犬瘟热病毒和犬细小病毒的分离与鉴定及其单克隆抗体的研制

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分类号：R4单位代码：10752密级：公开学号：201300141宁夏医科大学硕士研究生学位论文犬瘟热病毒和犬细小病毒的分离与鉴定及其单克隆抗体的研制Isolationandidentificationofcaninedistempervirusandcanineparvovirusanddevelopmentoftheirmonoclonalantibodies学位申请人：杨丽指导教师：徐广贤教授申请学位门类级别：医学专业名称：临床检验诊断学研究方向：临床病原微生物与免疫学所在学院：临床医学院论文完成日期：二〇一六年三月宁夏医科大学研究生学院 NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeIsolationandidentificationofcaninedistempervirusandcanineparvovirusanddevelopmentoftheirmonoclonalantibodiesStudent’sName:YangLiSupervisor:A.P.XuGuangxianSubjectCategory:MedicalscienceMajor:ClinicalLaboratoryDiagnosticsSpecialty:ClinicalMicroorganismandImmunoregulationSchool:ClinicalMedicineCompletionDate:LaboratoryMar.2016 犬瘟热病毒和犬细小病毒的分离与鉴定及其单克隆抗体的研制Ⅱ 犬瘟热病毒和犬细小病毒的分离与鉴定及其单克隆抗体的研制摘要目的本研究拟分别从宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子和犬细小病毒感染病犬的粪便拭子中，分离鉴定宁夏犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)毒株，并制备相应的单克隆抗体，为犬瘟热和犬细小病毒病的早期快速诊断和预防治疗提供研究基础。方法1.收集宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子和犬细小病毒感染病犬的粪便拭子预处理后，分别接种非洲绿猴肾细胞系（Vero）和猫胎肾细胞系(FK81)进行病毒的分离培养，并观察细胞毒性改变（CPE）。2.37℃/-20℃冻融收获分离培养的病毒，并对收获的CDV、CPV分别进行鉴定。鉴定试验有：病毒毒力测定（TCID50）、透射电镜观察病毒颗粒形态、特异性PCR鉴定及间接免疫荧光试验（IFA）检测。3.对分离培养鉴定出的CDV、CPV病毒分别浓缩纯化后，分别免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，并在二次免疫两周后同时剪尾巴采血测小鼠体内血清抗体效价，为细胞融合做准备。同时建立间接ELISA检测方法。4.制备CDV和CPV免疫脾细胞，分别与小鼠骨髓瘤细胞（SP20）、BALB/c小鼠饲养细胞进行细胞融合。融合后加入HAT培养基进行筛选，12天后更换为HT培养基。对间接ELISA检测阳性的融合孔利用有限稀释法进行克隆化，并随时检测克隆化后单克隆孔抗体分泌情况。将筛选出的间接ELISA检测3次以上阳性的单克隆孔扩大培养并保存。5.将筛选出的抗CDV单克隆抗体株和抗CPV单克隆抗体株分别进行杂交瘤细胞染色体计数、单克隆抗体亚型鉴、效价检测、特性性和稳定性检测和单克隆抗体抗原表位分析及单克隆抗体亲和层析柱纯化。Ⅰ 结果1.Vero细胞接种疑似犬瘟热感染病料盲传至第四代时，90%以上细胞发生CPE改变；透射电镜从形态学方面观察到病毒液中有形状不规则，直径在200nm左右，有囊膜的病毒颗粒；RT-PCR特异性鉴定和N基因全长扩增分别在484bp和1572bp处出现与预期大小一致的目的片段；IFA试验在细胞胞质中可观察到点状的特异性绿色荧光。2.FK81细胞接种疑似犬细小病感染病料盲传至第三代时，90%以上细胞发生CPE改变；透射电镜从形态学方面观察到病毒液中呈现立体对称、圆形、无囊膜，直径在20～23nm之间的实心病毒颗粒；PCR特异性鉴定和VP2基因全长扩增分别在209bp和1755bp处出现与预期大小一致的目的片段；IFA试验可观察到围绕细胞核的特异性绿色荧光。3.利用间接ELISA筛选出3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞，分别为C6细胞株、G10细胞株、H2细胞株；筛选出3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞株，分别为B8细胞株、E10细胞株、F12细胞株。4.3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞染色体数目都在90条以上，效价较低，亚型鉴定都为IgG1型且抗原表位相同，经鉴定为同一株单克隆杂交瘤细胞；3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞染色体数目都在95条以上，效价相对高，亚型鉴定B8株和F12株为IgG1型，E10株为IgM型，抗原表位不同，特异性高，稳定性好。结论：成功分离培养并鉴定出宁夏地区的CDV和CPV各1株。成功筛选出3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞，对其特性和生物活性进行鉴定，为同一杂交瘤细胞株；成功筛选出3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞，可以和不同抗原表位结合，为后续制备CPV诊断试剂盒和高效特异性的犬细小病毒单抗生物制剂奠定了基础。关键词：犬瘟热病毒，犬细小病毒，分离与鉴定，单克隆抗体Ⅱ IsolationandidentificationofcaninedistempervirusandcanineparvovirusanddevelopmentoftheirmonoclonalantibodiesABSTRACTObjectiveInordertoofferearlyrapiddiagnosisandpreventivetherapyforthecaninedistemper(CD)andcanineparvovirusdisease(CP).astrainofcaninedistempervirusandastrainofcanineparvoviruswereisolatedandidentifiedfromfecalswabsofdogssuccessfully,whichweresuspectedlyinfectedbycaninedistempervirusandcanineparvovirusinNingxia.Thestudydevelopedtwomonoclonalantibodiesagainsttheviruses,layafoundationforearlydiagnosisandpreventiontreatmentofcaninedistemperandcanineparvovirusdisease.Methods1.Wecollectedfecalswabsfromdogssuspectedlyinfectedbycaninedistempervirusandafecalswabfromdogsuspectedlyinfectedbycanineparvovirus.Afterwepretreatedthesuspiciousmaterialsandsynchronousvaccinatedtheirsensitivecelllinerespectively,whichwerenamelytheAfricangreenmonkeykidneycellline(Vero),catembryokidneycellline(FK81)andisolatedvirus.Weobservedcytopathiceffect(CPE).2.Thefrozenvirusesat-20℃weregottenoutandthawedat37℃.Aftercultured，CDVandCPVviruswereidentifiedrespectively.Thenthetoxicitymeasurement,electronmicroscopeobservation,specificidentificationofPCR,NgeneofCDVgeneamplificationofPCRandsequenceofanalysis,VP2geneofCPVgeneamplificationofPCRandsequenceofanalysis,indirectimmunofluorescentassaywerecarriedoutontheisolatedvirus.3.AftertheseparatedCDVvirusandCPVviruswereconcentratedandpurified,weusedthemtoimmunize6-8weeksoldfemaleBALB/cmicerespectively.Aftertwoweeksinthesecondaryimmune,weshearedtailsoftheimmunizedmiceandcollectedblood.Wetestedthetiterofserumantibodiesandpreparedforcellfusion.Atthesametime,weIII establishedamethodofindirectELISA.4.Preparationofmousemyelomacells(SP20),BALB/cfeedcells,CDV-immunizedspleencellsandCPV-immunizedspleencellsanddidcellfusionrespectively.AfterfusionweaddedHATculturemediumtoscreencellsandaddedHTculturemediumafter12days.WeearlyusedlimiteddilutionmethodtoscreenpositivecloneswhenwefoundthembyindirectELISAandwedetectedthesecretingofmonoclonalantibodiesatanytimeaftercloning.ExpandingandpreservingpositivecloningholeswhichwerescreenedbyELISAmonoclonalindirectdetectionofmorethanthreetimes.5.IdentifiedmonoclonalantibodiesagainstCDVorCPV.Thetestsasfollows:thecellcountofhybridomachromosomes,thetestofantibodiestiter,subtypeidentificationofmonoclonalantibodies,characterizationofmonoclonalantibodiesspecificity,thedetectionofmonoclonalantibodiessecretionandstability,theanalysisofantibodiesantigenepitopeandmonoclonalantibodieswerepurifiedbyaffinitychromatographycolumn.Results1.TheVerocellshad90%stabletoxicitychangesafterblindlypassagetothefourthgenerationwhichwereinoculatedwithsuspectedlyinfectedmaterials.Theresultofelectronmicroscopyshowedthatvirusparticleswereirregularshape,atabout200nmindiameterandenvelope.TheresultsofspecificRT-PCRidentificationandthelengthofNgeneamplificationwereconsistentwiththeexpectedsizepieces,onewas484bpanotherwas1572bp.IFAtestshowedthatpunctiformwithspecificitygreenfluorescencecanbeobservedinthecellcytoplasm.2.TheFK81cellshad90%stabletoxicitychangesafterblindlypassagetothethirdgenerationwhichwereinoculatedwithsuspectedlyinfectedmaterials.Virusparticleswerethree-dimensionalsymmetricalstructure,circular,nocapsulemembrane,thediameterbetween20nmand23nmandsolid.SpecificPCRidentificationandthelengthofVP2geneamplificationwereconsistentwiththeexpectedsizepieces,onewas209bpanotherwas1755bp.ThespecificgreenfluorescentcanbeobservedaroundthenucleusbyIFA.IV 3.ThreeCDVmonoclonalhybridtumorcellswerescreenedsuccessfully,andtheywereC6strain,G10strainandH2strain.BesidesthreeCPVmonoclonalhybridtumorcellswerealsoobtained,andtheywereB8strain,E10strainandF12strain.4.ThechromosomenumberofthreeCDVmonoclonalhybridtumorcellsweremorethan90.TheycansecretelowlevelofIgG1monoclonalantibody.Finallytheywerefoundtobethesamestrain.ThechromosomenumberofCPVmonoclonalhybridtumorcellsweremorethan95.Theycansecretearelativelyhightiterofmonoclonalantibody.BothB8strainandF12straincanproduceIgG1,andE10straincansecreteIgM.Threemonoclonalantibodiescouldrecognizedifferentantigenepitope,andhavehighspecificityandgoodstability.ConclusionsaCDVepidemicstrainandaCPVepidemicstraininNingxiawereseparatedandidentifiedsuccessfully,threestrainsofCDVmonoclonalantibodieswerescreenedandidentifiedbydetectionoftheircharacteristicsandbiologicalactivities.Finallywefoundthattheywerethesamestrain.Besides,threestrainsofCPVmonoclonalantibodieswerescreenedsuccessfullyandtheyhaddifferentepitopes.Thisstudylaidthefoundationfortheearlydiagnosisandtreatmentofcanineparvovirusdiseasewillhaveacertainapplicationinthefiledinthefuture.KEYWORDScaninedistempervirus,canineparvovirus,isolationandidentification,monoclonalantibodyV 中英文对照表英文缩写英文全称中文全称bpbasepair碱基对BSABovinealbumin牛血清白蛋白CDVCanineDistemperVirus犬瘟热病毒CPVCanineParvovirus犬细小病毒CDcaninedistemper犬瘟热CPCanineparvovirusinfection犬细小病毒病CPEcytopathiceffect细胞毒性改变DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbnentAssay酶联免疫吸附实验FK81FK81cells猫胎肾细胞H-Hypoxanthine，A-Aminopterin，次黄嘌呤，甲氨喋呤，HATT--Thymidine胸腺嘧啶核苷培养基次黄嘌呤，胸腺嘧HTH-Hypoxanthine，T--Thymidine啶核苷培养基IFAindirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光实验PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PEG4000polyethyleneglycol4000聚乙二醇4000PEG8000polyethyleneglycol8000聚乙二醇8000PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳reversetranscription-polymeraseRT-PCR逆转录聚合酶链反应,chainreactionTCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染量TMBTetramethylbenzidine四甲基联苯胺VeroVerocells非洲绿猴肾细胞Ⅵ 目录一、正文前言........................................................................................................................................1第一部分犬瘟热病毒的分离培养与鉴定...........................................................................3材料与方法....................................................................................................................3实验结果......................................................................................................................12讨论..............................................................................................................................14第二部分犬细小病毒的分离培养与鉴定........................................................................15材料与方法..................................................................................................................15实验结果......................................................................................................................21讨论..............................................................................................................................24第三部分犬瘟热病毒单克隆抗体和犬细小病毒单克隆抗体的研制............................26材料与方法..................................................................................................................26实验结果......................................................................................................................36讨论..............................................................................................................................41结论.............................................................................................................................43参考文献.....................................................................................................................44二、文献综述..........................................................................................................................46犬瘟热病毒和犬细小病毒的研究进展.......................................................................46参考文献.......................................................................................................................52三、致谢...............................................................................................................................56四、攻读学位期间发表的学术论文......................................................................................57五、个人简历..........................................................................................................................58Ⅶ 前言犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus，CDV)和犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)是感染犬科动物常见的两种病毒。CDV引起的犬瘟热（caninedistemper，CD）是一种[1]急性的、传播速度快的、接触性的传染病，在全世界范围内广泛分布。CPV引起的犬细小病毒病(Canineparvovirusinfection，CP)是一种急性烈性传染病，发病快，死亡率高[2]且传染速度极快，是养犬行业最严重的传染病之一。这两种病毒的感染对养犬行业、[3]动物养殖业、珍稀动物观赏和野生动物保护、宠物饲养行业及实验动物等危害极大，也带来了巨大的经济损失。所以有效快速的检测诊断和提早预防治疗犬类动物CDV和CPV的感染是十分必要和迫在眉睫的事情。越来越多的学者对CDV、CPV进行了深入的研究，包括CDV、CPV致病机制的研究，CDV、CPV的诊断及预防免疫疫苗方面的研究。本研究收集宁夏地区疑似犬瘟热病毒感染病犬粪便拭子和犬细小病毒感染病犬粪便拭子，用于分离培养鉴定CDV、CPV，其研究重点在于CDV、CPV两种病毒单克隆抗体的研制，为CD、CP两种传染病的早期快速诊断和预防治疗提供基础和可能性。在CD、CP的诊断方法中，CDV、CPV分离培养是诊断犬瘟热和犬细小病毒病最常用的方法。经查阅资料，目前用于分离培养CDV的细胞系为非洲绿猴肾细胞（Vero）传代细胞系，Vero作为国际组织普遍通用的一种传代细胞系，有着很高的开发应用潜力，是世界卫生组织推荐并用于生产人源性免疫生物制品的[4]传代细胞系，所以本研究选择Vero作为CDV分离培养的对象。CPV能够在猫胎肾细胞，[5]犬胎肾细胞，小貂肺细胞、牛胎脾细胞内复制，CPV选择猫胎肾细胞系（FK81）进行分离培养。利用实验室常规的病毒诊断鉴定方法，对分离的两种病毒进行鉴定。利用透射电镜检从形态学方面观察鉴定两种病毒粒子；RT-PCR技术、PCR技术从分子生物学方面分别检测感染Vero细胞中的病毒核酸鉴定CDV和检测感染FK81细胞中的病毒核酸来鉴定CPV；再通过免疫学方面的检测即间接免疫荧光技术进一步诊断鉴定分离的两种病毒。成功分离培养并鉴定出了宁夏地区1株CDV毒株和1株CPV毒株。单克隆抗体技术现在已经大面积应用于生物医学的诊断治疗领域，是新世纪生命科1 [6]研究的重要工具。单克隆抗体有其无与伦比的优点，特异性高、纯度高、亲和力高、重复性好、效价强、成本便宜且可大批量生产，在血清学和免疫学基础研究技术、肿瘤[7-8]治疗、抗原特异性纯化、抗体疫苗研制等方面应用广泛。本研究利用单抗细胞融合技术，将CDV、CPV分别免疫的BALB/c小鼠脾细胞和SP20骨髓瘤细胞融合，制备出能分泌抗CDV杂交瘤细胞株、抗CPV杂交瘤细胞株，从中培养、筛选出特异性CDV单克隆杂交瘤细胞株、CPV单克隆杂交瘤细胞株，为本实验室研制犬瘟热、犬细小病毒病诊断试剂盒和治疗制剂提供前期基础，进一步为宁夏地区犬瘟热和犬细小病毒病的诊断和预防治疗做出贡献。2 第一部分犬瘟热病毒的分离培养与鉴定材料与方法1．实验材料1.1病料、细胞株及抗体2014年采集宁夏地区一只鼻眼有分泌物、呼吸困难、呕吐、腹泻、严重脱水等症状病犬的粪便拭子。非洲绿猴肾细胞系（Vero）由本实验室保存。CDV阳性鼠抗血清由实验室自己制备保存。1.2主要试剂DL2000DNAMarker、ExTaqDNA聚合酶、dNTP购自天根生化科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒（DNAGelExtractionKit）购自Omega公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司。T载体购自北京全式金生物技术有限公司。胎牛血清（FBS）、DMEM高糖细胞培养液、磷酸盐缓冲液（PBS）购自GIBICO公司。青霉素-链霉素混合溶液（双抗）、EDTA-胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝科技有限公司。羊抗鼠FTIC-IgG荧光抗体购自Proteintech公司。1.3主要仪器设备仪器名称生产商家纯水系统EASYpureB/T(Barnstead)，美国超低温冰箱海尔，中国二氧化碳培养箱力康，中国香港普通/荧光显微镜OLYMPUS，日本台式迷你离心机Eppendorf，德国凝胶成像仪BIO-RAD，美国水平电泳槽BIO-RAD，美国普通PCR仪BIO-RAD，美国2.实验方法3 2.1病料处理①将采集的疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子立即放入含有PBS溶液（含100U/mL双抗）的离心管中，离心管放于4℃过夜。②用高压蒸汽灭菌法灭过菌的镊子将粪便拭子上的液体在离心管中挤干。③将上述含有液体的离心管放入离心机中，设置离心条件为4℃，8000r/min，离心40min后取出。④将上清液用0.22μm的无菌滤器过滤后，分装到灭菌的1.5mlEP管，密封后，冻存于-80℃冰箱供病毒分离培养使用。2.2病毒的分离培养2.2.1Vero细胞的复苏、传代培养①将Vero细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，并不时的摇动，使细胞冻存管在1min内完全融化。②将细胞冻存管外壁用75%酒精消毒后，在细胞间超净工作台内打开冻存管盖子，用一次性无菌吸管将融化的细胞悬液吸入装有8mLDMEM完全培养液的离心管中。③将上述离心管在1200r/min条件下离心6min，吸去上层培养液，加入含有12%FBS的DMEM完全培养液，用一次性吸管吹打液体使沉淀细胞悬浮，接种于细胞培养瓶，做好标记，37℃，5%CO2培养。④复苏的Vero细胞每24h换一次细胞培养液。大约在3～4天后细胞密度达90%以上时开始传代。⑤弃掉旧的细胞培养液，用PBS溶液洗涤细胞2～3次。加入0.25%胰蛋白消化酶约1mL左右，消化3min左右后，将培养瓶盖子拧开加入含12%FBS的DMEM终止消化。⑥用吸管轻柔吹打细胞培养瓶底部2-3次，将消化下的细胞收集到离心管中，1200r/min离心6min。⑦弃去培养上清，加入完全DMEM培养液重新悬浮细胞，以1︰2的传代比例将细胞悬液接种于细胞培养瓶，每瓶5mL培养液，做好标记，37℃，5%CO2培养。2.2.2同步法接毒CDV4 ①选择生长状态良好，密度均一，长成单层的Vero细胞作为接种病毒的最佳对象。②将上述状态的Vero细胞在消化传代的同时，接种已经处理好的病料。病料的接种量为培养液总体积的1/10。③设立未接毒的Vero细胞为正常对照组，做好标记，将两者同时置于37℃，5%CO2培养箱。④培养期间每天观察细胞毒性病改变（CPE），并拍摄照片记录试验结果。⑤若盲传至五代以上Vero细胞依旧无CPE改变，则视为病毒分离试验为阴性结果；若接毒4d后Vero细胞有CPE改变，则将培养物在37℃/-20℃条件下冻融3次，4℃12000r/min离心45min，0.22μm微孔滤膜过滤后，取上清液继续同步接毒Vero细胞，培养至第四代，90%以上Vero细胞出现稳定的CPE改变时，收获病毒，-80℃冰箱冻存为后续试验做准备。2.2.3细胞冻存①在冻存细胞的24h前更换新鲜细胞培养液，使Vero细胞处于指数生长期。②提前配制好细胞冷冻保存液。按照DMEM培养液︰FBS︰DMSO=7︰2︰1的比例配制冻存液于离心管中，放入4℃冰箱。③将Vero细胞用胰蛋白酶消化后，用一次性吸管吸入离心管中。④将上述离心管1200r/min离心6min，弃去上层培养液，加入一定量的细胞冻存液，用吸管轻柔反复吹打直至单个Vero细胞悬液。⑤将上述Vero细胞悬液分装至2ml的细胞冻存管中，1.2mL/支，标记好细胞名称、代数、冻存时间、日期。⑥按照4℃冰箱1.5h，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜的条件冻存细胞，第二天将冻存细胞管放入液氮罐中。2.3病毒的鉴定2.3.1病毒毒力测定（TCID50）-1-10①将收获的第四代病毒液在2mL的EP管中做10-10的倍比稀释。②将倍比稀释的第四代病毒液接种于96孔细胞培养板，每一稀释度接种12个细胞孔100μL/孔。5 ③再将长成单层的Vero细胞用胰酶消化，调整细胞密度，接种于含有病毒液的96孔细胞培养板，每孔接种100μL细胞悬液。④设立未接毒的对照组，做好标记后，放入37℃、5%CO2培养箱。逐日观察不同稀释度每孔细胞的CPE改变并做好试验记录。2.3.2透射电镜观察病毒粒子①将培养的第四代病毒培养液用加样抢取10μL滴于铜网上。②在室温环境下，待铜网上的病毒液快干时，用加样枪取10μL2%磷钨酸滴于上述铜网对病毒液中的病毒颗粒进行负染。③在透射电镜下调整合适的视野观察病毒颗粒的形态和大小并拍摄照片。2.3.3RT–PCR特异性扩增鉴定和N基因全长的扩增鉴定①设计的引物序列如下表所示引物序列目的基因大小作用引物1F:5′-GTGACTGCTCCTGATACTGC-3′484bp特异性检测R:5′-GTTCAACACCAACTCCCATA-3′引物2F:5'-TGGCTAGCCTTCTTAAGAGC-3'1572bpN基因扩增R:5'-TTAATTGAGTAGCTCTCTGTCATTA-3'备注：引物在北京三博远志生物技术有限责任公司合成②病毒感染的Vero细胞、正常Vero细胞总RNA的提取a.向病毒感染细胞管和正常细胞管分别加入800μLTrizol试剂，用加样抢上下吹吸使其充分混匀后，室温静置8min。b.向上述细胞管中加入1/5Trizol试剂体积量的氯仿即160μL，用漩涡震荡仪剧烈振荡40s混匀，室温静置8min后，4℃，13000r/min离心20min。c.轻拿轻放小心取出后，将上层液体用加样枪轻轻的吸取到做好标记的对应的EP管中。d.向上述EP管中加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀15次，室温静置15min，4℃，6 13000r/min离心8min取出，将上清液弃掉。e.向上述EP管中加入1mL配制好的75％乙醇，用加样枪轻柔清洗离心管壁和底部后，4℃，13000r/min离心8min，小心弃掉上清。f.重复e步骤g.室温放置EP管10min，使管中酒精挥发干净，沉淀完全干燥后，加入35μL的DEPC水，完全溶解RNA沉淀，标记好名称日期后，迅速放入-80℃超低温冰箱。③cDNA合成（采用Fermentas反转录试剂盒操作步骤）a.将上一步提取的RNA溶解液置于冰盒上，取EP管做好标记。依照下表加样，混匀后点离。ComponentsVolumeRNA1µLRandomprimer1µLddH2O10µL总体12µL积，在62℃水浴锅中放置5min，立即放于冰盒上。b.按照下表所示顺序继续加样（冰盒上操作）：ComponentsVolume5XReactionBuffer4µLRiboLockRNaseInhibitor1µL10mMdNTPMix2µLRevertAidM-MuLVReverse1µLTranscriptase与a共同组成20µL体系，充分混匀并点离。c.将装有液体的上述EP管42℃孵育60min。d.再70℃孵育6min来终止反应。e.-80℃冰箱保存备用。④PCR特异性扩增和N基因扩增7 A.两者使用相同的扩增体系如下表所示：试剂名称体积缓冲液（10×）2µLdNTP混合物1µL1µLTaqDNA聚合酶上游引物1µL20µL下游引物1µLcDNA1µLddH2O13µLB.扩增反应条件如下特异性扩增反应条件94℃预变性5min94℃30s56℃30s30cycles72℃30s72℃延伸10minN基因扩增反应条件95℃预变性5min95℃1min55℃1min35cycles72℃2min72℃延伸8minC.1.0%琼脂糖凝胶电泳a.配制凝胶：称取1.0g琼脂糖于配胶瓶内，加100mL1×TBE溶液，放入微波炉使凝8 胶融化，稍微晾一会儿，将其倒入提前插好梳子的凝胶槽内，待其凝固后使用。b.加样：将10×的上样缓冲液和PCR产物以1︰9比例混合均匀后，每孔上样5µL，同时加入5µL的2kbDNAMarker和阴性对照，记录好加样顺序。c.电泳：将电泳仪调节为90V，50min。d.观察结果：戴好手套，取出电泳后的凝胶，放入EB染缸中浸泡染色35min，清水漂洗后，用凝胶成像仪观察目的基因条带，拍照记录试验结果。2.3.4特异性基因、N基因测序①目的条带的凝胶回收a.在紫外灯照射下，将扩增出来的与预期大小一致的目的基因的琼脂糖凝片段用酒精消毒的小刀切下，装入标记好的EP管中，电子天平称量凝胶重量。b.加与凝胶体积相同的BindingBuffer后，将EP管置于60℃水浴锅中孵育10min，每间隔3min左右颠倒混匀一次。c.将600μL的融化液体加入到套有2mL收集管的HiBindTMDNA柱子，室温下，11000r/min离心90s，弃去液体，若还有融化液体，则再重复一次c步骤。d.将柱子重新套回收集管中，加300μLBindingBuffer至HiBindDNA柱子中，室温条件下，11000r/min离心90s，弃去滤液。e.将柱子重新放回收集管中，加入700μLSPWWashbuffer，室温11000r/min离心90s，弃去滤液。f.将柱子重新套回收集管中，重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室温条件下，11000r/min离心90s，弃去滤液。g.弃去滤液，将柱子套回收集管中，15000r/min离心3min。打开盖子，室温放置10min，待柱子干燥。h.把柱子装在一个灭菌的做好标记的EP管上，加样抢对准柱子的滤膜中央，加入35μLDEPC水，11000r/min离心90s，-20℃冰箱保存。②连接反应：PCR特异性片段和N基因片段的胶回收产物与T载体进行连接。相同的连接体系如下表所示：9 ComponentsVolumeT载体1μLPCR回收产物4μL27℃在水浴锅中连接8min，并做好标记。③连接终产物的转化a.提前取出–80℃冻存的感受态细胞，放到冰盒自然融化。b.冰盒孵育：将上述连接产物取5μL加入感受态细胞（50μL）管中，做好标记，用加样抢轻柔的吹打混合，冰盒上放置35min。c.热击：将上述EP管在37℃水浴锅中热击30s，立刻转移到冰盒上，放置15min。d.复苏：向热击后的EP管加入650μL无抗LB液体混匀后，37℃摇床震荡培养1.5h。(205r/min）e.涂板：将培养1.5h的菌液室温3500r/min离心8min后，弃去上清液至150µL左右，悬浮菌体沉淀，用玻璃棒将菌液均匀的涂布在提前配制好的氨苄抗性的培养板上，待液体干燥后，37℃培养箱培养12～14h。此过程中要注意无菌操作，以免杂菌影响试验结果。④摇菌、送测序a.转化第二天，选取转化平板上白色单个的大菌落，用灭菌枪头挑取并接种到5mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床振荡过夜培养（205r/min）。b.将菌液和甘油冻存液按1︰1比例分装到1.5mlLEP管，封口膜密封标记后，尽快送公司测序。2.3.5间接免疫荧光（IFA）试验①将单层的Vero细胞用胰酶消化接种在96孔板，100µL/，同时接种第四代病毒液100µL/孔，混匀后，放入细胞培养箱培养，每天观察Vero细胞的形态变化。同时设立阴性对照组。②4天后，Vero细胞发生90%以上CPE，此时弃去培养上清，加入PBS洗涤3次，再加入–20℃冰箱预冷的甲醇室温固定30min。10 ③加入PBS摇床震荡洗涤4次后，加入实验室自制的鼠抗一抗100µL/孔，37℃温箱反应1.5h。④加入PBS摇床震荡洗涤4次后，加入羊抗鼠二抗（FTIC标记）100µL/孔，37℃温箱反应1.5h。⑤加入PBS摇床震荡洗涤4次后，吸水纸上拍干液体，立即在倒置荧光显微镜下观察结果并拍照，以防荧光淬灭。11 实验结果1．病毒的分离培养疑似感染病料接种Vero细胞盲传至第四代时，与正常Vero细胞(图A)相比，接毒24h后(图B)，Vero细胞轮廓变模糊，细胞质中出现许多黑色的细小颗粒；接毒72h后(图C)，90%以上Vero细胞变圆脱落，聚集成堆，接近死亡，出现明显的CPE。结果如图1所示ABCA:正常Vero细胞;B:接种CDV24h后的Vero细胞;C:接种CDV72h后的Vero细胞.图1Vero细胞接种CDV细胞病变2．TCID50测定-4.2根据Reed-Muench的计算方法计算出病毒液的TCID50为10/0.1ml，即取-4.210/0.1ml的CDV病毒液可引起50%以上Vero细胞发生感染。3.病毒形态学观察病毒液用2%磷钨酸负染后，可在透射电镜下观察到形状不规则，接近长条形，直径在200nm左右，有囊膜的病毒颗粒，如图2所示。图2CDV病毒粒子电镜照片12 4.RT-PCR特异性鉴定和N基因扩增利用病毒液的cDNA和正常对照Vero细胞的cDNA(阴性对照)为模板，PCR扩增后，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，在484bp、1572bp处出现与预计大小一致的目的片段，见图3、图4。M123M12342000bp2000bp1000bp1572bp1000bp750bp750bp500bp500bp250bp484bp100bp250bp100bpM:DNA分子质量标准;1、2:病毒特异扩M:DNA分子质量标准;1、2、3:病毒N增片段;3:阴性对照基因扩增片段;4:阴性对照图3特异性鉴定扩增图（484bp）图4N基因扩增图(1572bp)5.间接免疫荧光（IFA）CDV感染Vero细胞4天后，IFA试验结果表明，病毒在Vero细胞质中复制，特异性绿色荧光点状分布在细胞质中，如图5所示。ABA:CDV感染Vero细胞IFA;B:CDV感染Vero细胞放大图图5IFA检测CDV在Vero细胞中复制13 讨论犬瘟热病毒是危害犬类最为严重的一种病原性病毒，它传染性强，致死率高，具有较高的临床研究意义。本研究收集宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子，从中成功分离出了一株CDV毒株，并对其进行了鉴定，不仅丰富了宁夏地区犬瘟热病毒的流行病学资料，也为后续试验提供了研究基础。由于CDV为RNA病毒，脂质囊膜易被光照和高温灭活，抵挡外界环境刺激的抵抗力[9]较弱，病毒分离成功率较低，故本研究首先需要先综合考虑来确定最佳状态的分离培养细胞系，提高CDV的培养分离率。本研究通过查阅资料，魏凤等人研究结果表明：CDV[10]在Vero细胞中繁殖，产生CPE病变所需时间短，病变明显利于观察，且Vero作为一种国际通用传代细胞系。所以本研究选择并采用了CDV病毒敏感的传代细胞系Vero细胞，使其分离成功率提高。当Vero细胞接毒CDV盲传到第四代时，90%以上的Vero细胞变圆，脱落，出现细胞毒性改变，通过冻融法收获CDV。本研究对成功分离培养的CDV毒株从各个方面进行了鉴定，包括理化性质TCID50的鉴定，形态学方面病毒粒子的鉴定，分子生物学PCR特异性和基因全长扩增鉴定，免疫学方面间接免疫荧光的检测，最后通过测定基因序列的鉴定，所有的鉴定结果都与最初预想的结果相符。对分离培养出的CDV病毒进行了TCID50的测定，对其细胞毒性有了初步的了解，为后续试验有一个指挥引导的作用；利用透射电镜观察寻找病毒液中的病毒粒子，将拍摄照片中的病毒颗粒与常规的CDV病毒颗粒判断标准进行比较，发现形态相符合，具有囊膜，大小直径也在标准范围之内，这些结果都对后续试验有一定的推动力，对后续试验更有把握。通过查阅资料，CDV核衣壳蛋白（N）是CDV结构蛋白中[11]含量最高的，突变率比较低的，序列经常被用来作为RT-PCR诊断的靶序列，所以本研究针对CDV的N基因设计特异性鉴定引物和N基因全长的扩增引物，成功扩增出目的基因片段，其测序结果与CDV的N基因序列比对后高度相符合。将分离培养出的CDV病毒感染Vero细胞，利用间接免疫荧光（IFA）试验定位检测CDV病毒复制感染的部位，点状的绿色荧光分布在Vero细胞质当中，从免疫学方面再次证明分离培养的CDV细胞毒株是成功的，是具有研究意义的。14 第二部分犬细小病毒的分离培养与鉴定材料与方法1．实验材料1.1病料、细胞系及抗体2014年5月中旬采集宁夏地区某宠物医院一只有发热，厌食、频繁呕吐、剧烈腹泻症状病犬的粪便拭子；猫胎肾细胞系（FK81）为本实验室保存；CPV阳性鼠抗血清由实验室自己制备保存。1.2主要试剂胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养液购自GIBICO公司；青霉素链霉素混合液、EDTA-胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝科技有限公司；DL2000DNAMarker、ExTaqDNA聚合酶、dNTP购自天根生化科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Omega公司；T载体购自北京全式金生物技术有限公司，羊抗鼠FTIC-IgG荧光抗体购自Proteintech公司。1.3主要仪器设备仪器名称生产商家Ⅱ级生物安全柜NUAIRE，美国普通PCR仪BIO-RAD，美国细胞培养箱力康，中国香港倒置荧光显微镜OLYMPUS，日本恒温震荡培养箱恒一，中国凝胶成像仪BIO-RAD，美国水平电泳槽BIO-RAD，美国电子天平梅特勒，上海2.实验方法15 2.1病料的处理：病料的处理方法和上一节所叙述的病料处理方法相同。2.2病毒的分离培养2.2.1FK81细胞的复苏、传代培养：试验步骤同上一节细胞的复苏、传代步骤，唯一不同的是FK81细胞2～3天传代一次，传代比例为1︰3。2.2.2同步法接毒CPV①将长成单层的FK81细胞消化传代的同时，加入500µL处理好的病料，做好标记，并设立未接毒的空白对照。②置于37℃、5%CO2培养箱培养12h后，更换维持培养液。培养期间每天观察FK81细胞的细胞毒性变化。③接毒3d后，FK81细胞形态改变。将细胞培养物反复冻融后继续盲传，待FK81细胞出现90%以上CPE时收毒，-80℃冰箱冻存备用。2.3病毒的鉴定2.3.1病毒毒力测定（TCID50）-1-10①将收获的第三代病毒液在2mL的EP管中做10-10的倍比稀释。②将倍比稀释的第三代病毒液接种于96孔板，一个稀释度接种12个细胞孔，100µL/孔。③再将长成单层的FK81细胞消化接种于上述96孔板，100µL/孔，混匀。做好标记。④设立未接毒对照组，一起放细胞培养箱中培养。每天观察不同稀释度每孔细胞的CPE病变并做好试验记录。2.3.2电镜观察病毒粒子①取10µL第三代病毒培养液加于铜网上。②等铜网上病毒液快干时，滴一滴2%磷钨酸负染。③在透射电镜下观察病毒颗粒形态和大小并拍摄照片。2.3.3PCR特异性扩增鉴定和VP2基因全长的扩增鉴定[12]①引物设计：PCR鉴定引物1参照文献合成；VP2基因全序列扩增引物2由自己设计合成。两对引物都在北京三博司合成。16 ②引物序列：引物1F5'-CATTGGGCTTACCACCATTT-3'R5'-AAATGGCCCTTGTGTAGACG-3'引物2F5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3'R5'-TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGT-3'③第三代病毒液DNA的提取（按照OMEGA病毒DNA提取试剂盒说明书操作）a.吸取1mL病毒液于2mL的EP管中，并加入500µLBufferMPG，上下颠倒混匀50次。b.室温孵育60min。c.15000rpm/min离心15min，弃掉上清。d.加入200µLDEPC水和25µLOBProtease，漩涡震荡60s重悬沉淀。e.55℃水浴锅孵育10min，期间漩涡震荡混匀一次。f.加入250µL无水乙醇混匀后，室温孵育8min。g.将柱子和收集管组装好，做好标记，将上述液体加入组装好的柱子，14000rpm/min离心90s，弃去上清液。h.将柱子放入新的收集管，加500µLBufferVHB(加乙醇)清洗，14000rpm/min离心90smin，弃去上清液。i.将柱子放入新的收集管，加500µLBufferRWB(加乙醇)清洗，14000rpm/min离心1min，弃掉上清。重复一次。j.将柱子放入收集管，以最大速度15000rpm/min离心3min。k.将柱子放入无菌的EP管，加40µLDEPC水，14000rpm/min离心2min，收集液体，标记好保存备用。④PCR特异性扩增和VP2基因扩增A.两者使用相同的扩增体系如下所示：17 试剂名称体积缓冲液（10×）5µLdNTP混合物4µL1µLTaqDNA聚合酶上游引物1µL50µL下游引物1µLDNA模板2µLddH2O36µLB.扩增反应条件如下特异性扩增反应条件94℃预变性5min94℃30s55℃30s35cycles72℃30s72℃延伸8minVP2基因扩增反应条件96℃预变性4min96℃1min52℃1min30cycles72℃2min72℃延伸8minC.1.2%琼脂糖凝胶电泳a.配制凝胶：称取0.6g琼脂糖于配胶瓶内，加50mL1×TBE溶液，微波炉融化凝胶，将其倒入插好梳子的制胶槽内，制作两块小的胶块。b.上样：将10×的上样缓冲液和PCR产物以1︰9比例混匀后，每孔上样10µL，同时18 加入6µL的2kbDNAMarker和阴性对照。c.电泳：将电泳仪电压调节为110V，时间设置为35min。d.观察结果：电泳结束后，凝胶放入EB染缸中浸泡25min，用凝胶成像仪观察目的基因条带。2.3.4特异性基因、VP2基因测序①目的DNA条带的回收：试验步骤与上节凝胶产物回收步骤相同。②连接反应：PCR特异性片段和VP2基因片段的DNA胶回收产物与T载体进行连接。连接体系如下：ComponentsVolumeT载体1μLPCR回收产物4μL室温连接8min。③转化a.从–80℃取出感受态细胞，放到冰盒上自然融化。b.冰浴：将上述连接产物取5μL加入感受态细胞（50μL）中，轻柔吹打，冰盒上静置35min。c.热击：在37℃水浴锅中热击30s，立刻转移到冰盒上，放置10min。d.复苏：向上述EP管加入700μL无抗LB，37℃摇床培养2h后，3000r/min离心10min，上清液弃至200µL左右。e.涂板：混匀菌体沉淀，用玻璃棒将菌液涂在氨苄抗性的培养板上，置于37℃培养箱中培养13h。④摇菌、送测序a.选取转化板上较大的单一菌落，接种到6mL氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡过夜（205r/min）。b.将菌液和甘油冻存液按1︰1比例分装到1.5mlL的EP管忠，密封标记后，尽快送公司19 测序。2.3.5间接免疫荧光（IFA）试验①将长成单层的FK81用胰酶消化选取合适密度接种在96孔板，100µL/孔，同时接种第三代病毒液100µL/孔。设立阴性对照组，做好标记，放入细胞培养箱培养，每天观察FK81细胞的变化。②3天后，FK81发生90%以上CPE，此时弃去上清液，PBS洗涤2次，加入–20℃预冷的甲醇室温固定25min。③PBS洗涤3次后，加入实验室自制的鼠抗一抗37℃温箱孵育2h。④PBS洗涤3次后，加入羊抗鼠二抗（FTIC标记），37℃温箱孵育2h；⑤PBS洗涤3次后，在吸水纸上拍干液体，立即在荧光显微镜下观察结果并拍照。20 实验结果1．病毒分离培养结果疑似感染病料同步接毒FK81细胞盲传至第三代，正常FK81细胞（图A）相比，接毒48h(图C)后90%以上细胞发生形态改变，出现明显的CPE。实验结果记录了接毒24h,接毒48h,接毒72hFK81细胞的形态变化，如图1所示。ABCDA.正常FK81细胞；B.接种CPV24h后FK81细胞CPE；C.接种CPV48h后FK81细胞CPE；D.接种CPV72h后FK81细胞CPE图1FK81细胞接种CPV后的细胞病变2.TCID50测定-6.3根据Reed-Muench的计算方法计算出第三代病毒液的TCID50为10/0.1ml，即取-6.310/0.1ml的CPV病毒液可引起50%以上FK81细胞发生感染。3．病毒形态学观察2%磷钨酸负染可观察到第三代病毒收获液中成簇堆积的、立体对称、圆形、无囊膜，直径在20～23nm之间的实心病毒颗粒，如图2所示。21 图2CPV病毒粒子负染照片4.特异性基因和VP2全基因的PCR扩增提取第三代病毒液的病毒基因组DNA和未接毒的FK81细胞的基因组DNA(阴性对照)，PCR扩增后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，在209bp、1755bp处出现与预计大小一致的目的片段，见图3、图4M123M12(bp)(bp)20001755100020007505001000250750100500250209100M.DL2000Marker；1、2.第3代病毒M.DL2000Marker；1.第3代病毒液液扩增产物；3.阴性对照扩增产物；2.阴性对照图3特异性检测扩增结果（209bp）图4VP2全基因扩增结果(1755bp)5.间接免疫荧光试验检测CPV感染FK81细胞72h后，IFA实验结果表明，病毒在FK81细胞质中复制，并且集中在细胞核周围。如图5（A）所示，特异性绿色荧光主要集中在细胞核周围。阴性对照22 组无特异性绿色荧光出现。ABA.接种CPV的FK81细胞；B.接种CPV的FK81细胞放大图图5间接免疫荧光检测CPV在FK81细胞中复制23 讨论犬细小病毒属于细小病毒科，细小病毒属，是没有囊膜自主复制的单股线性的DNA[13]病毒，其引起的犬细小病，给养犬业和宠物喜爱者带来了严重的经济损失和精神伤害。针对犬细小病毒的危害性，以及尽快为感染病犬提供合适的早期预防与治疗的可能性，笔者产生了极高的研究兴趣。本研究采集宁夏地区一只有犬细小病毒感染症状的病犬的粪便拭子，对病料进行预处理并选择犬细小病毒敏感的FK81细胞作为分离培养的细胞系。采用同步接毒法，将CPV接种在状态良好的FK81细胞，并随时观察FK81细胞的毒性变化。本研究选择同步[14]接毒法的主要原因在于CPV病毒完全依赖于宿主细胞DNA的复制机制进行复制，本研究中CPV病毒就依赖于FK81细胞DNA的复制机制进行复制。将接毒CPV的FK81细胞盲传至第三代时，90%以上细胞出现形态改变，变为长梭形，拉网状，还有变圆脱落等细胞毒性改变。此时采用冻融法收活病毒，-80℃冰箱冻存为后续试验做准备。将分离培养的第三代病毒液用2%磷钨酸负染后，透射电镜观察培养液中病毒颗粒的形态并拍摄照片，将拍到的病毒颗粒与标准的CPV病毒颗粒形态进行比较：圆形、无囊膜，直径在20-23nm之间完全符合标准。电子显微镜是从形态学方面对CPV病毒粒子进行直观、准确的鉴定，其操作方法简便，省时省力，是CPV病毒常用的诊断方法之一。VP2结构蛋白作为CPV的免疫原性蛋白，主要编码CPV的抗原决定簇，同时诱导机体产[2][15]生具有中和活性的抗体，并且决定宿主变异范围和宿主之间病毒的相互感染，所以本研究针对VP2基因设计引物进行PCR特性鉴定和VP2基因全长扩增，电泳图表明成功扩增出了与预期大小一致的目的基因片段，且测序结果与CPVVP2基因序列高度相符合。PCR分子生物学的诊断鉴定方法和实验室其它常规诊断鉴定方法相比，前者更为精准，还可以排除其它同属病毒的干扰，更一步增强了诊断鉴定的特异性、准确性。利用间接免疫荧光试验检测CPV病毒在FK81细胞中的复制情况，发现特异性绿色荧光主要集中在FK81细胞核周围，此方法操作简便、检测迅速、检出机率高，大部分的国家和地区将此方法作为CPV的诊断的法定方法，也是我国实验室用于诊断CPV常规的定性方法之[16]一。24 综上所述，本研究用实验室常规的CPV诊断方法成功分离鉴定出一株CPV毒株，为后续进行CPV单克隆抗体新型诊断试剂盒和CPV预防治疗的新疫苗的研究奠定了基础，提供了相应的可能性。25 第三部分犬瘟热病毒单克隆抗体和犬细小病毒单克隆抗体的研制材料与方法1．实验材料1.1细胞株、病毒、实验动物SP20骨髓瘤细胞为本实验室保存，CDV病毒、CPV病毒为本实验室自己分离鉴定的毒株，雌性BALB/C小鼠（SPF级）购自宁夏医科大学动物实验中心。1.2主要试剂RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）均购自GIBICO公司；PEG4000、PEG8000、HAT培养液、HT培养液、8-AG、秋水仙素（2mg）均购自Sigma公司；鼠源单抗体亚型鉴定试剂盒、TMB显色液、包被缓冲液、ELISA终止液均购自Proteintech公司；牛血清白蛋白（BSA），吉姆萨染色液，考马斯亮蓝染液均购自北京索莱宝科技有限公司；ProteinA亲和层析柱子购自东曹（上海）生物科技有限公司。1.3主要仪器设备仪器名称生产商家电泳仪和垂直电泳槽BIO-RAD，美国8孔排枪Eppendorf，德国酶标仪BIO-RAD，美国正置光学/荧光显微镜NIKON，日本低温高速冷冻台式离心机SIGMA，美国凝胶成像仪BIO-RAD，美国2．实验方法2.1CDV、CPV抗原的浓缩纯化①将CDV第四代病毒培养液和CPV第三代病毒培养液分别在37℃/-20℃条件下反复冻融3次。26 ②冻融液体在4℃，3500rpm/min条件下离心35min后，分别收集CDV、CPV上清液。③在收集的上述上清液中加入PEG8000，使其终浓度为12%，加入NaCl使其终浓度为0.5M/L。④每隔15min搅拌混匀一次，重复四次，将CDV、CPV病毒液放入4℃冰箱过夜。⑤将过夜的CDV、CPV病毒液4℃，15000rpm/min离心50min后，小心取出，弃掉上清液，根据病毒沉淀量加入适量的PBS将沉淀悬浮。⑥将上述PBS悬浮液体用标记好的对应的EP管分装后，-80℃冰箱冻存备用。2.2动物免疫①选取6-8周龄，体重在20g左右的雌性BALB/c小鼠（SPF级），随机分成A、B、C三组。②首次免疫：A组小鼠皮下注射CDV浓缩纯化病毒和弗氏完全佐剂的乳化物（等量混合），B组小鼠皮下注射CPV浓缩纯化病毒和弗氏完全佐剂的乳化物（等量混合），C组小鼠皮下注射PBS。注射量都为50ul/注射点，每只小鼠皮下注射四个点。③二次免疫：首次免疫两周后，对A组小鼠皮下注射CDV浓缩纯化病毒和弗氏不完全佐剂的乳化物（等量混合），B组小鼠皮下注射CPV浓缩纯化病毒和弗氏不完全佐剂的乳化物（等量混合），C组小鼠皮下注射PBS。注射量和注射方法同首次免疫。注射部位避开首次免疫部位。④二次免疫两周后，对免疫小鼠和阴性对照组小鼠进行剪尾巴采血，为后续测定小鼠体内血清效价做准备，同时对小鼠做好标记。⑤三次免疫：二次免疫三周后，对小鼠进行第三次免疫，免疫方法和病毒注射量同二次免疫。注射部位避开二次免疫部位。⑥冲击加强免疫：三免两周后，选取A组效价高的小鼠腹腔注射浓缩纯化的CDV病毒液，B组效价高的小鼠腹腔注射浓缩纯化的CPV病毒液，注射量较之前加倍。⑦冲击免疫四天后，无菌条件下采取CDV、CPV免疫脾细胞进行细胞融合。2.3间接ELISA法测定小鼠体内血清效价①检测板的准备27 a.包被：将CDV、CPV的浓缩纯化病毒用包被液倍比稀释后，100µL/孔，横向包被，每种稀释度做8个复孔。用封条密封后，4℃冰箱过夜（12h以上）包被。b.封闭：将包被板取出，弃去上清，摇床震荡PBS洗涤四次拍干后，加入配制好的5%的BSA封闭液，300µL/孔，37℃温箱孵育封闭2.5h。c.洗涤：用PBS震荡洗涤四次，拍干。d.加一抗：将得到的CDV、CPV小鼠阳性血清1︰2000稀释后再做倍比稀释分别与对应的包被抗原棋盘滴定法加样，100µL/孔，37℃温箱孵育1h。e.洗涤：摇床震荡PBS洗涤五次，拍干。f.加二抗：加入酶标二抗（1︰10000稀释），100µL/孔，37℃温箱孵育1.5h。g.洗涤：摇床震荡PBS洗涤五次，拍干。h.显色：加新鲜配制的TMB显色液，100µL/孔，室温放入抽屉密闭反应30min。i.终止反应：加ELISA终止液100µL/孔。j.检测：加终止液检测OD450值。确定最合适抗原包被浓度和血清稀释浓度。k.以确定的最佳抗原包被浓度包被一批CDV、CPV抗原检测板，供后续试验和单抗筛选检测使用。②将采集的CDV、CPV小鼠血清倍比稀释后，加入各自对应的检测板中100µL/孔，37℃温箱孵育1.5h。同时设立阴性对照，每个检测样本设立三个复孔。③洗涤–酶标二抗–洗涤–显色–终止–读取结果–整理数据。试验步骤同①。2.4小鼠骨髓瘤细胞（SP20）的筛选①细胞融合前两周左右复苏SP20细胞。②配制20μg/mL的8-氮鸟嘌呤（8-AG）并用0.22μm滤膜过滤备用。③选取状态良好的SP20细胞（细胞圆形透亮）加入含8-AG的RPMI-1640细胞培养液进行筛选。一周左右后，换成正常细胞培养液。2.5细胞融合2.5.1饲养细胞悬液的制备①将8周龄左右的BALB/c小鼠处死后（断颈），75%酒精浸泡10min。28 ②将处死的小鼠以解剖姿势（腹部朝上）固定在紫外灯照射后的超净工作台中。③左手用高压灭菌的镊子提起小鼠腹部皮肤，右手用灭菌的手术剪在提起的部位剪一小口，沿着剪开的小口将小鼠皮肤撕开，暴露小鼠腹部。④用酒精棉球将小鼠暴露的腹部消毒后，用10mL一次性注射器吸取RPMI-1640不完全培养液，轻轻注射到小鼠腹腔，并用酒精棉球轻揉小鼠腹部。注射器将液体推入轻轻推入腹腔，再轻轻抽出，来回抽吸两次。⑤轻轻吸出注射液体转移到一次性无菌离心管中。⑥将含有饲养细胞的液体1500rpm/min离心8min后，弃上清，加入RPMI-1640不完全培养液用一次性吸管轻柔吹打洗涤一次，再次以相同的离心条件离心弃去上清液。⑦用含有HAT的12%FBS的RPMI-1640完全培养液悬浮细胞沉淀并作计数后，将其加入到96孔细胞培养板，100µL/孔。做好标记。⑧将96孔板放入细胞培养箱中培养24h。2.5.2SP20细胞悬液的制备①将通过8-AG筛选过的SP20细胞在融合前48h传代扩大培养，使其处于生长对数期，并计算好细胞融合所需比例。②融合当天用一次性无菌吸管将SP20细胞轻轻的从细胞培养瓶璧吹下，收集在无菌的50mL离心管中。③将收集好的SP20，1300rpm/min离心5min，弃上清，加入RPMI-1640不完全培养液25mL进行洗涤，继续以相同条件离心弃上清液。以相同条件再洗涤SP20两次。④洗涤完毕之后，对SP20进行计数。2.5.3免疫小鼠脾细胞悬液的制备①选取效价高的BALB/c免疫小鼠进行细胞融合。先对BALB/c免疫小鼠摘眼球采血(后续作为阳性血清对照)，处死（断颈），置于做好标记的两个含有75%酒精的烧杯中浸泡10min。②在经过紫外线消毒的超净工作台中，将A组CDV免疫小鼠和B组CPV免疫小鼠分别以解剖姿势固定。29 ③用灭菌手术剪（2个）分别剪开两个小鼠的皮肤，使腹部暴露，用酒精棉球消毒小鼠腹部。更换手术剪（2个）剪开小鼠腹部。用灭菌镊子在脾脏所在解剖部位分离出免疫脾脏（脾脏肿大，颜色暗红）。分别置于做好标记的灭菌的细胞培养皿中。④立即用RPMI-1640不完全培养液冲洗脾脏，用灭菌的镊子分别剥离CDV免疫脾脏和CPV免疫脾脏外的结缔组织和包膜后，将其分别放入新的做好标记的灭菌细胞培养皿中。⑤用一次性注射器内芯（2个）分别挤压CDV、CPV免疫脾脏，使脾细胞进入细胞培养皿。加入RPMI-1640不完全培养液冲洗脾脏，使更多脾细胞从脾脏中冲出进入细胞培养皿。⑥将挤压冲出的脾细胞悬液分别通过200目灭菌细胞筛（2个）过滤到做好标记的新的灭菌细胞培养皿中，使其成为单个脾细胞悬液。⑦将单个脾细胞悬液用一次性无菌吸管吸到做好标记的50mL无菌离心管中。⑧将脾单细胞悬液1300rpm/min离心6min，弃上清，加入25mLRPMI-1640不完全细胞培养液洗涤，以同样条件离心弃上清。相同条件洗涤两次。⑨分别对CDV、CPV免疫脾细胞悬液计数。2.5.4融合过程①将免疫脾细胞与SP20以6︰1的比例混合于无菌的50mL离心管中，加入RPMI-1640不完全培养液至35mL。②用一次性无菌吸管轻柔吹打使两种细胞充分混匀，1300rpm/min离心6min，弃掉上清，吸干净残余液体。③轻轻敲打离心管底部，使沉淀细胞之间有点空隙。置于37℃水浴中预热的同时，用1mL无菌吸管吸取0.8mL经37℃预热的50%PEG4000。在60s内滴加到离心管中，在滴加的过程中时刻轻轻摇动离心管。④用一次性无菌吸管以由快到慢的速度加入37℃预热的RPMI-1640不完全培养液后，将融合管放置于37℃恒温箱25min。⑤将静置后的融合管1300rpm/min离心6min，弃上清。30 ⑥加入含有HAT，12%FBS的RPMI-1640完全培养液，悬浮融合的细胞沉淀。⑦取出提前铺有饲养细胞的96孔板，加入融合细胞悬液100µL/孔，并做好标记。⑧将96孔板放入细胞培养箱培养，每天观察细胞变化。2.6CDV、CPV阳性融合孔的筛选①细胞融合5天后，用含HAT，20%FBS的RPMI-1640培养液对半换液。②融合12天后将HAT换为HT培养液。③融合17天后换为正常细胞培养液。④在整个培养筛选的过程中，密切观察每孔细胞的生长变化，当有细胞融合簇出现且融合细胞达足够数量时，做好标记并及时检测其分泌抗体的情况。⑤对融合孔间接ELISA法连续三次以上检测阳性的孔做好标记，及时克隆化，以免丢失。2.7CDV、CPV阳性孔的克隆化（有限稀释法）①阳性孔克隆化的前一天制备饲养细胞，方法同前面所介绍。②用吸管将检测阳性结果的融合孔细胞吸到无菌的含1mL细胞培养液的15mL离心管中，详细做好标记。③对吸出的每孔细胞计数。④根据细胞计数情况对每孔细胞进行稀释，稀释到5-10个细胞/mL，10-20个细胞/mL，20-30个细胞/mL，三个不同的稀释度。⑤将每孔细胞不同稀释度的细胞悬液铺到有饲养细胞的96孔板上100µL/孔，做好标记。⑥将96孔板放入细胞培养箱培养。⑦在克隆培养过程中每天观察每孔细胞的生长情况并做标记，细胞换液时，应该特别小心以防污染。⑧对出现单个克隆的细胞孔尽早进行检测，并做好标记保护好细胞株。弃去两个以上克隆的细胞孔。⑨对检测阳性的单个克隆按照上述方法继续进行克隆化。2.8CDV、CPV阳性单克隆孔细胞株的扩大培养与冻存31 ①对连续克隆化两次以上且一直是阳性结果的孔进行扩大培养和冻存。②将CDV、CPV阳性单克隆，从96孔板转移到铺有饲养细胞的24孔板扩大培养。③待细胞长满细胞培养板后，再将细胞从24孔板转移至铺有饲养细胞的12孔板，同时检测每孔的抗体分泌情况。3④将分泌阳性的细胞孔细胞从12孔板移至大体积的细胞培养瓶（75cm）培养。随时检测细胞分泌抗体的情况。⑤对扩大培养的检测一直阳性结果的单克隆细胞株按照常规方法进行冻存，冻存细胞液按照RPMI-1640︰FBS︰DMSO=7︰2︰1比例配制。标记好冻存细胞株种类，冻存日期。2.9CDV、CPV单克隆抗体株的染色体计数①秋水仙素处理a.用细胞培养配制10µg/mL的秋水仙素处理液并用0.22µm的滤膜过滤备用。b.滴一滴约20µL左右的秋水仙素处理液于处于对数生长期的CDV、CPV单克隆细胞培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶，使其混合均匀。c.将细胞培养瓶继续放入细胞培养箱培养4h。②收集细胞：培养时间到后，将细胞培养瓶细胞轻轻吹下，收集到无菌的15mL离心管中，1500rpm/min离心8min。③制片a.低渗处理：弃去细胞上清液，加入8mL37℃预温的KCl溶液（0.075mol/L），用吸管吹打混匀后，置于37℃温箱低渗处理35min后，1500rpm/min离心8min弃上清。b.预固定：加入1.5mL新鲜配制的固定液（甲醇︰冰乙酸=3︰1），用吸管吹打混匀，室温静置15min后，1500rpm/min离心5min弃去上清。c.固定：加入9mL固定液，吹打混匀1min，室温放置40min，1500rpm/min离心8min弃上清。重复固定一次。d.制备细胞悬液：加入新鲜固定液，一次性吸管吹打混匀。e.滴片：将玻片从冰水浴中取出倾斜30°角，滴管距离玻片正上方20cm左右滴片，每32 张片子滴2-3滴，轻轻吹口气，吸水纸吸干玻片。④染色：在上述玻片上滴加Giemsa染液，室温染色30min。自来水缓慢冲洗，吸水纸擦干后镜检。⑤镜检拍照：油镜下找到合适的视野计数100个以上细胞染色体数后，进行拍照。记录试验结果。2.10CDV、CPV单克隆抗体亚型鉴定及其效价的测定2.10.1CDV、CPV单克隆抗体亚型鉴定（试剂盒）①将待测CDV、CPV单抗细胞培养上清液做适当稀释，加入样品检测孔中，50µL/孔。②继续加入1×羊抗鼠IgM＋IgG-HRP，50µL/孔。轻轻震荡混匀。③贴上封板膜，室温放置孵育1h。④甩去孔内液体，震荡洗滴4次，拍干。⑤加显色液100µL/孔。⑥放入抽屉密闭反应25min，加终止液，100µL/孔。⑦结果判读：颜色最深或OD值最高孔为对应的相应单抗细胞株亚型。2.10.2CDV、CPV单克隆抗体效价的测定n①将CDV、CPV单克隆抗体细胞培养上清，分别做1︰2的稀释。②将不同稀释度培养上清加入到对应的包被抗原的ELISA板中，100µL/孔，37℃温箱孵育1h。③摇床震荡洗涤四次后，加入酶标二抗，100µL/孔，37℃温箱孵育1h。④摇床震荡洗涤四次后，加入TMB显色剂，室温避光反应30min。⑤酶标仪读取OD450值，分析试验结果。2.11CDV、CPV单克隆抗体特异性测定①将CDV单克隆抗体细胞培养上清加入到包被CPV抗原的检测板；CPV单克隆抗体细胞培养上清加入到包被CDV抗原的检测板，100µL/孔，37℃温箱孵育1h。②按照间接ELISA的检测步骤测定试验结果，并做记录。2.12CDV、CPV单克隆抗体细胞株稳定性的检测33 ①复苏之前冻存的CDV、CPV单克隆抗体细胞株，传代培养至30代以上并用间接ELISA法测定其分泌抗体水平。②将冻存6个月以上的CDV、CPV单克隆抗体细胞株复苏之后，间接ELISA法测定其分泌抗体水平。[17]2.13ELISA液液相加法测定CDV、CPV单克隆抗体抗原表位①CDV单克隆抗体抗原表位测定a.将待测的三株CDV单克隆抗体分别做适当稀释。b.在CDV抗原包被板中，加入其中一种单克隆抗体培养上清，37℃温箱孵育1.5h，洗涤四次后，加另外一种单克隆抗体，37℃温箱孵育1.5h，洗涤四次后，后续加入酶标二抗按照间接ELISA法的步骤进行试验。c.三株单克隆抗体做好标记，按照b的步骤两两重复。d.根据OD450值和计算公式算出相加指数（AI），AI(%)=(2A1+2/A1+A2－1)×100。②CPV单克隆抗体抗原表位测定a.将待测的CPV单克隆抗体分别做适当稀释。b.在CPV抗原包被板中，加入一种单克隆抗体，37℃温箱孵育1.5h，洗涤四次后，加入另一种单克隆抗体，37℃温箱孵育1.5h，洗涤四次后，后续加入酶标二抗按照间接ELISA法的步骤进行实验。c.根据OD450值和计算公式算出相加指数（AI），AI(%)=(2A1+2/A1+A2－1)×100。2.14CPV单克隆抗体的纯化和SDS聚丙烯凝胶电泳验证①单克隆抗体的纯化a.取5mLCPV单抗细胞培养上清，用0.22μm滤膜过滤备用。b.平衡柱子：用配制的0.1M的PB缓冲液平衡ProteinA亲和层析柱。c.培养上清上样：将CPV单抗细胞培上清缓慢上样，将流速控制在1mL/min。d.洗涤柱子：用配制的0.1M的PB缓冲液洗涤上样后的ProteinA亲和层析柱子。e.洗脱柱子：用配制的0.1M的柠檬酸缓冲洗脱液洗脱ProteinA亲和层析柱，并分管收集流出的液体，标记好每管的顺序。34 f.柱子再生：使10mL的0.1M的柠檬酸缓冲液流过ProteinA层析柱子，流速控制在1mL/min。g.柱子保存：用含20%乙醇的PBS平衡再生后的ProteinA层析柱后，将其浸泡在含20%乙醇的PBS中，4℃冰箱保存备用。②SDS-聚丙烯凝胶电泳验证a.用镊子夹着手工制备的甲醇棉球将垂直电泳槽的玻璃板擦洗干净并晾干，同时用电泳缓冲液清洗垂直电泳槽。b.根据单克隆抗体分泌的抗体蛋白分子大小配制好SDS凝胶（12%的分离胶和5%的浓缩胶）。等待凝胶凝固。c.将配制好的凝胶夹到垂直电泳槽的相应部位，往电泳槽倒入电泳缓冲液，组装好垂直电泳槽。并检查其是否有漏液情况。若液面长时间没有下降，则继续下一步骤，否则继续配制凝胶，直至没有漏液现象。d.第一个孔加入5µL蛋白Marker，后面孔相继加入不同的CPV单克隆抗体的细胞培养上清和蛋白上样缓冲液的混合物，两种的混合比例为1︰9。加样量为20µL，并设立阴性对照组。e.设置电泳仪电压：浓缩胶恒压70V，50min后，改为100V继续电泳40min。f.将电泳完的凝胶用刀片小心刮取下，切勿将凝胶损坏。取出后放入考马斯亮蓝染液中37℃摇床染色2h。g.按照甲醇︰冰乙酸︰去离子水=3︰1︰6的方法配制考马斯亮蓝脱水液，将染色的凝胶摇床震荡过夜脱色。h.第二天，将脱水的凝胶用去离子水漂洗后，用凝胶成像仪拍摄照片，记录试验结果。35 实验结果1.小鼠血清效价检测用间接ELISA法检测小鼠二次免疫后体内抗体的上升水平。根据阳性标本判断标准：样本OD值≥2.1阴性OD值，来分析CDV组2号小鼠血清效价最高，被选为细胞融合的对象；CPV组1号小鼠血清效价最高，被选为细胞融合的对象。试验数据如表1和表2所示。表1间接ELISA测CDV免疫BALB/C小鼠后血清效价平均OD450nm值血清稀释度（1︰2000X）小鼠血清编号12481632641281号小鼠2.3462.2612.0511.5831.4190.8990.8490.6442号小鼠2.7752.5722.4562.1091.8521.2151.0890.7983号小鼠2.6772.4892.3111.9291.6241.1150.9530.722阴性对照0.1330.1390.1290.1260.1190.1000.1290.153表2间接ELISA测CPV免疫BALB/C小鼠后血清效价平均OD450nm值血清稀释度（1︰2000X）小鼠血清编号12481632641281号小鼠2.2782.1401.9411.4961.2560.8460.7920.6292号小鼠2.0381.9161.5021.1430.9040.6030.5580.4243号小鼠2.0541.8511.4931.0870.8200.5590.4820.254阴性对照0.1780.1810.1780.1890.1700.1760.1710.1732.CDV、CPV杂交瘤细胞筛选克隆化筛选出3株抗CDV单克隆杂交瘤细胞，分别为C6细胞株、G10细胞株、H2细胞株；筛选出了3株抗CPV单克隆杂交瘤细胞，分别为B8细胞株、E10细胞株、F12细36 胞株。克隆化过程中形成的单克隆细胞株如图1（A、B）所展示。AB图1克隆化过程中单克隆细胞株展示图3.CDV、CPV单克隆杂交瘤细胞株的染色体计数如图2所示ABCDEFA.CDV杂交瘤细胞株C6染色体数目；B.CDV杂交瘤细胞株G10染色体数目；C.CDV杂交瘤细胞株H2染色体数目；D.CPV杂交瘤细胞株B8染色体数目；E.CPV杂交瘤细胞株E10染色体数目；F.CPV杂交瘤细胞株F12染色体数目.图2杂交瘤细胞染色体数目3.CDV、CPV单克隆杂交瘤细胞亚型鉴定及其效价的测定CDV单克隆杂交瘤细胞亚型鉴定结果显示：C6细胞株、G10细胞株、H2细胞株的重链都为IgG1亚型，轻链都为Kappa型；CPV单克隆杂交瘤细胞亚型鉴定结果显示：37 B8细胞株、F12细胞株重链亚型都为IgG1型，轻链都为Kappa型，E10细胞株重链亚型为IgM型，轻链为Kappa型。CDV的3株单克隆杂交瘤细胞培养上清的效价测定结果如表3所示：C6细胞株效价为1︰16，G12细胞株效价为1︰16，H2细胞株效价1︰32；CPV的3株单克隆杂交瘤细胞培养上清效价测定结果如表4所示：B8细胞株效价为1︰256，E10细胞株效价为1︰512，F12细胞株效价为1︰128。阳性标本判断标准：样本OD值≥2.1阴性OD值。表3CDV单克隆杂交瘤细胞培养上清效价测定（平均OD450nm值）细胞上清稀释度（1︰2n）细胞株12345678C60.7750.6550.5500.4550.4010.3890.3060.289G100.7020.5550.4990.4640.4000.3820.3030.225H20.8470.7050.6540.5850.4840.4020.3390.255阴性0.1990.2010.2000.1810.1930.2030.1800.188表4CPV单克隆杂交瘤细胞培养上清效价测定（平均OD450nm值）n细胞上清稀释度（1︰2）细胞株12345678910B80.9950.9320.8100.7670.7010.6420.5990.5030.4300.339E100.9990.8890.8220.8020.7830.6950.6190.5850.4900.392F120.9280.8650.7810.7070.6820.5170.4930.4000.3570.289阴性0.2000.2050.2080.1990.2120.1980.2220.2110.2030.20838 4.CDV、CPV单克隆杂交瘤细胞特异性、稳定性检测3株CDV单克隆杂交瘤细胞培养上清和CPV抗原检测板都不反应，3株CPV单克隆杂交瘤细胞培养上清和CDV抗原检测板也都不反应，说明筛选出的CDV单克隆杂交瘤细胞和CPV单克隆杂交瘤细胞都具有较高的特异性；将3株CDV单克隆杂交瘤细胞传代至30代检测其培养上清抗体分泌为阴性结果，3株CPV单克隆杂交瘤细胞传代至30代检测其培养上清抗体分泌都为阳性结果。将冻存六个月的3株CDV单克隆杂交瘤细胞和冻存六个月的3株CPV单克隆杂交瘤细胞复苏后，检测其培养上清前者为阴性结果，后者为阳性结果。5.CDV、CPV单克隆杂交瘤细胞抗原表位检测根据检测单克隆杂交瘤细胞株的OD值结果结合计算公式AI（%）=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100来分析抗原表位，若AI≧50%则两种单克隆抗体为不同抗原表位，若AI<50%则两种单克隆抗体为同一抗原表位。通过表5和表6分析：3株CDV单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体为同一抗原表位，则视为同1株单克隆杂交瘤细胞株；CPV单克隆杂交瘤细胞B8细胞株和F12细胞株为不同抗原表位，不同细胞株。表5CDV3株单克隆杂交瘤细胞AI值相加结果AI细胞株C6G10H24230G1025—表6CPV2株单克隆杂交瘤细胞AI值相加结果AI细胞株B8F12F1256—B8—5439 6.CPV单克隆杂交瘤细胞株分泌抗体纯化和SDS聚丙烯凝胶电泳结果CPV单克隆杂交瘤细胞株B8和单克隆杂交瘤细胞株F12的细胞培养上清纯化前和经ProteinA亲和层析柱(IgG)纯化后的SDS-PAGE电泳图如图3、图4分别所示。在图3中B8细胞株分泌的抗体重链在50KDa左右，轻链在28KDa左右；F12细胞株分泌的抗体重链在55KDa左右，轻链在28KDa左右。两者分泌的抗体蛋白分子量大小与预期的片段大小相符合。KDaB8MF12E10KDaB8MF1214011514011580806565505040403030252515151010M.ProteinLadder；B8、F12、E10M.ProteinLadder；B8、F12为纯为未纯化的CPV单克隆抗体株。化后的CPV单克隆抗体株。图3未纯化的单克隆抗体SDS-PAGE图4纯化后的单抗隆抗体SDS-PAGE40 讨论在前两节中，犬瘟热病毒和犬细小病毒的成功分离与鉴定，为抗犬瘟热病毒单克隆抗体、抗犬细小病毒单克隆抗体的研制奠定了基础。本研究将分离鉴定出来的犬瘟热病毒和犬细小病毒浓缩纯化后免疫BALB/c小鼠，保证了细胞融合后筛选得到的所需单克[18]隆抗体株的机会增加，同时减轻筛选、克隆化的工作量，提高杂交瘤细胞的阳性率。在小鼠二次疫后，剪尾巴采集BALB/c小鼠血液，分离血清检测小鼠体内抗体滴度水平后，选择抗体效价高的小鼠做细胞融合，可提高细胞融合的成功率。在杂交瘤细胞筛选过程中，间接ELISA法连续检测3次以上阳性结果再进行克隆化，保证了所得到的杂交瘤细胞株克隆化的成功率。同时发现阳性融合孔尽早检测，尽早克隆化，以免阳性孔丢失，对确定的检测阳性的细胞孔尽早冻存保种。本研究总共筛选出了3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞、3株抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞并对筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行了各方面的鉴定。首先对单克隆杂交瘤细胞染色体进行计数，可以直观的判断细胞融合是否成功，BALB/c小鼠脾细胞染色[19]体数目为40条，SP20骨髓瘤细胞染色体数目约为60～70条，筛选的到的单克隆杂交瘤细胞染色体数目都在90条以上，说明细胞融合是相当成功的，筛选出的单克隆杂交瘤细胞株都为融合细胞。对筛选出的3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞和三株抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞进行亚型鉴定和效价测定发现，3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体都为同一亚型IgG1型，且3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌抗体效价都比较低。3株抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞分泌抗体亚型鉴定结果及效价结果测定显示：有2株为同一亚型IgG1型，另1株为IgM亚型，3株单抗效价都比较高。接着对3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体进行ELISA叠加法抗原表位分析，发现为同一抗原表位。对2株同一亚型的抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体进行ELISA叠加法抗原表位分析，发现两者为不同抗原表位，进一步将这2株细胞分泌的细胞培养上清进行纯化并通过SDS-PAGE验证发现，所得到的这2株单克隆细胞株分泌的抗体片段大小与预期结果一致，有一定的研究意义。综上所述，本研究筛选出的3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞株，分泌的抗体41 为同一亚型，同一抗原表位，实则为同一株杂交瘤细胞株。筛选出的3株抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体为不同亚型，不同抗原表位，效价比较高，且纯化后的结果比较理想，为后续制备犬细小病毒早期诊断试剂盒和预防治疗犬细小病毒病的生物制剂奠定了基础，有比较高的应用价值。42 结论1.从宁夏地区疑似犬瘟热感染病犬的粪便拭子中，成功分离培养并鉴定出1株犬瘟热病毒。2.从宁夏地区疑似犬细小病毒感染的病犬粪便拭子中，成功分离培养鉴定出1株犬细小病毒。3.将分离培养鉴定的犬瘟热病毒浓缩纯化免疫小鼠后，从融合细胞当中成功筛选出C6细胞株、G10细胞株、H2细胞株共3株抗犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞株，经鉴定为同一株杂交瘤细胞株。4.将分离培养鉴定的犬细小病毒浓缩纯化免疫小鼠后，从融合细胞当中成功筛选出B8细胞株、E10细胞株、F12共3株抗犬细小病毒单克隆杂交瘤细胞株。这3株单克隆杂交瘤细胞株特异性高、稳定性好，拥有不同抗原表位，效价高，纯化后结果理想，可用于犬细小病毒早期诊断试剂盒和预防治疗犬细小病生物制剂的制备，有较高的应用价值。43 参考文献[1]何洪彬，夏咸柱.犬瘟热的诊断及其预防免疫的研究进展[J].动物医学进展，2001，22(1)：12-15.[2]李河林，焦铁军，刘淑红，等.犬细小病毒研究进展[J].动物医学进展，2008，29(5)：73-77.[3]许莎琼，朱建国，傅志强，等.犬瘟热病毒当前研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2006,1：5-7[4]COMAR，RIBESM，OREJASC，etal．Preycapturebyabenthiccoralreefhydrozoan［J］．CoralReefs，1999，18：141－145．[5]孙梅，吴建华，白文军.犬细小病毒研究进展[J].北京农业，2013,（36）：175-178.[6]朱学泰，谢溱，马瑞军.单克隆抗体制备技术研究进展[J].甘肃科技，2005,3（21）：108-110.[7]SekiF，OnoN，YamaguchiR，etal．EfficientisolationofwildstrainsofcaninedistempervirusinverocellsexpressingcanineSLAM(CD150)andtheiradaptabilitytomarmosetB95acells［J］．JVirol，2003，77(18)：9943－9950．[8]AnaDJ，KimbTY，SongDS，etal．Animmunochromatographyassayforrapidantemortemdiagnosisofdogssuspectedtohavecaninedistemper［J］．JVirolMeth，2008，147(2)：244－249．[9]曾智勇，周莉，汤德元，等.犬瘟热病毒贵州株CDV-GZ1的分离与鉴定[J].贵州农业科学，2012,40(2):109-111.[10]魏凤，管宇，王金良，等．犬瘟热病毒在不同组织细胞上增殖特性的研究[J]．动物医学进展，2010,31(2):83-86.[11]罗彬，易立，王建科，等.犬瘟热病毒核衣壳蛋白分子生物学研究进展[J].特产研究，2010，02：70-74.[12]祝文琪，徐卫康，陆彦，等.犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013，34(5)：17-20.44 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文献综述犬瘟热病毒和犬细小病毒的研究进展摘要犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus，CDV)和犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)是感染犬科动物常见的两种病毒。这两种病毒对犬科动物和其它易感动物的危害越来越严重，对犬的养殖业、动物园的动物观赏和野生动物造成了巨大的经济损失，同时对爱狗人士也带来了严重的精神伤害。所以为了让更多的人对这两种病毒有足够的了解和认识。本文从CDV、CPV两种病毒的生物学特性、基因组结构、常用的诊断技术等方面对CDV、CPV最新的研究进展进行详细阐述。前言CDV感染引起的犬瘟热最早发现于18世纪后叶，Carr’e氏在1905年首次报道犬瘟热为病毒性疾病，我国1973年首次发现犬瘟热疾病。CPV是美国学者Eugster和Naira[1][2]在1977从犬粪便中第一次发现细小病毒粒子；Kelly等1978年从病犬体内第一次分[3]离到CPV；梁士哲等1982年首次报道我国存在CPV感染。两种病毒分别引起的犬瘟热和犬细小病毒病都是感染率高、致死性强的急性接触性传染病，在全世界范围内广泛流行。据目前研究调查CPV只感染犬科动物，但是CDV不仅可以感染犬科动物，还可[4]以感染鼬科、浣熊科及部分灵猫科和猫科动物，且感染宿主进一步扩大到非人灵长类[5-6]动物。更重要的是近几年来，其感染宿主不断扩大，甚至已经有人感染犬瘟热病毒[7][8]的病例，Mee等也从患Paget’s病的病人组织中检测出犬瘟热病毒核酸。所以为了保护国宝大熊猫和猕猴等珍稀动物，弄清楚CDV病毒是否会成为继狂犬病之后的第二个人犬共患病，越来越多的学者对CDV、CPV的诊断和预防免疫、致病机制等方面进行了深入的研究。1CDV、CPV的生物学特性1.1CDV的生物学特性[9]CDV在分类上属于副粘病毒科麻疹病毒属，是一种单链RNA病毒。CDV在室温条件下，不太稳定，特别是对紫外线照射、干燥的环境及50～65℃以上高温条件较为敏感；4℃条件下，CDV可存活数周，低温冷冻条件下，可存活数月，在冷冻干燥条件下，46 可存活数年。基本常规的消毒试剂均可将CDV杀灭，例如脂溶剂和普通消毒剂。此外，CDV对酸碱环境极其敏感，当PH低于4.5或高于9.0都可迅速使其灭活。CDV病毒颗粒是主要的致病原，在透射电镜下，病毒颗粒呈现为圆形或不规则形，偶尔也呈长丝状、条形状，直径多在150~330nm之间，外有囊膜和纤突。由于CDV的这些生物学特性，致使CDV的分离培养比较困难，分离成功率较低。1.2CPV的生物学特性[10]CPV在分类上属于细小病毒科细小病毒属，属于细小病毒亚群。CPV对实验室常用的消毒剂抵抗力强，4℃冰箱保存可存活6个月，55℃条件下可存活24小时，82℃条件下存活13分钟，室温条件下保存3个月仍具有感染性。CPV对氯仿、乙醚等有一定的抵抗力，但是对紫外线照射、次氯酸钠等氧化剂较为敏感。CPV有较强的血凝活性，能和恒河猴、仓鼠、猪、猫、马的红细胞发生凝集，而不和其他动物的红细胞发生凝集，[1]这个特殊性质可作为该病毒鉴定的参考指标。在透射电镜下，CPV病毒颗粒呈圆形，直径在20nm～28nm之间，无囊膜，注意观察病毒粒子可分为实心粒子和空心粒子两种。2.CDV、CPV基因组结构及其蛋白编码2.1CDV基因组结构及其蛋白编码CDV是单股负链不分节段的RNA病毒，编码6种结构蛋白，从3ˊ～5ˊ分别是[11]N-P-M-F-H-L蛋白，基因组呈线性排列，全长15616bp。编码的6种结构蛋白是CDV病毒颗粒的主要组成部分，分别是核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质膜蛋白（M）、融合蛋白(F)、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）。其中核衣壳蛋白（N）是CDV中含量最[12]高的结构蛋白，突变率低，其序列经常被用来作为RT-PCR诊断的靶序列。N蛋白的分子量为58KDa；P蛋白的分子量为66KDa；M蛋白的分子量为34KDa；F蛋白的分子量为62KDa，H蛋白的分子量76~85KDa，L蛋白的分子量约为246KDa。CDV的RNA是被一个呈螺旋状的核衣壳包裹的，这个核衣壳主要是由N蛋白组成的，P蛋白和L蛋[13]白也是核衣壳的组成部分并且具有聚合酶活性，与RNA转录和复制有关。M蛋白和病毒的组装成熟和病毒慢性的持续性的感染有一定关系；F蛋白介导病毒和感染细胞之间发生融合，感染细胞和非感染细胞之间发生融合，增强病毒在宿主体内扩散感染的47 能力。H蛋白可诱导机体产生中和抗体，是抗犬瘟热病毒免疫的重要抗原，并且病毒是[14]通过H蛋白吸附到易感细胞表面的受体上，所以H蛋白可以决定宿主特异性。弄清楚CDV基因组结构和编码蛋白功能就使得我们对其研究有一个切入点和掌握。2.2CPV的基因组结合和蛋白编码[15]CPV为单股负链线性DNA病毒，基因组全长5323bp，有2个开放阅读框(ORF)，[16]分别编码非结构蛋白NS1、NS2和结构蛋白VP1、VP2。CPV病毒颗粒的空衣壳含有VP1和VP2两种蛋白，其中VP2是其主要成分，且为免疫原性蛋白，编码CPV的主[1]要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体，同时决定宿主的变异范围和宿主之间病毒[17]的相互感染。以前发现证实的CPV2突变毒株存在3种亚型，即在VP2蛋白区有5[18][19][20-21]个aa改变的CPV2a，1984年发现的CPV2b,426位上的Glu变异株CPV2c。现在的CPV2毒株已发展为CPV2a、CPV2b、CPV2c(a)、CPV2c(b)4种亚型。欧洲主[22]要以CPV2a流行为主,美洲主要以CPV2b流行为主。我国的流行株以CPV2a为主,[23-24]CPV2b在我国的南方也有流行。CPV2c最早在意大利分离出现，之后也在越南发[25][26]现了CPV2c的存在。PerezR等首次报道CPV2c在美洲大陆的流行。近几年来，CPV2发生了抗原漂移，变异速度极快，致使现在的疫苗免疫效果不太理想，所以很有必要将CPV的研究重点放在毒株分型方面。3CDV、CPV常用的诊断技术3.1CDV、CPV临床诊断CDV、CPV感染犬科动物后，有不同的临床症状，我们可以通过临床症状和表现来诊断是否有CDV、CPV的感染。CDV感染后，病犬会有厌食、体温上升、上呼吸道发生感染等临床症状。最开始出现的症状是体温上升保持1-2天后消退，几天后又会发现体温会再次升高，病犬流泪、眼结膜红红的、眼分泌物为粘脓性，鼻子发干，鼻液为脓性的。犬感染CPV后发病较急，死亡率高，一般都是暴发性流行，病犬会出现呕吐、腹泻、血性腹泻等临床症状。CDV、CPV的感染除了临床症状诊断外，还要辅助结合其它实验室诊断进行检查。3.2CDV、CPV分离培养48 CDV、CPV的分离培养是确诊犬瘟热和犬细小病毒病感染的最基本的方法。但是由于犬瘟热病毒和犬细小病毒的生物学特性，使得两者的分离成功率往往比较低。所以选择合适的细胞系来分离这两种病毒是十分关键的。目前用于分离CDV、CPV的细胞系有原代培养细胞和传代培养细胞系两大类。经过更多学者的验证，非洲绿猴肾细胞（Vero）用于分离CDV；猫胎肾细胞（FK81）用于分离CPV。通过观察接毒CDV、CPV后Vero细胞和FK81细胞的毒性改变来判断病毒的分离情况。Vero细胞接种后可见胞质内黑色颗粒增多，部分细胞变圆坏死脱落。FK81细胞接种后，细胞变为细长梭型，呈现拉网状，并有坏死细胞漂浮在培养液中。3.3CDV、CPV透射电镜检查CDV、CPV两种病毒直接镜检。我们可以将感染病犬的粪便用氯仿处理后，5500r/min离心20min，取上清液，滴于铜网上，用2%磷钨酸染色后在透射电镜下观察。也可以将疑似这两种病毒感染的犬的排泄物预处理后，接毒两者对应的敏感细胞分离培养，将分离培养液进行透射电镜镜检。只要在电镜下观察到大小均一、散在的符合两种病毒颗粒各自判断标准的粒子，就可以初步判断CDV、CPV的感染。但是，由于这种诊断技术仪器比较昂贵，不可应用于临床诊断，且病毒粒子较小，不同的发病时期含量也有差异，极易可能影响检出率。所以透射电镜检查多应用于实验室常规诊断。3.4CDV、CPV分子生物学诊断随着分子生物学技术的发展和广泛应用，CDV、CPV的检测手段也上升到分子生物学阶段，其中RT-PCR、PCR技术已成为大多学者最常选用的诊断检测方法。PCR技术是在DNA水平上对病毒和细菌等微生物进行诊断，引物体外扩增病毒、病原微生物的特异性基因，因此具有快速、高特异性和高敏感性等优点，被广泛而方便地用于病原的检[27]测。熊炜等建立了犬瘟热病毒RT-PCR诊断方法，可检测病犬粪便、口鼻液等分泌物。[28][29]Rzezutka及Shin等人分别通过扩增感染CDV犬的外周血单核细胞、血清、全血、脑[30]脊髓液中病毒的N蛋白而建立RT-PCR诊断方法。Frisk等应用RT-PCR、套式PCR及Southern杂交检测犬和毛皮动物外周血单核细胞CDV的P基因。近几年来，巢式[31][32][33]RT-PCR、半巢式RT-PCR、荧光定量RT-PCR方法用于犬瘟热病毒的检测进一49 步提高了检测的灵敏性。CPV的PCR检测包括普通PCR、套式PCR和荧光定量PCR。[34]CalderonMG等将PCR用于CPV的检测并和测序技术相结合来确定病毒的亚型。[35]HirasawaT等将套式PCR用于CPV的检测，其检测灵敏度高于普通PCR10倍以上。[36]EliaG等将荧光定量PCR用于CPV的检测，通过设计的TaqMan探针可以检测到100个拷贝的核酸样品。对于CDV、CPV的快速诊断来说，RT-PCR、PCR无疑是最适合的方法，临床诊断方面应尽量采用此类方法，将其临床化，为CDV、CPV快速诊断提供方法。3.5CDV、CPV免疫学方法诊断最常用于CDV、CPV诊断的免疫学方法有酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫荧光实验。ELISA是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的敏感性而建立起来的一种免疫学检测技术，具有准确度高、特异性好、检测快速、大批量检测等优点，是临床常选的检测方法之一。ELISA又分为间接法、双抗体夹心法和竞争法，目前主要用双抗体夹心法检测CDV、CPV特异性抗原和间接法检测CDV、CPV特异性抗体。免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的特异性和荧光染色技术来检测病毒抗原，通常分为直接免疫荧光染色法和间接免疫荧光染色法。免疫荧光技术可用于检测CDV、CPV的感染样本，也可用于组织器官中CDV、CPV抗原的定位，是目前国际通用的检测技术手段。COFFIN等[37][38]和Fairchild等建立了检测CDV感染的荧光抗体技术，在国外实验室广泛使用。袁书[39]智等制备兔抗犬瘟热病毒抗原荧光抗体检测犬血液白细胞、犬脾细胞中的CDV抗原，[40][41]具有较高的敏感性和特异性；杨百亮等和苏建青等则分别用抗犬瘟热病毒单克隆抗体建立了间接荧光抗体染色法和直接荧光抗体染色法。免疫荧光技术用于组织样品中CDV、CPV抗原的检测，具有快速、直观、检出率高等特点，但由于操作步骤复杂且需荧光显微镜等特殊仪器条件的约束，使该检测方法在基层推广使用还是相对困难的。所以ELISA方法与其相比更适合推广临床使用。4展望CDV、CPV两种病毒的感染宿主范围都在逐渐扩大，而且病毒的变异速度也在加快，所以对CDV、CPV广泛而深入的研究迫在眉睫。本文中详细叙述了CDV、CPV两种病毒的生物学特性、基因组结构和最新最常用的诊断检测方法。可是，面对越来越大的犬科50 动物和其它易感动物遭受病痛的折磨，我们更应该从根本上解决问题。首先建立早期快速而准确的检测方法才能控制犬瘟热和犬细小病毒病的流行。所以这就迫使我们应该致力于CDV、CPV的ELISA检测试剂盒和CDV、CPV单克隆抗体免疫胶体金诊断试剂盒的研究。此外，中和性的单克隆抗体也是我们大力研究的一个方面，为犬瘟热和犬细小病毒病的预防治疗做出贡献。相信随着单克隆技术和高科技的不断发展，定会有效控制CDV、CPV的扩散和感染。越来越多的CDV、CPV单抗产品会广泛的用于犬瘟热病毒和犬细小病毒的的临床检测，更好地服务生产实践。51 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三、致谢毕业季，在这个春暖花开，万物葱茏的季节里，一幕幕温暖的记忆像过电影一般定格在每一位即将离别的毕业学子的记忆中。这是一场永不散场的宴席，我们等待着下一场华丽的开幕，带着心中的阳光和勇敢的飞，等待着迎接未知的前方旅途。回忆这生命中最美好的三年研究生时光，忘不了这里曾经盛开过的花，青翠过的繁华了一夏的柳树。感恩母校曾经带给我们的感动、回忆还有泪水、曲折。相信有了这些年前奏的历练，我们一定会飞的更高，飞的更远！回首三年的研究生生涯，首先特别要衷心的感谢我的恩师徐广贤教授对我学习、工作、科研和生活的谆谆教诲、悉心指导和无私帮助，您渊博的学识、严谨的治学态度、和蔼可亲的待人之道以及对待同事的极大热诚将是我一生学习的楷模，能以您为师是我莫大的荣幸。徐老师不仅指导我顺利完成了自己的学业，同时也让我明白了许多待人接物与为人处世的道理。我在学业科研上取得的成就，都倾注了导师大量的心血。在此，向导师表示我最崇高的敬意和衷心的感谢。感谢宁夏医科大学临床医学院检验系段相国老师，郭乐老师，张爱君老师在课题完成过程中给予的无私帮助和指导。感谢宁夏医科大学临床学院检验系各位老师给予的热情帮助，感谢宁夏医科大学研究生院全体老师的关心和支持。感谢我的同门张议心、赵瑾、郭文伟及师弟师妹李振昊、高倩、徐向荣、蒋丹、屈昱良的热心帮助，感谢实验室良好的氛围是我完成课题的巨大支持。最后，感谢一直关心、理解和支持我的家人，他们给予我的默默的精神支持是我前进的动力和巨大源泉！56 四、攻读学位期间发表的学术论文[1]杨丽，段相国，刘宏鹏，徐广贤，郭文伟，张议心，赵瑾，犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定，中国兽医杂志，2015，51卷第11期，33-35。[2]杨丽,徐广贤，段相国，张议心，郭文伟,赵瑾，一株犬瘟热病毒的分离与鉴定，中国兽医科学，2016，46卷第2期，94-97。57 五、个人简历一般情况：姓名杨丽性别女年龄26岁民族汉族籍贯陕西宝鸡学习、进修与工作经历：2009.9～2013.6宁夏医科大学医学检验专业2013.9～2016.7宁夏医科大学检验系研究生在读2016.2～2016.5宁夏医科大学总医院医学实验中心实习58