多聚体，可同时与胶原纤维和血小板结合，当血管破裂时大量血小板以vWF为中介，粘附在胶原纤维上，形成血栓，得以止血。在正常的生理条件下,vWF绝大部份由内皮细胞合成,1 前言2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察其余则由巨噬细胞生成。前者产生后多储存在W-P小体（Weibel-Paladebody，WPB）[12]内,后者则储存在血小板的颗粒中。[13,14]有研究曾经报道vWF与心血管事件有关。并在糖尿病血管病变及动脉粥样硬[15]化的发生发展中起重要作用。一项历时10年的前瞻性研究表明,vWF是与大血管病变死亡率相关的危险因素之一,合并冠心病者较不合并冠心病者的vWF显著升高。动[16]物实验发现,给动物高胆固醇饮食诱发显著的主动脉粥样硬化时,缺乏vWF的同种对照动物(患有vonWiIlebrand病动物)却未发生主动脉粥样硬化,这也提示vWF水平升高是促进血管并发症发生发展的危险因素。因此，需要进一步研究探索其与糖尿病大血管病变发病机理，有助于提高糖尿病大血管并发症的防治水平。目前有关在T2DM中vWF与颈动脉粥样硬化相关性研究的报道较少。本文旨在探讨2型糖尿病（T2DM）患者血管性血友病因子（vWF）与颈动脉粥样硬化(AS)的相关性，为阐明其在T2DM患者颈动脉粥样硬化发生、发展过程中所起作用提供一定的理论依据，探讨其作为糖尿病颈动脉粥样硬化早期诊断、干预及治疗靶点的可能性。参考文献[1]InternationalDiabetesFederation.Titleofsubordinatedocument.In:DiabetesAtlasthed[EB/OL].[2014].http://www.idf.org/sites/default/files/Atlas-poster-2014_EN.pdf[2]刘子琪,刘爱萍,王培玉.中国糖尿病患病率的流行病学调查研究状况[J].中华老年多器官疾病杂志,2015(7):547-550.[3]李锐,卢伟,贾伟平,等.上海市2型糖尿病患病情况现状调查[J].中华医学杂志,2006,86(24):1675-1680.[4]李莉娜.2008年我国糖尿病疾病负担研究[D].北京中医药大学,2011.[5]鞠晓华，谢宝明，张金彪，2型糖尿病并发脑梗死患者联合检测血浆vWF水平及血小板参数的临床价值［J］实用临床医药杂志，2014，18（16）：22[6]宁光，内分泌学高级教程[M]。北京，人民军医出版社，2013.328～329[7]扎迦利,朱钊,宋滇平.美国内分泌学会关于糖尿病前期的会议共识(一)[J].糖尿病天地·临床旬刊,2009(8):353-360.[8]KhuranaR,MoonsL,ShafiS,etal.Placentalgrowthfactorpromotes2 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察前言atheroscleroticintimalthickeningandmacrophageaccumulation[J].Circulation,2005,111(21):2828～2836.[9]HiroT,KimuraT,MorimotoT,etal.Effectofintensivestatintherapyonregressionofcoronaryatherosclerosisinpatientswithacutecoronarysyndrome:amulticenterrandomizedtrialevaluatedbyvolumetricintravascularultrasoundusingpitavastatinversusatorvastatin(JAPAN-ACS[Japanassessmentofpitavastatinandatorvastatininacutecoronarysyndrome]study).[J].JournaloftheAmericanCollegeofCardiology,2009,54(4):293-302.[10]OrbeJ,BeloquiO,ColinaI,etal.W03-P-009IndependentassociationofVonWillebrandfactorwithsurrogatemarkersofsubclinicalatherosclerosis[J].AtherosclerosisSupplements,2005,6(1):15.[11]BonthronD,OrrEC,MitsockLM,etal.Nucleotidesequenceofpre-pro-vonWillebrandfactorcDNA.[J].NucleicAcidsResearch,1986,14(17):7125-7127.[12]GinsburgD,HandinRI,BonthronDT,etal.HumanvonWillebrandfactor(vWF):isolationofcomplementaryDNA(cDNA)clonesandchromosomallocalization.[J].Science,1985,228(228):1401-6.[13]PáramoJA,BeloquiO,ColinaI,etal.IndependentassociationofvonWillebrandfactorwithsurrogatemarkersofatherosclerosisinmiddle-agedasymptomaticsubjects.[J].JournalofThrombosis&Haemostasis,2005,3(4):662-664.[14]vanMourikJA,RomanidWT.VonWillebrandfactorpropeptideinvasculardisorders[J].Thrombosis&Haemostasis,2001,86(1):164-71.[15]GaedeP,VedelP,,ParvingHH,etal.ElevatedlevelsofplasmavonWillebrandfactorandtheriskofmacro-andmicrovasculardiseaseintype2diabeticpatientswithmicroalbuminuria.[J].Nephrology,dialysis,transplantation:officialpublicationoftheEuropeanDialysisandTransplantAssociation-EuropeanRenalAssociation,2001,16(10):2028-2033.[16]Ossei-GerningN,,WilsonIJ,GrantPJ.Sexdifferencesincoagulationandfibrinolysisinsubjectswithcoronaryarterydisease.[J].Thrombosis&Haemostasis,1998,79(4):736-40.3 资料与方法2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察资料与方法一、研究对象1．正常对照组（NC组）56例健康体检人员，从2015年01月至06月苏州大学附属第一医院的门诊体检人员中选取，其中男30例，女26例，平均年龄(53±4)岁，并根据WHO（1999年）标准，所有受试者均接受75g葡萄糖耐量实验（OGTT），证实为糖耐量正常，即空腹血糖<6.1mmol/l，糖负荷后2小时血糖<7.8mmol/l，且无颈动脉病变。2．2型糖尿病组选取2015年01月至06月期间，苏州大学附属第一医院内分泌科收治入院的2型糖尿病患者共120例，均符合1999年WHO制定的糖尿病诊断标准。并根据彩色多普勒超声仪检查双侧颈动脉的结果进行进一步分为两组：（1）T2DM合并颈动脉粥样斑块患者（T2DM+AS组），共60例（男32例，女28例），平均年龄（55±4）岁，此组所有患者经颈动脉超声检查IMT≥1.5mm。（2）T2DM无颈动脉粥样斑块组（T2DM+NAS组），共60例（男32例，女28例），平均年龄（53±6）岁，此组所有患者经颈动脉超声检查双侧颈动脉内-中膜厚度(IMT)<1.0mm；四组在性别、年龄上相匹配。所有入选对象排除标准：（1）1型糖尿病、2型糖尿病合并急性并发症、特殊类型糖尿病；（2）妊娠、哺乳期妇女或长期服用避孕药；（3）有吸烟史的患者；（4）高血压、冠心病及其他心脑血管疾病，急慢性感染、肝肾功能不全、恶性肿瘤、血液系统疾病；（4）风湿免疫系统疾病或其他内分泌代谢疾病，如甲状腺功能异常，肾上腺皮质功能异常等。二、研究方法1．颈动脉超声检查采用美国惠普SONOS500彩色多普勒超声仪，探头中心频率7.0~11.0MHz，患者取平卧头仰位，由我院固定专科人员对双侧颈总动脉全段、分叉部位及颈内、颈外动脉进行扫描，观察内膜有无斑块形成。并测量左、右颈总动脉分叉处远端1cm处前后壁4 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察资料与方法共4个点的IMT值，共测量5次，取双侧测量值的平均值为颈动脉IMT值，根据2009年血管超声检查指南：IMT<1.0mm为正常，IMT≥1.5mm定义为斑块。2．体格指标的测定所有受试者均免冠脱鞋，穿单衣，由同一人测量身高及体重；按照测量血压标准方法，所有受试者休息5-10分钟后，采取坐位，在右侧肱动脉处，用台式袖带血压计测量收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，间隔一分钟，连续测量两次，计算并记录平均值。22计算体重指数（BMI）：BMI=体重／身高（kg/m）。3．生化指标的测定所有研究对象均需隔夜空腹至少10h，于次日清晨抽取肘静脉血5ml至促凝管中直接送检。空腹血浆葡萄糖（FPG）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）的测定由Hitachi7600全自动生化分析仪完成；糖化血红蛋白(HbA1c)的测定采用高效液相色谱法，由美国Bio-RadVariantII糖化血红蛋白检测仪完成；采用酶联免疫吸附法测定空腹血清胰岛素（FINS）浓度，试剂盒购于美国DSL公司，批内变异系数<3%，批间变异系数<5%）。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），采用稳态模型评估法计算：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。4．血清vWF的测定4.1标本收集每例受试者均另留一份血样5ml至促凝管中，2h内送至实验室，予离心机3000r/min离心10min，并分离血清，装入冻存管，保存于-70℃冰箱中待检测。4.2主要试剂（1）人vWFELISA试剂盒：购自AssayPro公司。检测范围20U/L-400U/L,灵敏度：最低检测浓度小于10U/L。板内、板间变异系数均<10%，试剂盒组成：96人份微孔板、vWF标准品450U/L1.5ml一瓶、标准品/标本稀释液1.5ml一瓶、酶标试剂6ml一瓶、样品稀释液6ml一瓶、显色剂A6ml一瓶、显色剂B6ml一瓶、20×浓缩洗涤液、终止液、封胶纸板。4.3主要仪器（1）LDZ5－2离心机北京医用离心机厂（2）DW－L328低温冰箱北京信康亿达科技发展有限公司（3）WZR－D961型微量振荡器苏州市东吴医用电子仪器厂5 资料与方法2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察（4）XW－80A蜗旋混合器上海琪特分析仪器有限公司（5）WH－966调速混匀器太仓市科教器材厂（6）DK－8A型电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司（7）CERES900酶标仪美国Bio-Tekinstrument，Inc（8）各型号的微量移液器和移液吸头4.4血清vWF含量的测定按照试剂盒说明书严格进行，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定，板内、板间变异系数均<10%。（1）检测原理试剂盒中的微孔板已预先包被纯化的抗人vWF特异单克隆抗体，往包被单抗的微孔中按序依次加入标准品及待测样本，温育足够时间后，标本及标准品中的vWF会与微孔中的单抗结合，洗涤除去游离成分，再加入生物素化的抗人vWF抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素，生物素与亲和素特异性结合，抗人vWF抗体与结合在单抗上的人vWF结合而形成免疫复合物，洗涤除去游离成分，加入显色剂，若反应孔中有vWF，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂转变为蓝色，最后加终止液，蓝色在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中vWF浓度呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），PLGF浓度与OD450值之间呈正比，以标准品浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，可绘制出标准曲线，用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程即可得到样品浓度。（2）操作步骤1)试验开始前，提前60分钟从冰箱中取出试剂盒，将试剂平衡至室温（20-25℃），混匀。2)标准品的稀释：取一瓶VWF标准品管（80mU，冻干），加入1.0ml标准品稀释液，轻轻混匀（注意不起泡沫），待彻底溶解后静置15分钟以上，制备成浓度为80mU/ml的标准品。再准备7根干净试管标记为1-7，在试管中进行倍比稀释：1号管中加入1ml标准品，2-7号管中分别加入500μl标准品稀释液，用微量移液器从1号标准品管中取出500μl加入2号管，轻轻混匀后用移液器取出500μl加入3号管中，3号管混匀后再取500μl加入4号管，依次类推，直至从6号管中取出500μl加入7号管。最后分别得到浓度为80mU/ml、40mU/ml、20mU/ml、10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、6 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察资料与方法1.25mU/ml的标准品。加标准品和待测样本：从已平衡至室温的密封袋中取出所需数量的微孔板条（其中应有一孔为空白显色孔），固定于框架上，分别设置空白对照孔、标准品孔及待测样本孔，记录好各孔位置，按下图所示，从1-7号试管中逆标号顺序分别取100μl标准品（浓度分别为1.25mU/ml、2.5mU/ml、5mU/mll、10mU/ml、20mU/ml、40mU/ml、80mU/ml）以及各待测样本加入相对应的微孔中，A1为空白对照孔，不加标准品或样本（如下图，15分钟内加完）。123456789101112Ablank19172533414957657381B1.25210182634425058667482C2.5311192735435159677583D5412202836445260687684E10513212937455361697785F20614223038465462707886G40715233139475563717987H808162432404856647280883）温育：用封板胶纸封住反应孔，将反应板放入37℃恒温水浴箱孵育90分钟。4）浓缩洗涤液的稀释：用双蒸水将25倍浓缩洗涤液稀释成原倍洗涤液（如1ml浓缩洗涤液加入24ml蒸馏水），稀释好备用。5）生物素化抗体工作液的准备：在使用前1小时内准备，根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配置时适当多配置0.1-0.2ml），用生物素化抗体稀释液1:100将浓缩的生物素化抗体稀释成厡倍（按1μl生物素化抗体浓缩液加99μl生物素化抗体稀释液的比例配置，轻轻混匀），洗板前稀释好备用。6）甩液：反应90分钟后，快速甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗。7 资料与方法2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察7）加生物素化抗体工作液：除空白孔外，在其余每孔加入准备好的生物素化抗体工作液100μl。8）温育：用封板胶纸封住反应孔，将反应板继续放入37℃恒温水浴箱孵育60分钟。9）酶结合物工作液的准备：在使用前30分钟准备，根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配置时适当多配置0.1-0.2ml），用酶结合物稀释液1:100将浓缩的酶结合物稀释成厡倍（按1μl浓缩酶结合物加99μl酶结合物稀释液的比例配置，轻轻混匀），洗板前稀释好备用。10）洗板：反应60分钟后，快速甩去酶标板内液体，对着吸水纸拍干，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干，如此重复洗板3次。11）加酶结合物工作液：除空白孔外，在其余每孔加入准备好的酶结合物工作液100μl。12）温育：用封板胶纸封住反应孔，将反应板继续放入37℃恒温水浴箱孵育30分钟。13）洗板：反应30分钟后，快速甩去酶标板内液体，对着吸水纸拍干，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。14）显色：每孔加入90μL显色液，避光37℃恒温水浴箱孵育20-25分钟。15）终止：每孔加入100μL终止液，轻轻混匀，终止反应。16）测定：以空白孔调零，在终止反应后5分钟内，用酶标仪在450nm波长处读取各孔的吸光值(OD值)。17）计算：根据标准品的浓度及其对应的OD值，计算出标准曲线的线性回归方程，再根据各样本的OD值，在回归方程上计算出各样本对应的vWF浓度。三、统计学处理采用PRISM5软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差（xs±）表示，两组间比较行t检验；血清vWF与临床其他指标进行Pearson相关分析和多元线性逐步回归分析，动脉粥样硬化的风险因子分析使用Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。8 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察结果结果一、一般临床代谢指标比较三组间年龄、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、TC差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。T2DM+AS组、T2DM+NAS组血清vWF水平均显著高于NC组(P<0.05)，T2DM+AS组血清vWF水平显著高于T2DM+NAS组(P<0.05)(具体见表1、图1)。表1各组临床指标检测结果( x±s)TablComparisonoftheclinicaldataamonggroups( x±s)例数(男/组别年龄（岁）WHRBMISBPDBP女)2GroupAge(y)(kg/m)(mmHg)(mmHg)N(M/F)T2DM+AS32/2855±40.93±0.0524.48±3.08124.47±6.8577.77±5.77T2DM+NAS32/2854±60.91±0.0524.30±3.22123.39±8.3679.70±6.630.87±0.06NC30/2653±4ab23.31±3.07119.32±6.1375.54±6.711组别FPGFINSTCTGHDL-CHOMA-IRGroup(mmol/L)(mU/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)T2DM+AS8.86±1.555.28±2.072.03±0.614.45±0.831.68±0.691.18±0.241.08±0.72T2DM+NAS7.11±1.454.45±2.322.01±0.834.39±0.811.20±0.22a5.01±0.679.12±2.481.40±0.721.27±0.351.33±0.26NC4.24±0.53abababaab组别HbA1chsCRPLDLvWFGroup(%)(mg/L)(mmol/L)(U/L)T2DM+AS9.78±1.974.25±1.142.80±0.4857.29±8.18aT2DM+NAS9.39±2.382.01±0.832.70±0.4551.18±8.42ababababNC4.60±0.311.40±0.722.45±0.4545.43±7.67ab与T2DM+AS组比较，P<0.05,与T2DM+NAS组比较，P<0.059 结果2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察图1三组血清vWF水平Fig1SerumvWFlevelsofthreegroups﹡二、vWF与其他临床指标的相关分析（1）控制年龄及性别因素后，Pearson相关分析显示，三组血清vWF水平TG（r=0.200，P=0.042）、SBP（r=0.210，P=0.049）、hsCRP（r=0.270，P=0.011）、FBG（r=0.504，P=0.023）、HbA1c（r=0.440，P=0.027）表达呈正相关，与HDL-C（r=―0.280，P=0.008）表达呈负相关。（表2）。图2-5为PLGF与以上指标相关散点图。表2三组血清vWF与其他临床指标的相关分析Tab2CorrelationanalysisofserumvWFwithotherclinicalindicesamongthreegroupsPearson相关分析项目变量rPSBP(mmHg)0.2100.049FPG(mmol/L)0.5040.023TG(mmol/L)0.2000.042HbA1C(%)0.4400.027hs-CRP(mg/L)0.2700.011HDL-C(mmol/L)-0.2800.00810 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察结果图2血清vWF水平与TG相关性散点图(r=0.200)Fig2ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandTG图3血清vWF水平与SBP相关性散点图(r=0.210)Fig3ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandSBP11 结果2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察图4血清vWF水平与hs-CRP相关性散点图(r=0.270)Fig4ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandhs-CRP图5血清vWF水平与FBG相关性散点图(r=0.504)Fig5ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandFBG12 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察结果图6血清vWF水平与HbA1c相关性散点图(r=0.440)Fig6ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandHbA1c图7血清vWF水平与HDL-C相关性散点图(r=-0.280)Fig7ScatterplotofthecorrelationbetweenserumvWFandHDL-C13 结果2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察三、Logistic回归分析以T2DM患者是否发生颈动脉粥样硬化为因变量，以患者血清vWF、FBG、HbA1c、SBP、TG、HDL-C、hsCRP水平作为自变量，进行多元线性逐步回归结果显示，血清vWF、HbA1c、HDL-C是T2DM患者发生颈动脉粥样硬化的独立影响因素表3T2DM患者发生颈动脉粥样硬化的影响因素分析Tab3Multivariatelogisticregressionanalysisofclinicalfactorsaffectingcarotidarteryplaque项目OR值95%CIP值vWF1.0211.024~1.0280.004FBG0.9770.846~1.1230.749HbA1c0.6180.394~0.9390.039SBP0.9360.844~1.2240.741TG2.1980.583~8.7200.269HDL-C1.2301.028~1.4570.047hsCRP2.0950.588~8.1480.29714 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察讨论讨论近年来，随着社会经济加速发展，人们生活水平不断提高，生活方式也逐渐改变，伴随而来的是糖尿病患病率的逐年上升。尽管全世界对于糖尿病的认识越来越深入，管理与治疗水平也在不断规范、提高，但糖尿病的控制状况却依旧不容乐观。2011年一项全国多中心横断面调查研究显示：糖化血红蛋白以[1]７％为标准，仅有不到1/3的受访者血糖控制达标。伴随长期的血糖、血压、血脂控制不佳，糖尿病病人易合并各种并发症，给个人、家庭、社会带来巨大损失。据世界卫生组织统计，2005-2015年间中国由于糖尿病及其相关心血管疾[2]病导致的经济损失将达5580亿美元。大血管病变是2型糖尿病主要并发症之一，也是糖尿病患者致死致残的重要原因[3]，动脉粥样硬化是大血管病变的主要病理过程，古有中医“治未病”的思想，之于当代又有疾病的三级预防措施，因此，早期发现和干预动脉粥样硬化在2型糖尿病及其并发症的管理与治疗中有着至关重要的意义。[4]T2DM的主要死亡原因为大血管病变，即大血管动脉粥样硬化。本研究显示，T2DM+NAS及T2DM+AS组血清vWF水平均明显高于NC组，而T2DM+AS组血清vWF水平又明显高于T2DM+NAS组；Logistic回归分析示vWF为颈动脉粥样斑块的危险预测因子，说明vWF在超声检查示颈动脉正常的T2DM患者血清中表达已增多，在已形成粥样斑块的T2DM患者血清中表达进一步增多，提示vWF可能参与了2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的早期形成，促进了动脉粥样斑块的发生、发展，或可作为2型糖尿病患者预测颈动脉粥样硬化的一个早期指标。[5]vWF是由内皮细胞和巨核细胞合成的糖蛋白,其合成基因位于第12号染色体,其相应的mRNA碱基数目为8500~9000个,内含有合成2818个氨基酸肽链(前vWF原)[6]的密码。翻译出来的前vWF原(亚单位)的羧基端通过二硫键在内质网形成二聚体,[7]然后经过一系列加工过程,包括切掉信号氨基酸22肽(变成vWF原)和糖化,并且从vWF原水解掉741个氨基酸多肽(均发生在聚合以后),水解下来的多肽以特殊的蛋白形式从细胞释放或贮存在血α-颗粒内,相当于以前描述的vonWillebrandantigen[8]II,其功能不清楚。水解后成熟的vWF由2050个氨基酸组成,其基本的氨基酸序列[9]已用经典的Edaman降解方法分析过。vWF双聚体通过肽链间的二硫键形成大分子15 讨论2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察的多聚体,推测邻近亚单位氨基端以头对头结构连结；这个过程可能需要细胞内酸性[10]环境,并且在水解掉vonWillebrandantigenII以后发生。内皮细胞中的成熟vWF(多聚体形成之后)从细胞释放或贮存在Weibed-Palade体中,以备在适当的刺激下释放。内皮细胞释放的vWF进入循环的血液中或进入血管外变成内皮下组织的一部分。巨核细胞中合成的vwF贮存在血小板α-颗粒内,在血小板活化时释放。颈动脉斑块是颈动脉粥样硬化的表现，是由于多重危险因素导致的颈动脉血管壁损伤、血流中的有形成分聚集所形成的团块状结构。内皮功能损伤是动脉硬化的始动[11][12]因素和核心环节，而vWF被认为是内皮损伤或者功能紊乱的标志。T2DM患者的高糖状态与血管内皮功能密切相关，高浓度葡萄糖可诱导内皮细胞功能异常。此外，[13]高血糖状态可刺激血小板活化，vWF是血栓形成的重要物质，参与血小板的聚集过程。本研究中相关分析显示，血清vWF表达与FBG、HBA1c表达呈正相关，多元回归结果亦显示血清vWF水平与血糖密切相关。T2DM高糖状态可致内分泌代谢紊乱，一[14]氧化氮活性降低，内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、糖基化终末产物增多，进而导致内皮细胞损伤、前列腺素E2和具有舒张血管作用的松弛因子分泌下降，促凝物质、组织因子等分泌增多，血液呈高凝状态，导致血栓形成和微循环障碍，引起内皮功能损[15][16]伤及血小板活化，从而引起vWF的升高。Kawano等研究表明，在T2DM早期已出现内皮功能损伤，进一步提示vWF在T2DM早期即可参与动脉硬化的发生，其机制可能为内皮细胞损伤增加vWF的释放，增加血栓形成的可能，血栓形成势必加剧血管内皮细胞的损伤，从而形成恶性循环，最终促进颈动脉粥样硬化斑块的形成。Standle[17]等历时10年的前瞻性研究表明，合并大血管病变的高血糖患者vWF水平较不合并大血管病变患者显著增高。血管内皮损伤时，Weibel-Palade小体变形，储存于其内的vWF大量释放。此外受损的血管基底胶原暴露，除激活XII因子启动内源性凝血机制外，内皮细胞还表达和释放vWF，血浆vWF含量增高。vWF可与血小板膜受体结合，[18]导致血小板与内皮黏附，血小板被激活，而继发血栓形成。加之vWF分子量大，其升高还可导致血液粘稠度增加，形成血小板血栓。而这些过程又进一步破坏血管内皮和血管功能，使之形成正反馈，血管内皮功能更趋恶化，从而引起动脉粥样硬化的发生和发展。以上实验结果均与本实验结果相符。16 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察讨论本研究中还发现，在T2DM患者中，血清vWF水平与hsCRP、TG、SBP呈正相关，与[19]HDL-C呈负相关。CRP能直接作用于血管内皮，造成内皮细胞损伤。CRP通过合成粘附分子及低分子趋化物，促进白细胞合成、释放超氧化物和蛋白水解酶，引起组织损[20]伤，损伤血管内皮，从而使血清vWF升高。TG是公认的AS独立危险因素,已知TG致AS的机制主要是促使氧自由基产生,加速LDL氧化及对EC的损伤。有研究认为,内皮功[21]能失调是AS的首发步骤。高胆固醇血症伴血小板活性增高,是导致AS和血栓性心脑[22]血管疾病的主要危险因素。Luscher认为AS的形成与血管内皮功能的受损有关,即EC产生和释放的NO、ET等活性物质平衡失调、内皮依赖性舒张功能受损被认为是这一[23]过程的始动因素和中心环节。本实验也证实在糖尿病患者TG高于正常对照组,HDL低于正常对照组。高血压可导致内皮细胞功能紊乱。临床研究发现，在急性糖负荷之[24][25]后，高血压组内皮功能损伤较血压正常组严重。TsuchiyaK等通过对101名无大血管病变的2型糖尿病患者的研究表明：高血压和胰岛素抵抗一样在内皮细胞功能紊乱的发展中起着致病作用。而内皮细胞功能紊乱亦可引起高血压，在血压正常而血管[26]内皮功能紊乱人群中未来发生高血压的机会比血管内皮功能正常的人群明显增加。[27]在相关性分析中发现，血浆vWF与SBP成正相关，这与张雪莲等研究结果一致，说明在内皮功能受损的同时血压亦升高。本研究也存在着一定的局限性。如样本量相对较小；由于筛选对象时排除要求较多，收集健康体检者时颈动脉超声未发现有颈动脉粥样硬化斑块形成者，故本实验最终未设置非T2DM患者伴有颈动脉粥样硬化斑块的组别，以后的实验中将进一步细化分组。本实验未进行血清vWF水平与TNF-α、IL-6等炎症因子之间的实验关系，因此需要进一步研究vWF在不同情况下与促炎因子、急性期反应物、细胞粘附分子的相关性，探讨vWF在临床应用的可能价值。由于颈动脉彩色多普勒超声检查较多层螺旋CT冠状动脉血管造影及冠状动脉造影等检查具有操作便利性及价格的优势，是评估全身动脉粥样硬化的常用手段，是动[28]脉硬化的评价指标。而vWF是辅助临床诊断和反映疾病进展的一种非损伤性的方法。可否通过对T2DM患者vWF的测定，及结合颈动脉超声检查结果，在颈动脉粥样硬化斑块形成前就进行预防性用药，值得进一步研究。17 结论2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察结论（1）vWF在颈动脉正常的T2DM患者血清中表达已增多，在T2DM合并颈动脉粥样硬化斑块的患者血清中表达进一步增多，提示vWF可能参与了2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的早期形成，促进了动脉粥样硬化斑块的发生、发展，或可作为2型糖尿病患者预测颈动脉粥样硬化的一个早期指标。（2）相关分析显示HbA1c、HDL-C是T2DM患者发生颈动脉粥样硬化的独立影响因素，vWF水平与HbA1c呈正相关，与HDL-C呈负相关，提示vWF可能通过参与高糖状态、血脂谱紊乱与血管内皮功能改变等而促进2型糖尿病颈动脉粥样硬化的发生发展。（3）三组血清vWF水平与TG、SBP、hsCRP、FBG、HbA1c呈正相关，与HDL-C表达呈负相关，提示血清vWF水平与血压、血糖、血脂均密切相关，良好控制血压、血糖、血脂或可使T2DM患者血清vWF水平下降，从而延缓颈动脉粥样硬化的发生、发展。18 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察参考文献参考文献[1]JiL,LuJ,GuoX,etal.GlycemiccontrolamongpatientsinChinawithtype2diabetesmellitusreceivingoraldrugsorinjectables[J].BMCPUBLICHEALTH,2013,13(602).[2]张璐,孔灵芝.预防慢性病:一项至关重要的投资——世界卫生组织报告[J].中国慢性病预防与控制,2006,(01):1～4.[3]TaylorKS,HeneghanCJ,FarmerAJ,etal.All-CauseandCardiovascularMortalityinMiddle-AgedPeopleWithType2DiabetesComparedWithPeopleWithoutDiabetesinaLargeUKPrimaryCareDatabase[J].DIABETESCARE,2013,36(8):2366～2371.[4]MaglioneD,GuerrieroV,VigliettoG,etal.IsolationofahumanplacentacDNAcodingforaproteinrelatedtothevascularpermeabilityfactor[J].ProcNatlAcadSciUSA,1991,88(20):9267～9271.[5]HiroT,KimuraT,MorimotoT,etal.Effectofintensivestatintherapyonregressionofcoronaryatherosclerosisinpatientswithacutecoronarysyndrome:amulticenterrandomizedtrialevaluatedbyvolumetricintravascularultrasoundusingpitavastatinversusatorvastatin(JAPAN-ACS[Japanassessmentofpitavastatinandatorvastatininacutecoronarysyndrome]study).[J].JournaloftheAmericanCollegeofCardiology,2009,54(4):293-302.[6]CarrI,ValleleyES,MarkhamA,etal.Sequenceanalysisandeditingforbisulphitegenomicsequencingprojects[J].NucleicAcidsResearch,2007,35(10):9-0.[7]MccarrollDR,RuggeriZM,MontgomeryRR.CorrelationbetweencirculatinglevelsofvonWillebrand'santigenIIandvonWillebrandfactor:discriminationbetweentypeIandtypeIIvonWillebrand'sdisease.[J].JournalofLaboratory&ClinicalMedicine,1984,103(5):704-711.[8]GirmaJP,ChopekMW,TitaniK,,etal.LimitedproteolysisofhumanvonWillebrandfactorbyStaphylococcusaureusV-8protease:isolationandpartialcharacterizationofaplatelet-bindingdomain.[J].Biochemistry,1986,25(11):3156-63.[9]WagnerDD,MarderVJ.BiosynthesisofvonWillebrandproteinbyhumanendothelialcells:processingstepsandtheirintracellularlocalization.[J].JournalofCellBiology,1984,99(6):2123-30.19 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综述血管性血友病因子的研究进展2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察综述血管性血友病因子的研究进展周颖异综述成兴波审校【摘要】血管性血友病因子（vWF）是由血管内皮细胞及巨核细胞合成和分泌的糖蛋白，被认为是内皮细胞损伤及功能障碍的标志物。近年来研究发现vWF在糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、血友病、肿瘤等疾病中均发挥重要作用。本文将从其结构、功能及与各疾病的关系方面作一简单阐述。【关键词】血管性血友病因子；结构；功能；动脉粥样硬化RencentprogressofvonWillebrandfactorZhouYingyi,ChengXingbo【Abstract】vonWillebrandfactor(vWF)isaglycoproteinsecretedbyvascularendothelialcellandmegakaryocyte,itisknowntobethekeymarkofendothelialcelldamageanddysfunction.IthasbeenreportedthatvWFplaysanimportantroleinvariousdiseasessuchasT2DM,cardiovasculardisease(CVD),acutecoronarysyndrome（ACS）,blooddisease,tumorandsoon.I'llgiveabrieflyreviewofvWFfromitsstructure,functionandtherelationshipwithvariousdiseases.【Keywords】vonWillebrandfactor(vWF)，structure，function，atherosclerosis血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)是一种分子量很大的糖蛋白，其功能单位是vWF单体，参与止血与凝血。德国教授EricvonWillebrand干1926年曾描述一家庭中几个成员患有先天性出血性疾病,后来命名为vonWillebrand病,是一种vWF异常引起的疾病。1971年第一次用免疫学方法检测出vWF并命名为factorVIII-relatedantigen(VIIIR:Ag)。1987年国际血栓与止血学会因子VIII和VonWillebrand因子专题委员会建议统一命名为vWF。1.vWF的概述1.1vWF的基因定位、结构特点vWF是一种大分子糖蛋白，也是一种粘附蛋白，它可由巨噬细胞、内皮细胞、血小板颗粒、血浆和内皮下连接组织合成并释放，其中内皮细胞是血浆vWF的主要合[1,2]12成场所。vWF其基因位于12号染色体短臂（12P），52个外显子长178kb，占人12号染色体近0.1%组成，最小的外显子长40kb，最大的外显子长1.4kb，后者编码22 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察综述血管性血友病因子的研究进展[3,4]整个A1及A2区，是vWF的重要功能区，也是vWD突变部位所在。vWF的基因具有高度多态性，有100余种之多。vWF的基因多态性与血浆vWF水平显著相关，[5]于血栓栓塞性疾病的发生有关。内皮细胞分泌多形式的vWF,包括vWF前体、二聚体亚单位和多聚体，未受刺激的内皮细胞主要分泌前两者，当钙离子载体、凝血酶等[6]刺激内皮时，释放多聚体vWF。[7,8]vWFcDNA全长8900bp,有一个编码2813个氨基酸残基的阅读框，其产物是309kD的vWF前体，首端的22个氨基酸残基是典型的信号肽，其后744个残基是81kD的vWAgII，这个蛋白在内皮细胞内切下来，与vWF一起贮存在Weibel-Palade氏体。成熟的vWF含有2050个氨基酸残基，有5种不同的结构区:A区含有193-220个氨基酸残基，有三个连续拷贝A1,A2,A3;B区含有25-35个氨基酸残基，有2个拷贝；C区含有116-119个氨基酸残基，有2个拷贝；两个D区分布于A区两侧，近N端还有与D区有部分同源性的D’区，含有46个氨基酸残基。vWF单体通过稳定的C段二硫[9][10]键形成多聚体。单体是其功能的机构基础，单体中有22个糖基化位点。vWF有两种分泌方式,一种是在高尔基体中修饰后,立即持续地分泌到细胞外,另一种是贮存在内皮细胞的Weibel-Palade小体内,或者巨核细胞和血小板中α颗粒中,[11]而后在促分泌素的刺激下分泌到血液中。1.2vWF的功能vWF调节血小板粘附于暴露的内皮下组织，在血管损伤处促进血小板血栓形成而参与止血过程。vWF能结合血小板膜的2种独特蛋白，他们是糖蛋白Ib和IIb/IIIa。[12]vWF分子链上与Ib结合的区域位于449-728氨基酸序列之中；而IIb/IIIa结合区域和1744-1747氨基酸序列有关，其他粘附蛋白，如纤维结合蛋白、纤维蛋白原分子链[13][14]上也有同样的序列。第二个肝素结合区域位于基本结构；第二个胶原结合区域[15]位于亚单位的中间部位。最初覆盖在损伤的内皮细胞上的单层血小板行程过程中，vWF起桥梁作用。其一端与内皮下成分如胶原、类肝素物质结合，另一端与血小板上Ib结合。vWF与Ib相互作用促使血小板活化，并且在其他激活因子参与下，可能促进另外的血小板聚集，[16]使血栓变大。近年来研究表明血小板聚集过程也需要vWF参与。vWF与血小板膜Ib的结合会改变IIb/IIIa的结构，然后促使另外的vWF、Fbg结合在已变构的IIb/IIIa[17]复合物上，继而促进血小板粘附、聚集。23 综述血管性血友病因子的研究进展2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察2.vWF与疾病的关系2.1vWF与糖尿病正常人血浆vWF浓度为5-10μg/ml，半衰期为几个小时，浓度有波动，可能与生长激素有一定关系。运动及胰岛素诱导的低血糖可使vWF水平升高，口服葡萄糖[18]负荷后其水平下降。糖尿病病人血浆vWF水平比正常人高，伴有糖尿病血管并发症的病人血浆vWF水平更高。vWF水平在24小时内也有波动，一般白天较高，夜间较低。24小时vWF生物活性变化平行于免疫活性变化，提示24小时vWF水平的波[19]动是数量上的变化，而不是质的变化。与正常人不同，糖尿病伴有血管并发症病人血浆vWF水平与血浆葡萄糖浓度、生长激素及胰岛素的应用均无关，与泌乳素水平、食物的摄入也无关，尤其是夜间生长激素水平升高时，vWF水平反而下降。这些现象提示伴有血管并发症的糖尿病病人血浆vWF代谢调节已有变化。由于血管内皮细胞是合成vWF的主要场所，可能的解释是包括由生长激素或血糖和其他因素调节vWF[20]的机制已被破坏。24小时vWF水平与患者的年龄及病程呈正相关，而年龄与病程不相关，提示它们的效应是相互独立的。随年龄的增长，病程的延长，血浆vWF水平也升高。动物实验发现，给动物高胆固醇饮食诱发显著的主动脉粥样硬化时，缺乏vWF的同种对照动物却未发生粥样硬化。这提示vWF水平升高时促进血管并发症发生、发展的危[21]险因素。进一步支持vWF在糖尿病血管病变发生、发展中起作用的假说。糖尿病酮症酸中毒的病人血浆vWF水平显著升高，而且睡着临床和生物化学指标的恢复，vWF水平也下降，这可能是糖尿病酮症酸中毒的一个显著特征。这可能与内皮细胞损伤相关。交叉免疫电泳时vWF前峰的出现，似乎也是糖尿病酮症酸中毒[22]状态的一个特征，这可能与血浆vWF水平升高有关，也可能表示聚集的vWF。2.1.1vWF与糖尿病肾病糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一,发病机理尚不十分清楚。有人认为糖尿[23],两者的共同改变及其相病肾病发生之前己出现血小板反应性增高和内皮细胞损伤互作用可能促使糖尿病肾病的发生,故vWF测定对糖尿病肾病的发病机理从血管内皮损伤方面提供了一定依据。尿微量白蛋白是至今早期糖尿病肾病（DN）诊断的金标准，同时是DN的表现之一。诸多研究表明，vWF与尿微量白蛋白相关，vWF在尿微量白蛋白组常升高，vWF24 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察综述血管性血友病因子的研究进展升高可作为预示微量蛋白尿发展的进程。内皮细胞培养研究提示高糖水平可致内皮损伤，vWF从内皮细胞中Weibel-Palade体重释放增加，其升高认为是先于微量白蛋白[24][25]尿出现。另一项研究表明，DN患者中vWF水平明显高于非DN组，提示2型糖尿病患者vWF水平增高可能是DN发生的使动因素之一，并与微量白蛋白尿及肾损伤进程有关。2.2vWF与脑血管疾病脑血管疾病(cerebrovasculardisease,CVD)是世界范围内成人致残首要因素和第三位人口死亡病因,同时也是老年人认知功能障碍和情感障碍的重要原因之一。我国为CVD高发国家,CVD年发病率(185-219)/10万,估计每年有200万新发CVD病例,[26]每年有150万人死于CVD,有CVD存活者700万人,CVD是我国人口死亡的第二位原。临床上对vWF在CVD的诊断、治疗和预后判断方面的作用已经进行了大量的研究。CVD如脑梗死和脑出血均由脑血管病变所致,脑梗死是由于脑动脉硬化导致血栓形成,造成脑血管阻塞而产生缺血性坏死,脑出血是由于脑动脉硬化,使脑血管脆性增加,血管破裂引起脑出血。因此,动脉粥样硬化是脑血管病发病的基础。有研究表明,在兔高脂血症和鼠动脉粥样硬化模型中,在斑块形成前,已经有血小板黏附在斑块即将形成的部位。这一过程的启动仅需要内皮细胞的激活,而不需要内皮细胞完全露,vWF和[27,28]GPIb的失活将抑制这一过程的发生。而vWF失活和GPIb抑制也都将影响脂肪条纹[29,30][31]的生成。Della-Morte等通过对287例多米尼加人颈动脉斑块的表型与凝血系统基因的单核苷酸多态性关系的分析发现,vWF、血小板反应蛋白1(THBS1)以及人纤溶酶原激活物抑制剂1(SERPINE1)基因变异在动脉粥样硬化斑块的发病机制中发[32]挥着重要的作用。由此看来,vWF在动脉粥样硬化病变早期即发挥重要作用。根据vWF在止血和内皮细胞功能紊乱,以及在粥样硬化病变中的重要作用,可以把vWF作为CVD[33]危险因子。[34]Bugnicourt等以25例脑静脉窦血栓(CSVT)患者为病例组,64例年龄、性别匹配的健康人为对照组,测定其血浆中FVIII和vWF水平,结果发现,病例组血浆FVIII和vWF水平均高于对照组,而在脑静脉窦血栓组和对照组中vWF与FVIII水平具有显著的正相关性。所以,血浆FVIII和vWF水平的升高都是脑静脉窦血栓形成的危险因子,但vWF作用可能依赖于FVIII的调节。vWF作为评价中风患者发生和死亡的危险因子,已经受到越来越多的关注,而25 综述血管性血友病因子的研究进展2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察vWF介导的新型血小板黏附和激活的拮抗剂,作为一种更强大、安全的抵抗血栓形成[35]紊乱的药物,也受到越来越多的关注。2.3vWF与妊娠期高血压病[36][37]产妇在正常妊娠过程中，血管性血友病因子（vWF）明显增高。Deng等调查发现，子痫及子痫前期孕妇和正常孕妇相比，前者血浆vWF含量显著升高，除此之外，其血管内皮细胞可以观察到明显的不同程度的损害，并且表现出极强的凝血功能。滋养层细胞和血管内皮细胞内出现大量的vWF，对滋养细胞的分化和浸润表达vWF可能会造成一定的影响。受滋养层侵袭影响，滋养层细胞侵入部位只表现在表浅位置，如蜕膜层。除此之外，vWF可以造成螺旋动脉生理变化失常，造成进入胎盘的血液减少[38]，血管内皮细胞损伤程度加重，在妊娠高血压产妇中出现更多复杂的病理变化。有文献报道，子痫前期产妇母体外周血vwF可能出现显著的增高现象，然而滋养细胞缺氧是否为上述结果的罪魁祸首还难以确定，相关研究还需要进一步进行。2.4vWF与急性冠状动脉综合征急性冠状动脉综合征(ACS)是由于动脉粥样硬化斑块破裂，内皮下促凝血物质的暴露，继而血栓形成并导致心肌缺血甚至梗死。vWF参与这一过程。它帮助血小板向受损血管壁的内膜下基质的附着，增强血小板聚集，并且促进纤维血栓形成。相应地，在急性心肌梗塞（AMI）患者，高剪切力诱导血小板聚集显著增强。此外，对人类冠[39]状动脉新鲜血栓的研究表明，vWF可能是血小板血栓的生长的原因。根据现有的数[40]据以非加权的均数±标准差表示，vWF在AMI患者较之不稳定型心绞痛、稳定性型心绞痛和健康对照者显著升高。血浆vWF水平在冠心病患者中预测发生心肌梗死的能力已经得到确立。大规模研[41]究表明，血浆VWF水平增高是心绞痛患者发生心肌梗死的独立的预测因子，即使在校正其他危险因素之后，其再发心血管事件的相对风险为1.85。许多研究则进一步验证了血浆vWF水平和再发心肌梗死或死亡之间的关系。例如，Haines等的研究发现，心肌梗死后一年内死亡的患者较之存活者有较高的血浆vWF水平。SHEEP研究证[42]实，较高的血浆vWF水平是再发心肌梗死的良好的预测因子，其优势比为2．3。魏玉杰等研究发现ACS患者血浆vWF水平较稳定性心绞痛组和健康对照组明显增高，[43]认为vWF参与了ACS的病理生理过程，是动脉粥样硬化斑块不稳定的标志。26 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察综述血管性血友病因子的研究进展综合上面的研究结果，可以得出以下结论：对于一般人群而言，血浆vWF水平与其发生冠脉事件之间仅有很弱的联系：而对于那些已经存在冠心病，特别是心肌梗死存活的患者，增高的血浆vWF水平与其发生冠脉事件之间则有很强的相关性。2.5vWF与血液病血管性血友病(vonWillebranddisease，vWD)是最常见的常染色体遗传的出血性疾病之一，该病主要是由于血浆中vWF基因缺陷，导致血浆中vWF的数量减少或质量异常。随着研究者对vWF的结构与功能的相关性等有了进一步了解，vWD的诊断、[44]分类和治疗也得到发展。目前将遗传性vWD分为3型：1型主要是vWF合成减少，而vWF多聚体的结构正常，该型患者为常染色体显性遗传；2型主要是由于vWF的结构和功能缺陷所致，又可分为2A、2B、2M和2N4种亚型，该型患者多数为常染色体显性遗传，临床有轻到中度的皮肤和粘膜的出血倾向；3型主要是由于vWF的含量和活性均极度减低或缺如所致，为常染色体隐性遗传，临床出血严重。vWF水平的测定及对vWF多聚体的分析是对于诊断该病具有重要意义。2.6vWF与肿瘤血小板-肿瘤细胞间的粘附是导致癌血栓形成并且是增加肿瘤细胞附着和浸润至[45][46]内皮下的关键步骤，vWF在这一过程中起重要作用。Oleksowicz等人发现肿瘤扩散的患者血浆中vWF水平及瑞斯托霉素辅因子活性均显著增高，并且大分子量的[47]vWF多聚体明显增多。随后Koo等发现转移性肿瘤患者的血浆ADAMTSl3的活性下降，从而导致大分子量的vWF多聚体增多，介导肿瘤细胞的粘附和迁移。3.vWF与疾病治疗vWF在动脉血栓形成中角色的确立使得其成为一个颇具前途的治疗标靶。事实上，vWF拮抗剂已经被建议作为具有潜在优点的、新型的抗血小板药物。许多方法用来以阻止懈与血小板GPIb受体之间的相互作用，进而抑制vWF在血栓形成中的作用。肝素能显著影响vWF依赖的血小板止血，其主要机制是与vWF分子结合而覆盖vWF[48]与GPIb结合的A1区域。值得注意的是，肝素亚组能明确的抑vWF和血小板的相互作用。人体试验表明，血小板GPIIb／IIIa受体拮抗剂，主要是阿昔单抗。[49]能够降低vWF介导的血小板活性。很多特异性的针vWF与GPIb相互作用的拮抗剂已经被开发。27 综述血管性血友病因子的研究进展2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察4.小结与展望总之，血管性血友病因子自发现以来就受到研究者们的关注，到如今其生理作用及在糖尿病及其并发症、心脑血管疾病、肿瘤、妊娠期高血压病等多种临床疾病中的作用机制逐渐被发现，并能够更好的解释某些疾病的发生，为疾病的早期诊断、早期干预、早期治疗提供了新的思路及靶点，是一个很有前景的细胞因子。28 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察参考文献参考文献[1]GinsburgD,,BowieEJ.MoleculargeneticsofvonWillebranddisease.[J].Blood,2012,29(4):313-324.[2]SadlerJE.BiochemistryandgeneticsofvonWillebrandfactor.[J].AnnualReviewofBiochemistry,1998,67(1):395-424.[3]WagnerDD,OlmstedJB,MarderVJ.ImmunolocalizationofvonWillebrandproteininWeibel-Paladebodiesofhumanendothelialcells.[J].JournalofCellBiology,1982,95(1):355-60.[4]JagerA,vanHinsberghVW,KostensePJ,etal.VonWillibrandfactor,C-reactiveproteinand5-yearmortalityindiabeticcandnondiabeticsubjects:theHoornStudy[J].ArteriosclerosisThrombosis&VascularBiology,1999,19(12):3071-3078.[5]MannucciPM,CoppolaR.VonWillebrandfactor[M]//ECATAssayProceduresAManualofLaboratoryTechniques.SpringerNetherlands,1992:71-75.[6]MarcoLD,GirolamiA,,ZimmermanTS,etal.vonWillebrandfactorinteractionwiththeglycoproteinIIb/IIacomplex.Itsroleinplateletfunctionasdemonstratedinpatientswithcongenitalafibrinogenemia.[J].JournalofClinicalInvestigation,2011,77(4):1272-7.[7]TsaiHM.VonWillebrandfactor,ADAMTS13,andthromboticthrombocytopenicpurpura.[C]//SeminarsinThrombosisandHemostasis.2010:4-14.[8]HassanMI,SaxenaA,AhmadF.StructureandfunctionofvonWillebrandfactor.[J].BloodCoagulation&FibrinolysisAnInternationalJournalinHaemostasis&Thrombosis,2012,23(1):11-22.[9]StarkeRD,FrancescoF,PaschalakiKE,etal.EndothelialvonWillebrandfactorregulatesangiogenesis.[J].Blood,2010,117(3):1071-80.[10]ThadhaniR,MutterWP,WolfM,etal.Firsttrimesterplacentalgrowthfactorandsolublefms-liketyrosinekinase1andriskforpreeclampsia[J].JClinEndocrinolMetab,2004,89(2):770～775.[11]NightingaleTD,WhiteIJ,DoyleEL,etal.ActomyosinIIcontractilityexpelsvonWillebrandfactorfromWeibel-Paladebodiesduringexocytosis.[J].JournalofCellBiology,2011,194(4):613-29.[12]LeonieP,AdamM,RaedAD,etal.Thrombingenerationinthepresenceof29 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2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察参考文献[46]OleksowiczL,BhagwatiFM.DeficientactivityofvonWillebrand'sfactor-cleavingproteaseinpatientswithdisseminatedmalignancies.[J].CancerResearch,1999,59(9):2244-2250.[47]KooBH,MielkeHK,AungPP.ADAMTSL3/punctin-2,agenefrequentlymutatedincolorectaltumors,iswidelyexpressedinnormalandmalignantepithelialcells,vascularendothelialcellsandothercelltypes,anditsmRNAisreducedincoloncancer[J].InternationalJournalofCancer,2007,121(8):1710–1716.[48]SobelM,McneillPM,CarlsonPL,etal.HeparininhibitionofvonWillebrandfactor-dependentplateletfunctioninvitroandinvivo.[J].JournalofClinicalInvestigation,1991,87(5):1787-93.[49]AlexanderB,FuchsTA,ChauhanAK,etal.vonWillebrandfactor-mediatedplateletadhesioniscriticalfordeepveinthrombosisinmousemodels.[J].Blood,2010,117(4):1400-7.33 中英文对照缩略词表2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称T2DMType2DiabetesMellitus2型糖尿病vWFVonWillebrandFactor血管性血友病因子ASatherosclerosis动脉粥样硬化NCNormalcontrol正常对照SBPsystolicbloodpressure收缩压DBPdiastolicbloodpressure舒张压FPGFastingPlasmaGlucose空腹血糖FINSFastingSerumInsulin空腹血胰岛素HbA1cglycosylatedhemoglobin糖化血红蛋白TGTriglyceride甘油三酯TCTotalCholesterol总胆固醇HDL-CHighDensityLipoproteinCholesterol高密度脂蛋白胆固醇LDL-CLowDensityLipoproteinCholesterol低密度脂蛋白胆固醇hsCRPhighsensitivityCreactiveprotein高敏C反应蛋白BMIBodyMassIndex体重指数HomeostasismodelassessmentinsulinHOMA-IRHOMA胰岛素抵抗指数resistanceindexIMTintima-mediathickness动脉内膜中层厚度OGTToralglucosetolerancetest口服葡萄糖耐量试验ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织WPBWeibel-PaladebodyW-P小体IDFInternationalDiabetesFederation国际糖尿病联合会ECendothelialcell内皮细胞ETendothelin内皮素NOnitricoxide一氧化氮TNF-αtumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子-αIL-6interleukin6白介素-6AMIacutemyocardiuminfarction急性心肌梗塞vWDVonWillebrandDisease血管性血友病DNdiabeticnephropathy糖尿病肾病34 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察中英文对照缩略词表CVDcerebrovasculardisease脑血管疾病antihemophilicfactorIIIFVIII凝血因子VIIICVSTcerebralvenoussinusthrombosis脑静脉窦血栓ACSacutecoronarysyndrome急性冠状动脉综合征THBS1thrombospondin-1血小板反应蛋白1adisintegrin-likeandmetalloproteinasewith血管性血友病因子裂解ADAMTS13thrombospondintype-1motif13蛋白酶35 攻读硕士期间公开发表论文2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察攻读硕士期间公开发表论文1.周颖异，成兴波，朱燕.2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性分析[J].江苏医药杂志，已录用，2016.04月见刊.36 2型糖尿病患者血管性血友病因子与颈动脉粥样硬化相关性的观察致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，时间总是转瞬即逝，还记得三年前踌躇满志踏进苏大校园的自己，匆匆地，我也逐渐褪去当初那份青涩与稚嫩，如今，更多的是带着一份成熟与积淀，迎来了我的毕业季。回顾三年的苏大研究生生活，我得到了全面的提高与升华，而我现在最想要做的则是感激。三年来，无论是在专业理论课的学习、临床的实践还是在科研方面，身边总有那么一些人，一直在关心我，支持我，帮助我，借此机会我想向他们表达我最诚挚的谢意！首先最需要感谢的是我的恩师成兴波教授，您不仅在科研方面给了我最专业地指导，帮助我完成了课题的立题、实验及最后论文的审稿，更在学习生活上给予我无微不至的关心与帮助。恩师乐观积极的人生态度，严谨求实的科研精神，扎实渊博的专业知识，精益求精地工作作风，低调平实的处事方式，无不对我影响深远，让我受益终生。真心祝愿我的恩师成兴波教授身体健康，万事如意！感谢苏大附一院内分泌科施毕旻主任医师；鲁燕、邵新宇、陆轶群、李慧娟、杨春梅、范庆涛、殷霞等副主任医师；樊华英、钮利娟、解婧、朱燕、杜宣、陈漪婷等主治医师，方琼蕾、韩俊霞等住院医师以及张萍、康琪师姐在我临床实践、课题设计、实验和论文写作过程中给予的指导与帮助；感谢周惠娟护士长；邹建英、高红兰、施伟燕、刘丽珺等全体护士在我临床工作及收集实验标本中给予的支持与配合。感谢内分泌科实验室王秋萍、孙爱云在我实验过程中给予的指导和协助。感谢我的同窗好友徐清田和师妹方琼蕾、张欣欣、胡兴娜等在我学习、生活、工作中给予的关心和帮助。特别要感谢我亲爱的家人，二十几年来一如既往地无私付出，在我取得成绩时与我一起收获喜悦，在我遇到困难时给予我最大的支持与鼓励，是你们造就了今天的我。最后，特别感谢各位专家和教授百忙之中参加我论文的评审和答辩，向你们致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢！周颖异2016年3月25日于苏州大学37 巧輩化－戟謠辭Ｖ’：，．—表；户。為？议客、等■苏州方！蠢締—牽，’硕±学论貧护黛祈某祭叫＇汽—霄１．ｉ門＾学和做：＾；：护－一一ｒ一：：＾；＾．＾ｉ一ｎ－＞言：＇，：起ｖ讀＇點一＾一拭．：：醫品．：／誦琶＇觀ｙ．．．营昔￡．；＇；ｒ馬立．７：；：Ｉ．：：：ｌ；：ｆＶ苗德—＇：，／：ｉ’ｙ旁－ｓ妥－＞？．＾＇ｍ－／Ｖ；？ｉ＇ｌｉ＇妾；挤；祭Ｉ；野議＇＇－芭．转．＇面ＪＶ＇：表：整ｒ。＇替Ｖｉ議＂：；．７好京鹽茜ｌ＇．ｉ驾＇审孔ｌｉｉ瓦片一巧享。；ＶＪｉ？心仆ｉ皆接王ｉ黃專ｉ窜麵－＂——Ｉ－．—．ｊ’ｉ－．＿’ｎ６Ｖ■心Ｉｉｒ＇一；；
