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分类号：Ｒ７８１．４密级：公开：１０７６０２１４７６７８单位代码：１０７６０学号斯新疆医科大学ＸｉｎＪｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｇ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ口腔医学硕士专业学位（学历教育）论文题目：Ｃ反应蛋白基因多态性与墨玉县维吾尔族成人慢性牙周炎相关性研究研究生李丹丹指导教师赵今教授专－业学位领域口医学＾＿＿＿研究方向牙周病病因与防治＇２０－２０１６５研究起止时间１５年１２月年月所在学院新疆医科大学第一附属医院２０１７年３月．． 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我本人在赵今导师的指导下进行，论的科研工作及获得的学术研究成果。论文中除了特别标注的地方外文中不包含他人已发表或己撰写过的学术成果。对我实验有所帮助的以以及对我实验做出贡献的同志已在论文中作了明确的说明并表示了谢居、。。签字日期：丨学位论文作者签名：“＇签字日期：—：／导师签名Ｉ彡、气叫关于论文使用授权的说明，、１本人完全了解学校关于保留使用学位论文的各项规定屯，“”（同意）以下事项：选择／不同意，，允许论文被杳阅和借阅１．学校有权保留本论文的复印件和磁盘可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；“２．学校有权将本人的学位论文提交至淸华大学中国学术期刊（光盘”版）电子杂志社用于出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》或其他问。类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容：：签字日期学位论文作者签名＾签字日期：“二—导师签名： C反应蛋白基因多态性与墨玉县维吾尔族成人慢性牙周炎相关性研究研究生李丹丹指导教师赵今教授专业学位领域口腔医学研究方向牙周病病因与防治2017年3月 AssociationofC-reactiveproteingenepolymorphismswithadultchronicperiodontitisinMoyuUygurpopulationＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofStomatologicalMedicineByLiDan-danStomatologicalMedicineDissertationSupervisor:Prof.ZhaoJinMarch,2017 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名ALAttachmentLoss附着丧失CPChronicperiodontitis慢性牙周炎CRPCreactiveproteinC反应蛋白PCRPolymeraseChainReaction聚合酶连反应PDProbingDepth探诊深度 目录摘要...............................................................................................................................1Abstract............................................................................................................................2前言...............................................................................................................................3研究内容与方法...............................................................................................................51研究对象..............................................................................................................51.1一般资料...................................................................................................51.2慢性牙周炎诊断标准...............................................................................51.3纳入标准...................................................................................................51.4排除标准...................................................................................................52研究内容与方法..................................................................................................52.1实验仪器与试剂.......................................................................................62.2基因组DNA的提取................................................................................72.3CRP基因多态性检测..............................................................................73质量控制..............................................................................................................84统计方法..............................................................................................................95技术路线图..........................................................................................................9结果.............................................................................................................................10讨论.............................................................................................................................15小结.............................................................................................................................21致谢.............................................................................................................................22参考文献.........................................................................................................................23综述C反应蛋白与牙周炎和冠心病相关性研究进展..............................................29攻读硕士学位期间发表的学术论文..............................................................................36导师评阅表.....................................................................................................................37 新疆医科大学硕士学位论文C反应蛋白基因多态性与墨玉县维吾尔族成人慢性牙周炎相关性研究研究生：李丹丹导师：赵今教授/主任医师摘要目的：测定墨玉县维吾尔族慢性牙周炎患者和牙周健康对照者中C反应蛋白+1444C/Trs1130864、+1059G/Crs1800947两位点的基因分型，分析各实验组间基因型分布和等位基因频率的差异；探讨C反应蛋白CRP基因多态性与维吾尔族人群慢性牙周炎易感性的关系，为牙周病的防治提供理论依据和实验基础。方法：将墨玉县维吾尔族人群慢性牙周炎流行病学调查组于前期流调建立的生物样本库作为研究对象，实验分为健康对照组、轻度慢性牙周炎组、中重度慢性牙周炎组，每组随机抽取100例样本，提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法测定rs1800947，rs1130864两位点的基因分型，统计分析慢性牙周炎的发病是否与C-反应蛋白基因多态性相关。结果：C反应蛋白rs1800947和rs1130864两多态性位点的基因型以及等位基因频率在3组间差异无统计学意义（P＞0.05）；有序多分类Logistic回归分析结果：年龄是慢性牙周炎发病的危险因素（P＜0.001），性别与慢性牙周炎发病无显著相关（P＞0.05）。结论：C反应蛋白+1444C/Trs1130864、+1059G/Crs1800947两位点基因多态性与墨玉县维吾尔族成人慢性牙周炎无显著相关性，但有必要增加样本量进行进一步的探索；年龄是患慢性牙周炎的危险因素，且年龄越大越易患慢性牙周炎。关键词：C反应蛋白，基因多态性，慢性牙周炎1 新疆医科大学硕士学位论文AssociationofC-reactiveproteingenepolymorphismswithadultchronicperiodontitisinMoyuUygurpopulationPostgraduate:LiDan-danSupervisor:Prof.ZhaoJinAbstractObjective:ToexploretheassociationbetweenC-reactiveprotein(CRP)+1444C/Trs1130864,+1059G/Crs1800947genepolymorphismandsusceptibilitytochronicperiodontitisinadultsinMoyucounty.Methods:TheobjectsofthestudyarepreliminaryepidemiologicalinvestigationgroupinMoyuCountyretrievedsamples,Randomlyselectednormalcontrolgroup,mildperiodontitisgroupandseverechronicperiodontitis;MoyuCounty.chronicperiodontitisgroup,100casesineachsample,extractionofDNA,Thegenotypingofrs1800947,rs1130864weredetectedbyusingpolymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphismmethod,andthenstatisticalanalysiswasusedtoanalysewhethertheincidenceofchronicperiodontitisassociatedwithC-reactiveproteingenepolymorphism.Results:therewasnosignificantdifferenceinCRPgenepolymorphismsitesofrs1800947,rs1130864genotypeandallelefrequencybetweengroups(P＞0.05);Logisticregressionanalysisresults:ageisariskfactorfortheincidenceofchronicperiodontitis(P＜0.001),regardlessofgendersusceptibilitytochronicperiodontitis(P＞0.05).Conclusion:thereisnosignificantcorrelationbetweenrs1130864,rs1800947genepolymorphismandUygurMoyuCountyadultchronicperiodontitis,butitisnecessarytomakefurtherexplorationtoincreasethesamplesize;what’smore,ageisariskfactorforperiodontitis,andtheolder,themoresusceptibletoperiodontitis.Keywords:C-reactiveprotein;Genepolymorphism;Chronicperiodontitis2 新疆医科大学硕士学位论文前言慢性牙周炎（ChronicPeriodomtitis，CP）是由一些细菌微生物潜藏在人体牙周组织内，释放细菌内毒素，经长时间的不断侵害，最终导致牙周组织局部炎症。随着疾病的不断进展，会造成牙周组织结构、功能的损伤，如牙槽骨吸收，牙齿松动，根分叉病变等。当疾病发展到一定程度时，临床治疗难度也会随之增加，从而影响治疗效果，最终导致不良预后[1]。慢性牙周炎的危害不仅局限于局部牙周支持组织以及口腔功能，还可引发机体全身各个系统（如心血管系统）的损害[2]。在炎症期，机体内一些免疫细胞（如T淋巴细胞）会被激活参与免疫应答，在此过程中会免疫细胞会释放多种炎症因子参与机体自身防御，如肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-6、白介素-8，C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）等，其中，CRP是反应机体处于炎症状态的一个较为敏感而可靠的指标，已成为近年来研究热点因子之一。牙周炎作为机体局部组织炎症，关于其与CRP之间的关联也得到了广泛研究。有研究证实，患有牙周炎患者的血清CRP浓度在年龄与性别等基线一致的条件下显著高于牙周健康患者[3]。CRP水平受遗传和环境因素的共同调节，环境因素如吸烟，体重，缺乏锻炼，糖尿病，激素替代疗法等；遗传因素可导致CRP水平相差27％-40％[4-6]。Cao等[7]对加拿大的人群研究显示，冠心病初期阶段患者：CRP+1059G＞C位点发生同义变异，并用证据说明CRP+1059携带等位基因G/C者较携带非等位基因G/C者，CRP水平明显较高。对于同一个基因位点多态性的研究结果，国内外也有差异，国外研究提示-717A/G多态性与CRP水平不相关[4]，然而国内研究与此相反[5]，这提示CRP基因多态性可能存在种族差异，多位学者的研究提示-390C/A/T与CRP的水平和冠心病相关，带有T等位基因者有较高的CRP水平[6,8-10]。先前的研究证明CRP血清水平与其基因的rs2027471、rs17860488、rs2794520和rs2808628位点呈高度相关；而在美国高加索人群中，CRP血清水平与rs1205、rs1800947、rs1130864位点基因多态性有显著相关性，且CRP基因型与全身性炎症有关[11]。在无传染性或炎症性疾病的健康成年人中，即使先通过多因素分析校正了年龄、性别、体重指数、高血压、血脂异常以及阻塞性睡眠呼吸暂停这些影响因素后，重新检测其血清hs-CRP水平及其基因型，仍能发现CRP水平受CRP+1444C杂合子和纯合子基因型的影响。进一步进行多因素分析时发现CRP的血清水平还受到286C/T杂合子基因型的影响，且显著相关[12]。个体差异使得机体对于同样的治疗，结果往往不一样：在对中度牙周炎患者进行牙周治疗后，发现血清CRP、白介素-15水平呈现先增后降趋势，在排除冠心病和炎症因子等传统风险因素的干扰后，CRP+1444TT纯合子3 新疆医科大学硕士学位论文个体和CC纯合子相比较，前者CRP水平更高且高出近40％左右[13,14]。CRP基因多态性对其血清水平的影响在一定程度上解释了某些炎症相关疾病的种族特异性，以及个体差异对治疗的不同反应。查阅国内外大量文献发现，目前关于CRP基因多态性与慢性牙周炎致病以及严重程度的相关性报道量较少，且研究结果不尽一致。牙周炎受环境因素（自身及外界环境）与多基因遗传因素以及诸多混杂因素的共同影响，而CRP水平亦受到较多其他遗传性和获得性因素影响，故研究二者之间的相关性尚存在诸多问题：样本收集困难、样本量偏小、且牙周炎发病率有随年龄增加的趋势、临床观察时间较短、失访率较高等问题，CRP基因多态性与牙周炎还需扩大样本量，进一步进行多中心的研究。目前，关于CRP基因因素对新疆维吾尔族慢性牙周炎的影响国内外还未报道。墨玉县作为一个较为封闭的地区，维吾尔族人口占97.16％，保留了其最原始的生活习惯，具有人群代表性[15]，且本团队前期流调发现该地区牙周炎患病率高达65.2％，对其发病原因有待进一步研究及探讨[16]。本研究通过测定墨玉县维吾尔族慢性牙周炎患者和牙周健康对照者中CRP+1444C/Trs1130864、+1059G/Crs1800947两位点的基因分型，分析组间基因型分布和等位基因频率的差异，探讨CRP基因多态性与维吾尔族人群慢性牙周炎易感性的关系，为牙周病的防治提供理论依据和实验基础。4 新疆医科大学硕士学位论文研究内容与方法1研究对象1.1一般资料将墨玉县维吾尔族人群慢性牙周炎流行病学调查组于前期流调取回的样本（颊粘膜拭子）作为研究对象，样本库中颊粘膜拭子共1604个，其中轻度CP样本899个，中度230个，重度85个，正常399个。分组：实验人群分为3组，中、重度慢性牙周炎组，轻度慢性牙周炎组，健康对照组。样本量：本实验为三组平行对照+Z22计数资料，故根据公式nij=（Z1-α/（2T）1-β）[P1（1-P1）+P2（1-P2）]/δij计算本实验所需样本量：每组需要100个样本，共300个样本。计算机随机抽取正常对照组100例、轻度慢性牙周炎组100例、中重度慢性牙周炎组患者100例（中度73个，重度27个）。1.2慢性牙周炎诊断标准口腔检查及样本采集由3名经过统一培训的口腔医务工作者在视野清晰及光线充足条件下，使用社区牙周CPI探针，采用提插式检查方法，探诊力度适中20-25g左右，即可探测到实际深度又不至使患者感觉不适。按照社区牙周指数（CPI）[17]应对每位检查对象的10个牙位（右上中切牙，左下中切牙以及上下颌第一、二磨牙）进行检测，其中每个牙位均检查6个位点，包括近中颊、舌面，颊、舌面正中，远中颊、舌面，最后计算求得各牙位的附着丧失水平的平均值（averageattachmentloss，AAL），该指标较为准确的反应牙周组织的破坏程度。根据慢性牙周炎的国际诊断标准[18]：轻度牙周炎：附着丧失1-2mm，中度牙周炎：附着丧失3-4mm，重度牙周炎：≥5mm。1.3纳入标准轻度慢性牙周炎组、中重度慢性牙周炎组纳入标准：年龄18-65岁；3代均为维吾尔族；口内存留牙不少于10颗，包括4颗磨牙(不含第三磨牙)；无明显错牙合畸形和不良修复体。对照组纳入标准：年龄:18-65岁；3代均为维吾尔族；牙周健康：口腔卫生状况良好，牙龈无异常，牙齿无松动、无附着丧失，缺失牙不超过3颗。1.4排除标准排除标准：患有与慢性牙周炎相关的系统性疾病：如糖尿病、心血管疾病、肾功能衰竭等；妇女处于妊娠期或哺乳期；3个月内使用抗生素或者免疫抑制剂者；半年内进行过牙周专业治疗者。5 新疆医科大学硕士学位论文2研究内容与方法2.1实验仪器与试剂2.1.1实验仪器-80°C超低温冰箱中科美菱微量加样枪德国eppendorf公司涡旋振荡器德国IKA电热恒温水箱上海精宏实验设备有限公司超速台式离心机德国Eppendorf电子天平德国Sartorius微波炉广州美的有限公司梯度PCR扩增仪美国Bio-Rad电泳仪北京六一仪器厂全自动凝胶图像分析仪美国Bio-Rad高压蒸汽灭菌器日本SANYO2.1.2实验试剂口腔拭子DNA提取试剂盒北京天根生化科技有限公司引物美国ThermoFisherScientific无菌去离子水北京天根生化科技有限公司2×TaqPCRMasterMIX美国ThermoFisherScientifi琼脂糖北京恒奥生物有限公司5×TBE电泳液北京化学试剂公司核酸染料Gelview北京BioTeke无水乙醇兰州三泰液体厂100bpDNALeader上海纪宁实业有限公司实验中自行配置的试剂（2%琼脂糖凝胶）：（1）lxTBE电泳缓冲液的配置：首先量取100ml成品5xTBE液，加入到洁净的1000ml大量筒中，再加入400ml无菌双蒸水，充分颠倒混匀，便可配置成lxTBE电泳液。将配置好的溶液室温储存，备用，期间避免污染。（2）灌胶用量筒量取1xTBE电泳缓冲溶液30ml，加入烧瓶内，再用电子天平秤取0.6g的琼脂糖粉，倒入烧瓶内，混合混匀，放至微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，且溶液变清亮时停止加热，静至溶液待其冷却至50-60℃时加入lμl核酸染料，轻摇混匀，摇动幅度不宜过大，以防气泡产生。然后将琼脂糖溶液倒入胶床中，期间应避免气6 新疆医科大学硕士学位论文泡产生，胶厚约5mm，插入需要的梳子，室温静置30min左右，待胶完全聚合。2.2基因组DNA的提取本实验采用DNA提取试剂盒（TIANampSwabDNAKit）提取颊粘膜拭子DNA（具体步骤严格参照口腔拭子基因组DNA提取试剂盒说明书）：本试剂盒的特点在于可特异性结合DNA以及其缓冲液的独特性。不仅可高效专一的提取DNA，且可提取片段大，纯度高的DNA，较为可靠的用于临床实验研究。具体步骤如下：（1）样本处理：从－80℃冰箱中将随机抽选的样本取出，将颊粘膜拭子转放在用消毒2ml离心管中，用无菌剪刀剪下整个棉絮头，在使用消毒好的移液枪往离心管中加入GA缓冲液400l。（2）再向离心管中加入20l蛋白酶K溶液，可通过上下颠倒，以及旋涡振荡仪等方式将管内液体混合均匀，将离心管放置到先前已经调好的56℃恒温水浴锅中加热1小时，在此期间，需在等时间内将离心管旋涡混匀4次（每次间隔15分钟）。（3）将离心管从水浴锅中取出，使用移液枪加入GB缓冲液400l，快速充分混匀，在70℃条件下将离心管放置10分钟。待溶液变得清亮，将离心管放置到离心机中离心数秒，以去除附在瓶盖及壁上的液体，再用移液枪将尽可能多的液体转移至新的离心管中。（4）往离心管中加入无水乙醇200μl，快速充分的混匀，将离心管放置到离心机中离心数秒，以去除附在瓶盖及壁上的液体。（5）将上一步所得的溶解和棉絮沉淀加入到提前放置到收集管中的吸附柱CR2中，再将收集管对称摆放到高速离心机中，离心条件：室温，转速：12000rpm（～13，400×g）时间30s，然后将收集管中的液体倒净，在将吸附柱放回，要保证放回至先前收集管。（6）继续将500lGD缓冲液（已提前加入乙醇溶液）加入到吸附柱CR2中，高速离心，条件同上一步，倒弃废液，吸附柱放回。（7）然后向吸附柱中加入600lPW漂洗液（已提前加入乙醇溶液），高速离心，条件同上，倒弃废液，吸附柱放回。再重复离心一次，倒除废液。（8）将吸附柱CR2从收集管中转至消毒好的无菌离心管中，用移液枪悬滴入TB缓冲液30l，尽量不要接触吸附柱管壁。室温条件下静至3分钟，高速离心（12000rpm（～13，400×g）2分钟，此时便完成基因组DNA的提取，将离心管中提取得的DNA使用核酸蛋白仪进行浓度及纯度检测，符合要求的DNA置于－20℃低温冰箱保存备用。2.3CRP基因多态性检测采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性法对实验组和对照组rs1800947，7 新疆医科大学硕士学位论文rs1130864两位点进行基因型检测。2.3.1rs1800947基因型检测根据Cao[7]等引提出的引物，序列如下：上游5’-GATCTGGTGATCTGAGAAACCTCT-3’，下游：5’-GAGGTACCAGAGACACAGAGACGTG-3’。PCR反应体系：2lDNA模板，CRP+1059G/C上下游引物各1l，2倍MasterMix12.5l，以超纯水补足反应总体积至25l，混合均匀。PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30S、56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终末延伸5min；4℃保持。反应结束后取6l反应产物经2％琼脂糖凝胶（自行配置）电泳鉴定PCR产物，以DNAMarker（100bp）作分子量Marker，电压110V，30min，经全自动凝胶成像分析系统分析PCR扩增片段长度为744bp。CRP+1059G/C的RFLP反应体系：PCR产物DNA1g，2倍MaeIII缓冲液12.5l，超纯水补充体系至25l，限制性内切酶MaeIII1U，55℃水浴2h。2％琼脂糖凝胶电泳行酶切片断分析。2.3.2rs1130864基因型检测根据孙大磊[19]等采用的引物，序列如下：上游：5’-CCCTTCAGTCCTAATGTCC-3’下游：5’-GCTCTTGCCTTATGAGTTTT-3’。PCR反应体系：2lDNA模板，CRP+1444C/T上下游引物各1l，2倍MasterMix12.5l，以超纯水补足反应总体积至25l，混合均匀。PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30S、55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终末延伸5min；4℃保持。反应结束后取6l反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，以DNAMarker（100bp）作分子量Marker，电压110V，30min，经全自动凝胶成像分析系统分析PCR扩增片段长度为195bp。CRP+1444C/T的RFLP反应体系：限制性内切酶HpyCH4III5U，PCR产物DNA1g，10XNEBuffer2.5μl，补充总体系至25l，37℃水浴2h，2％琼脂糖凝胶电泳行酶切片段分析。3质量控制（1）本实验所使用的样本是由经过统一培训的3名专业人员采集，且严格按照纳入排除标准筛选研究对象，建立的数据库及样本标本库真实可靠。（2）所有的样本都在盲法下进行测量；（3）实验标准化：实验中使用同一型号的仪器并定期校验；使用同一品牌的DNA提取试剂盒及相关试剂；检测方法统一，并由经过训练的同一人检测；（4）随机抽取10％样本在单盲情况下重复测定各位点基因型，以检验所测基8 新疆医科大学硕士学位论文因型的重复性和可靠性。4统计方法采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行最终分析。使用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检查CRP+1059G/C、CRP+1444C/T位点基因型和等位基因频率是否具有群体代表性。关于两位点的基因频率，则采用直接计数法。采用卡方检验分析比较各组间基因型和等位基因频率差异。年龄，性别作为独立变量在有序多分类Logistic回归中进行校正来控制混杂因素。检验水准为双侧仅α=0.05。5技术路线图随机抽取流调组采集的样本根据纳入排除标准中重度CP组100例轻度CP组100例健康对照组100例DNA试剂盒提取DNA抽取10%样本PCR-RFLP测定CRP基因型PCR质量控制数据整理、统计分析研究结果9 新疆医科大学硕士学位论文结果1研究对象的基本资料及临床指标基本资料（见表1）：其中正常对照组男女比例0.5:l，平均年龄34.6±11.0岁。轻度CP组男女比例1:1，平均年龄40.3±11.3岁。中重度CP组男女比例1.5:1，平均年龄53.0±10.0岁。3组间性别构成、年龄之间比较均有显著统计学差异（P＜0.001）。临床指标：组间牙周临床指标的比较发现AL、PD的差异亦有统计学意义（P＜0.001）。2CRP+1059G/C目的基因扩增和酶切分析对PCR扩增片段进行电泳分析，目的基因长度为744bp，PCR扩增片段经限制性内切酶MaeⅢ酶切后分析显示三种基因型，分别为：GG型（310bp，233bp，201bp）；GC型（434bp，310bp，233bp，201bp）；CC型（434bp，310bp）（图1～2）。744bp图1CRP+1059PCR扩增电泳图Fig.1CRP+1059geneamplifiedElectrophoreticpatternM12345678744bp434bp310bp233bp201bp图2CRP+1059PCR产物经限制性内切酶MaeⅢ酶切后的电泳图Fig.2CRP+1059PCRproductafterrestrictionenzymeMaeIIIdigestion注：M：Marker：1，2，4，5，7：GG基因型；3，6：GC基因型；8：PCR产物3CRP+1444C/T目的基因扩增和酶切分析目的基因扩增片段长度为195bp，根据限制性内切酶酶切结果，酶切结果为C型：156bp+39bp，T型：195bp，见图3-4。10 新疆医科大学硕士学位论文195bp图3CRP+1444C/T扩增电泳图Figure3CRP+1444C/TamplifiedElectrophoreticpatternM123456789195bp156bp图4CRP+1444C/T产物经限制性内切酶HpyCH4III酶切后的电泳图Figure4CRP+1444C/TproductafterrestrictionenzymeHpyCH4IIIenzymeelectrophoresis注：M：Marker；1，5：CT型；2，6：TT型；3，4，7，8：CC型4CRP+1059G/C、CRP+1444C/T位点基因型及等位基因频率分布CRP+1059G/C位点共有GG基因型282例，分布如下：正常对照组：93例，轻度CP组：93例，中重度CP组：96例；GC基因型共18例，健康对照组：7例，轻度CP组：7例，中重度CP组：4例，三组均未发现CC型携带者。卡方检验分析发现3组在基因型分布上无明显差异（表2）。G型和C型等位基因频率分别为97％和3％，等位基因频率在3组间的差异无显著性（表3），CRP+1444C/T基因型分布及等位基因的分布本实验中共有CC型211例，其中正常对照组66例，轻度慢性牙周炎组71例，中重度慢性牙周炎组74例；CT型81例，其中正常对照组29例，轻度慢性牙周炎组29例，中重度慢性牙周炎组23例，TT型13例，其中正常对照组5例，轻度慢性牙周炎组4例，中重度慢性牙周炎组4例。3组间基因型分布差异无显著性（表4）。C型和T型等位基因频率分别为82.2％和17.8％，等位基因频率在3组间的差异无显著性（表5）。5慢性牙周炎易感因素的分析慢性牙周炎的发病原因包含局部以及全身因素，本文使用有序多分类Logistic11 新疆医科大学硕士学位论文回归分析来评估慢性牙周炎易感性因素。结果发现：年龄与CP显著相关，且有可能是是CP的危险因素；性别与慢性牙周炎的易感性无显著相关性；在校正了年龄以及性别等混杂因素后，CRP两位点基因型以及等位基因分布与慢性牙周炎的易感性仍无显著相关性（P＞0.05）。12 新疆医科大学硕士学位论文表1正常组与慢性牙周炎组的基本资料及临床数据Table1basicdataandclinicaldataofnormalgroupandchronicperiodontitisgroup性别年龄年龄分布组别附着丧失（mm）探诊深度（mm）（男/女）（岁）＜3535-4445-5455-65正常34/6634.6±11.075214001.3±0.4轻度CP50/5040.3±11.3303821111.8±0.62.1±0.5中重度CP60/4053.0±10.041538434.5±1.42.5±0.6P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001表23组观察对象CRP+1059G/C基因型分布情况Table2DistributionofCRP+1059G/Cgenotypesin3groups基因分型（百分比）2分组PGGGCCC正常对照组93（93）7（7）0轻度CP组93（93）7（7）01.0640.587中重度CP组96（96）4（4）0合计282180表33组观察对象CRP+1059G/C等位基因分布情况Table3ThedistributionofCRP+1059G/Callelesin3groups基因分布（百分比）2分组P等位基因G等位基因C正常对照组193（96.5）7（3.5）轻度CP组193（96.5）7（3.5）1.0310.597中重度CP组196（98）4（2）合计58218表43组观察对象CRP+1444C/T基因型分布情况Table4DistributionofCRP+1444C/Tgenotypesin3groups基因分布型（百分比）2分组PCCCTTT正常对照组66295轻度CP组672941.4600.834中重度CP组73234合计206811313 新疆医科大学硕士学位论文表53组观察对象CRP+1444C/T等位基因分布情况Table5ThedistributionofCRP+1444C/Tallelesin3groups基因分布（百分比）2分组P等位基因C等位基因T正常对照组16139轻度CP163371.1830.554中重度CP16931合计493107表6慢性牙周炎易感因素的Logistic回归分析Table6LogisticregressionanalysisofpredisposingfactorsofchronicperiodontitisOR值95%CIP值男1.00--性别女0.860.60-1.310.410＜351.00--35~442.121.08-3.81P＜0.05年龄（岁）45~548.344.15-17.92P＜0.001＞5528.2613.17-57.13P＜0.001CC1.00--rs1130864基因型CT1.100.71-2.120.372TT1.340.74-2.450.413Crs1130864等位基因1.00--TGG1.00--rs1800947基因型GC1.120.83-2.520.384CC1.050.77-2.350.535Grs1800947等位基因1.00--C14 新疆医科大学硕士学位论文讨论1慢性牙周炎及其与全身疾病的关系慢性牙周炎是临床上最常见的一种牙周炎，约占全部牙周炎患者的95%，该疾病可发生于任何年龄段，但大多数患者为成年人。随着年龄的增长，慢性牙周炎的患病率和疾病的严重程度也随之增长。慢性牙周炎根据牙周附着丧失、牙槽骨吸收的范围及严重程度可分为轻、中和重度。慢性牙周炎的发生发展都比较缓慢，多由慢性牙龈炎发展而来，一般早期症状往往被患者忽略，一般患者就诊时已到中晚期。慢性牙周炎患者一般有如下临床特征：牙周袋＞3mm，牙周袋探诊后有出血，X线片表现为牙槽骨的垂直型或水平型吸收，慢性牙周炎中晚期患者还可出现牙齿松动，移位。慢性牙周炎作为一种炎症性破坏性疾病，往往有很多伴发病变：根分叉病变，牙周脓肿，牙龈退缩、牙根敏感，根面龋，食物嵌塞，逆行性牙髓炎，继发性咬合创伤，以及口腔异味等。慢性牙周炎目前已成为成人失牙的主要原因，因此对于慢性牙周炎的早期诊断，早期治疗就显得尤为重要。关于慢性牙周炎的治疗临床上一般采用牙周序列治疗，要全面评估患者疾病的严重程度，解剖因素，牙周炎是否处于活动期，是否有全身性疾病，有无吸烟等不良生活习惯后，制定合理的治疗计划。在治疗过程中，也要根据病情的变化对治疗计划进行是适时的补充和调整。在慢性牙周炎的治疗过程中也会遇到一些治疗难题。根分叉病变作为慢性牙周炎发展到较严重程度时常见的并发症之一，病变累及多根牙的根分叉区，可发生于任何类型的牙周炎。下颌磨牙区患病率较高，上颌前磨牙患病率最低，且病变发生率与年龄呈正相关。Glickman将根分叉病变分为四度，有利于临床上治疗的指导以及预后疗效的评估。临床上关于其治疗方法较多：牙周刮治术，分根术，单纯牙周翻瓣术，隧道成形术等，但由于根分叉解剖结构的特殊性，多数牙周刮治器械难以进入根分叉病变区，使得菌斑结石等刺激物难以去除，导致预后效果不佳[20]。我前期通过搜索国内外运用单纯翻瓣术，单纯引导组织再生术以及引导组织再生术联合植骨术治疗根分叉病变的文献，并对治疗疗效进行Meta分析发现引导骨再生在改善牙周附着水平，牙槽骨吸收，以及牙周袋深度方面可取的较好疗效。可以为临床治疗提供一定的指导[21]。慢性牙周炎是以牙周支持组织破坏为主要特征的一种发展较慢的局部组织炎症[22]。牙周致病菌产生的细菌毒素，如细胞溶解酶、细菌内毒素，一部分可以通过破坏的牙周袋上皮进入到血液中，同时，感染的炎性龈组织在机体进行免疫应答过程中会有大量炎症介质产生，如肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor，TNF-α），C反应蛋白，前列腺素E2等，该类介质进入血液系统后会加重总体炎症负担。流行15 新疆医科大学硕士学位论文病学研究表明慢性牙周炎与全身多疾病有相关性[23,24]。1.1慢性牙周炎与心血管疾病近年来有研究表明CP与心血管疾病的发生发展有密切的联系，虽然两疾病之间直接的相互作用关系尚不明确，但仍有研究显示，在测定CRP和一些其他炎症标记物时，慢性牙周炎可增加整体炎症感染可能[25]。牙周致病菌的长期侵害会导致血管壁的病理性改变；细菌及其释放的内毒素亦可通过牙周组织的上皮屏障，进入血液循环，造成血管内皮细胞的直接感染以及动脉粥样硬化斑块的形成；此外，在牙周炎进展期，机体进行免疫应答时会产生各种炎症介质（白细胞毒素，脂多糖等），会对血管内皮造成不同程度的损害，导致血小板的凝集，最终造成胆固醇结晶的沉积和泡沫细胞的形成，进一步会堆积形成脂质条纹、斑块，都是由泡沫细胞进一步发展而来。在上述讲到的多重因素的共同作用下，加速了动脉粥样硬化的形成[26,27]。1.2慢性牙周炎与呼吸道疾病相关性目前有充分的证据支持慢性牙周炎可以增加肺炎的感染风险。Paju等[28]认为唾液中牙周致病菌产生的一些毒素可以破坏口腔内粘膜，暴露出能促进潜在呼吸道病原体复制和粘附的受体。此外，慢性牙周炎产生的特异性酶可以破坏口腔内唾液保护膜，降低机体自身对呼吸道病原菌的免疫抵抗作用。Tantipong等[29]研究发现，引导患者有意识的改善口腔环境，维护良好的口腔卫生可以降低肺炎的感染率达40%。Scannapieco[30]等研究发现口腔内牙周致病菌可经呼吸道到进入肺部引起肺炎，尤其是在住院病人和老人，并可能影响慢性阻塞性肺疾病的过程，通过改善口腔环境可有效降低慢性肺炎的感染率。Scannapieco[31]早在1999年就发现口腔作为和呼吸道联通的一个器官，是造成肺部感染的一个重要途径：呼吸作用有利于细菌以较为稳定的菌斑形式定居在牙面以及修复体表面，亦可以通过呼吸作用将菌斑带入呼吸道中，造成肺部感染。1.3慢性牙周炎与糖尿病慢性牙周炎与糖尿病之间的联系多年来已得到广泛研究，多项研究表明，两者疾病有着一致的危险因素，且互为高危因素。Mealey等[32]研究表明糖尿病的患病率与牙周炎的严重程度呈正相关。在牙周炎患者口腔中，机体会释放较正常人更多的炎症因子，如CRP、TNF-α、纤维蛋白原等。机体代谢（糖代谢）也会因此而变得复杂，导致牙周破坏增加，从而进入一种恶性循环[33]。Andersen等[34]也证实先天性、后天性糖尿病均可增加慢性牙周炎的罹患风险，同时对牙周炎的严重程度也有着不同程度的影响。慢性牙周炎作为糖尿病的第六大并发症，预防和治疗牙周炎已成为糖尿病的重要防治策略，只有两种疾病同步治疗，才能取得更加理想的临床疗效。16 新疆医科大学硕士学位论文1.4慢性牙周炎与不良妊娠意大利Pizzo等[35]通过10年的随访观察慢性牙周炎与不良妊娠之间存在一定的关系。有研究[36,37]表明：孕期母亲患慢性牙周炎是低体重婴儿的危险因素之一。牙周致病菌及其释放的内毒素可以通过袋内上皮进入微循环和胎盘通道；此外，牙周炎患者自身免疫会激活多种炎症因子，如脂多糖、产妇炎症介质等，这些介质进入胎盘后，也可能导致不良妊娠的发生。关于慢性牙周炎导致不良妊娠的机制不尽相同，还有待进一步研究。1.5慢性牙周炎与消化系统疾病慢性牙周炎与消化系统之间的关联主要表现在其与慢性胃炎之间的相互作用。有研究表明[38]：作为胃炎危险因素的幽门螺旋杆可在牙周炎患者龈下菌斑中检测到，其水平较健康对照组而言，明显较高。肖炜[39]等在研究幽门螺旋杆菌在慢性牙周炎的发生发展机制中的作用时发现：幽门螺旋杆菌感染是慢性牙周炎严重程度的危险因素。1.6慢性牙周炎与肾病慢性牙周炎与肾病之间的关系近年来也得到了广泛关注。阿孜古丽等研究发现CP与肾病的发生、进展有密切关联，且肾病的发病率随着牙周炎严重程度的增加而增加[40]。许志鹏[41]等通过观察伴有慢性牙周炎的IgA肾病患者发现经过牙周序列治疗之后，血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-8（IL-8）水平明显降低，有助于临床上IgA肾病的治疗。2CRP在全身疾病中的作用机制CRP水平和全身疾病的关系多年来在国内外已得到广泛研究。李卫[42]等在探讨C反应蛋白在急性胰腺炎中的诊疗价值的研究中发现：胰腺炎患者较正常对照组，C反应蛋白水平显著较高。金剑虹[43]等学者研究发现：血清CRP随着糖尿病病情的变化而不断波动，当病情有所好转时，CRP水平下降明显。左蕾[44]等学者研究发现血清中C反应蛋白的水平在老年患有支气管哮喘并发呼吸道感染的人群中升高明显，该水平变化可作为临床上评估支气管疾病病情的重要指标之一。关于CRP水平与系统性疾病的相关性研究还涉及皮肤黏膜淋巴结综合征，大动脉炎症，显微镜下多血管炎症，左房黏液瘤（恶性），系统性坏死性小血管炎（非特异性），小儿史-约综合征，大动脉炎（小儿），成人still病，风湿类风湿热，小儿肺炎，牙周炎（主要为慢性牙周炎）等。慢性牙周炎虽是局部炎症性疾病，但它的发生可使外周血液中一些物质浓度发生改变，从而对全身系统产生一定的影响，一些牙周致病菌和细菌毒素也可直接进入血液循环到达靶组织对其造成损伤，而这种影响随牙周炎严重程度的加重而愈加明显。在牙周炎进展期，机体进行自身防御时会产生多种抗炎因子，其中包括C反17 新疆医科大学硕士学位论文应蛋白。CRP作为一中高敏反应蛋白，当机体发生病理变化（尤其是局部炎症反应）时，CRP会很快“感知”，并会相应的出现血清水平的变化。慢性牙周炎患者血清CRP水平显著增高的机理可能在于牙周致病菌及其释放的内毒素在破坏局部牙周支持组织的同时，由于体内炎症因子水平的变化也可激发机体产生整体性炎症反应，如刺激免疫细胞分泌一些炎症性因子，一系列的级联效应最终使得CRP水平的升高。前文已讲述慢性牙周炎和心血管疾病相互关联，CRP可能在两疾病之间发挥介导作用，CRP可以结合在受损的血管内膜上，激活特异性补体，促使以中性粒细胞为主的免疫细胞释放一氧化氮，最终促使动脉粥样硬化的形成。牙周病和全身疾病的相互联系中，CRP在关联机制中的作用是一条值得进一步深入研究的重要途径。3CRP与慢性牙周炎的关系牙周炎是由多种牙周致病菌引起的慢性感染性疾病，牙周袋内壁组织受到破坏，牙周袋内的细菌进入血液循环，激发全身炎症反应，此时，一些特异性牙周致病菌所产生的内毒素可引起局部及外周血中产生炎性因子，如白介素-6、肿瘤坏死因子-α、CRP等。CRP作为敏感的急性时相反应蛋白之一，已有多项研究报道[45-47]，血清hs-CRP水平在慢性牙周炎患者人群中显著高于牙周健康者。而牙周基础治疗以及牙周手术均可以明显降低血清hs-CRP水平，有利于牙周病的治疗及其他相关全身疾病的防治。慢性牙周炎不仅可导致血清CRP水平升高，且CRP水平与牙周炎的严重程度呈正相关[48]。对牙周炎患者和牙周健康者龈沟液中IL-1b和CRP水平的研究发现，较高CRP水平与牙周炎相对危险度有关，龈沟液中CRP水平较高的个体更易患牙周炎[49]。越来越多的研究表明牙周炎患者CRP的血清水平显著高于健康对照组，控制混杂因素后，仍然显示慢性牙周炎与血清CRP水平的升高相关[50]，牙周非手术治疗可显著降低牙周炎患者血清CRP水平[51]。hsCRP水平成为牙周炎或动脉粥样硬化的标志物，研究提示牙周炎增加了罹患动脉粥样硬化的风险[52]。这些研究结果提示CRP在牙周病的发生发展中发挥重要作用，且已有研究证实[53]，血清高敏CRP水平与rs1800947、rsl130864两位点的基因多态性有一定相关性，但具体机制尚待进一步研究。关于C反应蛋白基因多态性与牙周炎相关性的研究目前国内外研究状况如下：刘娟等[54]研究结果表明：CRP血清水平受CRP+1059G/C、CRP+1444C/T两位点多态性影响显著，差异有统计学意义，但两位点在基因型以及等位基因频率在CP组及对照组间并无明显差异。张帆等[55]在研究侵袭性牙周炎与C反应蛋白+1059G/C位点多态性的关联中发现：3组间（侵袭性牙周炎组与CP组及对照组）CRP+1059基因型分布以及等位基因频率的分布结果同刘娟等人研究结果，并无明显统计学差异。张帆等[56]在另一篇探讨CRP基因多态性在CP伴Ⅱ型糖尿病患者的作用中发现：3组（CP伴Ⅱ型糖尿病组、CP组与正常对照组）CRP+1059基因型比较亦无显著差18 新疆医科大学硕士学位论文异。孙大磊等[19]通过将单纯慢性牙周炎，慢性牙周炎伴冠心病以及健康对照者的CRP基因型进行对比，得出结论与张帆等人相似：三组间基因分型无显著统计学差异。但同时发现CRP基因位点（rs1800947，rs1130864）的单倍型GT在CP伴CHD组和对照组间比较结果则不同，显示有统计学差异，并得出结论：单倍型GT可能是CHD与CP的危险因素之一。ZhangQ等[57]根据研究结果推测：龈沟液中CRP水平的上升可能导致牙周支持组织（牙槽骨）的丧失加重。Miranda等[58]发现：CRP血清水平在患有青少年关节炎伴牙周炎的患者中也有着较高水平。D’Aiuto等[15]研究结果与其他学者不尽相同，其研究表明炎症标志物（CRP，白介素-6）在牙周治疗后不降反增；CRP水平在CRP+1444C/T基因分型为TT型者较CC型高。Marsik等[14]通过制作炎症模型研究CRP水平的相关因素发现：CRP+1444CC纯合子的CRP水平比TT纯合子低约40％。Slade等[59]研究得出结论：牙周炎患血清以及龈沟液CRP水平均较高，约为正常对照组中牙周健康者的2倍。综上所述，慢性牙周炎与CRP之间的关联，尤其是CRP基因层面对CP发生发展的影响以及其作用机制都有待进一步探讨。4PCR-RFLP技术本实验采用DNA提取试剂盒（TIANampSwabDNAKit）提取颊粘膜拭子DNA：本试剂盒采用的离心吸附柱可特异性结合DNA以及独特的缓冲液系统，可高效，专一吸附DNA，提取的DNA质量稳定可靠。聚合酶链反应（Polymerase.ChainReaction，PCR），是于1985年由美国Mullis发明的一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR体系应该在没有DNA污染的干净清洁环境中进行。为了保证PCR产物的可靠性以及准确性，我们采用以下措施来避免PCR体系的污染：每次操作穿戴隔离衣、隔离帽，口罩；使用无菌操作台或紫外线消毒操作台；每次配置PCR体系时更换新的乳胶手套；使用去离子水经过高温高压二次消毒；使用的一次性瓶子、管子均经高温高压消毒；所有溶液试剂在使用前经凝胶电泳分析，确保无污染；移液枪每次使用前经75%酒精擦拭消毒。目前用于基因多态性的检测方法有很多，包括：限制性片段长度多态性法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）、单链构象多态性（SSCP）、PCR-ASO探针法、PCR-SSO法、PCR-SSP法、PCR-荧光法、PCR-DNA测序、PCR指纹图法、基因芯片法、AFLP法、变性梯度凝胶电泳法、随机扩增的多态性DNA法。基于各方法的可靠性，操作简便性以及费用等因素，最终决定选用限制性片段长度多态性法。PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳联合使用，该方法具有高分辨率、重复性好、简便快捷，稳定可靠等优点，被公认为是基因多态性检测19 新疆医科大学硕士学位论文最经典的方法[60,61]。本实验研究结果显示：CRP多态性位点rs1800947和rs1130864的基因型以及等位基因频率在各组间差异无统计学意义，这与原相关研究[4,19]结果相一致。本研究结果中墨玉县维吾尔族牙周健康者和慢性牙周炎患者的rs1130864位点T等位基因频率高于丁一[54]等人报道的中国汉族人群的携带频率，同时也高于已报道[7,62-64]的西方人群的携带频率；CRP+1059C等位基因频率低于已报道[54]的汉族人的携带频率，但高于前研究报道中的高加索人的[7]携带频率。这种差异可能是由于样本量大小不同所造成，也可能是由于种族和地域的差异所导致。有序多分类Logistic回归分析结果发现：年龄与慢性牙周炎的患病显著相关，年龄55-65岁的人群的患慢性牙周炎风险是年龄＜35岁人群的85.29倍，说明年龄是患牙周炎的危险因素，年龄越大越容易患牙周炎，这与以往研究结果一致，生安菊等[65]人研究发现慢性牙周炎患者牙槽骨的吸收与年龄呈正相关。此外，本实验研究结果发现：性别与慢性牙周炎无显著相关性。关于性别是否为牙周炎的危险因素，各学者研究结果也不近相同，但多数学者认为男性较女性更易罹患慢性牙周炎。Valerio等[66]研究显示，在排除混杂因素后，男性牙周组织破坏程度仍显著高于女性，可能原因有吸烟，不规律的饮食，就医依从性，对口腔的重视程度等。但近期研究显示，即使调整了口腔维护行为和生活习惯、环境等因素，男性仍有较高的慢性牙周炎发病率，可能与性别特异性免疫功能的差异有关[67]。关于年龄与慢性牙周炎相关性以及其机制还有待增大样本量，排除相关干扰因素进行进一步研究。虽然C反应蛋白在慢性牙周炎患者中的水平明显增高，且rs1800947，rsl130864两位点的基因多态性与hs-CRP水平变化有一定相关性，但本研究结果显示，轻度，中重度牙周炎患者与牙周健康对照组间两位点基因型和等位基因频率差异并无统计学意义，这可能是由于这两个基因位点多态性仅有一部分慢性牙周炎患者血清CRP水平有影响，且作用不显著。另外，关于rs1800947，rsl130864两位点的基因多态性与冠心病，动脉粥样硬化等心血管疾病的相关性研究结果显示：均具有显著相关性；亦有研究报道：牙周炎与心血管疾病具有显著相关性，但CRP+1444C/Trs1130864、+1059G/Crs1800947两位点多态性在上述两种疾病的关联机制中是否存在某种潜在生物学机理尚待进一步研究。此外，慢性牙周炎是由多种致病菌共同作用引起的炎症性疾病，菌斑牙结石是其发生的始动因素，但口腔卫生、饮食习惯和生活方式，环境以及遗传等因素也共同影响着牙周炎的发生发展[68]；同时，血清CRP基因多态性也受地域和种族差异的影响[69]，在今后的研究中应排除慢性牙周炎以及C-反应蛋白其他遗传因素的干扰，进一步在基因层面探讨CRP基因多态性与慢性牙周炎患者的相关性，为牙周炎的防治提供提供理论依据和实验基础。20 新疆医科大学硕士学位论文小结1CRP+1059G/C、CRP+1444C/T两位点基因型分布及等位基因的分布3组间基因型分布差异无显著性。2有序多分类Logistic回归分析结果：年龄可能是慢性牙周炎发病的危险因素，性别与慢性牙周炎发病无显著相关。在今后的研究中应排除慢性牙周炎以及C反应蛋白其他遗传因素的干扰，进一步在基因层面探讨CRP基因多态性与慢性牙周炎患者的相关性，为牙周炎的防治提供提供理论依据和实验基础。21 新疆医科大学硕士学位论文致谢首先，要感谢我的导师赵今教授，感谢您的知遇之恩，让初来到这个陌生城市时的我倍感温暖；感谢您三年来对我科研思路的培养，感谢您将精湛的医疗技术亲授于我；感谢您对我生活方向的指引，感谢您给我树立如此美好的方向标，您一丝不苟的工作态度和医疗精神将一直激励着我不断向前。在此，向您献上十二分的谢意。同时，还要感谢我的5位同门：黄萍，张雨慧，马婷，李莎，牛颖慧。感谢你们在实验中给与的帮助，感谢你们让我感受到了友情的温暖，感谢你们带给我的快乐和勇气。感谢连冰洁师姐教会了我如何与病人建立良好的医患关系，感谢林静师姐对我实验中的指导，感谢玛利亚木师姐对我文章的指导，感谢马丽师姐在临床上给予我的帮助与指导，师姐对待病人认真负责的态度，临床治疗过程中精益求精，不断追求创新的精神将一直指引着我不断努力攀登。感谢在临床轮转过程中各科代教老师以及各位师兄师姐对我学习和临床上的指导与倾心相授。感谢实验室李亮老师和王慧老师在实验过程中耐心的答疑解惑，为我实验的顺利进行提供了很大的帮助，真心的感谢二位老师。感谢我的家人对我学业的鼓励和支持，你们永远是我最坚实的后盾和心灵的港湾，我也会不断努力，不辜负你们的期望。22 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1]KinaiaM,StigerJ,NeelyAL,etal.TreatmentofclassIImolarfurcationinvolvement:meta-analysesofreentryresults[J].JPeriodontol,2011,82(3):413-428.[2]郝媛媛,刘文静,李刚,等.慢性牙周炎是影响全身健康的危险因素[J].口腔生物医学,2013,4(2):103-106.[3]ParaskevasS,HuizingaJD,LoosBG,etal.Asystematicreviewandmeta-analysesonC-reactiveproteininrelationtoperiodontitis[J].JClinPeriodontol,2008,35(4):277-290.[4]KovacsA,GreenF,HanssonLO,eta1.Anovelcommonsinglenucleofidepoly-morphisminthepromoterregionoftheC-reactiveproteingeneassociatedwiththeplasmaconcentrationofC-reactiveprotein[J].Atherosclerosis,2005,178(1):193-198.[5]ChenJ,ZhaoJ,GuD,eta1.-717A＞GpolymorphismofhumanC-reactiveproteingeneassociatedwithcoronaryheartdiseaseinethnicHanChinese:theBeijigatherosclerosisstudy[J].JMolMed,2005,83(1):72-78.[6]EdbergJC,WuJ,LangefeldCD,eta1.GeneticvariationintheCRPpromoter:associationwithsystemiclupuserythematosus[J].HumManGenet,2008,17(8):1147-1155.[7]CaoH,RobertA,HegeleJ,eta1.HumanC-reactiveprotein(CRP)1059G/Cpolymorphism[J].HumGenet,2000,45(2):100-101.[8]MoritaA,NakayamaT,DobaN,eta1.PolymorphismoftheC-reactiveprotein(CRP)geneisrelatedtoserumCRPlevelandarterialpulsewavevelocityinhealthyelderlyJapanese[J].HypertensRes,2006,29(5):323-331.[9]CrawfordDC,YiQ,SmithJD,eta1.AllelicspectrumofthenaturalvariationinCRP.HumGenet[J].2006,119(5):496-504.[10]EklundC,KivimakiM,IslamMS,eta1.C-reactiveproteingeneticsisassociatedwithcariotidarterycomplianceinmeninTheCardiovascularRiskinYoungFinnsStudy[J].Atherosclerosis,2008,196(2):841-848.[11]GalliechioL,ChangHH,ChristoDK,eta1.Singlenueleotidepolymorphismsininflammation-relatedgenesandmortalityinacommunity-basedcohoinWashingtonCounty,Maryland[J].AmJEpidemiol,2008,167(7):807-813.[12]JonesJ,ChenLS,BaudhuinL,eta1.RelationshipsbetweenC-reactiveproteinconcentrationandgenotypeinhealthyvolunteers[J].ClinChemLabMed,2009,23 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新疆医科大学硕士学位论文综述C反应蛋白与牙周炎和冠心病相关性研究进展李丹丹综述赵今审校牙周炎是一种以细菌为主要治病因素的慢性感染性疾病，是临床工作中最常见的一种口腔疾病之一，不仅会造成局部牙齿的松动，脱落，牙槽骨的吸收破坏，还可增加全身炎症性疾病的感染风险[1]。冠状动脉粥样硬化也是临床上最常见的心血管疾病之一。C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）作为一种炎症急性期反应蛋白，正常状况下，其血清水平相对较低且稳定，当机体出现损伤或者细菌感染时，其水平快速增高，可以作为一种相对可靠的炎性标记物[2]。近年来研究表明CRP直接参与到机体炎症免疫应答过程以及动脉粥样硬化发生发展过程中，是临床上诊断心血管疾病的重要指示因子之一[3]。研究表明，牙周炎患者血清和龈沟液中CRP水平显著升高，与牙周健康状况相关[4]。本文就近年来关于CRP水平以及基因多态性与牙周炎以及冠心病的发生发展之间的相关性做一综述，为临床诊疗提供依据。1CRP及其生物学作用CRP主要是由肝脏合成的一种糖蛋白，它作为第一种被认为炎症急性期的反应蛋白，已成为炎症反应以及组织器官损伤的标记性物质[5]。早在1930年，Tillett和Fraccis就已在患有肺炎双球菌的患者血液中检出CRP的存在，因其可使肺炎患者的体细胞多糖凝集沉淀，故得名C反应蛋白[6]。肾脏是继肝脏之后被发现的又一可分泌CRP的器官。近年来又有研究发现，C反应蛋白也可由血管内皮细胞以及肺泡巨噬细胞诱导表达合成[7]。人类CRP分子是由分别含有206个氨基酸残基的5个类似的非糖基化多肽亚单位组成。它们通过非共价键相连形成一种环形结构。CRP可以快速识别侵入机体的病原体以及局部组织变性坏死细胞，并以形成复合体、补体的形式来发挥免疫应答作用，还可经CRP受体介导发挥作用。影响血液中CRP水平的主要因素就是其合成的速率。CRP在炎症及组织损伤等情况发生时可快速合成并发挥免疫应答作用，但当这些刺激因素被控制后，其水平下降也相当迅速[8]。一般情况下，健康无炎症感染的成年人的CRP正常浓度一般不高于2毫克每升。CRP水平正常情况下相对稳定。一般不会随时间，饮食等外界环境的改变而有大的波动，故在临床上可作为一个较为可靠的判定炎症或组织损伤的重要指标。29 新疆医科大学硕士学位论文CRP水平受遗传和环境因素的共同调节，环境因素如吸烟，体重，缺乏锻炼，糖尿病，激素替代疗法等；遗传因素可导致CRP水平相差27％-40％[9-11]。Cao等[12]对加拿大的人群研究显示，冠心病初期阶段患者：CRP+1059G＞C位点发生同义变异，并证实CRP+1059等位基因G/C携带者CRP水平明显高于非等位基因G/C携带者。对于同一个基因位点多态性的研究结果，国内外也有差异，国外研究提示-717A/G多态性与CRP水平不相关[9]，然而国内研究与此相反[10]，这提示CRP基因多态性可能存在种族差异，多位学者的研究提示-390C/A/T与CRP的水平和冠心病相关，带有T等位基因者有较高的CRP水平[11,13-15]。先前的研究证明CRP血清水平与其基因的rs2027471、rs17860488、rs2794520和rs2808628位点呈高度相关；而在美国高加索人群中，CRP血清水平与rs1205、rs1800947、rs1130864位点基因多态性有显著相关性，且CRP基因型与全身性炎症有关[16]。在无传染性或炎症性疾病的健康成年人中，即使先通过多因素分析校正了年龄、性别、体重指数、高血压、血脂异常以及阻塞性睡眠呼吸暂停这些影响因素后，重新检测其血清hs-CRP水平及其基因型，仍能发现CRP水平受CRP+1444C杂合子和纯合子基因型的影响。进一步进行多因素分析时发现CRP的血清水平还受到286C/T杂合子基因型的影响，且显著相关[17]。个体差异使得机体对于同样的治疗，结果往往不一样：在对中度牙周炎患者进行牙周治疗后，发现血清CRP、白介素-15水平呈现先增后降趋势，在排除冠心病和炎症因子等传统风险因素的干扰后，CRP+1444TT纯合子个体和CC纯合子相比较，前者CRP水平更高且高出近40％左右[18]。CRP基因多态性对其血清水平的影响在一定程度上解释了某些炎症相关疾病的种族特异性，以及个体差异对治疗的不同反应。2CRP与冠心病动脉粥样硬化是临床上最常见的心血管疾病之一，而CRP与其的相互关联对临床上冠心病的诊疗都有一定的指导意义。多项研究表明CRP直接或间接的参与冠心病的发生发展过程中，可作为心梗，中风等心血管疾病的可靠的预测因子[19]。关于CRP在心血管疾病中的致病机制，Pasceri等[20]研究发现，CRP在激活血管内皮细胞之后，黏附分子的表达也随之增加，此时，大量的单核细胞就会迁入血管内膜，在CD32介导作用下，巨噬细胞会不断摄取低密度脂蛋白，形成会进一步产生细胞因子和CRP的泡沫细胞。在多种因子的相互循环往复的作用下，炎症会进一步恶化发展。DevaraJ等[21]通过对大鼠进行体内外研究发现，CRP水平的增高不仅会促进血管内皮透明质酸的释放，还会导致位于细胞膜上的糖蛋白厚度的降低，显著降低糖蛋白中主要的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素的表达。上述研究结果均提示CRP造成血管内皮功能障碍主要是通过损伤细胞膜糖蛋白的功能来实现。30 新疆医科大学硕士学位论文3CRP与牙周炎牙周炎是由多种牙周致病菌引起的慢性感染性疾病，牙周袋内壁组织受到破坏，牙周袋内的细菌进入血液循环，激发全身炎症反应，此时，一些特异性牙周致病菌所产生的内毒素可引起局部及外周血中产生炎性因子，如白介素-6、肿瘤坏死因子-α、CRP等。CRP作为敏感的急性时相反应蛋白之一，已有多项研究报道[22-24]，血清hs-CRP水平在慢性牙周炎患者人群中显著高于牙周健康者。而牙周基础治疗以及牙周手术均可以明显降低血清hs-CRP水平，有利于牙周病的治疗及其他相关全身疾病的防治。慢性牙周炎不仅可导致血清CRP水平升高，且CRP水平与牙周炎的严重程度呈正相关[25]。对牙周炎患者和牙周健康者龈沟液中IL-1b和CRP水平的研究发现，较高CRP水平与牙周炎相对危险度有关，龈沟液中CRP水平较高的个体更易患牙周炎[26]。越来越多的研究表明牙周炎患者CRP的血清水平显著高于健康对照组，控制混杂因素后，仍然显示慢性牙周炎与血清CRP水平的升高相关[27]，牙周非手术治疗可显著降低牙周炎患者血清CRP水平[28]。hsCRP水平成为牙周炎或动脉粥样硬化的标志物，研究提示牙周炎增加了罹患动脉粥样硬化的风险[29]。这些研究结果提示CRP在牙周病的发生发展中发挥重要作用，且已有研究证实[30]，血清高敏CRP水平与rs1800947、rsl130864两位点的基因多态性有一定相关性，但具体机制尚待进一步研究。4CRP在牙周炎与冠心病相关性中的作用研究表明，冠心病和牙周炎之间不仅在疾病的发生发展中息息相关，他们还有相同的危险因素，其中包括饮食习惯，维护健康意识，年龄增长，吸烟，精神压力过大，以及全身性疾病（糖尿病）等[31,32]。关于两者疾病的相互影响机制有学者猜测病验证可能是由于局部和全身炎症的相互作用导实现。其中CRP水平会由于牙周炎而增高就是心血管患者患病风险增高的一个因素[33]。而规范的牙周序列治疗在降低CRP水平的同时也使得患冠心病的风险降低。Lopez等[34]研究发现牙周炎患者炎症标记物，CRP水平以及患冠心病的几率都会增加，这说明其与炎性物质的增加相关，也可能由于体内一些因子水平的变化以及牙周致病菌长期作用引起的引菌作用而导致冠心病的患病率增加。此外，亦有流行病学证据支持牙周炎和冠心病存在一定相关性[35]。上述两疾病虽存在密切相关性，但不能定论为两者存在因果关系，冠心病不仅与牙周炎是否患病相关，与其严重程度也存在一定相关性，在年龄、BMI指数等基线一致情况下，中晚期牙周炎仍会增加冠心病罹患率[36]。关于hs-CRP在两疾病相互关联中的作用，有学者研究发现，同时患有两种疾病的患者的hs-CRP较单纯患其中之一种疾病的患者以及健康对照者的水平均明显较高[37]。牙周致病菌在破坏牙周组织的同时，会释放一些内毒素，这些毒力很大的内毒素以及细菌可通过被破坏的牙周袋内皮进入血液循环，由于引菌作用使得机体患有31 新疆医科大学硕士学位论文各种局部、全身性炎症的风险增加，与此同时，还会激活自身应激反应，引发一系列的免疫反应，进而导致一些炎症因子如肿瘤坏死因子、白介素-6，血管内皮生长因子，转化生长因子等水平增加，其中CRP作为一种超敏物质，其水平亦会急剧增高，而CRP又可引发组织因子、巨噬细胞的产生，从而引发凝血过程；作为一种纤维蛋白原的趋化因子，可使得单核细胞附着在血管内皮上，在进一步转移到内膜上；此外，CRP对参与动脉粥样硬化的其他因子的表达亦有调控作用[38]，这些因子随着CRP水平的变化而变化，从而影响着冠心病以及全身炎症的患病率以及其严重程度。上述这些因子和CRP会通过对凝血机制[39]或是其他影响冠心病患病的因素的影响而加重冠心病。关于冠心病反作用于牙周病的机制是由于在冠心病的发生发展过程中，即从一开始斑块的形成、发展及破裂的整个过程，都伴随着炎症的发生[40]。由于炎症反应之间的相互影响，而动脉粥样硬化是发生于全身微小血管的炎症性病变，所以会加重全身其他组织的炎症病变，而牙周炎作为牙周局部组织的炎症也会随着血清水平的增加而进一步恶化[41-43]。5小结及展望牙周炎作为一种由细菌长期作用于牙周组织引起的慢性炎症性疾病，牙周致病菌长时间的作用不仅会造成牙周局部炎症，由于其引菌作用以及机体的自身免疫等原因，会造成局部以及全身炎症易感性增加，近年来关于冠心病与慢性牙周炎之间的相互作用也有大量证据支持。临床牙周序列治疗，包括龈上龈下洁治，药物治疗等均可降低血清CRP水平，这也进一步改善了血管内皮，从而降低了心血管疾病的患病风险。CRP与牙周炎以及心血管疾病之间的关系已经得到了大量证据的支持，但具体作用机制还有待进一步研究。参考文献[1]孟焕新.牙周病学[M].北京:人民卫生出版社,2008:75-91.[2]Niyi-OdumosuFA,BelloOA,BiliaminuSA,etal.RestingSerumConcentrationofHigh-SensitivityC-ReactiveProtein(hs-CRP)inSportsmenandUntrainedMaleAdults[J].NigerJPhysiolSci.2017,31(2):177-181.[3]TayefiM,TajfardM,SaffarS,etal.hs-CRPisstronglyassociatedwithcoronaryheartdisease(CHD):Adataminingapproachusingdecisiontreealgorithm.[J].ComputMethodsProgramsBiomed,2017,141(10):105-109.[4]PejcicA,KesicL,JMilasinJ,etal.C-reactiveproteinasasystemicmarkerofinflamm-ationinperiodontitis[J].EurJClinMicrobiolInfectDis,2011,30(3):407-414.32 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