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：分类号？Ｒ６９２．６密级：公开？单位代码：１０７６０学号：１０７６０２１５８４２３新疆医科大学？ＸｉｎＪｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｇ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ临床医学硕士专业学位（学历教育）论文题目：ＡＣＥ２基因多态性与新疆墨玉县维吾尔族慢性肾脏病的关系研究生李芳指导教师刘健教授—专业学位领域内科学研究方向慢性肾脏病研究起止时间２０１６年１０月－２０１７年１０月所在学院新疆医科大学第一附属医院２０１８年３月．＂．．“＊＂＇＇ｖ－？＇．１＇＇Ａ■，１？．ｋＨ．ｔｆ，ＴＺ．／？．Ｔｒ－－？＾．／ｒ．；，．ＪＶ；＾ｉ 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地一方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。ｗｍ：曰期：学位论文作者签名．签字一？－＞签字日期：＾Ａ导师签名：？／关于论文使用授权的说明，本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定〃＂）司在７（选择同意／不同意）以下事项：１，．学校有权保留本论文的复印￥和磁盘，允许论文被查阅和借阅可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；＂＿２．学校有权将本人的学位论文提交至清华大学中国学术期刊光盘（〃版电子杂志社用于出版和编入ＣＭＫＩ《中国知识资源总库》或其他同类）。数据库，传播本学位论文的全部或部分内容耐Ｕ学位论文作者签名签字日期：／：＿Ｍ导师签名：￣签字曰期：＾ｍ ACE2基因多态性与新疆墨玉县维吾尔族慢性肾脏病的关系研究生李芳指导教师刘健教授专业学位领域内科学研究方向慢性肾脏病2018年3月 TherelationshipbetweenACE2genepolymorphismandchronickidneydiseaseofXinjiangUygurMoyuCounty.ADissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByLifangInternalMedicineDissertationSupervisor:LiuJianMarch,2018 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名ACEAngiotensinConvertingEnzyme血管紧张素转换酶ACE2Angiotensinconvertingenzyme血管紧张素转换酶2ACRAlbumin-creatinineRatio尿白蛋白/肌酐AGTAngiotensinogen血管紧张素原AngIAngiotensinI血管紧张素IAngIIAngiotensinII血管紧张素IIAng(1-7)Angiotensin(1-7)血管紧张素(1-7)Ang(1-9)Angiotensin(1-9)血管紧张素(1-9)BMIBodyMassIndex体重指数CKDChronicKidneyDisease慢性肾脏病EstimatedGlomerularFiltrationeGFR估算肾小球滤过率RatePCRandrestrictionfragment聚合酶连反应和限制性片PCR-RFLPlengthpolymorphism段长度多态性 RASRenin–angiotensinSystem肾素血管紧张素系统ScrSerumcreatinine血肌酐 新疆医科大学硕士学位论文1目录摘要……………………………………………………………………………………...................1ABSTRACT………………………………………………………………………………...........2前言………………………………………………………………………………………................4内容与方法………………………………………………………………………………............71研究对象…………………………………………………………………………………..71.1诊断标准…………………………………………………………………………….71.2纳入标准…………………………………………………………………………....71.3排除标准…………………………………………………………………………....82研究方法…………………………………………………………………...................93质量控制………………………………………………………………......................104统计学方法…………………………………………………………………….............11结果…………………………………………………………………………………………...............12讨论……………………………………………………………………………………………………....19小结…………………………………………………………………………………….....................23致谢…………………………………………………………………………………….....................24参考文献…………………………………………………………………………………….............25综述…………………………………………………………………………………….....................29攻读硕士学位期间发表的学位论文………………………………………………………38导师评阅表………………………………………………………………………………...............39 新疆医科大学硕士学位论文1ACE2基因多态性与新疆墨玉县维吾尔族慢性肾脏病的关系研究生:李芳导师:刘健教授/主任医师摘要目的：探讨肾素血管紧张素转化酶2（ACE2）基因多态性与新疆墨玉县维吾尔族成人慢性肾脏病(CKD)的关联。方法：以我科在2013年03月-2014年04月期间对新疆墨玉县农村维吾尔族成人慢性肾脏病流行病学调查的数据为基础，运用聚合酶连反应和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分型技术对254例研究对象的ACE2两个基因位点（G8790A、A1075G）单个核酸多态性（SNPs）进行基因分型鉴定。结果:（1）ACE2G8790A女性CKD组中AA基因型频率大于健康对照组，有统计学意义（P<0.05）；CKD合并高血压组与CKD非高血压组比较，AA基因型频率基本相等，无统计学意义（P>0.05）。男性CKD组A等位基因频率高于健康对照组，有统计学差异；CKD并高血压组中A等位基因频率与非高血压组A等位基因频率基本相等，故无统计学差异；（2）在ACE2基因G8790A女性CKD组中，携带AA基因型者其收缩压水平高于GG、GA基因型，而eGFR水平降低。在男性CKD组中，G、A等位基因在血压水平上无差异，但A等位基因携带者其ACR水平升高，eGFR水平降低。（3）ACE2基因A1075G多态性在女性CKD组GG基因型频率高于健康对照组，但无统计学意义；CKD并高血压组中AA基因型频率大于非高血压组，且有统计学意义。男性CKD组中G等位基因频率大于健康对照组，但无统计学差异；在CKD并高血压组中G、A等位基因频率相等，故无意义。在CKD组中，ACE2基因A1075G多态性与血压、ACR、eGFR水平无明显相关性。结论：1.ACE2G8790A基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔族成人CKD有关，AA基因型携带者可能与女性CKD收缩压升高有关。2.ACE2A1075G基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔族女性成人CKD合并高血压有关。关键词：ACE2；基因多态性；慢性肾脏病；维吾尔族；1 新疆医科大学硕士学位论文2TherelationshipbetweenACE2genepolymorphismandchronickidneydiseaseofXinjiangUygurMoyuCountyPostgraduate:LiFangSupervisor:Prof.LiuJianAbstractObjective:toinvestigatetherelationshipbetweenACE2genepolymorphismandCKDinXinjiangUyguradults.Methods:basedonthedatabaseoftheepidemiologicalsurveyofUyguradultchronickidneydisease(CKD)inXinjiangMoyuCountyRuralbetweenMarch2013andapril2014,randomlyselecteddataintegrityofCKDandhealthycontrolsubjects254cases,byusingthepolymerasechainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)toidentifyACE2wosinglenucleotidepolymorphism(SNPs)genotypeofG8790A,A1075G.Results:ThefrequencyofAAgenotypeinACE2G8790AfemaleCKDgroupwashigherthanthatinhealthycontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant.ThefrequencyofAAgenotypeinCKDcombinedwithhypertensiongroupwasbasicallythesameasthatinCKDnonhypertensiongroup.AmalegroupCKDallelefrequencyishigherthanthehealthycontrolgroup,therewasstatisticalsignificance;AallelefrequenciesbetweenCKDconbinedwithhypertensiongroupandCKDisbasicallythesame,nostatisticalsignificance;ACE2geneA1075Gpolymorphism:inthefemaleCKDgroupthefrequencyofGGgenotypewashigherthanthatofthecontrolgroup,butnosignificantdifferences;thefrequencyofAAgenotypeinCKDcombinedwithhypertensiongroupwashigherthanCKDgroup,andtherewasstatisticalsignificance.ThefrequencyofGalleleinmaleCKDgroupwashigherthanthatinhealthycontrolgroup,butnostatisticalsignificance.InCKDcombinedwithhypertensiongroup,thefrequencyofGandAalleleswasequal,so,therewasnostatisticalsignificance.Conclusion:thepolymorphismof2 新疆医科大学硕士学位论文3ACE2G8790AgenemayberelatedtoUyguradultsinXinjiang.PolymorphismofACE2A1075GgenemaybeassociatedwithCKDcombinedwithhypertensionoffemaleadultsinUygurofXinjiang.KeyWords:Angiotensinconvertingenzyme2;genepolymorphism;chronickidneydisease;Uygur;3 新疆医科大学硕士学位论文4前言慢性肾脏病(ChronicKidneyDiseaseCKD)是全球公共健康的危害性重大慢疾病之一，RAS的极度激活已被公认为与慢性肾脏病发生、发展密不可分。在糖尿病，高血压，缺血再灌注，炎症及各种损伤致病因子的作用下肾脏表现出炎症细胞的浸润，上皮细胞转分化，系膜细胞增生，细胞外基质的沉积等一系列病理改变，使得肾脏生理结构发生改变，造成不可逆的肾小球硬化、间质纤维化（慢性肾脏病进展至终末期肾脏病的共同通路是肾脏纤维化），导致肾功能不断恶化，直至衰竭[1]。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensinsystemRAS）无论在机体的生理功能调节还是病理过程中，都扮演着不可或缺的角色。研究表明RAS的过度活化是肾脏发生纤维化的重要原因[1]，在肝脏生成的血管紧张素原(AngiotensinogenAGT)，通过血管紧张素转换酶（ACE）的作用，将其转化为血管紧张素I（angiotensinIAngI)，同时ACE可进一步将AngI其转化为血管紧张素II（angiotensinIIAngII）,AngII是RAS的主要效应因子。病理状态下，AngII在慢性肾脏病中起着关键的致病效应。以往研究多关注AngII的生成通路，而AngII的降解通路在其介导的肾脏损伤中的作用较少涉及，血管紧张素转换酶2（AngiotensinConvertingEnzyme2ACE2）作为AngII降解通路的主要酶，可将AngI降解为血管紧张素（1-9）[angiotensin(1-9)Ang(1-9)]，也可降解AngII为血管紧张素（1-7）[angiotensin(1-7)Ang(1-7)]。ACE2降解AngII的酶活性是降解AngI的酶活性的400倍，因此ACE2被认为是肾小管细胞生成Ang(1-7)从而发生保护作用的主要酶[2]。同时，由于ACE是AngII生成和Ang(1-7)降解的主要酶，因此，肾组织局部Ang(1-7)、AngII浓度受到ACE／ACE2降解活性变化的调节，ACE2通过拮抗ACE减少AngII的作用，从而降低细胞外基质成分的生成，降低氧化应激及炎症反应等，使得肾脏纤维化的进展得到延缓。人类ACE2是在2000年被发现的，全长40Kb,位于X染色体的Xp22位点上，属于1型跨膜蛋白，由羧基端胞质结构域、活性部位（锌离子结合膜体）、跨膜结构域、氨基末端信号肽组成，胞外结构为锌调节催化部位，一共有850个氨基酸。其与ACE氨基酸序列有40%同源，但它们对底物有不同的特异性。研究发现，在肾小球脏层、远端小管和集合管上皮细4 新疆医科大学硕士学位论文5胞ACE2表达程度低；在肾小球内皮细胞、系膜区ACE2几乎不表达；而在肾脏动静脉的内皮、平滑肌、近端肾小管上皮细胞ACE2呈高度表达；在壁层上皮细胞中度表达[3]。通过裂解ACE2暴露得酶活性外功能区细胞膜上得水平可来调节ACE2酶活性。当AngII的主要降解通路受阻时，肾脏炎症和纤维化都加重，这与肾内AngII升高,Ang1-7降低（AT1和ERK1/2信号激活)及TGF-β/Smad及NF-κB的激活有关[4]，ACE2基因的缺失可通过AngII的水平的升高，使AngII受体1（AT1R）依赖的Smurf2上调引起的Smad7负性调节因子的泛素化降解，Smad7的泛素化降解抑制了TGF-β/Smad3激活的同时也通过促进IκBα降解从而加强NF-κB信号介导的肾脏损害[4,10]而使肾脏炎症和纤维化加重。因此ACE2在慢性肾脏病的进展中的作用备受关注，逐渐成为肾脏纤维化和慢性肾脏病防治的新的靶向位点[5-9]。近年来，探寻ACE2基因多态性和高血压，高血压肾损害，糖尿病肾病，代谢综合征肾损害及与蛋白尿的可能关联的研究不胜枚举。在一篇有关ACE2基因多态性与原发性高血压关系的meta分析中发现G8790AA等位基因与汉族男性高血压存在明显相关性，且AA基因型与女性高血压也存在明显关联性[11]。Burrell等研究发现rs4240157G等位基因与男性及女性高血压患病率均存在相关性[12]。在韩国的研究中发现rs1514282、rsl514283与舒张期血压存在显著关联性[13]。钟健等研究发现ACE2A/G基因型为高血压肾损伤的易感基因型，同时也是代谢综合征肾损害的独立危险因素[14-15]。邱书娟等通过横断面病例对照研究发现ACE2基因多态性与II型糖尿病地易感性可能无关，而与糖尿病肾病的发生有一定的相关性[16]。但在维吾尔族人群中相关的资料和报道仍是空白。因此我们采用病例对照研究的方法，在之前对新疆墨玉县农村维吾尔族成人慢性肾脏病流行病学调查的数据库基础之上，以ACE2基因多态性为着手点来探讨新疆墨玉县农村维吾尔族成人ACE2基因多态性与慢性肾脏病关系得研究。从而从基因水平上为慢性肾脏病的防治提供科学依据。我们选择美国应用生物公司（ABI）开发的，主要针对中等通量的SNP分型的技术：SNaPshot，对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。它具有能准确分型，灵敏度和特异度高（仅次于直接测序）；一次性可检测数个位点，且不受位点多态性的限制，同时受样本量的限制较小等特点，可以在一个体系中检测A/T、G/C、C/T、G/A的插入/缺失等。在美国国立生物技术信息数据库获得ACE2基因组序列5 新疆医科大学硕士学位论文6（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search￡DB=gene)Genebank序列号为AY217547。通过查阅文献，我们选取了相关文章中2个最常用的SNP位点：rs2285666和rs1978124做进一步的研究。首先需要设计2个位点相应序列上下游扩增引物和SNaPshot引物，采用聚合酶链反应进行DNA扩增，用荧光标记的ddNTP对PCR产物进行延伸，最后采用DNA测序仪检测基因型，并对检测结果进行基因分型、卡方检验，判断2个多态性位点和高血压及慢性肾脏病（CKD）之间的关系。6 新疆医科大学硕士学位论文7研究内容和方法1研究对象在2013年03月-2014年04月对新疆墨玉县农村维吾尔族成人CKD流行病学调查[17]的数据库基础上，选取符合CKD诊断标准所有调查对象作为CKD组，同时按照1：1.35的比例随机抽取同一时期非CKD调查对象作为健康对照组，所有研究对象均为自愿且需签署知情同意书。1.1诊断标准：（1）白蛋白尿：①微量白蛋白尿：尿白蛋白／肌酐比值(ACR）≥30-299mg／g。②显性白蛋白尿：ACR>300mg／g；①和或②均称为白蛋白尿。③持续性白蛋白尿：所有白蛋白尿患者在3个月后复查尿蛋白及尿肌酐，检测结果仍符合白蛋白尿诊断标准者则称为持续性白蛋白尿。（2）肾小球滤过率（eGFR）=175×(Scr/88.4)-1.234×年龄(岁)-0.179(女性×0.79)。肾小球滤过率的计算是根据血肌酐值运用校正简化MDRD公式计算。①eGFR下降：eGFR<60mL.min-1(1.73m2）-1②持续性eGFR下降：所有eGFR下降者在3个月后再次留取空腹血，仍采用上述方法重新评估，eGFR<60mL.min-1(1.73m2）-1诊断为持续性eGFR下降。（3）持续性蛋白尿和(或)持续性eGFR下降或两者均有诊断为CKD。（4）高血压：①收缩压（SBP）≥140mmHg；②舒张压（DBP）≥90mmHg；①和或②或在服用降压药者诊断为高血压。1.2纳入标准1.2.1CKD组（1）年龄大于或等于18岁的成年人，临床资料完整，血、尿标本保存完好；（2）CKD诊断符合KDIGO标准[18]。（3）收缩压（SBP）≥140mmHg；舒张压（DBP）≥90mmHg；或在服用降压药者诊断为高血压。1.2.2健康对照组7 新疆医科大学硕士学位论文8（1）年龄大于或等于18岁的成年人，临床资料完整，血、尿标本保存完好；（2）达不到CKD的诊断标准；（3）近期无感染病史，无高血压、糖尿病史，无明显器质性病变。1.3排除标准1.3.1CKD组（1）已进行肾脏替代治疗或严重肾功能不全者（eGFR＜30ml/min/1.73m²）；（2）有糖尿病病史者。1.3.2健康对照组（1）有明显器质性病变：晚期恶性肿瘤、心力衰竭，病毒性肝炎；（2）有高血压、糖尿病、高尿酸血症、高脂血症患者；2研究方法2.1问卷调查[17]横断面调查方法见前期研究，所有研究对象临床资料从电子文本库中提取。2.2腰围、臀围的测量使用带有毫米刻度的软尺测量腰围和臀围，使用之前需要经过钢卷尺校对，每米误差不可超出2mm；测量单位统一为毫米，保留到小数点后一位。（1）腰围测量：检测者嘱被检者吸气，然后从剑突到脐点连线的中点处，绕腰部一周，所测得地值为腰围，并记录；（2）臀围测量：从耻骨联合的前方，绕两侧的股骨及臀部最高点所测量的围度。2.3血压的测量被检测对象测量前半小时内不可吸烟、喝咖啡等。在静息状态下休息5分钟，被检查者采取坐位，使前臂屈曲放于检测桌上与心脏在同一水平线上，分别以第1音及第5音记录收缩压和舒张压，血压的单位为mmHg，每次测量间隔时间为15分钟，连续测量2次，取其算数平均值。2.4血、尿样本采集采集被检者空腹静脉血，在现场立即离心，分离血浆后-20℃冷冻保存；收集被检者清晨清洁中段尿10ml（月经期妇女除外），现场离心后-20℃冷8 新疆医科大学硕士学位论文9冻保存。2.5血尿标本检测指标包括空腹血糖、血肌酐、血尿酸、甘油三酯、总胆固醇、尿肌酐、尿白蛋白等。该标本置于-70℃冷冻保存备检。2.6血肌酐检测从冷冻箱取出血标本后，将其放置在4-8℃的冰箱内待部分溶解，随后取出放于室内常温下使其完全溶解，在标本溶解过程中将其充分摇匀。用碱性苦味酸动力法检测。2.7尿白蛋白检测从冷冻箱取出尿标本后，首先将其放置于4-8℃的冰箱使之逐渐溶解，随后放置于室内常温下使其完全溶解，在尿标本溶解过程中液需要不断震荡，充分摇匀。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测尿白蛋白。2.8DNA提取采集外周静脉血5ml,抗凝使用EDTA,按照UNIQ-10柱式血液基因组DNA试剂盒(上海生工)说明书对DNA进行提取,提取后的DNA标本置于-20℃冰箱保存。在美国国立生物技术信息数库获得ACE2基因组序列，其序列号为AY217547。通过查阅文献，我们选取了相关文献中最常用的2个SNP位点G8790A及A1075G做进一步研究。2.9PCR反应（1）PCR引物G8790AF：AAGGTTGGCAGACATCAGGTCA；G8790AR：CATTCTCTTCAGCAAAATTTCCATTGA1075GF:GAAAGGGAGAGAACTTTGGAAACCTGA1075GR:TCCCAAAACAGTATCCTTAAGTGGTGA（2）反应体系(10µl)：2xGCbuffer5ul,25mMol/LMgCl20.2ul,2.5mMol/LdNTP0.8ul,DNA1µl,引物1ul,DNA聚合酶0.1ul,ddH201.9ul。（3）反应条件：95摄氏度预变性2min,94摄氏度变性20s，退火温度在起始的11个循环中为65-60摄氏度，每个循环递减0.5摄氏度，反应40s，72摄氏度延伸30s。在以后的24个循环中，退火温度固定在59℃，反应30s,最后72℃延伸2min终止所有反应。9 新疆医科大学硕士学位论文102.10酶切反应：（1）反应体系（20µl）：包含10Xcutsmartbuffer2ul，G8790A限制性内切酶为AluI1U，A1075G限制性内切酶为MnlI1U，PCR产物10µl，ddH207µl，酶切最适温度为37℃，并在DK-8D型电热恒温水槽中过夜12小时。（2）将酶切产物稀释10倍，上3730XL毛细管电泳进行SNP分型。3质量控制按照相同的标准，运用统一的测量工具、统计方法，对研究对象的纳入、问卷资料的收集和数据的处理。问卷调查均采用统一的专业人员设计制定好的流行病学调查表，并由接受专业培训的维吾尔族医生进行询问及填写。所用检测设备、试剂、检测方法均一致。尿肌酐的测定采用罗氏602全自动分析仪，批次内部的相差度为2.78%，批次之间的相差度为4.4%；血肌酐的测定采用罗氏602全自动分析仪，批次内部的相差度为1.5%，批次之间的相差度为2.95%；采用免疫比浊法测量尿白蛋白；血糖、血脂、血尿酸等相关指标采用深圳迈瑞公司全自动生化仪；基因分型采用ABI公司3730xlgeneticanalyz。4统计学方法：采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。连续性变量采用均数±标准差表示，计量资料两组比较采用t检验，3组间比较采用one-way-ANOVA分析，等位基因频率、基因型频率的计算及比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。10 新疆医科大学硕11士学位论文11 新疆医科大学硕士学位论文12结果1研究对象一般情况本研究共纳入254例研究对象，其中男性100例，女性154例，由于ACE2基因位于X染色体上，我们按性别对一般临床指标进行比较，其中男性CKD患者41例，健康对照者59例。其中CKD组又按照是否有高血压分为非高血压组（19例），高血压组（22例）。女性CKD患者共有67例，其中合并高血压47例，非高血压20例，健康对照者共87例。女性CKD组在BMI、收缩压、舒张压、血肌酐、ACR、eGFR、TC、TG均高于健康对照组（P＜0.05），而CKD并高血压组在年龄、收缩压、舒张压及TG均高于非高血压组（P＜0.05）。男性CKD组在收缩压、舒张压、血肌酐、ACR、eGFR、血尿酸均高于健康对照组（P＜0.05）；CKD合并高血压组仅在收缩压、舒张压、ACR高于非高血压组（P＜0.05）。（见表1，2）表1男性一般临床资料在各组中的比较Table1Comparisonofmalegeneralclinicaldataineachgroup一般临床CKD组CKD组健康对照组P值P值资料高血压组非高血压组例数41592219年龄57±1655±170.57753±1661±150.150BMI25.31±3.8124.66±3.650.39425.72±3.9724.84±3.660.400收缩压145±27112±11<0.001164±19122±11<0.001舒张压90±1475±9<0.001101±1078±8<0.001血肌酐135.92±14.4264.97±9.61<0.001172.47±39.2093.60±19.190.600ACR124.04±12.4759.00±0.78<0.001170.53±55.8370.21±35.630.010eGFR83.68±29.58131.16±32.09<0.00179.10±32.3489.00±25.860.291TC4.65±1.124.31±0.890.1004.82±1.294.44±0.880.284TG1.10±0.501.17±0.780.6571.18±0.511.01±0.510.294血尿酸296±74236±67<0.001296±66295±820.984FPG4.36±0.554.54±0.670.1664.41±0.594.32±0.510.634注：ACR：尿白蛋白/肌酐；BMI：身高/体重的平方；eGFR：估算肾小球滤过率FPG:空腹血糖；TC:甘油三酯；TG：总胆固醇Scr:血肌酐12 新疆医科大学硕士学位论文13表2女性一般临床资料在各组中的比较Table2Comparisonoffemalegeneralclinicaldataineachgroup一般临床CKD组健康对照组P值P值资料高血压组非高血压组例数67874720年龄49±1550±150.82654±1239±160.001BMI25.68±4.3425.16±3.610.72225.92±4.3425.11±4.410.489收缩压148±29115±12<0.001161±20117±15<0.001舒张压92±1576±10<0.00198±1277±11<0.001血肌酐77.79±15.5554.72±10.590.01686.35±27.6454.65±24.960.156ACR155.79±28.1311.50±0.86<0.001168.31±27.28150.46±19.190.606eGFR104.37±33.01138.30±35.94<0.001104.39±34.84104.30±29.080.992TC4.83±1.034.78±0.820.6014.98±1.024.48±0.980.064TG1.54±.941.49±.4810.5851.69±0.951.19±0.810.045血尿酸207±76199±680.512217±75184±760.133FPG4.93±1.764.59±0.580.1335.47±2.824.70±1.000.107注：BMI：身高/体重的平方；Scr:血肌酐ACR：尿白蛋白/肌酐；eGFR：估算肾小球滤过率;TC:甘油三酯;TG:总胆固醇FPG:空腹血糖;2酶切结果将酶切产物稀释10倍后，上3730XL毛细管电泳进行SNP分型。ACE2G8790APCR产物片段长度为431bp，用AluI酶切后,不同基因型表现出不同的裂解模式。其中含A等位基因的PCR产物可以被切开，长度为276bp,而含G等位基因的则无法被切开，长度为431bp，GA基因型可部分被切开，长度分别为276bp,431bp。ACE2A1075GPCR产物长度为131bp，用MnlI切酶后，含G等位基因的PCR产物可被切开，长度为77bp，而含A等位基因则无法被切开，长度为131bp，AG基因型可部分被切开,长度分别为77bp,131bp（见图1、2、3）。13 新疆医科大学硕士学位论文14图1A1075GAA基因型/G8790AGG基因型Fig1A1075GAAgenotype/G8790AGGgenotype图2A1075GGG基因型/G8790AAA基因型Fig2A1075GGGGenotype/G8790AAAgenotype图3A1075GA/G8790AGA基因型Fig3A1075GA/G8790AGAgenotype14 新疆医科大学硕15士学位论文3ACE2基因两个位点多态性在男、女性人群中的分布情况：3.1ACE2基因G8790A多态性分布情况：（1）男性基因型分布情况：有67例携带G等位基因，有33例携带A等位基因。其中CKD组中，A等位基因频率高于健康对照组，且高于同组G等位基因频率，差异有统计学意义（P<0.05）；在CKD并高血压组中A等位基因频率亦高于同组G等位基因频率，却与非高血压组A等位基因频率基本相等，故差异无统计学意义（P<0.05）。（2）女性基因型分布情况：GG基因型65例，GA40例，AA49例，在CKD组中AA基因型频率高于GG基因型频率，且高于健康对照组AA基因型频率，有统计学差（P<0.05）。在CKD并高血压组中，AA基因型频率有类似分布，但与CKD非高血压组AA基因型频率基本相等（见表3）。3.2ACE2基因A1075G多态性分布情况：（1）男性基因型分布情况：男性共有48例携带G等位基因,共有52例A等位基因。CKD组中G等位基因频率低于A等位基因频率，且高于健康对照组G等位基因频率，但无统计学意义（P>0.05）；在CKD并高血压组中G、A等位基因频率相等，且低于非高血压组G等位基因频率，亦无统计学意义（P>0.05）。（2）女性基因型分布情况：其中51例GG基因型，47例GA基因型，56例AA基因型。CKD组GG基因型频率高于AA基因型频率，且高于健康对照组GG基因型频率，但无统计学意义（P>0.05）。在CKD并高血压组中GG基因型与AA基因型频率基本相等，低于非高血压组GG基因型频率，且有统计学意义（P<0.05）（见表3）。15 新疆医科大学硕士学位论文16表3ACE2等位基因及基因型频率在男、女性各组分布情况Table5DistributionofACE2alleleandgenotypefrequencyinmaleandfemalegroupsCKD（67）基因型/等位基因CKD组健康对照组p值p值高血压组非高血压G8790AN（%）N（%）N（%）N（%）GG18(26.9)26(63.4)0.00113(27.7)5(25.0)0.968女性GA19(28.4)21(24.2)13(27.7)6(30.0)AA30(44.8)19(21.8)21(44.6)9(45.0)G15(36.6)52(88.1)<0.0018(36.4)7(36.8)0.975男性A26(63.4)7(11.9)14(63.6)12(63.2)A1075GN（%）N（%）N（%）N（%）女性GG28(41.8)23(26.4)0.13314(29.8)14(70.0)0.009GA18(26.9)29(33.3)15(31.9)3(15.0)AA21(31.3)35(40.3)18(38.3)3(15.0)男性G22(53.7)26(44.1)0.3411(50)11(57.9)0.256A19(46.3)33(55.9)11(50)8(42.1)4ACE2基因多态性与CKD组相关临床指标关系：4.1ACE2G8790A基因多态性与CKD组相关临床指标关系（1）在女性CKD组中AA基因型的收缩压水平较GG、GA基因型有所升高（P<0.05），且eGFR较GG、GA基因型降低（P<0.05）（见表4）（2）在男性CKD组中，携带A等位基因患者的血肌酐、尿蛋白与肌酐比率、血尿酸水平均高于G等位基因携带者（P<0.05），且eGFR较G等位基因降低（P<0.05）（见表4）16 新疆医科大学硕17士学位论文表4ACE2G8790A基因型、等位基因与CKD组相关指标之间的关系Table4TherelationshipbetweenthegenotypeoralleleofACE2G8790AandtherelatedindexesofCKDgroupGGGAAAP值GAP值性别女性男性人数1819301526年龄46±1649±1551±150.56447±1763±150.001BMI26.22±4.5425.36±4.3225.56±4.350.82224.82±3.7325.12±3.750.711收缩压138±21141±21157±340.042139±24148±280.289舒张压87±1189±1496±170.09186±1492±140.153Scr55.39±23.6374.75±25.9993.14±26.950.24369.21±16.6144.52±15.33<0.001ACR141.55±14.58167.10±12.96157.16±12.210.83476.30±28.46128.36±97.730.001eGFR125.50±32.07100.00±27.6794.44±31.770.004125.08±34.7184.54±32.30<0.001TC4.53±0.974.95±0.964.93±1.090.3584.30±1.114.85±1.100.128TG1.28±0.521.42±0.8877±1.120.1861.13±0.741.17±0.540.780血尿酸220±53212±86196±830.545259±44317±790.012FPG4.76±0.824.64±0.935.22±2.450.4814.47±0.635.80±0.780.168注：BMI：身高/体重的平方；Scr:血肌酐ACR：尿白蛋白/肌酐；eGFR：估算肾小球滤过率;TC:甘油三酯;TG:总胆固醇FPG:空腹血糖;4.2ACE2A1075G基因多态性与CKD组相关临床指标关系（1）在女性CKD组中血压、血肌酐、尿蛋白与肌酐比率等相关指标在ACE2A1075G各基因型中无差异（P>0.05）。（见表5）（2）男性CKD组的血压、血肌酐等相关临床指标在ACE2A1075G等位基因分布中也无明显差异（P>0.05）。（见表5）17 新疆医科大学硕士学位论文18表5ACE2A1075G基因型、等位基因与CKD相关指标之间的关系Table5TherelationshipbetweenACE2A1075GgenotypesorallelesandtherelatedindexesofCKDgroupGGGAAAP值GAP值性别女性男性人数2818212219年龄46±1651±1153±14.09450±1753±15.653BMI24.86±4.4825.12±3.7724.44±3.27.75224.78±3.9825.05±3.48.719收缩压123±18124±21147±35.065124±23126±27.774舒张压80±1180±1391±18.28181±1481±14.968Scr63.98±12.1262.64±10.0361.18±37.46.74488.18±26.12112.05±29.48.560ACR55.49±18.6472.73±19.8488.48±33.35.32546.65±27.71113±25.62.661eGFR124.41±39.44121.80±36.21123.55±39.7.943116.28±44.93107.47±32.06.259TC4.39±1.024.51±0.774.76±1.04.1544.56±1.084.34±0.92.306TG1.17±0.681.23±0.941.36±0.72.4251.14±0.711.13±0.64.898血尿酸99±71215±87197±54.447259±69262±82.868FPG4.71±0.824.61±0.674.81±2.22.8104.49±0.595.3±0.62.51118 新疆医科大学硕士学位论文19讨论慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD）随着其进展最终发展为终末期肾脏病，其在全球的患者人数呈递增趋势，因其预后较差，花费巨大，给社会几家庭带来沉重的经济及精神负担，已逐渐成为整个世界所需共同面对的问题。近年来，CKD地流行病学调查也已经成为世界关注的热点，欧、美等发达国家比较早开始对CKD的流行病学调查，美国开始于1967，而日本则1972年便开始对慢性肾脏病的流行病学调查，其覆盖范围的广泛性，调查的严格性和全面性是值得我们借鉴和学习。美国对1900万成年人得流行病学调查显示，起重慢性肾脏疾病患病率远大于11%。同时，在日本、欧洲及澳大利亚的流行病学调查数据也是触目惊心的，竟有6%～16%的CKD患者[19]。而在发展中国家，因其人力、物力、财力不及发达国家充裕，故对慢性肾病和终末期肾病的调查研究尚欠缺。墨西哥曾对当地城市的3564例成年居民进行了慢性肾脏病地患病率横断面调查研究，结果提示慢性肾脏病氮质血症期(CKD2期)的发病率为调查人群的29.0%，慢性肾脏病3期的患病率为调查人群的8.1%[20]。我国关于慢性肾脏病流行病学调查数据相对匮乏，其中在2010年进行的一项横断面调查结果显示，18岁以上得成年人群中CKD得患病率为10.8%[21]。我国大城市进行得CKD患病率调查数据主要集中在北京，在2004年，北京大学第一附属医院对长期居住北京石景山区得4个社区公民进行了调查，其中年龄大于40岁的中老年居民有2353名，调查数据显示中国北京等大城市的老年人口CKD得患病率为9.4％，几乎等同于发达国家患病率[22]。提示我国大城市慢性肾脏病地患病率几乎接近于欧美等发达国家水平。我国目前仍处于并在很长一段时间内处于农业大国，农村人口占我国人口基数的主要部分，但对农村人群流行病学调查研究微乎其微。新疆位于我国西北部，地处偏远，占有全国1/6的土地，人口基数较大，且绝大部分（46%）为维吾尔族人群，其中75%的人群居住在农村。由于该地区偏远，经济落后，因此该地区的调查研究数据匮乏。我科于2003年起便开始对新疆墨玉县农村维吾尔族成人慢性肾脏病患病率展开调查，通过调查，结果显示该地区成人CKD患病率为5.4%，对疾病的知晓率为12.5%[17]。但通过对地区CKD得流行病学研究，可反应该地区疾病分布特征，从而为CKD早期预防提供理论基础。但是对于CKD早期的流行病研究比较欠缺。目前，关于慢性肾脏病大规模地流行病学调查数据仍局19 新疆医科大学硕士学位论文20限于终末期肾脏病（CKD5期）阶段。因此，慢性肾脏病相关危险因素得寻找及干预，故需呼唤全社会引起关注，开展对CKD的早期筛查，具有重大的社会价值和重要的临床意义。基因多态性（polymorphism）指的是在一个生物群体中，同时存在两种或两种以上不连续的等位基因或基因型或变异型，该现象普遍存生于圣武群体中。人类基因多肽性可分为3类：①DNA重复序列的多态性，尤其是短串联序列重复。②限制性片段长度多态性（RFLP）。③单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，其中包括单个碱基的置换，单个碱基的缺失和插入，其中更多的是单个碱基的置换，这也是目前研究者们研究火热的一类多态性。SNP在基因组中数目，分布秘籍，易于批量检测，且能反映个体间的遗传差异。因此，各种常见疾病及药物遗传学研究常将其作为有效的运用工具，这将推动慢性肾脏疾病在分子遗传水平的预防、诊断和治疗领域迈向新的台阶。1ACE2与慢性肾脏病在一项大鼠的动物实验研究发现，ACE2在原发性高血压大鼠肾内表达下调[23,24]，在高血压肾脏病患者的标本中也证实，ACE2的表达水平也会减低，但同时发现ACE的表达是增高的[25]。有研究发现在ACE2基因敲除的Akita小鼠中肾小球基底膜增厚，尿白蛋白增加。在糖尿病肾病肾活检患者标本中也发现:肾小球和小管间质ACE的表达增加，ACE2表达降低[26]。除了在高血压，高血压肾损害及糖尿病肾病发现ACE2的表达变化，在IgA肾病，微小病变肾病，肾小球局灶节段性硬化、膜性肾病等原发性或继发性肾脏病病理类型中，ACE2在肾小球和肾小管周毛细血管内皮中均有新的表达[27]，而ACE2基因干预治疗可以延缓高血压肾损害的进展，并且在ACE2基因干预治疗的糖尿病大鼠模型中，肾脏炎症和纤维化指标减轻[28]。还有研究发现在CKD（3-5期）患者ACE2活性可作为肾功能进展[29]。我们在ACE2基因敲除的小鼠的单侧输尿管梗阻动物模型中证实血管紧张素转换酶-2可能通过与Smad相互作用拮抗血管紧张素II介导的肾脏炎症和纤维化作用[4],当AngII的主要降解通路受阻时，肾脏炎症和纤维化都加重，这与肾内AngII升高,血管紧张素1-7降低（AT1和ERK1/2信号激活）及TGF-β/Smad及NF-κB的激活有关。20 新疆医科大学硕士学位论文21在动物实验和临床资料，及各种原因的慢性肾脏病中，ACE2的表达变化都与慢性肾脏病的发展密切相关，血管紧张素转换酶2作为AngII的主要降解途径可能为慢性肾脏病的治疗提供新的靶向位点。2ACE2与心血管疾病最新研究发现，没有心血管疾病病史的CKD患者，其血ACE2活性与传统的心血管危险因素如：男性、老年及糖尿病直接相关，该研究证明ACE2在抗动脉粥样硬化中起保护作用[30]。这可能部分由于ACE2反调控AngII信号转导以及抑制炎症反应有关，是动脉粥样硬化、心血管事件发生的生物标记[31]。最初的研究认为ACE2只在老年患者及高患病率的疾病如：心血管疾病、糖尿病、高血压中被检测到[32]，但随后的研究发现ACE2在健康人中也可检测出[33]，且在心衰、心肌梗死[34]患者中ACE2活性更高。研究发现心血管疾病（CHD），包括高血压在内患者CKD患病率为21.4%,而非CHD患者CKD患病率仅为9.7%[39]。这暗示心血管疾病与慢性肾脏病的患病风险之间可能存在千丝万缕的联系。3ACE2G8790A基因型多态性与慢性肾脏病的关系近年来，研究者们对ACE2基因多态性与临床多种常见疾病的相关性展开了炙热研究，成为多基因遗传病领域的一个研究焦点。其位于22号X性染色体上，含有18个外显子，目前已知的有159个ACE2基因位点，大部分位于非编码区的内含子区域，其中研究较多的是位于第3内含子、紧靠外显子的G8790A多态性与原发性高血压，高血压肾损害，糖尿病肾病，代谢综合征肾损害及与蛋白尿的关联性。王群等通过横断面病例对照研究发现ACE2基因多态性与2型糖尿病的易感性可能无关，但与糖尿病肾病的发生有一定的关联[16]。在近期的一篇meta分析中发现ACE2基因多态性与不同种族女性及汉族男性原发性高血压发生均有关[11]，且A等位基因为汉族男性高血压的危险因素[35]。有研究者发现ACE2基因G790A多态性与山西汉族原发性高血压及原发性高血压合并代谢综合征无明显相关性，但女性高血压合并代谢综合征者其舒张压水平明显升高[37]。目前，尚缺乏G8790A与CKD的相关性研究的报道，本研究发现：（1）在ACE2G8790A基因多态性与女性CKD组相关临床指标的关系中：①AA基因型收缩压高于GG及GA基因型，eGFR较GG、GA基因型降低；②男性CKD组中，A、G等位基因在血压之间无差异，但A等位基因在血肌酐、尿蛋21 新疆医科大学硕士学位论文22白与肌酐比率高于G等位基因，且eGFR较G等位基因降低。这提示AA基因型可能与CKD女性血压升高有关，A等位基因可能与CKD男性血肌酐、Scr升高及eGFR降低有关。（2）在ACE2等位基因及基因型频率分布情况中发现：①CKD组女性AA基因型频率及男性A等位基因频率均高于健康对照组；②女性CKD并高血压组与非高血压组各基因型及男性等位基因比较中，均无统计学差异。这提示AA基因型可能与女性CKD易感性有关，而A等位基因可能与男性CKD有关。4ACE2A1075G基因型多态性与慢性肾脏病的关系目前亦未查阅到有关ACE2A1075G基因多态性与CKD关系的报道，关于A1075G基因多态性的研究多集中在与原发性高血压的关联中，ACE2A1075G基因多态性与北京房山区男性汉族2级高血压有关，且A等位基因频率高于G等位基因频率，但在汉族女性2级高血压患者中，基因型频率分布无统计学意义[36]。李金等研究了包括ACE2A1075G在内的5个基因位点，均未发现ACE2基因多态性与东北地区原发性高血压有关[38]。本研究发现：①CKD组男性等位基因及女性基因型频率与健康对照组比较均无明显差异；②但在女性CKD合并高血压组中，AA基因型频率高于CKD非高血压组AA基因型频率。结果的不一致，可能与区域、民族、性别不同，或是样本量过小所致。我们的研究提示AA基因型可能与女性CKD并高血压有关。综上所述，ACE2G8790A基因多态性可能与新疆维吾尔族成人CKD有关。ACE2A1075G基因多态性可能与新疆维吾尔族成人女性CKD合并高血压有关。因此，我们可对上述两个位点基因型/等位基因进行检测，筛查出易感人群，从而为CKD、CKD并高血压的早期防治提供新的诊疗思路。但由于高血压为CKD的常见病因，同时，CKD往往合并高血压，ACE2在高血压,CKD中都发挥重要作用，故ACE2基因多态性和CKD的关系是否受血压状态的影响，尚需后续研究进一步明确。本研究人群分布较为局限，且样本量较少，只选取了新疆墨玉县维吾尔族，在外推至整个维吾尔族时可能会有局限。且未能检测人血ACE2浓度，无法评估ACE2浓度在CKD及健康对照组中有无差异，并进一步分析ACE2浓度与其基因型之间的关系。因此，还需进行多中心、多民族、大样本的研究进一步证实ACE2基因多态性与CKD及高血压的关系。22 新疆医科大学硕士学位论文23小结1ACE2G8790A基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔族成人CKD有关，AA基因型可能与女性CKD收缩压升高有关。2ACE2A1075G基因多态性可能与新疆墨玉县维吾尔族女性成人CKD合并高血压有关。23 新疆医科大学硕士学位论文24致谢光阴荏苒，岁月如梭，转眼间，我的硕士研究生三年的学生生活即将结束，心里不免有些难过和太多不舍，但更多的是感谢。在此，我想借此机会，衷心感谢每一位在我成长过程中帮助我的的同学、关怀和耐心教导我的老师以及支持我的亲人。特别感谢我的导师刘健教授，在学业上给予谆谆教诲和耐心指导，使我无论在临床专业还是在理论基础方面，都有了很大进步。主任常常教育我从患者身上学习，他们是医学发展最根本的来源，要尊重每一位患者。同时导师实事求是的工作态度、精益求精、不断进取的学习精神及忘我的敬业精神，使我终身收益。更让我难忘的是您对我生活与工作上的关心与无微不至的关怀，时常让我感动，让我全身心地投入到工作和学习中。我的导师不仅治学严谨，而且待人接物谦和，平易近人，是我学习的楷模，衷心感谢导师对我的培育之恩!非常感谢桑晓红主任医师对我的关心和指教，虽然她不是我的导师，但无论我有什么困难找到您，您都会竭尽全力的帮助我，科室都尊称您为“桑妈妈”；还要特别感谢刘珍副主任医师、撒圆圆师姐在课题的完成方面、临床学习和工作中给予我的热心指导和帮助!无限感激新疆医科大学研究生院、统计学教研室、一附院研究生科和科研科的各位老师在我学习期间给予我热心的帮助和指导，让我顺利的渡过了难忘的研究生生活，衷心感谢你们！万分感谢我的家人，在我求学期间他们所给予我精神和物质方面的大力支持，没有你们的支持也就没有我今天的学业上所取得的成绩。最后，祝愿所有关心、帮助和支持我的老师、同学、家人身体健康，工作顺利，也祝愿自己前程似锦！！！24 新疆医科大学硕士学位论文25参考文献：[1]PreventionofangiotensinII-mediatedrenaloxidativestress,inflammationandfibrosisbyangiotensinconvertingenzyme2.Hypertension,2011;57(2):314-322.[2]VickersC,HalesP,KaushikV,DickL,etal.Hydrolysisofbiologicalpeptidesbyhumanangiotensin-convertingenzyme-relatedcarboxypeptidase.(J).JBiolChem2002,277(17):14838-14843.[3]ChadbanSJ,BrigantiEM,KerrPG,etal.PrevalenceofKidneydamageinAustralianadults:TheAusDiabKidneyStudy.JAmSocNephrol2003;14:S131-138.[4]LiuZ,HuangXR,ChenHY,etal.Lossofangiotensin-convertingenzyme2enhancesTGF-β/Smad-mediatedrenalfibrosisandNFκB-drivenrenalinflammationinamousemodelofobstructivenephropathy.LabInvest.2012Feb13.[5]LelyAT,HammingI,vanGoorH,etal.RenalACE2expressioninhumankidneydisease.JPathol2004,204:587-593.[6]BatlleD,WysockiJ,SolerMJ,etal.Angiotensin-convertingenzyme2:enhancingthedegradationofangiotensinIIasapotentialtherapyfordiabeticnephropathy.KidneyInt,2012,81(6):520-528.[7]LiuCX,HuQ,WangY,etal.Angiotensin-convertingenzyme2overexpressionremarkablyamelioratedglomerularinjuryinaratmodelofdiabeticnephropathy:AcomparisonwithACEinhibition［J］.MolMed,2011,17(1-2):59-69.[8]宋蓓,钟久昌.ACE2基因-肾脏纤维化干预新靶点.中华临床医师杂志:电子版,2012,6(10:2758-2760)[9]ZhongJC,GuoD,ChenCB,etal.PreventionofangiotensinII-mediatedrenaloxidativestress,infIammation,andfibrosisbyangiotensinconvertingenzyme2.Hypertension,2011,57:314-322[10]YangF,HuangXR,ChungAC,HouCC,LaiKN,LanHY.EssentialroleforSmad3intensinII-inducedtubularepithelial-mesenchymal-transition.JPathol.2010Aug;221(4):390-401.[11]LuN，YangY，WangY，eta1．ACE2genepolymotphismandessentialhypertension;anupdatedmeta-analysisinvolving11,051subjects[J],MolBiolRep,2012,39(6)：6581-6589．[12]SongSB,JinHS,HongKW,eta1.Associationbetweenrenin-angiotensin-aldosteroneystem-relatedgenesandbloodpressureinaKoreanpopulation[J].Blood25 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新疆医科大学硕士学位论文27ShibuyaK,HaseH,etal:ExpressionofACEandACE2inindividualswithdiabetickidneydiseaseandhealthycontrols.AmJKidneyDis2008;51:613–623.[27]LiuCX,HuQ,WangY,etal.Angiotensin-convertingenzyme2overexpressionremarkablyamelioratedglomerularinjuryinaratmodelofdiabeticnephropathy:AcomparisonwithACEinhibition[J].MolMed,2011,17(1-2):59-69.[28]OuditGYLiuGC,ZhongJ,etal.HumanRecombinantACE2reducestheprogressionofdiabeticnephropathy.Diabetes,2010,59:529-538.[29]ZhangY.X.ZhaoY.H.ZhangL.etal,Angiotensinconvertingenzyme2attenuatesatheroscleroticlesionsbytargetingvascularcells,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(2010)15886-15891.[30]M.A.Roberts,E.Velkoska,F.L.Ierino,L.M.Burrell,Angiotensin-convertingenzyme2activityinpatientswithchronickidneydisease,Nephrol.Dial.Transpl.28(2013)2287e2294.[31]L.Anguiano,M.Riera,J.Pascual,J.M.Valdivielso,C.Barrios,A.Betriu,etal.,Circulatingangiotensin-convertingenzyme2activityinpatientswithchronickidneydiseasewithoutprevioushistoryofcardiovasculardisease,Nephrol.Dial.Transpl.30(2015)1176e1185.[32]G.I.Rice,A.L.Jones,P.J.Grant,A.M.Carter,A.J.Turner,N.M.Hooper,Circulatingactivitiesofangiotensin-convertingenzyme,itshomolog,angiotensinconvertingenzyme2,andneprilysininafamilystudy,Hypertension48(2006)914-920.[33]R.A.Lew,F.J.Warner,I.Hanchapola,etal.,Angiotensin-convertingenzyme2catalyticactivityinhumanplasmaismaskedbyanendogenousinhibitor,Exp.Physiol.93(2008)685-693.[34]S.Epelman,W.H.W.Tang,S.Y.Chen,etal.,Detectionofsolubleangiotensin-convertingenzyme2inheartfailure:insightsintotheendogenouscounter-regulatorypathwayoftherenin-angiotensinaldosteronesystem,J.Am.Coll.Cardiol.52(2008)750-754.[35]Si,D.N,Li,L,Chui,T.X.AssociationofangiotensinIconvertingenzyme2genepolymorphismandessentialhypertensionwithdiabetesmellitus.Chin.J.Pract.Nerv.Dis.12,(2009)38-40.[36]NiuW,QiY,HouS,etal.Correlationofangiotensin-convertingenzyme2genepolymorphismswithstage2hypertensioninHanChinese.ranslRes.200727 新疆医科大学硕士学位论文28Dec;150(6):374-80.Epub[37]曲华，高东来，血管紧张素转换酶2基因G-8790A多态性与原发性高血压合并代谢综合征关系的探讨[D].山西医科大学,2010.DOI:10.7666/d.Y1686461.[38]LiJ,FengM,WangY,etal.TherelationshipbetweenthreeX-linkedgenesandtheriskforhypertensionamongnortheasternHanChinese.ReninAngiotensinAldosteroneSyst.2015Dec;16(4):1321-8.[39]LiuH,YuJM,ChenF,etal.Inpatientswithcoronaryheartdiseasehaveahighprevalenceofchronickidneydiseasebasedonestimatedglomerularfiltrationrate(eGFR)inChina.HeartVessels,2007,22(4):223-228.28 新疆医科大学硕士学位论文29综述肾内血管紧张素转换酶与肾内血管紧张素转换酶2的回顾与进展李芳综述刘健审校肾内局部RAS作为旁分泌激素，与循环RAS不同。首先，经典的RAS的所有成分均在肾脏中呈现及表达。肾素不仅由肾小球球旁器细胞，还可通过连接小管和集合管主细胞产生[1-2]。虽有不少证据证明，大部分肾血管紧张素原（AGT）是由肝脏产生，但AGT也可在肾近曲小管产生[3]。其次，肾脏存在着可将血管紧张素I（AngI）转换成AngII的血管紧张素转换酶（ACE）[4]。再者，肾内AngII水平较血浆高1000倍左右[5]，这意味着肾内AngⅡ实际上大部分是在肾脏产生，并作为一种旁分泌激素作用于邻近组织[6]。最近发现的RAS新成员，即血管紧张素转换酶2（ACE2）和相应的ACE2/Ang（1-7）/MAS轴，它们也存在于肾脏中[6]。它与经典RAS通路作用不同，主要起拮抗经典RAS的作用。1ACE及ACE2无论在循环还是肾内，ACE是将AngI转换成AngII的产生作用的主力酶。ACE是由17号常染色体q23的基因所编码[7]。传统观点认为肺上皮细胞是ACE的主要来源，但研究发现人类肾脏可产生大量ACE，至少是肺ACE含量的5倍[8]。肾内ACE浓度在近端小管刷状缘最高。但有报道认为ACE的表达主要在肾小球内皮细胞等部位[8,9]。在AngⅡ诱导的高血压，高血压肾病、糖尿病肾病模型中，肾脏ACE表达增加，这提示ACE在高血压、高血压肾损伤的发病中起关键作用[10-11]。ACE2是2000年首次报道的一种单羧肽酶，它由一个信号肽、一个跨膜区及锌结合区位点三部分组成[12]。它可以抵消我们熟知的ACE/AngII/AT1R轴的作用。ACE2将AngII降解为具有舒张血管及抗增殖作用血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]，也可将AngI降解为Ang(1-9）。Ang(1-7)通过其受体Mas(MasR)发挥抗氧化、抗纤维化、抗炎等作用[13]。ACE2在29 新疆医科大学硕士学位论文30循环、肾脏、心脏、肺、肝脏、神经等多种组织中均有表达[14-16]。而肾内ACE2主要在肾小管、肾小球上皮细胞，血管平滑肌细胞中表达程度高[14,15]。与ACE相似，ACE2的表达改变了糖尿病肾病[17]，高血压肾病[19]，肾脏纤维化[20]等肾脏疾病的状态。2ACE及ACE2与高血压最近关于ACE在盐敏感性高血压中的作用引起了研究者们的广泛兴趣。盐敏感性与高血压的发病密不可分。肾脏在受到炎症或氧化应激等损伤时，RAS活性会增加，钠排泄减少[21]，进而使血容量增加。最近，Giani等和Gonzalez-Villalobos团队使用最小或肾脏缺乏ACE表达的小鼠实验证实了ACE在这一过程中的作用机制。这些小鼠循环中ACE及AngII水平正常，且肾脏发育正常。对肾脏缺乏ACE小鼠静脉注射AngII，发现它们并没有发生高血压，其肾脏局部AngII也未增加，尿钠排泄亦未减少；静脉注射AngII后野生型小鼠也观察到一样的结果。这使研究人员确信是肾脏ACE的独立作用[17,18]。Gian同时给予两种小鼠一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME，该药物可激活肾内RAS活性而不增加循环中RAS活性，随后再给予高盐饮食。实验中，仅给予L-NAME时，野生型小鼠发展为高血压，而肾内缺乏ACE的小鼠给予L-NAME和高盐饮食后均未形成高血压[22]。这一结果与肾内缺乏ACE小鼠肾小管钠氯协同转运蛋白磷酸化及上皮钠通道a表达更低相一致[23]。Gonzalez等发现，肾脏缺乏ACE小鼠在高盐状态下也能保持较高水平的肾小球滤过率，而给予L-NAME的野生型小鼠这种作用消失[18]。该实验模型说明与野生型小鼠相比，肾内缺乏ACE小鼠具有抗L-NAME诱导盐敏感性。相反，有实验研究发现仅在肾小管上皮细胞表达ACE的小鼠给予L-NAME后发展为盐敏感性高血压。关于肾内ACE的活性引起盐敏感性高血压的确切部位还需利用仅在肾小管上皮细胞刷状缘缺乏ACE的小鼠进一步研究明确[13]。总之，这一系列实验证明，肾小管上皮细胞产生的ACE在盐敏感性高血压起重要作用，其与循环RAS不同，主要通过调节肾脏钠的转运发挥作用。随着ACE2在内的新RAS成员发现，关于ACE和ACE2在高血压中的相互作用成为该领域研究热点。研究者们熟知ACE2/Ang(1-7)/Mas轴反调ACE/AngII/AT1R轴导致的收缩血管、升高血压作用。Berger等研究表明，原发性高血压大鼠高盐饮食后ACE2的表达下降，肾内ACE与ACE2的比例升高，肾小球增生肥大，足细胞足突消失，尿白蛋白量增加。但给30 新疆医科大学硕士学位论文31予低盐和正常盐饮食的对照组大鼠肾内ACE和ACE2比率降低[19]。这些研究结果暗示着ACE和ACE2比值变化可能是造成血压变化的原因。另一项研究中发现，连续给予原发性高血压大鼠氯沙坦降压，其ACE2表达增加，但肾ACE2受体Mas并没有增加[24]，提示ACE2活性可能与血压下降有关。Huskova等研究发现，肾内ACE2/Ang1-7的改变并不能明显改善cyp1a1-ren-2转基因大鼠ACE/AngII/AT1R通路活性增加导致的恶性高血压进展[25]。总之，这些研究对肾内ACE及ACE2在高血压中的作用提供了反面证据，使我们认识到关于肾内两个轴在高血压之间的特异性相互作用还需要进一步研究。3ACE及ACE2与糖尿病肾病RAS在糖尿病肾病中也起重要作用。有研究表明，ACE基因多态性对肾脏及循环ACE的表达有不同程度的影响，且为糖尿病肾病不同阶段的危险因素[7]。之前的实验室及临床研究已经证实，糖尿病肾病动物及人类肾小球、肾小管ACE2表达均显著下降[26]。而Soler等报道发现在非肥胖糖尿病小鼠肾皮质ACE2表达增加[27]。用ACE2抑制剂链脲霉素诱导的糖尿病小鼠较单纯糖尿病小鼠尿白蛋白/肌酐比率增加，肾小球系膜细胞扩张[28]。Clotet和Wysocki等研究发现，与野生型糖尿病小鼠相比，ACE2基因敲除的糖尿病小鼠血压升高，肾小球系膜细胞增生，足细胞消失，肾脏纤维化增加[29,30]（包括αSMA蓄积、增多，胶原的沉积）。重要的是，ACE2发挥肾脏保护作用与特定的表达部位有关。在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠循环中增加ACE2，未能改善肾小球滤过率，蛋白尿，肾组织纤维化[31]。但增加肾小管上皮细胞ACE2表达，可减少高糖诱导的活性氧（ROS）生成，逆转细胞凋亡。Giani等研究也发现类似结果，增加糖尿病小鼠近端小管ACE2表达，其肾脏纤维化、尿白蛋白得到改善[24]。有证据表明，ACE2可在尿中测得，其水平可作为监测疾病进展和代谢状态的指标[14]。在高血糖模型设定中，ACE2跨膜区被“解整合素-金属蛋白酶17”（ADAM17）和近端小管顶端模上的PKCδ分解，随尿液排出[32]。Mariana等研究表明，尿蛋白/肌酐比值与代谢指标包括空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯及总胆固醇呈正相关[33]。此外，尿ACE2水平可预测尿nephrin水平，是足细胞健康状态的一个标记[34]。Soler等研究发现，阻止肾脏ACE2的脱落可能对肾脏病的治疗提供新的方法。研究指出，与不给帕立骨化醇的非肥胖1型糖尿病对照组小鼠相比，给予帕立骨化醇的糖尿31 新疆医科大学硕士学位论文32病小鼠ADAM17表达降低，ACE2的表达增加[29]。这些研究表明，ACE2的水平可以通过防止从肾脏脱落增加，并提出了尿ACE2水平是否为评估糖尿病肾病进展以及治疗反应的指标。与高血压类似，越来越多证据表明，肾脏ACE/AngII/AT1R与ACE2/Ang（1-7）/MAS通路活性增加，是糖尿病肾病进展的关键。AT1R拮抗剂坎地沙坦，在糖尿病肾病的治疗作用已达共识，该药物被证明可以改善肾小管损伤和减少蛋白尿，其部分通过上调肾脏中ACE2/AT2R／MAS轴活性来发挥作用[18]。糖尿病大鼠给予骨化三醇治疗后，肾脏ACE水平降低，ACE2表达增加，从而降低ACE与ACE2的比率，同时蛋白尿减少[35]。有趣的是，在这项研究中，ACE的降低是通过p38MAPK通路介导，而ACE2上调是通过ERK信号通路实现的[36]。糖尿病小鼠给予重组人ACE2后同样可以减少肾损伤、血压和NADPH氧化活性降低[37]。在高糖或增加AngⅡ诱导肾系膜细胞疾病的体外研究表明，ACE2可减少氧化应激的发生，部分是通过增加其转化为Ang（1-7）来拮抗AngⅡ的作用[37]。研究发现肾内ACE2表达被抑制时，ACE表达增加，这进一步说明了ACE及ACE2之间的复杂关系。Velkoska等报道了：ACE2基因敲除的小鼠循环ACE表达增加，肾病恶化，而肾皮质ACE实际上是下降的[38]。这些研究结果说明关于糖尿病肾病患者ACE和ACE2之间的相互作用仍需进一步研究。4ACE、ACE2与慢性肾脏病及肾脏纤维化ACE/AngII/AT1R轴对慢性肾脏病（CKD）的肾损害众所周知，ACE2/Ang（1-7）/MAS轴的保护作用也越来越显著。ACE2缺乏使肾脏炎症和纤维化增加，加速慢性肾脏病的进展[39]。相反，高脂饲料喂养的小鼠给予Ang（1-7），其血浆及肾脏中的炎症指标，包括IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1显著降低。这主要是通过LDLr-SREBP2-SCAP通路调节脂质代谢，从而减少血脂异常导致的肾损伤[40]。同样，对ApoE基因敲除小鼠补充rACE2后，IL-1β，IL-6，TNF-α、IL-17A、TGF-β和I型胶原表达及肾损伤均降低，其主要是通过mTOR/ERK信号通路来调节Ang（1-7）/AngII的平衡来发挥作用[20,39]。在单侧输尿管梗阻的试验模型中，给予肾脏保护剂GLP-1类似物exendin-4，可逆转ACE上调、增加ACE2表达的同时减少肾纤维化、AngII、纤维化因子TGF-β/Smad3的表达[41]。该研究倾向于是exendin增加ACE2的表达从而使Ang（1-7）生成增加而导致上述结果，但并无统计32 新疆医科大学硕士学位论文33学意义[41]。这些结果在一定程度上强调了ACE和ACE2相对活性在肾间质纤维化进展中的重要性。与糖尿病研究结果类似，也有证据表明，尿ACE2水平增加可能是肾脏疾病恶化的信号。肾大部切除的小鼠不仅肾皮质ACE减少、肾皮质和髓质ACE2活性增加，而且尿ACE2水平增加与尿蛋白排泄量呈正相关、与肌酐清除率呈负相关[38]。类似的研究发现，CKD（3-5）期和接受透析的CKD5期患者循环中ACE2活性明显降低，且CKD（3-5）期患者尿ACE2明显增加，且与尿蛋白/肌酐比率有关[42]。这些研究表明，尿ACE2水平可能是肾脏及循环ACE2活性及慢性肾脏病进展的标志之一。5小结RAS一直被认为是肾脏病理生理学重要成员之一，对肾脏RAS及其作用的认识也在不断发展。随着RAS新成员的发现，使得RAS图谱变得越来越复杂。肾内ACE和ACE2之间的相互作用对于理解RAS如何促进或者延缓累及肾脏的各种病理过程显得非常重要。同时，RAS这两个重要成员之间相互作用和相互调节的确切机制远未解决。因此，进一步探索两个重要成员之间的关系可能对未来高血压和肾脏疾病的检测和治疗有重要意义。33 新疆医科大学硕士学位论文34参考文献：[1]RohrwasserA,MorganT,DillonHF,ZhaoL,CallawayCW,HillasE,etal.Elementsofaparacrinetubularrenin-angiotensinsystemalongtheentirenephron.Hypertension.1999;34:1265–74.[2]YangT,XuC.Physiologyandpathophysiologyoftheintrarenalrenin-angiotensinsystem:anupdate.JAmSocNephrol.2017;28:1040–9.[3]MatsusakaT,NiimuraF,ShimizuA,PastanI,SaitoA,KoboriH,etal.LiverangiotensinogenistheprimarysourceofrenalangiotensinII.JAmSocNephrol.2012;23:1181–9.[4]CasariniDE,BoimMA,StellaRC,Krieger-AzzoliniMH,KriegerJE,SchorN.AngiotensinI-convertingenzymeactivityintubularfluidalongtheratnephron.AmJPhys.1997;272:F405–9.[5]CareyRM.Theintrarenalrenin-angiotensinsysteminhypertension.AdvChronicKidneyDis.2015;22:204–10.[6]ErdosEG,SkidgelRA.StructureandfunctionsofhumanangiotensinIconvertingenzyme(kininaseII).BiochemSocTrans.1985;13:42–4.[7]RahimiZ.Theroleofreninangiotensinaldosteronesystemgenesindiabeticnephropathy.CanJDiabetes.2016;40:178–83.[8]BernsteinKE,GianiJF,ShenXZ,Gonzalez-VillalobosRA.Renalangiotensin-convertingenzymeandbloodpressurecontrol.CurrOpinNephrolHypertens.2014;23:106–12.[9]Gonzalez-VillalobosRA,BilletS,KimC,SatouR,FuchsS,BernsteinKE,etal.Intrarenalangiotensin-convertingenzymeinduceshypertensioninresponsetoangiotensinIinfusion.JAmSocNephrol.2011;22:449–59.[10]Gonzalez-VillalobosRA,SatouR,OhashiN,Semprun-PrietoLC,KatsuradaA,KimC,etal.Intrarenalmouserenin-angiotensinsystemduringANGII-inducedhypertensionandACEinhibition.AmJPhysiolRenalPhysiol.2010;298:F150–7.[11]VioCP,JeanneretVA.Localinductionofangiotensin-convertingenzymeinthekidneyasamechanismofprogressiverenaldiseases.KidneyIntSuppl.2003;86:S57–63.[12]GianiJF,EriguchiM,BernsteinEA,KatsumataM,ShenXZ,LiL,etal.Renaltubularangiotensinconvertingenzymeisresponsiblefornitro-L-argininemethyl34 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