1β表达及il-1β^＋3953基因多态性与慢性牙周炎的关系

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1β表达及IL-1β^＋3953基因多态性与慢性牙周炎的关系?456?上海口腔医学2006年10月第15卷第5期ShanghaiJournalofStomatologyVol15No.5October,2006[文章编号]1006—7248(2006)05—0456—05颊黏膜细胞IL一1p表达及IL一1p一基因多态性与慢性牙周炎的关系田亚光,潘亚萍,林莉,张冬梅,赵戬(中国医科大学口腔医学院牙周科,辽宁沈阳110002)?临床研究?ClinicalStudy【摘要】目的:探讨颊黏膜细胞IL一1B表达和IL一1B一基因型与慢性牙周炎的关系.方法:采集36例不同程度牙周炎患者和36例牙周健康者的颊黏膜细胞和静脉血样本,同时记录牙周状态;对颊黏膜细胞IL一1B的表达进行免疫组化检测;静脉血提取DNA,用PCR—RFLP方法检测IL一1B基因多型性;比较颊黏膜细胞IL一1B的表达差异及IL一1B+一基因型分布差异,将牙周状态及IL一1B基因型与颊黏膜细胞IL一1B表达进行多元线性回归分析.结果:IL一1B+一等位基因II型在重症牙周炎患者中的携带率(12%)显着高于健康对照组(0%)(P<0.05),牙周炎患者颊黏膜细胞IL一1B表达程度亦显着高于牙周健康者(x=365.095,P<0.001);牙周附着丧失和牙周探诊深度与IL一1B表达呈 正相关(CAL,P<0.05;PD,P<0.01),未发现菌斑指数,探诊出血指数及IL一1B一基因型与IL一1B表达的相关关系.结论:颊黏膜细胞IL-1B表达程度反映了牙周炎的严重程度,IL一1B+基因型没有使颊黏膜细胞IL一1B表达发生明显变化.【关键词】白细胞介素一lB;基因型;免疫组化;牙周炎;聚合酶链反应【中图分类号】R781.4【文献标识码】ATherelationshipofIL—lBexpressedinbuccaIceIIsandthepolymorphismsofIL—lBwithchronicperiodontitisTIANYa-guang,PANYa-ping,LINLi,ZHANGDong-mei,ZHAOJian.(DepartmentofPeriodontology,CollegeofStomatology,ChinaMedicalUniversity.Shenyang110002,LiaoningProvince,Cnj【Abstract】PURPOSE:ThepurposeofthisstudywastoinvestigatetherelationshipofIL一1BexpressedinbuccalcellsandthepolymorphismsofIL一113withchronicperiodontitisMETHODS:Thirty-sixpatientswithdifferentseverityofperiodontaldiseaseandthirty—sixsubjectswithhealthyperiodontaltissuesparticipatedinthisstudy.Buccalcellsandperipheralvenousbloodsampleswerecollectedandtheperiodontalstatuswererecorded.ImmunohistochemicalanalysisofIL-1BexpressedinbuccalcellswascarriedoutandthepolymorphismsinIL-1Bwereanalyzedbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphismafterextractingDNAfromperipheralvenousblood.ThenthedifferencesinthelevelofIL一1BexpressedinbuccalcellsandthedistributionofeachgenotypeinIL一1Bwerecompared.MultiplelinearregressionwasusedtocorrelatetheperiodontalstatuswiththepolymorphismsinIL一1BandtheexpressionofIL-I~inbuccalcells.RESULTS:ThecarryingratioofIL-I~allelIIinseverechronicperiodontitis(12%)was significantlyhigherthanthehealthycontrolgroup(0).ThelevelofIL-1BexpressedinbuccalcellsofpatientswithchronicperiodontitiswasalsosignificantlyhigherthanthatofsubjectswithhealthyperiodontalconditionsfX=365.095.P<0.OO1).ClinicalattachmentlossandprobingdepthcorrelatedpositivelywiththeexpressionofIL-1[3(CAL,P<0.05;PD,P<0.01)andnocorrelationwasfoundbetweenplaqueindex,bleedingonprobing,thepolymorphismsinIL-1BandthelevelsofIL一1B.CONCLUSIONS:TheresultsofthissmallsamplestudysuggestedthatthelevelofIL-1BexpressedinbuccalcellsshowedtheseverityofchronicperiodontitisandtheIL一113genotypedidnotmakethelevelofIL-I~expressedinbuccalcellschangedsignificantly.SupportedbytheScientificResearchFoundationfortheReturnedOverseasChinese【收稿El期12006-03-30;f修回El期12006—07-03[基金项目】国家教育部归国人员启动基金(2003-406);2宁省教育厅重大基础研究计划基金资助项目f202013l54)[作者简介】田亚光(1973一),女,辽宁人,硕士,住院医师[通讯作者】潘亚萍,Tel:024—2289l701,E—mail:yap..nancy@yahoocorn⑥2006年版权归《上海口腔医学》编辑部所有田亚光,等,颊黏膜细胞IL一1p表达及IL一1p基因多态性与慢性牙周炎的关系TANYa—guang,etal,Therea"i:+L一peinbucea¨".457thepolymorphismsofL1withchronicperiodontitis/.I—B姗..Scholars,StateEducationMinistry(GrantNo.2003—406)andGrandFundamentalResearchFoundationoftheEducationalDepartmentofLiaoningProvince(GrantNo.202013154). [Keywords]Interleukin一1p;Genotype;Immunohistochemistry;Periodontitis;PolymerasechainreactionShanghaiJStomatol,2006,15(5):456-460.http://www.omschina.org.cn/sjs/菌斑细菌是牙周病发生的始动因子,而易感的宿主是牙周病发生的基本要素.白细胞介素一1B(interleukin一1B.IL一1B)是机体细胞免疫反应过程中产生的重要细胞因子之一,参与牙周组织损伤过程.在牙周炎患者病变牙龈组织及龈沟液(gingivalcrevicularfluid.GCF)中可以检测到高浓度的IL一1B,并且与牙周病的严重程度呈正相关.有研究表明:IL一1B栅等位基因II型可能与IL一1B的表达增强有关,从而加重牙周组织的病理改变.但是牙周炎患者口腔黏膜免疫反应增强是由于牙周炎症导致,还是宿主易感因素所引起,或两者兼有,国内尚无研究报道.本实验对我国北方汉族慢性牙周炎患者及牙周健康者的颊黏膜细胞IL一1B的表达进行免疫组化研究,对静脉血中IL一1B删.基因型进行检测,旨在探讨颊黏膜细胞IL一1B表达和IL一1B删.基因型与慢性牙周炎的关系.1材料与方法1.1研究对象及分组实验组选自中国医科大学口腔医学院牙周专科门诊确诊为慢性牙周炎fCP1的患者36例,参照Armitage等Ij推荐的诊断标准,将其分为2组.即重度CP组和轻,中度CP组.重度组25例,男11例.女14例,年龄30～68岁,平均年龄42岁;轻,中度组11例,男6例,女5例,年龄26～57岁.平均年龄41岁.另选牙周健康者36例作为对照组.其中男,女各18例,年龄24～66岁.平均年龄40岁:均为汉族.不 吸烟,无糖尿病,肝炎等全身系统疾病.就诊前3个月未服用抗生素,半年内未做牙周治疗.妇女非妊娠.所有受试者知情同意.1-2牙周检查指标牙周检查是在受试者全口每颗牙的近中颊,正中颊,远中颊,近中舌,正中舌和远中共6个位点进行检测,检测项目包括牙周附着丧失(clinicalattachmentloss,CLA),牙周探诊深度(probingdepth,PD),菌斑指数(plaqueindex,PLI)及探诊出血指数(bleedingonprobing,BOP).测量值均为每颗牙各项临床指标6个位点测量值的均值,将全口每颗牙的相应临床指标均值记为该受试者的各临床指标检测参数.1.3样本采集受试者初次来诊时,收集其外周静脉血及颊黏膜细胞样本.清水漱口后,用无菌细胞~1](Medscand,瑞典)在两侧颊黏膜各刷10次,立即置于含中性PBS缓冲液的EP管中;同时于前臂采集lml外周静脉血,注入抗凝EP管中;样本均存放于一70℃.1.4IL一1B的免疫组化染色及结果判定室温溶解,1000r/min离心2min.弃上清:4%甲醛固定15min后吸取少量细胞悬液.滴于载玻片上,室温干燥;3%H2O2处理10min后滴加IL一1B兔抗人多克隆抗体.4~C过夜;此后分别滴加生物素化山羊抗兔IgG及SABC试剂(博士德公司,武汉),DAB显色,苏木素复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片.置于光学显微镜下,选取细胞分散均匀处,在40倍镜下随机计数100个细胞.以细胞质出现棕黄染色作为阳性细胞,染色深浅表示阳 性强弱:棕色或深棕色为强阳性(++),黄色或浅黄色为弱阳性(+),无着色为阴性(一).PBS代替一抗作为阴性对照1.5外周静脉血DNA提取室温溶解,取0.5ml加入TE溶液,10000r/min离心3min,弃上清;依次加入TE,蛋白酶K及SDS溶液,于37℃消化过夜,经饱和NaC1盐析.氯仿抽提,乙醇沉淀DNA后,将絮状DNA复溶于TE溶液.4cc存放备用.1.6IL一113+3953/TaqI多态性目的基因扩增和酶切分析PCR反应体系:DNA31xl,dNTP21xl,10x缓冲液2l,BSA2l,J顷义弓l物5一CTC—AGG—TGT—CCT—CGA—AGA—AAT—CAAA一3和反义弓l物5一GCT一II丫r一r]rG—CTG—TGA—GTC—CCG一3(Sangon.上海)各1Ixl(20lxmol/L),TaqDNA聚合酶1.5U,无菌去离子水补足体积至201xl.无菌液状石蜡覆盖反应液.循环参数:94℃预变性5min,94oC变性Imin.ILiil亡…*j】"Jt…n1Ic),.1lLu)bVclN05_1clob~,r048谜九11lllll_72L砸仲Jmhl5十黼lf十94I:尘lllli146:埋火1~1]ill711,IEIinin251舾虾|I71蜓伸5min取R产物10td.Tll{lI制I'1内耐《r-K,R_llLJ杠13L,l(1×酶切缓"Iizl无菌出离J水扑足芏2(IDI.觅舒匀.65'水浒过I产十l!%}^t,糙腔捧.I包碡取 耐凹岳出地85I)【】+971|l,+I21¨,31"殴.箐位J:只出州I_】¨+122个片段.等位墙J【1117统计学处数据用S['SSll5统【f戟什包进行址堤,根措黻槲类型录月』Y硷蝻慢多元线…分忻2结果21牙同临床指标镌测站3纽卅究象讦同f术指愉删结果衷3主【】之见有统I学异P<O05I3}∞1#TableI('linieaIDrifemil|-1dcxor322I】一I13…flI壁彩志陛与雌rI=炎的羌乐l1一VI'driI肇型3州委抒'旧分布表2矗2nr1=【¨健嚎ij墩耒j盘…ⅡIllB轻Lj胜(组ⅡJlB.,携带牢9.1}9%重度cP篁}i匀I!.均～1/Il肇干j行仆割的x传殓等f堆『q1/倥塍索纽f¨面生I]之司分布n1肇导性～P<O051丝罔型tf定l结见i2【l—Ill'~/TaqI目在受{击者Table20…n…fdifferent【L—lB~]Tacilgenoty●In23袖睫m胞ILl口表达与性性圩胤炎的戈不受比卉蠕赫膜胞iLiB表g(1i学傲蹄l,cx400)的表2-51LJB牙周必患行和可健康肴孙脱细眦1]均订挺.fEl表进程腰同蚌x,待骑ll—IB丧建程鹰3组有岛度234【q4l…llHii'72ii? 目Iu—IBP(R&#I:I.cH.3.u—lB"rH"II,I目4IL一1~IrTaqIIfll目.,I:,174tLae11ldigestn●HrkFi…IJ.rOdU~LPL'R—RnIJ'1:l('kumplilic~ti*mprt~d-uh.:II—IB叩nl¨lI/Iype.J:11一J删qIIllIgen~t)～I:4'xJ7,1一IlaeII]dig~l…kJ蠹●目2±月女甜口IL—IB∞cs^l{(x4l1.I】▲-l蝓#¨日[++J,:黏c+】Figure2Texpl*~sionolIL—IinIi~ccal~ell~inpallent~'Ith"peri~dnntitis{NAIRx…▲.……I¨lI—Jinhlieca[cells…I(+】.^-rhep…●?llufII—I13illIⅧl…II,…Ic+】目3,月女#膜l】lu白勺{^B{7~44111】▲藩%{¨】:选c+】I:igur~3VhePKpressionofn一1【linhul||Iceilsrr0Ⅲlnmildt..n"'dPmperi~tdontitis{s^b【~41)11}▲.ThepH?¨tIfJII_nbacealcells'I…tr0Ⅱc+T),-Theu^p…II?Il?u一JiniKIL'~BIr¨"j…kf+l.lalIIAiil'lulaliiIII13IliltILlI,,l¨I'r_IhI-r】l|l"lI}l~1)lⅦill【IIIJ…l~]tdll_mIli……_459目4月者目№IL1I自勺cH^B(x44111】▲:i++J.-且尊呈mc+J FIgure4…p|..nl¨IIlinhuc~JlhinnIj…ilhhealth5periodontnlcondltions[AB<x4ml】^:rhePsJ0noll1一l0_nJ'ucnlIc'ell~…【…{¨).rJteexp?ei??n..fIIIl{inbuccalcell~…,vcqk[十j.目5Il,】日_IcsAc.×4ml】Figure#…p…I.|n¨rIIIiIIt?urd14cSAII,10差异(,<001)进行分静I帅愉骑发删.轻r度(】II—I13边州度显普高r健康州(P<n.01j;重鹰cl】组ll—IB表述度显菩扁十辑巾『堑组(P<0【】I).1#表3州蛳媵细胞TT—I13点选进行多『己哉性呵¨舒析发珊PT.1BOI'll—I13ViI基型J制孙细吣II一18的美J蔓厄桐咒性:【二AL和PI)正丁却『赫膜细眦ILlBITi"J表达f～L,k()__5:PDP<001),丧4#№IL—lBl'~ble3lllcexpcI…r1ll1BinI'uccellsI:nnl皑"【{H…m4IlIlB$性目Tahk4A眦l'sisolthep……口ul11一IBbymtnltlpIinu3讨论珂痫是慵复杂的盘畦破州峨尽鹤'细柏被c^是瘌枝q旧婿动r信土龟懂厄』过程巾释放帕醴晕细j刈牙J缅的破坏山很亟l131llllB上…-艘细胞『生.是十U悼纠胞免崆反应过{i阡救的五班川胞于之一牙周病的发生发腥惭l川I:∈丁I,l外呐惜多樯蛙瑚诱导剂.过促进J刊隙紊Er』艟碓质金白嘶帅舟J,.州拉砰可嗣站缔【l什 导惜骨啦l导致才J纽m刊蛳黜心细胞托耻伴易不受收佯郫目.J虹穗芷l用口毗I'l~J免崆状采刚钲疫绀比疗法制枷孙唑细胞II—lB纳丧丛世fr惶删±-旱显小:煳黏啦川忸【J一IB】土牙啊肚酱轻-fJ鹰陛眺矸删挺』廿牙挺3r行n?姓蔷并.即重度组盟昔高r}巾睦绁.轻望组又舟J一匀瑚罐氍组性蝴赫细胞II—JBfIII达科与赴的匝程窿n疋为判断ll】B…基多忠埘IL—lB表J土{士JL影响行进墒影啊I1JB☆怕临床指*川受武青H一】B,IIa¨I锋位坫f型进仃r删老将fAIPD.PL[BOPII一】13'睡Iq型{M封1悦细怛【I.一IB的袁丛进行多元绒U【讣求挺删:IL—I13等位基Ⅱ仆市差仳存rj丁重鹰组Hf硅刈f0纽之.迪一沧箍海甘I的研究i果似提示JL—I13位『qⅡ型与重鹰1世牙用炎患者的敏仃疋:mk-u?-¨m"等和卅等II的研究结显,:患性哥用炎的[]讣几IL—iB'蜘的拱带为46()秆I406%.是|l_If,同ILJB基簇住同种摧i㈨圩布小同.旌几陧矸用炎忠肯】LlB"帅摧率l补L壁时锎黏嚷细胞IL—IB的丧进什多[跬恺同__廿浙发删.攫m『【一IB.等竹蛙Il患扦的¨黜呲『兀胞lLlB表逃强度术增]】¨.排测儿一IB'等位黟?460? 上海口腔医学2006年l()月第15卷第5期ShanghaiJounMofStomatologyVol15No.5October,2006基因II型可能在部分人群中对牙周组织的破坏或使损伤加重起到很大作用,而对机体细胞免疫反应的影响则不大.另外,CAL和PD正相关于IL一1p的表达,即牙周附着丧失越多和(或)牙周袋越深,颊黏膜IL一1B表达越强烈.可见,该小样本研究表明:颊黏膜IL一1B表达与牙周炎的严重性具有相关关系,其原因可能与牙周致病菌有关.我们采用原位杂交技术发现,口腔颊黏膜细菌侵入数量与龈下菌斑的细菌数量密切相关(未发表).引起牙周组织损伤的牙周致病菌,如牙龈卟啉单胞菌能够侵入颊黏膜细胞,其毒力因子引起局部细胞因子反应增强【7_s1.此外.遗传因素是通过影响个体对致病菌的炎症反应类型和强度而造成个体对牙周病的易感性差异,免疫相关因子的基因型可能决定了个体对牙周炎的易感性l91.该实验仅是一个小范围的探索性研究.并没有考虑其他细胞因子基因多态性的影响.有待于今后在大范围人群中进行多个细胞因子分析,从而更深入了解机体细胞免疫反应的影响因素以及细胞免疫与牙周炎发生,发展的关系.【参考文献】[1】AmfitageGC,WuY,WangHY,eta1.Lowprevalenceofaperi_odontitis—associatedinterleukin—lcompositegenotypeinindivid-ualsofChineseheritage[J].JPeriodontol,20O0,7l(2):l64一l71.『21Anne—LaureE,FrederickG,SylvieIT.eta1.Arecytokineslinkedtocollagenbreakdownduringperiodontaldiseaseprogres-sion[J]?JPeriodontol,2003,74(2):l96—201. 『31GravesDT,CochranD.Thecontributionofinterleukin—landtumornecrosisfactortoperiodontaltissuedestruction.JPeriodonto1.2003.74(3):3l9—401.[4]黄海云.庞如愚,章锦才,等.IL—lp~YTaqI基因型多态性与慢性牙周炎相关关系的研究『J1.实用口腔医学杂志,2001,l7(4):274-277.[5】KommanKS,CraneA,WangHY,eta1.Theinterleukin—lgenotypeasaseverityfactorinadultperiodontaldisease『J1.JClinPeriodontol,l997.24fl1:72—77.『61CoreEA.SandersJJ,PandeyJP,eta1.Interleukin—lpallele2:associationstatusinadultperiodontitis[J].JClinPeriodontol,l998.25fl0):78l-785.[7】SandrosJ,KarlssonC,LappinDF,eta1.Cytokineresponsesof0-ralepithelialcellstoPorphyromonasgingivalisinfection[J].JDentRes.2O0079(101:l808一l8l4.『81SuganoN,IkedaK,OshikwaI,eta1.Differentialcytokineindue.tionbytwotypesofPorphyromonasgingivalis【J】.OralMicrobiolImmunol,2004.19f2):l2l—l23.【91钟良军.张蕴惠,章锦才,等.白细胞介素l受体拮抗剂基因型与维吾尔族慢性牙周炎的关系Ⅲ.中华口腔医学杂志,2003,38f5):370—373.《中国IZlI1_?:颌面外科杂志》征订启事《中国VI腔颌面外科杂志》(ChinaJournalofOralandMaxillofacialSurgery)系中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会会刊,由卫生部主管,中华口腔医学会主办,中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会承办.于20o3年3月正式创刊.中国标准刊号CN11-4980/R,ISSN1672—3244.由着名口腔颌面外科专家,口腔医 学教育家,中国VI腔医学界第一位工程院院士邱蔚六教授担任主编,着名VI腔医学专家王大章,张震康,刘宝林,李金荣,张志愿,俞光岩教授担任副主编,郑家伟教授担任常务副主编.杂志本着坚持理论联系实际,贯彻"百花齐放,百家争鸣"的方针,发扬学术民主,活跃学术氛围.主要报道我国口腔颌面外科领域的新成果,新经验,新理论,新知识,开展国际学术交流,开辟继续教育园地,以繁荣和发展我国的VI腔颌面外科学事业.本刊主要栏目有述评,基础研究,临床研究,专栏论着,临床总结,综述,学术讲座等,适合国内外各医学院校,有关科研院所,医疗卫生机构及从事VI腔颌面外科专业与涉及本专业的各级医师,教师和科研工作者,包括大学生,硕士及博士研究生,博士后研究人员等参阅.《中国口腔颌面外科杂志》现为国家科技部中国科技论文统计源期q:lJ,中国科技核心期刊以及美国化学文摘(GA)收录期刊.欢迎订阅或直接与我部联系邮购.杂志为双月刊,单月末25日出版,标准A4开本,每期80页,铜版纸彩色印刷,每本定价8.o0元,全年定价48.o0元(邮购者全年6O.o0元).联系地址:上海市制造局路639号《中国VI腔颌面外科杂志》编辑部.联系人:徐新,电话:021—33183312,63138341—5290;传真:O2l一63121780:E—mail:cjoms@omschina.org.cn,网址:http://www.omschina.org.cn/cioms